Artykuł metodologiczny

Ciągły elektroencefalogram wideo podczas niedotlenienia-niedokrwienia u nowonarodzonych myszy

DOI:

10.3791/61346

⸱

11 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Virginia, 2Department of Neurology, University of Virginia, 3Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 4Brain Institute, University of Virginia, 5Department of Neuroscience, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje metodę ciągłych zapisów wideo EEG przy użyciu wielu elektrod głębokościowych u noworodków myszy poddawanych niedotlenieniu-niedokrwieniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedokrwienie niedotlenienia jest najczęstszą przyczyną napadów u noworodków. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów i fizjologii leżących u podstaw napadów padaczkowych u noworodków i niedokrwienia niedotlenienia. W tym manuskrypcie opisano metodę ciągłego monitorowania elektroencefalogramu wideo (EEG) u nowonarodzonych myszy w celu wykrywania napadów i analizy tła EEG podczas niedotlenienia niedokrwienia. Wykorzystanie wideo i EEG w połączeniu pozwala na opisanie semiologii napadów i potwierdzenie napadów. Metoda ta umożliwia również analizę spektrogramów mocy i trendów wzorców tła EEG w okresie eksperymentalnym. W tym modelu niedotlenienia niedokrwiennego metoda umożliwia zapis EEG przed urazem w celu uzyskania normatywnego punktu odniesienia oraz podczas urazu i rekonwalescencji. Całkowity czas monitorowania jest ograniczony przez brak możliwości oddzielenia młodych od matki na dłużej niż cztery godziny. Chociaż w tym manuskrypcie użyliśmy modelu napadów niedotlenieniowo-niedokrwiennych, ta metoda monitorowania wideo EEG noworodków może być stosowana do różnych modeli chorób i napadów u gryzoni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna (HIE) to stan, który dotyka 1,5 na 1000 noworodków rocznie i jest najczęstszą przyczyną napadów u noworodków1,2. Niemowlęta, które przeżyją, są narażone na różne niepełnosprawności neurologiczne, takie jak porażenie mózgowe, niepełnosprawność intelektualna i padaczka3,4,5.

Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu i badaniu patofizjologii niedotlenienia, niedokrwienia i napadów u noworodków6,7. Zmodyfikowany model Vannucciego służy do wywoływania niedokrwienia niedotlenienia (HI) w 10. dniu po urodzeniu (p10)7,8. Mysie szczenięta w tym wieku tłumaczą neurologicznie z grubsza na pełny termin ludzki neonat9.

Ciągłe monitorowanie elektroencefalografii (EEG) używane w połączeniu z tym modelem urazów pozwala na dalsze zrozumienie i scharakteryzowanie napadów niedotlenieniowo-niedokrwiennych u noworodków. W poprzednich badaniach stosowano różne metody analizy napadów padaczkowych u noworodków u gryzoni, w tym nagrania wideo, ograniczone zapisy EEG i telemetryczne zapisy EEG10,11,12,13,14,15,16. W poniższym manuskrypcie szczegółowo omawiamy proces nagrywania ciągłego wideo EEG u młodych myszy podczas niedotlenienia-niedokrwienia. Ta technika ciągłego monitorowania wideo EEG u nowonarodzonych młodych myszy może być stosowana do różnych modeli chorób i napadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Wirginii.

1. Budynek elektrody/budowa

  1. Użyj drutu ze stali nierdzewnej w izolacji unipolarnej (0.005" bez średnicy, 0.008" powlekany), aby wykonać elektrodę, która jest połączona z żeńskim złączem gniazdowym (żeńskie złącze gniazdowe 0.079).
  2. Użyj specjalnego, specjalnie wykonanego, aby podłączyć zwierzęta do amplifier.
    1. Podłącz męskie 4-pinowe złącze (złącze męskie 0,079") do 4-kanałowego wzmacniacza operacyjnego (op-amp) dopasowanego do impedancji jedności. Podłącz rezystor 10K do przewodów łączących się z akumulatorem 9 V. Przewód uziemiający, który nie jest podłączony do wzmacniacza operacyjnego, działa jako punkt środkowy akumulatora.
    2. Podłącz jeden koniec (AWG, 0.012" OD) do wzmacniacza operacyjnego, a drugi koniec podłącz do amplifier.

2. Zabieg wszczepienia elektrody

  1. Znieczulij szczenię (9 dzień po porodzie) 4-5% izofluranem w kapturze z przepływem skierowanym w dół. Przed rozpoczęciem zabiegu należy wstrzyknąć szczeniętom bupiwakainę (0,02-0,05 ml, 0,25% miejscowego nacieku podskórnego).
  2. Gdy zwierzę jest unieruchomione, przenieś się do etapu stereotaktycznego ze stożkiem nosowym. Użyj odwrotnej strony nausznika, ponieważ jest miękka, aby stabilnie trzymać głowę. W tym wieku szczenięta nie mają w pełni rozwiniętego ucha, aby używać spiczastego końca paska usznego.
  3. Zmniejsz przepływ izofluranu i utrzymuj go na poziomie 2,5-3%. Miej oko na stały oddech szczeniaka przez cały zabieg chirurgiczny. Uszczypnij ogon, aby sprawdzić reakcję na ból, a następnie przystąp do nacięcia.
  4. Wysterylizuj obszar nacięcia na czaszce betadyną i alkoholem (3 cykle naprzemiennego jodu i 70% etanolu). Ułóż otaczającą część ciała tak, aby obszar nacięcia był widoczny.
  5. Otwórz skórę głowy przednio-tylną nieco powyżej oczu i cofnij około 0,5 cm skóry. Ustaw głowę myszy na stoliku stereotaktycznym tak, aby skóra wyciągnęła się na zewnątrz, odsłaniając czaszkę.
  6. Nałóż nadtlenek wodoru na czaszkę za pomocą bawełnianego wacika i zeskrob czaszkę do czysta za pomocą ostrza skalpela. Czaszka jest bardzo miękka; Zachowaj ostrożność podczas skrobania.
  7. Nałóż jedną kroplę (około 50 μl) kleju i rozprowadź go po odsłoniętej okolicy czaszki za pomocą aplikatora. Wystaw na działanie światła UV przez 40 sekund, aby utrwalić klej.
  8. Zmierz współrzędne, używając odsłoniętej bregmy jako odniesienia. Implant elektrod obustronnie w okolicy CA1 hipokampa [-3,5 mm grzbietowo-brzuszny (DV), ±2 mm przyśrodkowo-boczny (ML), -1,75 mm głębokości (D)] i obustronnie w korze ciemieniowej [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] oraz elektroda referencyjna w móżdżku17. Użyj igły 32 G, aby utworzyć otwór w zaznaczonym obszarze.
  9. Oczyść krew z powierzchni czaszki. Dolne elektrody przymocowane do żeńskiego łącznika gniazda do mózgu za pomocą ramienia stereotaktycznego i zamocowane za pomocą akrylu dentystycznego. Wszczepić elektrodę do mózgu. Zestaw słuchawkowy ze złączem gniazda znajduje się na szczycie czaszki sklejonej ze sobą akrylem dentystycznym.
  10. Wstrzyknąć ketoprofen (5 mg/kg) podskórnie w okolicę międzyłopatkową po zamocowaniu elektrody. Umieść szczenięta z powrotem z matką.
    UWAGA: Przedstaw matce połowę miotu za pomocą zestawu słuchawkowego naraz, zamiast wprowadzać je pojedynczo. Zapobiegnie to uszkodzeniu zestawu słuchawkowego szczeniaka przez matkę.

3. Ustawienie i zapis EEG (wartość wyjściowa/przed urazem)

  1. Po 24 godzinach rekonwalescencji po wszczepieniu elektrody umieść każde zwierzę w podgrzewanej (37 °C) specjalnie wykonanej komorze z pleksiglasu do rejestracji EEG. Komora ta będzie również służyć jako komora do hipoksji.
  2. Podłącz szczenięta w komorze do systemu monitorowania wideo EEG za pomocą elastycznego (specjalnie wykonany wzmacniacza operacyjnego).
    UWAGA: Po założeniu zestawu słuchawkowego myszy są swobodnie mobilne i nie wykazują żadnych różnic w zachowaniu. Po przymocowaniu do drutów elektrod, druty muszą być wyregulowane w pasie mocującym komory, aby zapewnić odpowiednią ilość luzu, aby szczenię mogło swobodnie poruszać się po komorze.
  3. Digitalizacja danych EEG przy 1000 Hz ze wzmocnieniem 1K za pomocą wzmacniacza trawiastego. Przejrzyj sygnał EEG (filtr pasmowo-przepustowy w zakresie 3-70 Hz) później za pomocą oprogramowania (np. LabChart Pro).
  4. Zapisz podstawowe EEG przed urazem przez 30 minut przed odłączeniem zwierząt do zabiegu podwiązania tętnicy szyjnej.

4. Podwiązanie lewej tętnicy szyjnej

  1. Znieczulij szczenię (10 dzień po porodzie) 4-5% izofluranem w kapturze z przepływem skierowanym w dół i umieść je na specjalnie przygotowanym zestawie na podkładce do kąpieli wodnej. Ułóż zwierzę na wznak i zabezpiecz przednie kończyny taśmą papierową.
    1. Zmniejsz przepływ izofluranu do 2-3%. Uszczypnij ogon, aby uzyskać reakcję na ból i monitoruj oddech przez cały zabieg.
  2. Wysterylizuj miejsce nacięcia (między żuchwą a obojczykiem) po lewej stronie szyi betadyną i alkoholem (3 cykle naprzemiennego jodu i 70% etanolu).
  3. Wykonaj nacięcie o długości około 1 cm po lewej stronie szyi za pomocą mikronożyczek. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie cofnij tkankę podskórną i skórę, aby odsłonić tętnicę szyjną. Zwróć uwagę, aby zidentyfikować nerw błędny (biegnący bocznie do tętnicy) i delikatnie oddzielić go i wycofać z tętnicy.
  4. Nawlecz sterylny jedwabny szew o długości 5 cm pod tętnicę za pomocą mikrokleszczyków. Zawiąż podwójnie zawiązany szew wokół tętnicy, aby zablokować przepływ.
  5. Przeciąć nadmiar szwu i zamknąć odsłoniętą tętnicę, odciągając tkankę podskórną i skórę. Użyj spoiwa weterynaryjnego, aby uszczelnić nacięcie.
  6. Umieść zwierzę z powrotem na ciągłym monitorowaniu EEG w komorze o temperaturze pokojowej, którą umieszcza się na rozgrzewającym materacu. Wykonuj punktowe kontrole temperatury rdzenia w podczerwieni dla szczeniąt, aby uniknąć otwarcia komory. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez 1 godzinę przed hipoksją.

5. EEG i niedotlenienie

  1. Ciągłe monitorowanie FiO2 (frakcja wdychanego tlenu) w komorze za pomocą monitora tlenu.
  2. Przepłukać komorę 60 l/min 100% N2 i 0,415 l/min dla 100% O2 . Gdy nasycenie tlenem w komorze osiągnie 12%, zmniejsz przepływ N2 do 10 l/min, utrzymując przepływO2 na niezmienionym poziomie. Przy niewielkich regulacjach utrzymuj FiO2 na poziomie 8% przez 45 minut.
  3. Po 45 minutach ekspozycji na hipoksję przywróć FiO2 do 21%.
  4. Niech młode dojdą do siebie w komorze i monitorują EEG przez 2 godziny po niedotlenieniu.
  5. Po zakończeniu okresu rejestracji odłącz myszy od zapisu EEG i wróć do matki.

6. Analiza EEG

  1. Przeanalizuj plik EEG z wideo w LabChart Pro. Niech zaślepiony badacz zaznaczy EEG pod kątem napadów i wzorców tła17. Napady są definiowane jako zdarzenie elektrograficzne trwające dłużej niż 10 sekund z rytmicznymi wyładowaniami falowymi o wysokiej częstotliwości (≥3x linia bazowa) z wyraźną ewolucją17.
  2. Niech drugi zaślepiony badacz przejrzy losowo zaznaczone wydarzenia w celu uzyskania zgody.
  3. Przejrzyj powiązane wideo dla każdego oznaczonego zdarzenia elektrograficznego i przeanalizuj je zgodnie z wynikiem napadów behawioralnych u noworodków gryzoni16. Krótko mówiąc, wynik ten waha się od 0 do 6 (unieruchomienie do ciężkiego zachowania toniczno-klonicznego). Aby dokładniej scharakteryzować semiologię napadów, przeanalizuj zachowanie pod kątem lateralizacji (ruchy wieloogniskowe/obustronne vs. ogniskowe/jednostronne vs. mieszane).
  4. Utwórz spektrogram mocy. Użyj szybkiej transformaty Fouriera z oknem danych cosinus-bell o rozmiarze 1024 punktów danych. Stwórz gładką oś x w spektrogramie za pomocą nakładania się okien wynoszącego 87,5%. Wyraź moc jako μV218.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Semiologia napadów

Narażenie noworodków na niedotlenienie i niedokrwienie powoduje zarówno uogólnione, jak i ogniskowe napady u myszy (Rysunek 1A-C). Nagrania wideo EEG pozwalają na skorelowanie wyników elektrograficznych z zachowaniem na wideo. Zachowania te zostały ocenione przy użyciu wcześniej opublikowanego wskaźnika napadów behawioralnych u noworodków gryzoni (BSS)16. Oprócz BSS skategoryzowaliśmy zdarzenia na podstawi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono model ciągłego monitorowania wideo-EEG u noworodków myszy podczas napadów niedotlenieniowo-niedokrwiennych. Analiza wideo w połączeniu z EEG pozwala na scharakteryzowanie semiologii napadów. Analiza EEG pozwala na ekstrakcję spektrogramów mocy i analizę amplitudy tła.

Prawidłowe i staranne umieszczenie elektrod ma kluczowe znaczenie w tym protokole, ponieważ obrażenia podczas umieszczania elektrod lub niedokładne umieszczenie elektrod może znacząco wpłynąć na wyniki. Ocena normal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uznajemy następujące źródła finansowania: NIH NINDS - K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SURGERY
Ball Point ApplicatorMetrex Research8300-Fi-bond
Cranioplast (proszek/żywica)ColteneH00383Perm Reline/Power
I-Bond KulzerGmbH, Niemcy
LOOK Jedwabny szewSpecjalizacje chirurgiczne CorporationSP115LOOK SP115 pleciony jedwab Niewchłanialny szew chirurgiczny
RS-5168 Kleszcze BotvinInstrument chirurgiczny RobozRS5168Kleszcz do chirurgii / podwiązania
RS-5138 Kleszcze GraefeRoboz Instrument chirurgicznyRS5138Kleszcz do chirurgii / podwiązania
Światło UV do I-BondBlast Lite firmy First MediaBL778Światło UV do
nożyczek do mikrosekcji I-bond VannasRoboz Instrument chirurgicznyRS5618Nożyczki do podwiązania
Vet Bond3M Vetbond1469SBVet Glue
HYPOXIA
HypoxidialStarr Life Science
Czujnik tlenumedyczneMiniOxI- analizator/czujnik tlenu do wiertnicy do hipoksji
EEG RECORDING
żeńskie złącze gniazdowe 0,079"Mill-Max Manufacturing Corp832-10-024-10-001000Zamówione w Digikey
Grass AmplifierNatus Neurology IncorporatedGrass Product
LabChart ProADI Instruments Oprogramowanie do uruchomienia systemu
Złącze gniazda męskiego 0,079"Mill-Max Manufacturing Corp833-43-024-20-001000Zamówione w Digikey
Operational AmplifierTexas Instruments, Dallas, TX, USATLC2274CDTLC2274 Quad Wzmacniacz operacyjny Rail-to-Rail o niskim poziomie szumów
Wzmacniacz operacyjnyTexas Instruments, Dallas, TX, USATLC2272ACDRTLC2274 Quad Rail-to-Rail o niskim poziomie hałasu Wzmacniacz operacyjny
Drut ze stali nierdzewnejAM Systems7914000,005 "goły/0,008" powlekany ultraelastyczny drut o długości 100 stóp
McMaster-Carr9564T136 Drut z gazy w różnych kolorach
Produkty

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
  2. Volpe, J., et al. Neonatal Seizures. Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).
  3. Shankaran, S., et al. Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).
  4. Pappas, A., et al. Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy. Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).
  5. van Schie, P. E., et al. Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).
  6. Rensing, N., et al. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).
  7. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Burnsed, J. C., et al. Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study. PLoS One. 10 (3), 0118889(2015).
  9. Semple, B. D., et al. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).
  10. Comi, A. M., et al. Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia. Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).
  11. Comi, A. M., et al. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).
  12. Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).
  13. Burnsed, J., et al. Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice. Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).
  14. Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy. Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).
  15. Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).
  16. Kang, S. K., et al. and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).
  17. Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG. Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).
  18. Lewczuk, E., et al. EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).
  19. Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ci g y monitoring video EEGneonatalny model mysioperacja implantacji elektrodrejestracja EEGanaliza spektrogramu mocydetekcja napad wpodwi zanie t tnicy szyjnejfrakcja tlenu w gazach wdechowychmonitorowanie video EEG

Powiązane artykuły