Artykuł metodologiczny

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

DOI:

10.3791/61348

⸱

17 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wrodzony układ odpornościowy odgrywa ważną rolę w patofizjologii oka, w tym w zapaleniu błony naczyniowej oka, retinopatii cukrzycowej i zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności fagocyty jednojądrzaste, wyrażają nakładające się na siebie markery powierzchniowe komórek, co sprawia, że identyfikacja tych populacji jest wyzwaniem. Wieloparametrowa cytometria przepływowa pozwala na jednoczesną, ilościową analizę wielu markerów powierzchni komórek w celu różnicowania monocytów, makrofagów, mikrogleju i komórek dendrytycznych w oczach myszy. Protokół ten opisuje wyłuszczenie całych oczu myszy, rozwarstwienie oka, trawienie do zawiesiny pojedynczej komórki i barwienie zawiesiny pojedynczej komórki pod kątem markerów komórek szpikowych. Dodatkowo wyjaśniamy właściwe metody określania napięć za pomocą jednokolorowych kontrolek oraz wyznaczania bramek dodatnich za pomocą kontrolek fluorescencyjnych minus jeden. Głównym ograniczeniem wieloparametrowej cytometrii przepływowej jest brak architektury tkankowej. Ograniczenie to można przezwyciężyć za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej poszczególnych przedziałów gałki ocznej lub uzupełniającego barwienia immunofluorescencyjnego. Jednak immunofluorescencja jest ograniczona przez brak analizy ilościowej i zmniejszoną liczbę fluoroforów w większości mikroskopów. Opisujemy zastosowanie wieloparametrycznej cytometrii przepływowej w celu zapewnienia wysoce ilościowej analizy fagocytów jednojądrzastych w indukowanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej. Ponadto wieloparametrowa cytometria przepływowa może być wykorzystywana do identyfikacji podzbiorów makrofagów, mapowania losu i sortowania komórek w badaniach transkryptomicznych lub proteomicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wrodzony układ odpornościowy obejmuje wiele typów komórek, które stymulują aktywację dopełniacza i stan zapalny. Wrodzone komórki odpornościowe obejmują komórki NK (natural killer), komórki tuczne, bazofile, eozynofile, neutrofile i fagocyty jednojądrzaste. Fagocyty jednojądrzaste, które składają się z monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych, są zaangażowane w patofizjologię wielu schorzeń okulistycznych, w tym zapalenia błony naczyniowej oka, retinopatii cukrzycowej i zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD)1. W tym protokole skupimy się na identyfikacji fagocytów jednojądrzastych za pomocą wieloparametrowej analizy cytometrii przepływowej w mysim modelu neowaskularnego AMD2. Protokół ten można dostosować do mysich modeli retinopatii cukrzycowej i/lub zapalenia błony naczyniowej oka, ale ze względu na ogólnoustrojowy charakter tych chorób zaleca się bardziej rozległą dyssekcję oka.

Fagocyty jednojądrzaste wyrażają nakładające się na siebie markery powierzchni komórek. Długotrwałe makrofagi i mikroglej rezydujące w tkankach pochodzą z erytromieloidu progenitor3, podczas gdy makrofagi recyklingowe i komórki dendrytyczne różnicują się od progenitora komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego4. Markery powierzchni komórek myszy wspólne dla monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych obejmują CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17 oraz marker wewnątrzkomórkowy Iba18. Aby sprostać temu wyzwaniu, analiza transkryptomiczna makrofagów, monocytów i komórek dendrytycznych z wielu tkanek definiuje CD64 jako specyficzny dla makrofagów marker powierzchni komórek6. Makrofagi zostały opisane w tęczówce, naczyniówce, ciele rzęskowym i nerwie wzrokowym w zdrowych oczach3. Alternatywnie, identyfikacja komórek dendrytycznych jest trudniejsza; najbardziej specyficzna metoda identyfikacji komórek dendrytycznych wymaga mapowania losu za pomocą reportera Zbtb46-GFP mouse9. Niezależnie od tej linii reporterowej, ekspresja CD11c i MHCII w połączeniu z brakiem CD64 może zidentyfikować potencjalne komórki dendrytyczne6,10. Komórki dendrytyczne zostały zidentyfikowane w rogówce, spojówce, tęczówce i naczyniówce w zdrowych oczach11. Mikroglej to wyspecjalizowane makrofagi zlokalizowane w siatkówce, chronione przez barierę krew-siatkówka i pochodzące z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego12. W rezultacie, mikroglej siatkówki można odróżnić od makrofagów pochodzących z monocytów na podstawie ich słabych poziomów ekspresji CD45 13 i wysokich poziomów Tmem119, który jest dostępny jako przeciwciało cytometrii przepływowej14. Jednak po aktywacji mikrogleju, CD45 może być regulowany w górę15, a Tmem119 może być regulowany w dół3, co pokazuje złożoność biologii mikrogleju i jest to prawdopodobnie istotne zarówno w przypadku AMD, jak i jego modelu mysiego. Wreszcie monocyty można podzielić na co najmniej dwa podtypy, w tym klasyczne i nieklasyczne. Klasyczne monocyty wykazująCCR2+Ly6C wysoki poziom CX3CR1, niską ekspresję, a nieklasyczne monocyty wykazują niskie markery CCR2-Ly6Co niskimpoziomie CX3CR15.

Ze względu na konieczność ilościowej analizy ekspresji markerów, tj. wysokie i niskie/ciemne poziomy, wieloparametrowa cytometria przepływowa jest idealną metodą do rozróżniania monocytów, makrofagów, mikrogleju i komórek dendrytycznych w oku i innych tkankach. Dodatkowe zalety obejmują identyfikację subpopulacji, możliwość wykorzystania sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) do sortowania populacji komórek do analizy transkryptomicznej lub proteomicznej oraz mapowanie losów. Główną wadą wieloparametrowej cytometrii przepływowej jest brak architektury tkankowej. Można to przezwyciężyć poprzez rozwarstwienie okulistyczne na różne podprzedziały oka: rogówkę, spojówkę, tęczówkę, soczewkę, siatkówkę i kompleks naczyniówka-twardówka. Dodatkowo można wykonać potwierdzające obrazowanie immunofluorescencyjne, ale jest ono ograniczone ze względu na liczbę markerów i brak solidnej oceny ilościowej.

Badania asocjacyjne całego genomu powiązały wiele genów dopełniacza z AMD16. Aktywacja dopełniacza prowadzi do produkcji anafilatoksyny, rekrutacji leukocytów i wynikającego z tego stanu zapalnego. U myszy z niedoborem receptora dopełniacza uszkodzenie laserowe zmniejsza rekrutację fagocytów jednojądrzastych i obszar neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem (CNV)17. Podobnie, mysz z nokautem receptora chemokiny 2 z motywem C-C (CCR2), która ma niedobór rekrutacji monocytów do tkanki, wykazuje zarówno zmniejszoną rekrutację fagocytów jednojądrzastych, jak i indukowany laserem obszar CNV18. Te dane łączą fagocyty dopełniacza i jednojądrzaste z eksperymentalnym CNV i prawdopodobnie neowaskularnym AMD. Na poparcie tego związku receptory dopełniacza są rozregulowane na monocytach krwi obwodowej u pacjentów z neowaskularnym AMD19,20. Dane te wskazują na silny związek między AMD a fagocytami jednojądrzastymi.

W tym manuskrypcie użyjemy eksperymentalnego modelu CNV indukowanego laserem, aby scharakteryzować populacje fagocytów jednojądrzastych w oku myszy za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. Indukowany laserowo CNV jest standardowym mysim modelem neowaskularnego AMD, który wykazał skuteczność obecnej terapii neowaskularnej AMD pierwszego rzutu21. Protokół ten będzie opisywał enukleację oczu myszy, rozwarstwienie oka, trawienie do zawiesiny pojedynczej komórki, barwienie przeciwciał, oznaczanie napięć laserowych przy użyciu kontroli pojedynczego koloru oraz strategię bramkowania przy użyciu kontroli fluorescencji minus jeden (FMO). Szczegółowy opis modelu CNV indukowanego laserem można znaleźć w poprzedniej publikacji22. Korzystając z tego protokołu, zdefiniujemy mikroglej, monocyty, komórki dendrytyczne i populacje makrofagów. Ponadto użyjemy MHCII i CD11c do dalszego zdefiniowania podzbiorów makrofagów w modelu CNV indukowanym laserem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern. Myszy C57BL/6 umieszczono w grupie w ośrodku barierowym w Centrum Medycyny Porównawczej na Uniwersytecie Northwestern (Chicago, IL). Wszystkie zwierzęta były trzymane w 12/12 godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.

1. Pobranie tkanki oka

  1. Poświęć 10-12-tygodniowe myszy C57BL/6J dowolnej płci, stosując regulowane podawanie dwutlenku węgla, aż mysz przestanie reagować i przestanie wdychać. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy lub inną zatwierdzoną metodę wtórną, aby zapewnić eutanazję.
    UWAGA: Perfuzję przezsercową można wykonać w celu usunięcia krążących leukocytów, których nie ma w tkankach oka. W tym eksperfuzji ogólnoustrojowej nie zmniejsza liczby mikrogleju, monocytów, makrofagów lub komórek dendrytycznych wykrywanych w całych oczach nieleczonych lub leczonych laserowo. Dlatego większość tych typów komórek znajduje się w tkankach ocznych i ten krok jest opcjonalny.
  2. Aby wyłuszczyć oczy, dociśnij w pobliżu oczodołu, delikatnie umieszczając parę zakrzywionych kleszczyków pod okiem, gdy wystaje z oczodołu. Szczypce zaciskają się pod okiem, nie ściskając właściwego oka. Usuń oko z otaczającej spojówki (patrz wcześniejsza publikacja)23.
  3. Pociągnij oko na boki, aż nerw wzrokowy będzie jedynym pozostałym połączeniem, aby odłączyć oko. Nerw wzrokowy często przecina się pod wpływem napięcia, ale czasami potrzebne są małe nożyczki, aby przeciąć nerw wzrokowy. Umieść oko w zimnym 1x buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) z wapniem i magnezem w 1,7 ml probówce do mikrowirówki.

2. Trawienie tkanki oka

  1. Przygotować bufor wytrawiający zawierający 0,1 mg/ml enzymu wytrawiającego i 0,2 mg/ml DNazy w zimnym HBSS. Początkowo rozpuścić 5 mg enzymu trawiącego w 2 ml jałowej wody. Przygotować początkowe rozcieńczenie 10 mg/ml DNazy w HBSS. Na każde 10 ml buforu wytrawiającego (wystarczającego dla 3 zwierząt) należy zmieszać 9,4 ml zimnego HBSS z 0,4 ml odtworzonego enzymu wytrawiającego i 0,2 ml rozcieńczonej DNazy I.
    UWAGA: Stężenia te zostały empirycznie określone w wielu eksperymentach, aby zapewnić optymalne poziomy barwienia przeciwciał pojedynczych komórek, przy jednoczesnym zmniejszeniu śmierci komórek. Kolagenaza D została wypróbowana jako alternatywa dla enzymu trawiącego ze zmniejszoną żywotnością komórek i zmniejszoną liczbą komórek CD45 +. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na temat iteracyjnego procesu optymalizacji trawienia.
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu całkowitym usuń pozostałą spojówkę i nerw wzrokowy za pomocą cienkich kleszczyków i nożyczek sprężynowych w zimnym HBSS.
  3. Przenieś czyste oczy do suchego naczynia preparacyjnego lub małej łódki do ważenia. Wstrzyknąć 0,15-0,20 ml buforu wytrawiającego na oko za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 30 G do jamy ciała szklistego po wykonaniu dwóch ran perforujących w oku przez oś widzenia i w odległości 90° od tej pierwszej rany w celu wyjścia buforu trawiennego.
  4. Zmiel całe oczy za pomocą nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczyków ze wszystkimi kawałkami mniejszymi niż 0,5 mm x 0,5 mm. Zdysocjuj tkankę soczewki za pomocą uszkodzeń mechanicznych za pomocą kleszczy, aby zapobiec zatykaniu końcówek pipet w kolejnych krokach. Dla każdej próbki przepłucz kleszcze i nożyczki z 0,75 ml buforu do wytrawiania do małego naczynia. Użyj nowego naczynia dla każdej próbki.
  5. Przenieść zawartość naczynia do probówki dysocjacyjnej na lodzie za pomocą pipety P1000, uważając, aby nie stracić żadnego materiału podczas przenoszenia pipety. Opłucz naczynie dodatkowymi 1,5 ml buforu do wytrawiania, zwiększając całkowitą objętość w probówce dysocjacyjnej do 3,25-3,50 ml.
  6. Umieścić rurkę dysocjacyjną odwróconą na dysocjatorze elektronicznym i uruchomić cykl "m_brain_03_01", składający się z 1-minutowego jednokierunkowego obrotu przy 200 obr./min w temperaturze pokojowej, który jest wstępnie załadowanym programem. Upewnij się, że cała tkanka znajduje się na dnie rurki dysocjacyjnej w kontakcie z buforem wytrawiającym i rotorem dla tego i wszystkich pozostałych etapów.
  7. Umieścić probówkę dysocjacyjną w inkubatorze z wytrząsaniem na 30 minut przy 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
  8. Powtórz kroki 2.6 i 2.7 jeszcze jeden raz. Po drugiej 30-minutowej inkubacji przeprowadzić ostatnie mechaniczne wytrawianie przy użyciu dysocjatora elektronicznego, jak w kroku 2.6.
  9. Zatrzymaj reakcję, dodając 10 ml zimnego buforu przepływowego i umieść probówki na lodzie.

3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej

  1. Aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową, należy przelać zatrzymaną reakcję trawienia oka przez filtr 40 μm umieszczony na górze stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 2,5 ml przepchnąć pozostałe kawałki niestrawionej tkanki oka przez filtr.
  2. Przemyć probówkę dysocjacyjną 10 ml buforu przepływowego i przepłukać filtr przed użyciem tego samego tłoka do ponownego przepuszczenia przez filtr niestrawionych kawałków tkanki oka.
  3. Powtórz krok 3.2, używając 5 ml buforu przepływowego.
  4. Przemyć probówkę dysocjacyjną i filtr ostatnimi 10 ml buforu przepływowego.
    UWAGA: Całkowita objętość bufora mineralizacyjnego i przepływowego wynosi około 38-40 ml na każdą próbkę.
  5. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  6. Przygotuj 1x roztwór lizujący, dodając 10x roztwór lizujący do sterylnej wody. Rozbij granulkę, przesuwając rurkę o inną rurkę. Aby zejść czerwone krwinki, dodaj 1 ml 1x roztworu lizującego przez 30 sekund, mieszając w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Zatrzymać reakcję za pomocą 20 ml buforu przepływowego.
  8. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  9. Oddziel osad, przesuwając rurkę o inną rurkę. Dodaj 5 ml zimnego 1x HBSS na probówkę.
  10. Probówki wirówkowe o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant.

4. Barwienie zawiesiny komórkowej fagocytów jednojądrzastych

  1. Przygotuj 0,5 ml żywej/martwej plamy na próbkę, rozcieńczając żywy/martwy barwnik 1:5 000 w zimnym HBSS.
  2. Dodaj żywą/martwą plamę do każdej próbki za pomocą pipety P1000, upewniając się, że pelety całkowicie dysocjują. Przenieść próbki do mikroprobówek o pojemności 1,2 ml.
  3. Pobrać małą porcję (10 μl) do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz 4.4). Próbki inkubować z żywym/martwym barwnikiem przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić liczbę żywych komórek w próbce.
    UWAGA: Zazwyczaj 2 oczu 10-12-tygodniowej myszy C57BL/6J zawiera mniej niż 2 x 106 żywych komórek.
  5. Przemyć próbki, dodając 400 μl zimnego buforu przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do mianowania o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  6. Całkowicie zawieś komórki w 500 μl zimnego bufora przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do mianowania o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  7. Zablokuj do 5 x 106 żywych komórek w 50 μl blokuFC (rozcieńczenie 1:50 w zimnym buforze przepływowym oczyszczonego szczurzego anty-mysiego CD16 / CD32). Jeśli więcej niż 5 x 106 żywych komórek, odpowiednio zwiększ objętość.
  8. Dodaj blok Fc do osadu, upewniając się, że próbka została całkowicie oddzielona. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Dodać 50 μl roztworu barwiącego przeciwciała (patrz tabela 1 w celu wyboru i ilości każdego przeciwciała zawartego w roztworze) na 5 x 106 żywych komórek bezpośrednio do komórek w bloku FC i całkowicie wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ilości przeciwciał zależą od konfiguracji cytometru przepływowego i powinny być miareczkowane niezależnie dla każdego laboratorium i urządzenia. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z konfiguracją filtrów i lusterek przyrządu. Aby miareczkować przeciwciała, zacznij od zalecenia producenta i oblicz wskaźnik barwienia. Wykonaj próbę różnych stężeń przeciwciał (zarówno powyżej, jak i poniżej zalecenia producenta) i wybierz najniższe stężenie przeciwciała, przy którym utrzymuje się wskaźnik barwienia. Upewnij się również, że barwienie dodatnie, które jest mniej jasne niż kontrola jednokolorowa. Użyj niebarwionych komórek, aby upewnić się, że ujemnie barwione komórki są na skali i mają szczyt na poziomie 1 x 102 lub mniejszym. Użyj fluorescencji minus jedna kontrolka, aby zdefiniować dodatnio zabarwione komórki.
  10. Przemyć próbki, dodając 700 μl zimnego buforu przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do mianowania o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  11. Opcjonalnie, po wybarwieniu przeciwciałami, próbki można utrwalić za pomocą 500 μl 2% paraformaldehydu w buforze przepływowym. Utrwalać próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wykonaj jedno pranie zgodnie z opisem w 4.10. Utrwalone próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Kulki zliczające należy dodać w dniu zbierania danych z cytometrii przepływowej. Utrwalone próbki należy uruchomić na cytometrze przepływowym w ciągu 1-2 dni.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest substancją i stanowi zagrożenie dla zdrowia.
  12. Ponownie umyć próbki za pomocą 500 μl zimnego buforu przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do miana o gramaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać połowę supernatantu bez naruszania osadu komórkowego.
  13. Ponownie zawiesić granulki i przenieść do 96-dołkowej płytki testowej z dnem w kształcie litery U. Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aby zdekantować supernatant, odwróć płytkę i jednym silnym wstrząsem usuń płyn do miski zlewu, nie naruszając osadu.
  14. W nowej mikroprobówce do mianowania o pojemności 1,2 ml umieść 50 μl dobrze zawirowanych kulek do liczenia.
  15. Zawiesić granulki na płytce 96-dołkowej w 200 μl zimnego bufora przepływowego. Dodaj mieszaninę komórek na wierzchu koralików z poprzedniego kroku. Uruchomić na cytometrze przepływowym o całkowitej objętości 250 μl / mikroprobówkę.

5. Zbieranie danych cytometrii przepływowej

  1. Włącz i przygotuj cytometr przepływowy. Podane tutaj instrukcje dotyczą zmodyfikowanego cytometru czterolaserowego (tabela 2).
  2. Uruchom próbkę testową, która zawiera małą porcję z każdej próbki, aby upewnić się, że wszystkie komórki są zgodne z skalą dla każdego detektora. Dostosuj napięcia tak, aby wszystkie ogniwa znajdowały się na skali.
  3. Uruchom pojedyncze kontrole koloru (SCC) dla każdego fluoroforu używanego w koktajlu barwiącym (Tabela 3). Umieść mikroprobówkę z mikromianem w większej probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml w celu umieszczenia na stoliku cytometru przepływowego.
    UWAGA: Fluorofory korzeniowe, takie jak BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) i Alexa700, nie wymagają tego samego przeciwciała co koktajl (tj. CD19 PE dla CD64 PE). Jednak fluorofory tandemowe, takie jak PE-CF594, PE-Cy7 lub APC-Cy7, wymagają tego samego przeciwciała dla SCC co koktajl ze względu na potencjalną dysocjację sprzężonych fluoroforów.
    1. Utwórz SCC dla BV421, dodając 2 krople koralików kompensacyjnych do probówki z mianem o pojemności 1,2 ml wraz z 1 μl chomika anty-mysiego CD11c BV421. Kulki kompensacyjne są używane, ponieważ CD11c BV421 jest podtypem IgG lambda, a nie kappa, jak opisano w 5.3.3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 0,2 ml buforu przepływowego.
    2. Utwórz SCC dla barwnika Alive/Dead, dodając jedną kroplę dodatnich kulek barwiących (zielona nasadka) z kulek reaktywnych aminami, a następnie 1 μl barwnika Alive/Dead. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj jedną kroplę kulek ujemnych (biała nasadka) z kulek reaktywnych aminami. Dodać 0,2 ml buforu przepływowego.
    3. Utworzyć pozostałe SCC, dodając jedną kroplę dodatnich kulek barwiących (zielona nasadka) z zestawu kulek Ig kappa przeciwko szczurom i chomikom, a następnie podaną ilość przeciwciał (Tabela 3) w probówce z mianem o pojemności 1,2 ml. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać jedną kroplę kulek ujemnych (biała nakrętka) z zestawu kulek Ig kappa przeciwko szczurom i chomikom. Dodać 0,2 ml buforu przepływowego.
    4. Całkowicie odwiruj wszystkie mieszanki kulek. Przechowywać SCC w temperaturze 4 °C do 3 dni.
      UWAGA: SCC dla fluorescencyjnych myszy reporterowych to niebarwione komórki.
    5. Podczas uruchamiania SCC należy ustawić napięcia tak, aby próbka SCC miała pik większy niż jakakolwiek fluorescencja dla próbki komórek w tym samym kanale detektora. Ponadto napięcia powinny być ustawione tak, aby każdy SCC miał co najmniej 0,5 logarytmu różnicy między pikiem histogramu w kanale zainteresowania a dowolnym innym kanałem (Rysunek 1).
  4. Uruchom próbki na "Niskim", utrzymując zdarzenia na sekundę poniżej 4000. Jeżeli nie można odpowiednio obniżyć natężenia przepływu, należy rozcieńczyć próbki dodatkowym buforem o przepływie zimnym. Należy zapisać dodaną objętość, ponieważ będzie to niezbędne do obliczenia liczby (patrz reprezentatywne wyniki).
  5. Zbierz co najmniej 3 x 106 zdarzeń na próbkę. Może to być wyższe niż liczba komórek ze względu na to, że granulki pigmentu i zanieczyszczenia liczą się jako zdarzenia na cytometrze.
  6. Zapisać fluorescencję minus jeden (FMO) dla każdego fluoroforu innego niż żywy/martwy dla właściwej strategii bramkowania w sekcji 6.4. FMO to próbka, która została wybarwiona wszystkimi fluoroforami z wyjątkiem jednego.
  7. Wyczyść i wyłącz cytometr przepływowy zgodnie z instrukcjami producenta lub zakładu.

6. Adnotacja danych cytometrii przepływowej

  1. Otwórz nowy arkusz za pomocą oprogramowania do analizy. Importuj pliki FCS z cytometru dla wszystkich próbek i jednokolorowych kontrolek.
  2. Użyj SCC, aby utworzyć macierz wynagrodzeń.
  3. Zastosuj matrycę kompensacyjną do barwionych próbek i FMO.
  4. Użyj FMO, aby określić dodatnie barwienie w celu narysowania bramek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazał nieskompensowane histogramy częstotliwości dla SCC i komórek czerwonego lasera: Alexa647, Alexa700 i APC-Cy7. W Rysunek 1A, karmazynowa linia przedstawiała szczyt SCC dla Alexa647, podczas gdy niebieska linia pokazywała zamierzoną różnicę 0,5 logarytmu. Zauważ, że szczyt w Alexa700 i APC-Cy7 znajdował się na lewo (mniej jasno) od linii cyjanu. Zauważ również, że wszystkie komórki znajdowały się po lewej stronie karmazynowej linii. Żadne komórki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wieloparametrowa cytometria przepływowa pozwala na ilościową analizę wielu typów komórek w złożonej tkance. W tym raporcie opisujemy wykrywanie metodą cytometrii przepływowej populacji fagocytów jednojądrzastych, w tym monocytów, komórek dendrytycznych i podzbiorów makrofagów, po uszkodzeniu laserowym w oku myszy. Liyanage i inni niedawno poinformowali o podobnej strategii bramkowania w celu wykrywania neutrofili, eozynofili, limfocytów, DC, makrofagów, makrofagów naciekających i monocytów27. Nasz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JAL był wspierany przez K08EY030923 grantów NIH; CMC było wspierane przez grant K01 (5K01AR060169) z NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases oraz Novel Research Grant (637405) z Lupus Research Alliance.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 0,6 mlFisher Scientific05-408-120
Probówki do mikrowirówek 1,7 mlCostar3620
15 ml stożkoweThermoFisher339650
1x HBSS, 500 mlGibco14025-092
Strzykawka 2,5 mlHenke Sass Wolf7886-1
20% roztwór paraformaldehyduMikroskopia elektronowa Sciences15713-S
Pipety 25 mlFisher Scientific431032
Igła 30 GExel26437
Luer LockFisher Scientific14955457
41 x 41 x 8 mm polistyrenowy szalik wagowyFisher Scientific08-732-112
50 ml stożkoweFalcon352070
96-dołkowa, dolna płytka testowa w kształcie litery U bez pokrywkiFalcon353910
Kulki reaktywne aminyThermoFisherA10628
Oprogramowanie analityczneFlowJov 10
Zestaw koralików Ig kappa przeciw szczurom i chomikomBD Biosciences552845
C57BL/6J myszyJackson Laboratory664
Licznik komórekInvitrogenAMQAX1000
Szkiełka licznika komórekInvitrogenC10283
Koraliki kompensacyjneThermoFisher01-1111-42
Policz koralikiThermoFisher01-1234-42
Kleszcze zakrzywioneFisher Scientific16-100-123
Enzym trawiącySigma Aldrich5401020001
Mikroskop preparacyjnyNational Optical and Scientific Instruments, Inc.DC3-420T
Rurki dysocjacyjneMiltenyi Biotec130-096-334
DNaseRoche10104159001
Elektroniczny dysocjatorMiltenyi Biotec130-095-937
Oprogramowanie FACS DivaBD Biosciences
Blok FC, anty-mysz dla szczurów CD16/CD32BD Biosciences553142
Kleszcze drobnoziarnisteIntegra Miltex17035X
Bufor przepływowyMiltenyi Biotec130-091-221
Cytometr przepływowyBD Biosciences
Rurki przepływoweFalcon352008
Chomik anty-mysz CD11c BV421BD Biosciences562782
Wiadro na lódFisher Scientific07-210-123
Żywy/martwy barwnikThermoFisher65-0866-14
Roztwór do lizy, 10x roztwórBD Biosciences555899
Rurka i stojak z mikromianemFisher Scientific02-681-380
Mysz anty-mysia CD64 PEBioLegend139304
Mysz anty-mysia NK1.1 PECF594BD Biosciences562864
Końcówki do pipet P1000Denville ScientificP2404
P1000Końcówki
P2do pipet eppendorf22491806
P2Pipeta GilsonFA10001M
P20
P200Denville ScientificP2401
Pipetor P200GilsonFA10005M
Pipet manFisher ScientificFB14955202
Szczur anty-mysz B220 PECF594BD Biosciences562313
Szczur anty-mysz CD11b APC-Cy7BD Biosciences557657
Szczur anty-mysz CD19 AlexaFluor 700BD Biosciences557958
Szczur anty-mysz CD19 PEBD Biosciences553786
Szczur anty-mysz CD4 PECF594BD Biosciences562314
Szczur anty-mysz CD45 FITCThermoFisher11-0451-82
Szczur anty-mysz CD45 PE-Cy7BD Biosciences552848
Szczur anty-mysz CD8 PECF594BD Biosciences562315
Szczur anty-mysz Ly6CBD Biosciences
Szczur anty-mysz Ly6G PECF594BD Biosciences562700
Szczur anty-mysz MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
Szczur anty-mysz Siglec F PECF594BD Biosciences562757
Szczur anty-mysz Tim4 AlexaFluor647BD Biosciences564178
Inkubator wstrząsającyLabnet311DS
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15024-10
Sterylne sitko do komórek, siatka nylonowa 40 mmFisher Scientific22363547
Sterylna woda, 500 mlGibcoA12873-01
Wirówka z wiadrem wahadłowymeppendorf5910 R
Trypan niebieski, roztwór 0,4%Gibco15250061
Pipety 10 ml Fisher Scientific 431031 3ml Końcówki do pipet do pipet Gilson FA10006M Pipeta Końcówki do pipet Gilson FA10003M 561085

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099(2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935(2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313(2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636(2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wieloparametryczna cytometria przep ywowatrawienie oka myszyzawiesina pojedynczych kom rekmarkery powierzchniowe kom rekfluorescencja minus jedenbramkowanie w cytometrii przep ywowejpodgrupy makrofag widentyfikacja mikroglejuanaliza kom rek dendrytycznych

Powiązane artykuły