Artykuł metodologiczny

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

DOI:

10.3791/61350

⸱

21 maja 2020

 ,  ,  , 
1The Graduate Program for Neuroscience, Boston University, 2Department of Biology, Boston University, 3Neurophotonics Center, Boston University, 4Center for Systems Neuroscience, Boston University, 5Research and Early Development, Biogen, 6Department Pharmacology and Experimental Therapeutics, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola niedawno odkrytych genów związanych z chorobą w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje niejasna. Zmodyfikowana technika obustronnej elektroporacji in utero pozwala na transfer genów w dużych populacjach neuronów i badanie przyczynowego wpływu zmian ekspresji genów na zachowania społeczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ badania asocjacyjne całego genomu rzucają światło na heterogeniczne genetyczne podstawy wielu chorób neurologicznych, wzrasta potrzeba zbadania wpływu określonych genów na rozwój i funkcjonowanie mózgu. Opieranie się na modelach mysich w celu zbadania roli określonych manipulacji genetycznych nie zawsze jest wykonalne, ponieważ transgeniczne linie myszy są dość kosztowne, a wiele nowych genów związanych z chorobą nie ma jeszcze komercyjnie dostępnych linii genetycznych. Ponadto stworzenie linii myszy może zająć lata rozwoju i walidacji. Elektroporacja in utero oferuje stosunkowo szybką i łatwą metodę manipulowania ekspresją genów w sposób specyficzny dla typu komórki in vivo, która wymaga jedynie opracowania plazmidu DNA w celu osiągnięcia określonej manipulacji genetycznej. Obustronna elektroporacja in utero może być stosowana do celowania w duże populacje neuronów piramidowych kory czołowej. Połączenie tej metody transferu genów z podejściami behawioralnymi pozwala na badanie wpływu manipulacji genetycznych na funkcję sieci kory przedczołowej i zachowania społeczne młodych i dorosłych myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) doprowadziły do odkrycia nowych genów kandydujących, które są związane z patologiami mózgu1,2,3,4. Badania te były szczególnie korzystne w zrozumieniu wyniszczających zaburzeń neuropsychiatrycznych, takich jak schizofrenia (SCZ), gdzie badanie nowych genów posłużyło jako punkt wyjścia dla nowych kierunków badań i interwencji terapeutycznych5,6. Geny niosące ryzyko SCZ wykazują stronniczą ekspresję w korze przedczołowej (PFC) podczas rozwoju prenatalnego i wczesnego rozwoju poporodowego, regionie związanym z patologią kilku zaburzeń neuropsychiatrycznych7. Dodatkowo, mysie modele zaburzeń psychicznych wykazują nieprawidłową aktywność w sieciach PFC6,8,9. Wyniki te sugerują, że geny związane z SZC mogą odgrywać rolę w okablowaniu rozwojowym tego regionu. Konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, aby zrozumieć wkład tych genów kandydujących do tworzenia połączeń w PFC i ustalić, czy geny te odgrywają sprawczą rolę w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych. Techniki manipulacji genetycznej u myszy, które pozwalają na badanie zmian ekspresji genów w określonych obwodach neuronalnych podczas rozwoju prenatalnego i wczesnego postnatalnego, są obiecującą metodą zrozumienia mechanizmów molekularnych, które łączą zmiany ekspresji genów z dysfunkcją PFC.

Genetyczne linie myszy oferują metodę badania wpływu poszczególnych genów na rozwój i funkcjonowanie mózgu. Jednak poleganie na myszach transgenicznych może być ograniczające, ponieważ nie zawsze istnieją komercyjnie dostępne linie do badania wpływu określonych genów na rozwój obwodów neuronalnych. Co więcej, opracowanie niestandardowych linii myszy może być niezwykle kosztowne i czasochłonne. Zastosowanie intersekcjonalnych strategii manipulacji genetycznej, które łączą transgeniczne myszy z podejściami wirusowymi, zrewolucjonizowało zrozumienie mózgu10,11,12. Pomimo znacznego postępu, strategie wirusowe mają pewne ograniczenia w zależności od typu wektora wirusowego, w tym ograniczenia w pojemności pakowania, które mogą ograniczać ekspresję wirusa13 i toksyczność komórek związaną z ekspresją wirusa14. Co więcej, w większości warunków eksperymentalnych, silna ekspresja genów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wymaga około 2 do 4 tygodni15, co sprawia, że rutynowe strategie wirusowe są niewykonalne w celu manipulowania genami we wczesnym okresie rozwoju pourodzeniowego.

Elektroporacja in utero (IUE) to alternatywne podejście, które pozwala na szybki i tani transfer genów16,17, które w połączeniu z etykietowaniem fluorescencyjnym i podejściem farmakogenetycznym lub optogenetycznym stanowi potężną platformę do analizy funkcji obwodów neuronalnych. Dodatkowo, wraz z rozwojem CRISPR-Cas9, geny edytujące genom mogą ulegać nadekspresji lub precyzyjnie zmieniane poprzez specyficzne dla typu komórki knock-down lub knock-out określonych genów lub poprzez modulację promotorów18,19. Metody manipulacji genami z wykorzystaniem IUE są szczególnie korzystne, gdy wpływ genów na obwody neuronalne musi być badany w wąskich oknach rozwojowych20. IUE jest wszechstronną techniką, a nadekspresję można łatwo osiągnąć poprzez wstawienie genu do wektora ekspresyjnego pod określonym promotorem. Dodatkową kontrolę ekspresji genów można osiągnąć poprzez sterowanie ekspresją za pomocą promotorów o różnej sile lub za pomocą indukowalnych promotorów zdolnych do czasowego kontrolowania ekspresji genów21,22. Dodatkowo, IUE pozwala na celowanie w komórki w określonych warstwach kory mózgowej, typach komórek i regionach mózgu, co nie zawsze jest możliwe przy użyciu innych podejść5,17. Ostatnie postępy w konfiguracji IUE opartej na użyciu trzech elektrod, która generuje bardziej wydajny rozkład pola elektrycznego, rozszerzyły funkcjonalny repertuar tej metody i pozwoliły naukowcom skupić się na nowych typach komórek oraz zwiększyć wydajność, dokładność i liczbę komórek, które mogą być celowane23,24. Technika ta została niedawno wykorzystana do określenia przyczynowej roli składnika dopełniacza 4A (C4A), genu związanego z SCZ, w funkcji PFC i wczesnym poznaniu5.

Prezentowany tutaj jest eksperymentalny potok, który łączy podejścia do transferu genów w celu celowania w duże populacje neuronów pobudzających w korze czołowej, w tym PFC, z paradygmatami behawioralnymi, które nie tylko umożliwiają badanie zmian na poziomie komórek i obwodów, ale także pozwalają na monitorowanie zachowania we wczesnym okresie rozwoju postnatalnym i dorosłości. Pierwszą opisaną metodą jest obustronna transfekcja dużych populacji neuronów piramidowych warstwy (L) 2/3 w obszarach kory czołowej. Następnie przedstawiono zadania mające na celu zbadanie zachowań społecznych u młodych i dorosłych myszy. Liczbę komórek można uzyskać po wykonaniu zadań behawioralnych w celu ilościowego określenia zakresu i lokalizacji transfekcji komórek. Co więcej, liczba transfekowanych komórek może być skorelowana z danymi behawioralnymi w celu określenia, czy większa liczba transfekowanych komórek prowadzi do większych zaburzeń w zachowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi badań na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie roztworu DNA

  1. Kup komercyjny plazmid lub sklonuj interesujący Cię gen do plazmidu z pożądanym promotorem. W tym przypadku zastosowano plazmid zawierający EGFP pod promotorem CAG (PCAG-EGFP).
    UWAGA: Określ żądany promotor na podstawie wymaganego poziomu ekspresji. Ogólnie rzecz biorąc, plazmidy pod promotorem CAG mogą być używane do osiągania wysokich poziomów transgenu, podczas gdy promotory specyficzne dla typu komórki (np. synapsyna dla neuronów) są zwykle mniej aktywne. Eksperymentator powinien empirycznie określić odpowiednie poziomy ekspresji dla każdego plazmidu.
  2. Przekształć bakterie i hodować zapasy w pożywce bakteryjnej za pomocą odpowiedniego antybiotyku.
    1. Usunąć właściwe komórki (komórki DH5α) z temperatury -80 °C i rozmrażać na lodzie przez 20 minut.
    2. Wymieszaj 100 pg -100 ng plazmidowego DNA z 30 μl kompetentnych komórek. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 20 minut.
    3. Przeprowadzić szok termiczny przez inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 sekund, a następnie powrót probówki z powrotem do lodu na 2 minuty.
    4. Dodać 200 - 1 000 μl pożywki LB do przekształconych kompetentnych komórek i hodować przez 45 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
    5. Umieścić 200 μl przekształconych komórek na płytce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    6. Następnego dnia inkubować jedną kolonię bakteryjną w 200 ml bulionu LB z odpowiednim antybiotykiem w temperaturze 37 °C na inkubatorze z wytrząsaniem przez noc.
  3. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu maxiprep.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w otrzymanym zestawie maxiprep. Na etapie elucji nie należy eluować DNA do buforu elucji. Zamiast tego wymyj DNA za pomocą 200 μl sterylnego 1x PBS lub wody o jakości cząsteczkowej.
    2. Upewnij się, że końcowe stężenie DNA jest większe niż 1 μg/μl. Jeśli plazmid zawierający gen będący przedmiotem zainteresowania nie zawiera genu reporterowego, należy również przygotować plazmid do kotransfekcji z cząsteczką reporterową, taką jak białko zielonej fluorescencji (GFP), aby umożliwić wizualizację transfekowanych komórek.
  4. Przygotuj roztwór DNA do operacji, rozcieńczając plazmidowe DNA do 1x PBS do 1 μg/μL końcowego stężenia każdego plazmidu. Dodaj szybki zielony barwnik do roztworu DNA do końcowego stężenia 0,1%. Do wstrzyknięć obustronnych należy przygotować 60 μl roztworu na matkę (dla około 10 młodych).
    UWAGA: Jeśli plazmid nie zawiera genu reporterowego, należy przeprowadzić elektroporację z GFP. Szybkość koelektroporacji wynosi zwykle 95% lub więcej. W naszych rękach na efektywność transfekcji nie miała wpływu kotransfekcja. Wszystkie plazmidy poddane elektroporacji należy rozcieńczyć do 1 μg/μl.

2. Zamawianie lub hodowla myszy w ciąży w czasie

  1. W przypadku zamawiania myszy w ciąży w czasie, zamów myszy, aby przybyły na miejsce w dniu embrionalnym (E) 13 lub wcześniej, aby dać matkom odpowiedni czas na aklimatyzację w pomieszczeniach dla zwierząt. W tym protokole do wszystkich eksperymentów wykorzystuje się myszy niekrewniacze CD-1.
    UWAGA: Zamówienie z kilkudniowym wyprzedzeniem zmniejszy stres zwierząt i doprowadzi do większej przeżywalności szczeniąt.
  2. Jeśli hodujesz myszy w ciąży w czasie, sparuj samice myszy z samcem przez noc, raz w tygodniu. Następnego ranka sprawdzić, czy nie ma czopa dopochwowego (E0,5). Określ ciążę, monitorując wagę samic myszy.
    UWAGA: Różne szczepy myszy mają różny przyrost masy ciała w czasie ciąży, więc określ typowy przyrost masy ciała dla użytego szczepu myszy.
  3. Niezależnie od tego, czy zamawiasz myszy, czy je hodujesz, aby zmniejszyć stres matek, umieść w klatce podkładkę lęgową i domek dla myszy. Zmniejszenie stresu może pomóc w zwiększeniu przeżywalności szczeniąt.

3. Budowa i montaż elektrody trzybolcowej

  1. Użyj blach tytanowych klasy 2 o grubości 0,063 cala jako materiału podstawowego do styków elektrodowych.
  2. Używając standardowych technik obróbki skrawaniem lub precyzyjnych narzędzi ręcznych, wykonaj elektrody o wymiarach: 20 mm x 5 mm z zaokrągloną końcówką i rowkowanym grzbietem. Usuń wszelkie szorstkie krawędzie lub zadziory za pomocą papieru ściernego o drobnej ziarnistości.
  3. Aby podłączyć styki elektrody, owiń drut miedziany 22 G wokół rowków elektrody i zabezpiecz przez. Zabezpiecz to złącze za pomocą rurki termokurczliwej.
  4. Następnie przymocuj podłączoną elektrodę do autoklawowalnych, nieprzewodzących kleszczy za pomocą dodatkowej rurki termokurczliwej, aby wykonać dwie elektrody ujemne. Przymocuj pojedynczą elektrodę dodatnią do autoklawowalnego, nieprzewodzącego materiału (takiego jak rączka szczoteczki do zębów z odpiłowaną główką). Zamontuj otwarty koniec przewodu za pomocą standardowej wtyczki bananowej.

4. Przygotowanie do zabiegu

  1. Ciężarne matki należy przyprowadzić na miejsce zabiegu co najmniej 30 minut przed zabiegiem, aby umożliwić zmniejszenie poziomu stresu po transporcie z obiektu dla zwierząt.
  2. Wysterylizuj całe miejsce operacji za pomocą sterylizujących chusteczek bakteriobójczych, a następnie 70% etanolu. Zmień rękawiczki przed rozpoczęciem operacji.
  3. Sterylizuj narzędzia autoklawowane w sterylizatorze ze szklanych kulek.
  4. Przenieść sterylny 1x PBS (około 50 ml na zaporę) do 50 ml probówek stożkowych i umieścić w stojaku na probówki w łaźni wodnej podgrzanej do 38-40 °C. Sprawdź temperaturę sterylnej soli fizjologicznej za pomocą termometru.
  5. Włączyć pompę obiegową podgrzewania wody tak, aby została podgrzana do 37 °C przed rozpoczęciem zabiegu. Pozwoli to utrzymać temperaturę ciała myszy przez cały czas trwania zabiegu.  
  6. Włącz wtryskiwacz ciśnienia i elektroporator i upewnij się, że działa prawidłowo przed zabiegiem.
  7. Krótko odwirować roztwór plazmidowego DNA (otrzymany w kroku 1.4) na wirówce stołowej i umieścić go na lodzie.
  8. Pociągnij szklane pipety za ściągacz do pipet tak, aby końcówka pipety z wyciąganego szkła miała średnicę około 50 μm.
  9. Napełnij pipetę 20-40 μl roztworu DNA (otrzymanego w kroku 1.4).
  10. Ustaw wszystkie niezbędne przedmioty do operacji, w tym balsam do depilacji, jod, 70% etanol, bawełniane wymienniki, maść do oczu, szwy, gazę itp.
  11. Przygotuj kartę chirurgiczną i wypełnij niezbędne informacje, takie jak identyfikator myszy i waga, data operacji, nazwisko chirurga itp.

5. Operacja elektroporacji in utero

  1. Zważ mysz przed zabiegiem i zanotuj to na karcie operacyjnej.
  2. Znieczulić ciężarną mysz (E16) przez inhalację w komorze indukcyjnej z 4% (v/v) mieszaniną tlenu i izofluranu. Po indukcji u myszy przejdź do inhalacji z maską i utrzymuj izofluran na poziomie 1-1,5% (v/v) i monitoruj oddech przez cały czas trwania operacji. Sprawdź, czy mysz jest w pełni znieczulona, częstość oddechów powinna wynosić ~55-65 oddechów na minutę.
  3. Podawać przedoperacyjne leki przeciwbólowe: buprenorfina (3,25 mg/kg; SC) i meloksykamu (1–5 mg/kg; SC) przy maksymalnej objętości 10-30 ml/kg.
  4. Użyj kremu do depilacji lub ostrożnie użyj maszynki do golenia, aby usunąć sierść z brzucha. Wysterylizuj brzuch przez wymaz z jodonem powidonu i 70% etanolem i powtórz to co najmniej 3 razy. Stwórz sterylne pole wokół brzucha za pomocą sterylnej gazy, można również zastosować sterylne drapowanie.
  5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej (3-4 cm) w skórze brzucha, pamiętając, aby podnieść skórę kleszczami, aby uniknąć przecięcia mięśnia. Następnie przetnij mięsień, ponownie uważając, aby podnieść mięsień do góry, aby uniknąć przecięcia ważnych narządów.
  6. Ostrożnie wyciągnij rogi macicy z matki za pomocą kleszczy pierścieniowych i delikatnie umieść je na sterylnym polu, upewniając się, że róg macicy jest podparty wyściółką i nie odciąga się zbyt daleko od kodonu. Od tego momentu utrzymuj róg macicy zwilżony przez resztę operacji za pomocą wstępnie podgrzanego sterylnego 1x PBS.
  7. Ustaw zarodek za pomocą kleszczy lub palców. Ostrożnie włóż wyciągniętą szklaną pipetę pod kątem 45 stopni w stosunku do płaszczyzny poziomej głowy i włóż do komory bocznej, którą można wizualnie zidentyfikować między linią środkową mózgu a okiem. Wstrzyknąć około 2-3 μl do każdej komory bocznej, wkładając pipetę do jednej, a następnie do drugiej komory (zalecane) lub wstrzykując roztwór DNA do jednej komory, aż przejdzie do obu komór bocznych. Komora została skutecznie namierzona, jeśli po wstrzyknięciu występuje kształt półksiężyca.
    UWAGA: Końcówka szklanej pipety może pęknąć podczas operacji. Jeśli tak się stanie, wymień szklaną pipetę, upewniając się, że rogi macicy są zwilżone, podczas gdy nowa pipeta jest przygotowywana i napełniana roztworem DNA.
  8. Aby transfekować komórki obustronnie w korze czołowej, umieść dwie elektrody ujemne po bokach głowy zarodka tuż obok i lekko ogonowo do komór bocznych i umieść elektrodę dodatnią między oczami, tuż przed rozwijającym się pyskiem.
  9. Upewnij się, że zarodek jest obficie nawilżony. Zastosuj cztery impulsy kwadratowe (czas trwania impulsu = czas trwania 50 ms, amplituda impulsu = 36 V, interwał impulsów = 500 ms).
  10. Wstrzyknij i naelektryzuj wszystkie zarodki, jeden po drugim, tak aby każdy zarodek został poddany elektroporacji natychmiast po wstrzyknięciu roztworu DNA. Gdy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie włóż rogi macicy z powrotem do jamy brzusznej. Na tym etapie pokryj jamę brzuszną sterylnym PBS (1x), aby ułatwić umieszczenie rogu macicy.
  11. Wypełnij jamę brzuszną sterylnym 1x PBS, aby po zakończeniu szycia nie pozostały żadne kieszenie powietrzne. Zszyj mięsień szwami wchłanialnymi, a skórę jedwabnymi szwami niewchłanialnymi.
  12. Pozwól zaporze w pełni się zregenerować w ogrzewanej komorze przez co najmniej 1 godzinę. W ciągu następnych 48 godzin regularnie sprawdzaj stan zapór. Gdy tama dojdzie do siebie po znieczuleniu i odzyska przytomność, zacznie się poruszać i trzepać.
  13. Podawaj pooperacyjne leki przeciwbólowe, jeśli koniczyny wykazują oznaki bólu, takie jak zwijanie ciała w kłębek i szybki oddech. Podawać tylko wtedy, gdy występują oznaki bólu, ponieważ zastrzyki SC mogą stresować matki, ale jeśli są podawane grupie eksperymentalnej, podawaj również grupie kontrolnej lub odwrotnie.

6. Ocena wczesnych zachowań społecznych w zadaniu interakcji z matką

UWAGA: Ten protokół jest adaptacją poprzednich publikacji5,25. Wykonaj to zadanie po urodzeniu myszy od dnia poporodowego (P) 18-21.

  1. Matczyne zachowanie naprowadzające w zadaniu interakcja matczyna I (MI1).
    1. Upewnij się, że ściółka klatki nie została zmieniona w tygodniu poprzedzającym wykonanie zadania.
    2. Zdobądź lub zbuduj arenę z otwartym polem (OF), którą można łatwo wyczyścić (zalecany jest akryl) o wymiarach: 50 x 50 x 30 cm (długość-szerokość-wysokość). Warunki oświetleniowe podczas wykonywania zachowań mogą się różnić w zależności od pytania eksperymentalnego i mogą wpływać na poziom pobudzenia i zachowań podobnych do lęku. Nagrywaj eksperymenty behawioralne w słabym świetle (około 20 luksów) umieszczonym nad środkiem areny.
    3. Na dwa dni przed testami zachowania zaaklimatyzuj zaporę do areny, umieszczając ją pod siatkowym kubkiem z drutu (takim jak kubek z ołówkiem) w rogu areny na pięć minut dziennie.
    4. W dniu testu, który może przypadać na P18-21, zanim myszy zostaną odsadzone, dokładnie wyczyść arenę chusteczkami odkażającymi i 70% etanolem.
    5. Ustaw arenę z dwoma przeciwległymi rogami, z których oba zawierają czystą ściółkę, a jeden róg zawiera zabrudzoną ściółkę z domowej klatki szczeniaka.
    6. Pozwól każdemu szczeniakowi eksplorować arenę przez 3 minuty, umieszczając go w neutralnym, pustym rogu na początku.
      UWAGA: Nagraj zachowanie kamerą wideo z prędkością 30 kl./s. Dokładnie wyczyść arenę między każdym szczeniakiem i wymień świeżą ściółkę. Naprzemiennie, który róg jest świeżą i gniazdową ściółką, jako kontrolę, aby uniknąć preferencji narożnika z innych powodów (np. Hałas otoczenia lub światło). Jeśli prowadzisz wiele miotów w oknie rozwojowym P18-21, przeprowadź eksperymenty behawioralne w tym samym czasie między dniami. Upewnij się również, że w danym dniu grupy kontrolne i eksperymentalne są prowadzone równolegle.
  2. Zadanie Matczyna interakcja społeczna w interakcji matczynej II (MI2)
    1. Wykonaj to zadanie natychmiast po zadaniu MI1.
    2. Ustaw arenę tak, aby jeden róg zawierał pusty kubek z siatki drucianej, a przeciwległy róg zawierał zaporę pod kubkiem z siatki. Jeśli myszy są w stanie przesunąć kubek, obciąż go ciężarkiem, który można przykleić do górnej części kubka, aby zapobiec ruchom. Umieść zabrudzoną ściółkę gniazdową z domowej klatki w innym kącie.
    3. Uruchom zadanie MI2. Umieść szczeniaka w pustym rogu i nagrywaj zachowanie przez pięć minut przy 30 klatkach na sekundę, pozwalając szczeniakowi na eksplorację. Uruchom każde szczenię osobno i dokładnie wyczyść całą arenę i kubki z siatki drucianej między każdym szczeniakiem.

7. Zadanie polegające na testowaniu zachowań społecznych u dorosłych

  1. Uruchom dorosłe zachowania społeczne u tych samych myszy, które zostały uruchomione w zadaniu MI1 i MI2, gdy są dorosłe (P60-P70 lub starsze). Zebrane tutaj dane zostały wykonane w osobnej kohorcie.
  2. Dotykaj dorosłych myszy przez 3 kolejne dni, aby umożliwić przyzwyczajenie się do eksperymentatora. Upewnij się, że tylko eksperymentatorzy, którzy zostali zaznajomieni z myszami, przeprowadzają eksperymenty behawioralne, najlepiej niech ta sama osoba uruchamia wszystkie zadania.
  3. Przyzwyczajaj myszy do areny OF przez 3 dni przez 5 minut każdego dnia.
  4. Test zachowania w zadaniu rozpoznawania nowego obiektu w celu zmierzenia ogólnej lokomocji i zainteresowania nowym obiektem. Pozwoli to na bardziej znaczącą interpretację zachowań społecznych, jeśli myszy mają określony deficyt w interakcjach społecznych.  
    1. Umieść myszy na arenie na 5 minut z nowatorskim przedmiotem (małą plastikową zabawką o gładkich, łatwych do czyszczenia powierzchniach) w jednym rogu areny. Dokładnie wyczyść arenę między myszami za pomocą 70% etanolu.
    2. Aby rozpoznać nowy obiekt, umieść poprzednio odsłonięty "nowy obiekt", który jest teraz znajomy, w jednym rogu i umieść nowy nowy nowy obiekt w przeciwległym rogu. W przypadku wszystkich zadań przełączaj narożniki między próbami jako kontrolę.
    3. W przypadku nowych interakcji społecznych upewnij się, że nowe myszy są dopasowane pod względem wieku, szczepu i płci oraz są aklimatyzowane w drucianym kubku przez 2 kolejne dni przez 5 minut każdego dnia. W każdej próbie umieść nowatorską mysz pod siatkowym kubkiem z drutu, aw przeciwległym rogu umieść pusty kubek z siatki drucianej. Pozwól myszom eksplorować arenę przez 5 minut, nagrywając zachowanie. Dokładnie wyczyść arenę i siatkowe kubki z drutu między każdą próbą.

8. Analizowanie danych behawioralnych

  1. Użyj DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) do wykonywania podstawowego śledzenia części ciała). Szczegółowe uwagi dotyczące instalacji i użytkowania DeepLabCut można znaleźć na jego stronie GitHub. Dostępna jest również niestandardowa biblioteka oparta na Pythonie "dlc_utils" (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) do dalszej analizy danych po zakończeniu śledzenia podstawowych części ciała. Więcej szczegółów na temat korzystania z tej biblioteki można znaleźć na stronie GitHub.
    1. Zainstaluj DeepLabCut, korzystając z procesu instalacji anakondy. Zainstaluj wersję DeepLabCut z graficznym interfejsem użytkownika obsługującą tylko procesor, a także wersję z obsługą GPU do trenowania sieci.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostępnymi w linku poniżej, aby stworzyć projekt do śledzenia części ciała. W związku z tym wybierz próbkę klatek ze swojego zestawu danych i ręcznie zaznacz odpowiednie części ciała w tych próbkowanych klatkach. Przeszkol sieć DeepLabCut, aby przewidywała części ciała i sprawdź, czy wyszkolona sieć działa odpowiednio.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Do celów śledzenia pozycji ciała i identyfikowania prostych interakcji na otwartym polu należy określić środek ciężkości zwierzęcia, głowę (operacyjnie zdefiniowaną jako punkt środkowy między uszami), lewe i prawe ucho, a także pysk i podstawę ogona. Śledzenie wielu części ciała pozwala na odpowiednią substytucję, gdy niektórych części ciała brakuje w kadrze z powodu okluzji.
    4. Oprócz części ciała zwierząt śledź różne punkty związane z otoczeniem: takie jak krawędzie pól zachowań. Pozwalają one na powtarzalne oszacowanie takich punktów w wielu sesjach - nawet jeśli pozycja konfiguracji behawioralnej nieznacznie zmieni się względem kamery między sesjami.
    5. Po śledzeniu części ciała na podstawie danych o zachowaniu, należy przefiltrować przewidywane lokalizacje części ciała na podstawie pewności związanej z przewidywaniem w każdej klatce filmu. Przewidywania o niskim poziomie ufności są zwykle związane z zasłoniętymi częściami ciała. W przypadku takich przewidywań należy zastąpić daną część ciała inną (jeśli taka zamiana jest właściwa) lub wykorzystać lokalizacje innych części ciała, aby przewidzieć, gdzie prawdopodobnie znajduje się dana część ciała. W przypadku większości zastosowań w terenie otwartym środek ciężkości ciała gryzoni jest rzadko okludowany i można go przewidzieć z dużą dokładnością i precyzją.
    6. Wykorzystaj przewidywaną lokalizację środka ciężkości, a także lokalizację śledzonych punktów w środowisku, aby oszacować szereg cech zachowania zwierzęcia. Na przykład w danych z otwartego pola do obliczenia prędkości zwierzęcia można użyć pochodnej czasowej pozycji.
  2. Aby uniknąć stronniczości, wykonuj wszystkie eksperymenty "na ślepo" w stosunku do grupy eksperymentalnej, jeśli to możliwe, szczególnie gdy istnieje jakikolwiek element subiektywny w ocenie wyników. Przetestuj wpływ różnic płci na główne wyniki eksperymentalne poprzez łączenie danych w grupach męskich i żeńskich. Wszystkie testy statystyczne mają na celu przetestowanie równej liczby zwierząt w różnych grupach.

9. Liczenie komórek post hoc w celu scharakteryzowania zakresu transfekcji komórek

  1. Określ liczbę komórek transfekowanych na mysz, ponieważ nie wszystkie myszy będą miały udaną transfekcję i będą występować różnice w liczbie transfekowanych komórek. Jedną z metod, aby to osiągnąć, jest zliczanie liczby transfekowanych neuronów w naprzemiennych sekcjach koronalnych, a następnie interpolacja w celu oszacowania całkowitej liczby transfekowanych komórek. W tym celu należy zobrazować i policzyć co drugi przekrój koronalny (50 μm).
    1. Użyj perfuzji przezsercowych z 4% PFA, aby naprawić tkankę, a następnie wypreparować mózg. Po krioprotekcji należy podzielić mózg na odcinki koronalne pod kątem 50 μm.
    2. W przypadku kory czołowej policz komórki w odległości od +2,75 i + 1,35 mm od Bregmy. Współrzędne te zawierają obszary kory czołowej i obejmują część kory somatosensorycznej (S1). Stosując tę metodę, nie zaobserwowano transfekowanych komórek w bardziej ogonowych obszarach korowych lub obszarach podkorowych.
    3. Pamiętaj, aby oznaczyć lewą półkulę od prawej, na przykład zaznaczając jedną półkulę otworem na igłę podczas cięcia, i liczyć komórki obustronnie. Użyj oprogramowania do automatycznego liczenia komórek lub zlicz komórki ręcznie, potwierdzając obecność ciała komórki za pomocą DAPI.
  2. Po uzyskaniu liczby komórek należy ustawić próg włączenia. Na przykład uwzględnij tylko myszy, które są obustronnie elektroporowane w analizie. W celu dalszej analizy skoreluj liczbę transfekowanych komórek z reakcjami behawioralnymi, aby sprawdzić, czy istnieje związek. Technika ta będzie ukierunkowana na wiele obszarów mózgu, dlatego konieczne jest dostarczenie informacji o tym, które regiony mózgu zostały genetycznie zmodyfikowane.
    UWAGA: Możliwe jest, że manipulowanie niektórymi genami może zmienić migrację neuronów, specyfikację i/lub śmierć. Upewnij się, że podczas liczenia komórek badana jest anatomia mózgu i że każdy transfekowany neuron znajduje się w warstwie, która rzekomo została transfekowana (tj. L2/3). Ogólne pomiary anatomiczne, takie jak grubość kory mózgowej, można również określić ilościowo, mierząc odległość od pia do kory L6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne opracowanie i wdrożenie specjalnie zbudowanego elektroporatora i elektrody z trzema bolcami.
Dla IUE, niedrogi, zbudowany na zamówienie elektroporator został zbudowany w oparciu o wcześniej opisaną konstrukcję27 (Rysunek 1A i Rysunek 2). Elektroda z trzema bolcami została wykonana23,24 przy użyciu plastikowych kleszczyków z 2 elektrodami ujemnymi przymocowanymi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisano proces, który łączy manipulację nowymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania w dużych populacjach neuronów kory czołowej z testami behawioralnymi u myszy. Co więcej, proces ten pozwala na podłużne badanie zachowania tych samych myszy zarówno we wczesnym okresie rozwoju pourodzeniowego, jak i w wieku dorosłym. Technika ta pozwala uniknąć konieczności polegania na genetycznych modelach zwierzęcych, co może być kosztowne pod względem czasu i kosztów. Zaletą tego protokołu jest to, że możn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Lisie Kretsge za krytyczne opinie i edycję manuskryptu. Dziękujemy wszystkim asystentom badawczym w laboratorium Cruz-Martín, którzy byli nieocenieni w pomocy w perfuzjach i liczeniu komórek w mózgach behawioralnych. Dziękujemy Andrzejowi Cwetschowi za wkład w projekt elektrody tripolarnej oraz Toddowi Blute'owi i Boston University Biology Imaging Core za użycie mikroskopu konfokalnego. Praca ta była wspierana przez NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), Brenton R. Lutz Award (ALC), I. Alden Macchi Award (ALC), NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) oraz Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13mm Jedwabny pleciony szewHaklaSB77D
Kleszcze do szwów AdsonF.S.T.11006-12IUE
C270 WebcamLogitechN/ARejestruj zachowanie
ElektroporatorZbudowany na zamówienieNie dotyczyPatrz rysunek 1 i 2 oraz Bullmann i in., 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20prepsBio Basic Inc.BS466Preparat Pladmid
Fast Green FCFSigmaF7252-5GBarwnik do roztworu DNA
Cienkie nożyczki - ostreFST14060-09
Gąbki z gazy IUE FisherbrandFisher Scientific1376152IUE
Gaymar Ogrzewanie/chłodzenieBraintreeTP-700Poduszka grzewcza
Szklany ściągacz do pipetSutter Instrument,P-97
Pipety szklaneInstrument Sutter,BF150-117-10
Balsam do depilacjiNairN/ADepilacja
Hartman HemostatsF.S.T.13002-10IUE
Labirynt na otwartym polu - domowa akrylowa arenaZbudowany na zamówienieNie dotyczy50 &razy; 50 & razy; 30 cm długość-szerokość-wysokość
pCAG-GFPAddgene11150Wektor ekspresji ssaków do ekspresji GFP
Picospritzer IIIParker HannifinN/AWtryskiwacz ciśnieniowy
Retraktor - 2 zębyFST17023-13IUE
Kleszcze pierścienioweF.S.T.11103-09
IUE Sterylizator, suchy koralikSigmaZ378569sterylizowane narzędzia chirurgiczne
SZEW, 3/0 PGA, FS-2, FIOLETOWY TYLKO DO UŻYTKU WETERYNARYJNEGOHavel'sHJ398Mięsień szwu
Kąpiel wodnaCole-ParmerEW-12105-84rozgrzewająca sterylna sól fizjologiczna
IUE IUE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18 (1), 3000604(2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9 (1), 74(2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365 (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7 (2), 32446(2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37(2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518(2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dwustronna elektroporacjakora czo owaneurony piramidalnemanipulacja genetycznaanaliza behawioralnazarodki myszyprocedura chirurgicznaplazmid DNADeepLabCut

Powiązane artykuły