Specyficzne tkankowo narzędzia RNAi do identyfikacji składników sygnalizacji stresu ogólnoustrojowego

Podsumowanie

Utrzymanie proteostazy organizmu wymaga koordynacji reakcji kontroli jakości białek, takich jak ekspresja białka opiekuńczego z jednej tkanki do drugiej. W tym miejscu udostępniamy narzędzia stosowane w C. elegans, które umożliwiają monitorowanie zdolności proteostazy w określonych tkankach i określanie międzykomórkowych odpowiedzi sygnalizacyjnych.

Streszczenie

W ciągu ostatniej dekady nastąpił przełomowy wzrost wiedzy na temat regulacji procesów kontroli jakości białek, ukazując znaczenie procesów sygnalizacji międzykomórkowej w regulacji proteostazy nieautonomicznej komórki. Ostatnie badania zaczynają odkrywać komponenty i szlaki sygnałowe, które koordynują kontrolę jakości białek z jednej tkanki do drugiej. Dlatego ważne jest, aby zidentyfikować mechanizmy i składniki sieci proteostazy nieautonomicznej (PN) i jej znaczenie dla starzenia się, reakcji na stres i chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek. W laboratorium używamy genetycznego knockdownu przez tkankowo specyficzne RNAi w połączeniu z reporterami stresu i specyficznymi tkankowo czujnikami proteostazy, aby to zbadać. Opisujemy metodologie badania i identyfikacji składników nieautonomicznego dla komórki PN, które mogą działać w tkankach postrzegających stan stresu oraz w komórkach reagujących w celu aktywacji odpowiedzi ochronnej. Najpierw opisujemy, jak generować konstrukty RNAi spinki do włosów do konstytutywnego nokautu genetycznego w określonych tkankach oraz jak przeprowadzać specyficzne tkankowo nokautowanie genetyczne poprzez podawanie RNAi na różnych etapach życia. Reporterzy stresu i testy behawioralne funkcjonują jako cenne odczyty, które umożliwiają szybkie badanie przesiewowe genów i stanów modyfikujących procesy sygnalizacji stresu systemowego. Wreszcie, czujniki proteostazy ulegające ekspresji w różnych tkankach są wykorzystywane do określania zmian w specyficznej dla tkanek zdolności PN na różnych etapach rozwoju i starzenia. W związku z tym narzędzia te powinny pomóc w wyjaśnieniu i umożliwieniu monitorowania zdolności PN w określonych tkankach, pomagając jednocześnie w identyfikacji składników, które funkcjonują w różnych tkankach, pośrednicząc w nieautonomicznym PN w organizmie.

Wprowadzenie

Proteostaza komórkowa jest monitorowana przez skomplikowaną sieć komponentów kontroli jakości białek, takich jak molekularne białka opiekuńcze, reakcje na stres i mechanizmy degradacji, w tym system ubikwityny, proteasom (UPS) i autofagia1^,2. Aktywacja szlaków odpowiedzi na stres, takich jak reakcja na szok cieplny za pośrednictwem HSF-1 (HSR), odpowiedź na niesfałdowane białko retikulum endoplazmatycznego (UPR^ER) i mitochondriów (^{UPR mito}) jest niezbędna do adaptacji komórkowej i przetrwania podczas wyzwań środowiskowych lub choroby nieprawidłowego fałdowania białek, które prowadzą do toksycznej agregacji białek^1,2,3,4,5,6.

Proteostaza komórkowa jest koordynowana przez dodatkową warstwę w organizmach wielokomórkowych, takich jak C. elegans, która wymaga orkiestracji reakcji na stres komórkowy w różnych tkankach, aby aktywować ochronne składniki kontroli jakości białek, takie jak molekularne białka opiekuńcze⁷. W ciągu ostatniej dekady zaobserwowano nieautonomiczną aktywację komórkowych szlaków odpowiedzi na stres w odpowiedzi na szok cieplny (HSR), UPR^ER i^{UPR mito}, a także transkomórkowej sygnalizacji opiekuńczej (TCS)^3,4,7,8,9,10. W każdym przypadku układ nerwowy, jak również sygnalizacja z jelita, odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu aktywacji białek opiekuńczych w tkankach, w celu ochrony przed toksycznymi konsekwencjami ostrych i przewlekłych stresów związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek^3,5,9,11. Ta transmisja z neuronów do jelita i innych komórek na obrzeżach może być osiągnięta przez neuroprzekaźniki, tak jak ma to miejsce w przypadku UPR^ER i HSR^6,8,11. W jednej z form komórkowej nieautonomicznej sygnalizacji stresu, TCS, która jest aktywowana przez zwiększoną ekspresję HSP-90 w neuronach, wydzielane peptydy immunologiczne odgrywają rolę w aktywacji ekspresji białka opiekuńczego hsp-90 z neuronów do mięśni⁵. W innej postaci TCS zmniejszenie ekspresji głównego molekularnego białka opiekuńczego hsp-90 w jelicie prowadzi do zwiększonej ekspresji indukowanego ciepłem hsp-70 przy dopuszczalnej temperaturze w ścianie ciała Muscle^5,10. W tym konkretnym przypadku specyficzne cząsteczki sygnałowe aktywowane w jelicie odczuwającym stres i reagujące na niego komórki mięśniowe są jednak nieznane.

Tak więc, aby zidentyfikować, w jaki sposób ekspresja chaperonu jest aktywowana z jednej tkanki do drugiej, potrzebne jest podejście, które pozwala monitorować zdolność sieci proteostazy (PN) i aktywację reakcji na stres na poziomie specyficznym dla tkanki. Aby zbadać, który szlak odpowiedzi na stres jest aktywowany w poszczególnych tkankach, można wykorzystać dostępny wybór transkrypcyjnych reporterów opiekuńczych połączonych z fluorescencyjnymi znacznikami białkowymi (patrz również Tabela 3). Należą do nich znakowane fluorescencyjnie reportery transkrypcyjne hsp-90, hsp-70 i hsp-16.2, które wskazują na indukcję HSR, hsp-4, które wskazują na aktywację^{UPR ER} i hsp-6, wskazujące^{UPR mito}. Połączenie tych reporterów z specyficznym dla tkanki stanem stresu pozwala następnie na potężny odczyt, który wskaże poszczególne tkanki reagujące na brak równowagi PN w dystalnej tkance "nadawczej" postrzegającej stres. Aby wywołać stan stresu lub brak równowagi PN w określonej tkance, można zastosować różne podejścia. Na przykład jednym z takich podejść jest ektopowa ekspresja aktywowanej formy czynnika transkrypcyjnego stresu (np. xbp-1s), a innym jest zmniejszenie poziomów ekspresji niezbędnego molekularnego białka opiekuńczego (np. hsp-90) za pomocą swoistych tkankowo promotorów^8,10. Aby zubożyć składniki PN tylko w jednym typie komórki, użytecznym narzędziem jest specyficzny dla tkanki knockdown przez RNAi.

U C. elegans, RNAi jest jednak systemowe; dwuniciowe RNA w środowisku może dostać się i rozprzestrzenić po całym zwierzęciu, aby wyciszyć wybrany gen^12,13. To ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się spożytego dsRNA odbywa się za pośrednictwem białek SID (systemic RNAi defective), takich jak białka SID-1 i SID-2, które są transporterami dsRNA, a także SID-5, który kolokalizuje się z późnymi białkami endosomowymi i jest zaangażowany w eksport spożytego dsRNA^14,15,16. SID-1 jest wieloprzebiegowym białkiem transbłonowym we wszystkich komórkach z wyjątkiem neuronów i jest wymagane do eksportu dsRNA, jak również importu do komórek¹⁷. Ekspresja SID-2 jest ograniczona do jelita, gdzie działa jako receptor endocytarny dla spożywanego dsRNA ze światła jelita do cytoplazmy komórek jelitowych¹⁶. Neurony nie reagują na układowe RNAi, a to koreluje ze zmniejszoną ekspresją białka transbłonowego SID-1 w neuronach, co jest niezbędne do importu dsRNA^15,18. Tak więc, aby swoiste tkankowo RNAi było skuteczne tylko w jednym typie komórki, należy zapobiegać ogólnoustrojowemu rozprzestrzenianiu się dsRNA. Można to osiągnąć, wykorzystując oporny na RNAi mutant sid-1(pk3321), który zapobiega uwalnianiu i wychwytowi dsRNA w tkankach¹⁵. Ekspresja specyficznego tkankowo konstruktu RNAi spinki do włosów w tym mutancie lub ektopowa ekspresja SID-1 w określonej tkance może następnie uzupełnić funkcję zmutowanego sid-1 i pozwoli na specyficzne tkankowo RNAi¹⁹.

Więc jak dsRNA jest spożywane przez jelito w mutancie utraty funkcji sid-1 i jak może następnie dotrzeć do neuronów lub komórek mięśniowych, które ektopowo wyrażają konstrukt SID-1? W jednym z obecnych modeli wyjaśniających ten mechanizm, endocytozowane dsRNA jest pobierane do cytoplazmy jelitowej przez SID-2, a następnie eksportowane do pseudocoelom przez inny niezależny od SID-1 mechanizm, obejmujący SID-5 i transcytozę¹⁷. Tak więc, ponieważ SID-1 jest wymagany do importu dsRNA¹⁷, tylko komórki wykazujące ekspresję SID-1 typu dzikiego będą w stanie wchłonąć dsRNA uwolnione z jelita do pseudocoelom.

Tutaj demonstrujemy użycie zestawu narzędzi, które pozwalają na uzyskanie tkankowo specyficznego RNAi. Używamy przykładu molekularnego białka opiekuńczego Hsp90 do opisania budowy RNAi spinki do włosów, która może być przydatna do konstytutywnego obniżenia ekspresji genów w określonej tkance¹⁰. Opisane podejście może być stosowane w odniesieniu do dowolnego genu docelowego. Odpowiedź innych tkanek na nierównowagę proteostazy spowodowaną przez tkankowo specyficzne RNAi hsp-90 można badać, monitorując ekspresję fluorescencyjnie znakowanych reporterów stresu w innych tkankach. Jako drugą metodę dla tkankowo specyficznego RNAi, pokazujemy, w jaki sposób zmutowany system sid-1 może być przystosowany do karmienia bakterii eksprymujących RNAi, a nie do ekspresji konstruktu RNAi spinki do włosów. Może to być przydatne podczas wykonywania badania przesiewowego RNAi kandydującego lub obejmującego cały genom w celu zidentyfikowania składników wymaganych do odpowiedzi specyficznej dla tkanki. Podobnie, wady rozwojowe związane z wyczerpaniem istotnego składnika PN będą wymagały knockdownu za pośrednictwem RNAi w określonych tkankach na późniejszych etapach rozwoju. Pokazujemy, w jaki sposób system komplementacji SID-1 może być stosowany na kandydującym badaniu przesiewowym RNAi dla specyficznych tkankowo modyfikatorów TCS. W tym przykładzie staramy się zidentyfikować komponenty sygnalizacyjne, które po znokautowaniu w tkance nadawczej "odczuwającej stres" (jelicie) i tkance wywołującej stres (mięśnie) prowadzą do zmienionej ekspresji fluorescencyjnie znakowanego reportera hsp-70 w komórkach mięśniowych.

Protokół

1. Tkankowo specyficzne RNAi na dwa sposoby: Hairpin RNAi i tkankowa komplementacja SID-1

1. Generowanie konstruktów RNAi spinki do włosów do ekspresji specyficznej tkankowo w mutantach sid-1
   1. Amplifikuj docelową sekwencję genu (np. sekwencję hsp-90 wyizolowaną z klonu RNAi hsp-90 z biblioteki Ahringer RNAi²⁰) metodą PCR. Umieść sekwencję niepalindromiczną na końcu 3' sekwencji hsp-90, czyli miejsce SfiI (ATCTA)²¹.
      UWAGA: Startery używane do klonowania hsp-90 z sekwencją SfiI (podkreślone) to:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Sklonuj amplifikowaną sekwencję do komercyjnego wektora zestawu do klonowania (np. TOPO pCR BluntII).
   3. Wyizoluj odwróconą sekwencję hsp-90 od klonu RNAi hsp-90 (biblioteka Ahringer RNAi)²⁰ poprzez trawienie restrykcyjne przy użyciu miejsc restrykcyjnych XbaI i PstI i umieść ją poniżej sekwencji hsp-90-SfiI w wektorze (z kroku 1.1.1), co daje konstrukt spinki do włosów hsp-90 (Rysunek 1).
   4. Sklonuj konstrukt spinki do włosów do wektora wejściowego Gateway pDONR221 i połącz go z klonami wejściowymi Gateway, które zawierają specyficzne tkankowo promotory dowolnej ekspresji w neuronach (rgef-1p); w jelicie (VHA-6P); lub mięsień ściany ciała (unc-54p) i unc-54 3'UTR (lub dowolny inny 3'UTR z wyboru) w reakcji Gateway opisanej w protokole dostawcy.
   5. Linearyzuj powstałe konstrukty RNAi spinki do włosów (Rysunek 1) przy użyciu unikalnego miejsca restrykcyjnego poza sekwencją kodującą i mikrowstrzyknij jako złożoną tablicę o stężeniu 1 ng / μL konstrukt RNAi spinki do włosów, zmieszany ze 100 ng / μL N2 Bristol genomic DNA (trawiony przez ScaI) do szczepu C. elegans wyrażającego reporter hsp-70p::RFP (szczep AM722) i skrzyżowany z genetycznym tłem sid-1 (pk3321) mutanty (szczep NL3321). Aby zapoznać się z protokołem wykonywania mikroiniekcji złożonych tablic, postępuj zgodnie z ²².
   6. Jako kontrolę ujemną należy użyć pustych wektorowych konstruktów spinki do włosów wyrażających niepalindromiczną sekwencję zawierającą SfiI (GGCCATCTAGGCC) pod kontrolą swoistego tkankowo promotora.
   7. Użyj zwiększonego wyrażenia hsp-70p::RFP reportera jako odczytu, aby uzyskać dodatnie transformanty wyrażające RNAi spinki do włosów hsp-90 (Rysunek 3). Aby uzyskać bardziej ogólne podejście do weryfikacji specyficznego tkankowo knock-down dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania, zmierz poziomy mRNA całego zwierzęcia za pomocą qRT-PCR interesującego genu.
   8. Zintegruj układ pozachromosomalny otrzymanego szczepu wyrażającego specyficzny dla jelita konstrukt spinki do włosów hsp-90 (PVH2; patrz Tabela 1) przez promieniowanie gamma. Aby uzyskać informacje na temat integracji macierzy pozachromosomalnych z genomem, zobacz²².
2. Specyficzna tkankowo ekspresja SID-1 w celu umożliwienia specyficznego tkankowo RNAi poprzez karmienie bakterii eksprymujących dsRNA
   1. Sklonuj genomowe DNA sid-1 z wektora TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ do wektora wejściowego bramy pDONR221. Startery do klonowania DNA sid-1 można znaleźć w¹⁹. Połączyć konstrukt sid-1 pDONR221 z klonami wejściowymi Gateway zawierającymi promotory specyficzne dla mięśni (myo-3p) lub jelit (vha-6p) oraz unc-54 3'UTR (lub dowolny inny 3'UTR z wyboru) w reakcji Gateway, jak opisano wcześniej w 1.1.4.
   2. Mikrowstrzyknąć powstałe vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR lub myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR w stężeniu 30 ng/μL wraz z czerwonym fluorescencyjnym markerem koiniekcji gardła (np. myo-2p::RFP; 5 ng/μL) do mutantów sid-1(pk3321).
   3. Zintegruj pozachromosomalne układy sid-1 specyficzne dla jelit lub mięśni z genomem, jak opisano w²². W tym przypadku zaowocowało to szczepami PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) oraz PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1 (PK3321).
   4. Aby uzyskać specyficzną dla neuronów ekspresję sid-1 w mutancie sid-1 (pk3321), użyj szczepu TU3401 uIs3401 [unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321), który został wcześniej wygenerowany przez Calixto et al.¹⁹.
   5. Jak wspomniano w 1.1.7, należy zapewnić specyficzny dla tkanki knockdown genu będącego przedmiotem zainteresowania, mierząc poziomy mRNA pożądanego genu docelowego za pomocą qRT-PCR. Alternatywnie, potwierdź wrażliwość RNAi specyficzną dla tkanki za pomocą białka fluorescencyjnego (np. GFP lub RFP) wyrażonego w tej samej tkance i potraktuj robaki RNAi GFP lub RFP. Wystaw nicienie na działanie RNAi GFP/RFP jako zsynchronizowane larwy w stadium L1 i rosnąć na bakteriach RNAi do pierwszego dnia dorosłości (patrz Rysunek 2). W naszym przypadku użyliśmy szczepów eksprymujących SID-1 w neuronach, mięśniach lub jelicie i skrzyżowano je ze szczepami wyrażającymi HSP-90::RFP w neuronach (AM987), w jelicie (AM986) i w mięśniach (AM988).

2. Wykorzystanie reporterów stresu i czujników proteostazy do monitorowania autonomicznej i nieautonomicznej proteostazy komórek

UWAGA: Aby monitorować pojemność PN w określonych tkankach, użyj specyficznych dla tkanek czujników proteostazy (takich jak szczepy wyrażające Q44 w jelicie lub Q35 w mięśniach - patrz Tabela 3) i reporterów stresu (takich jak indukowany ciepłem hsp-70p::mCherry reporter; Tabela 3).

1. Genetyczna krzyżówka zmutowanego allelu sid-1 (pk3321) ze szczepem czujnika proteostazy i potwierdzenie obecności sid-1 (pk3321) poprzez podawanie RNAi
   1. Genetycznie skrzyżuj szczep czujnika proteostazy/reportera stresu z tłem genetycznym zmutowanego szczepu SID-1 (PK3321). Aby ustalić krzyżówki genetyczne między różnymi szczepami transgenicznymi, postępuj zgodnie z ²³, aby uzyskać szczegółowy protokół.
      UWAGA: mutanty sid-1 (pk3321) są oporne na karmienie RNAi, a zatem leczenie zarodków RNAi przeciwko niezbędnemu genowi (takiemu jak elt-2 lub hsp-90) doprowadzi tylko do zatrzymania rozwoju lub śmiertelności larw w szczepach heterozygotycznych lub dzikich dla genu sid-1.
   2. Niech 10 grawitacyjnych hermafrodytów złoży jaja na płytkach RNAi przeciwko elt-2 lub hsp-90 i kontroluj (pusty wektor; EV) Płytki RNAi w temperaturze 20 °C. Usunąć matki po 1 - 2 godzinach. Użyj N2 Bristol i mutanta sid-1 (pk3321) jako kontroli.
   3. Obserwuj rozwój larw na płytkach RNAi przez następne 2-3 dni. ELT-2 powiedział: RNAi spowoduje zatrzymanie larw L1, podczas gdy hsp-90 RNAi spowoduje zatrzymanie larw L3 w N2 Bristolu. Mutanty sid-1 nie będą wrażliwe na leczenie RNAi i rozwiną się w gravid dorosłe osobniki.
      UWAGA: C. elegans homozygota dla sid-1 (pk3321) będzie wykazywać jednolitą populację rozwijającą się do dorosłości. Na heterozygoty będą wskazywane mieszane populacje niektórych zwierząt wykazujące zatrzymanie larw, a niektóre zwierzęta rozwijają się w dorosłe
   osobniki.
2. Potwierdzenie obecności sid-1(pk3321) poprzez genotypowanie
   1. Pobrać 15-20 robaków z wybranego kandydującego szczepu F2 do probówki PCR zawierającej 15 μl buforu do lizy robaków (Tabela 2).
   2. Umieść probówkę w temperaturze -80 °C na co najmniej 10 minut lub na noc.
   3. Inkubować probówkę w maszynie do PCR za pomocą następującego programu:
   4. 65 °C przez 60 min (robak lizowy); 95 °C przez 15 min (dezaktywować proteinazę K); utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   5. Użyć 2 μl lizatu robaka jako "matrycy" do przeprowadzenia reakcji PCR w celu genotypowania, stosując następujące startery dla sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' i sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Do genotypowania PCR należy użyć następującego programu: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 minut, utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   7. Oczyść produkt PCR ~ 650 pz za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (tabela materiałów) i zsekwencjonuj produkt PCR sid-1 w celu zidentyfikowania mutacji punktu G-do-A allelu sid-1 (pk3321). Alternatywnie, mutacja punktowa G-to-A tworzy miejsce restrykcyjne ApoI, które może być użyte na produkcie PCR do genotypowania zgodnie z opisem w²⁴.
3. Wykorzystanie iQ44::YFP jako czujnika proteostazy jelita
   1. Zsynchronizuj C. elegans wyrażający Q44::YFP w jelicie (szczep OG412) lub skrzyżowany z zmutowanym tłem sid-1 (pk3321) przez wybielanie, postępując zgodnie z protokołem opisanym w²⁵. Larwy L1 należy umieścić na 9 cm płytce z agarem zawierającym bakterie OP50 z pożywką do hodowli nicieni (NGM) i rosnąć do stadium L4 w temperaturze 20 °C.
   2. Zebrać zwierzęta L4, zmywając robaki z płytki za pomocą 5 ml buforu M9. Przenieść bufor M9 zawierający robaki L4 do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety lub silikonowanej pipety z tworzywa sztucznego i odwirować przy 1000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby delikatnie osadzać robaki. Ostrożnie usunąć supernatant, upewniając się, że osad robaka pozostał nienaruszony.
   3. Krok krytyczny: Aby przenieść lub usunąć nicienie, użyj szklanej pipety lub plastikowej końcówki pipety, która została potraktowana środkiem silikonowym (np. SigmaCote) zgodnie z instrukcją producenta. Zapobiega to przywieraniu robaków do plastikowej powierzchni końcówki pipety.
   4. Powtórz krok 2.3.2 jeszcze trzy razy, aby zmyć wszystkie bakterie OP50 z robaków.
   5. Zebrać osad robaka w 5 ml buforu M9 i policzyć liczbę robaków obecnych w 10 μl.
   6. Płytki L4 zwierząt na 6 cm płytkach agarowych NGM zawierających puste bakterie kontroli wektorowej (EV) lub hsp-90 RNAi o gęstości 10 robaków na płytkę (przygotować 5 płytek na punkt czasowy i powtórzyć biologicznie) i inkubować przez 24 -48 godzin w temperaturze 20 °C.
   7. Po 24 godzinach (= dorośli Dzień 1) i 48 godzinach (= dorośli Dzień 2) policz liczbę ognisk Q44 w jelitach nicieni wykazujących agregaty. Wynik wynosi łącznie 30-50 nicieni na replikę biologiczną.

3. Specyficzny tkankowo kandydat na badanie przesiewowe RNAi dla modyfikatorów nieautonomicznej proteostazy komórki

UWAGA: Do badania przesiewowego RNAi specyficznego tkankowo użyliśmy szczepu PVH172 pozwalającego na uzyskanie RNAi specyficznego dla jelit poprzez karmienie bakteriami RNAi oraz szczepu PVH171 pozwalającego na RNAi specyficzne dla mięśni (zobacz Tabela 1 dla genotypu).

1. Przygotowanie płytki kandydującej RNAi
   1. Przygotuj 6 cm płytki agarowe NGM uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny i 1 mM IPTG zgodnie ze standardowymi metodami²⁵.
   2. Użyj biblioteki Ahringer RNAi, aby uzyskać kandydujące klony RNAi dla RNAi screen²⁰.
   3. Zaszczepić 3 ml pożywki LB-amp (50 μg/ml ampicyliny w pożywce LB) w probówce o pojemności 15 ml z pożądanym klonem RNAi za pomocą plastikowej końcówki do pipety. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc z mieszaniem.
   4. Następnego dnia dodać izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) (z 1 M zapasu) do końcowego stężenia 1 mM w nocnej hodowli bakteryjnej.
   5. Mieszać kultury przez kolejne 3 godziny w temperaturze 37 °C.
   6. Umieść 300 μl bakteryjnej kultury RNAi na 6 cm płytce agarowej NGM uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny i 1 mM IPTG. Pozostaw talerze do wyschnięcia na ławce przez 2 dni w temperaturze pokojowej, przykryte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Po wyschnięciu płytki RNAi można przechowywać w pudełku w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
2. Synchronizacja C. elegans i leczenie bakteriami RNAi
   1. Aby zsynchronizować szczepy robaków, wybierz 15 ciężarnych dorosłych osobników na płytki RNAi i pozwól im złożyć jaja przez 1 godzinę. Następnie usuń dorosłe osobniki z talerza.
   2. Krok krytyczny: W tym przypadku unika się synchronizacji przez wybielanie, ponieważ może ona wywołać reporter hsp-70p::RFP, ponieważ jest to stresujący stan dla C. elegans.
   3. Zbierz zsynchronizowane larwy w stadium L4 i przenieś na świeżą płytkę RNAi.
   4. Pozwól nicieniom rosnąć na odpowiednim RNAi przez dwa pokolenia, aby zapewnić skuteczne pobieranie dsRNA, upewniając się, że temperatura jest utrzymywana na poziomie 20 °C.
   5. Do obrazowania i kwantyfikacji fluorescencji hsp-70p::RFP należy użyć osoby dorosłej dnia 1.
3. Przygotowanie preparatów mikroskopowych
   1. Przygotuj szkiełka mikroskopowe, umieszczając ~250 μl 2% roztworu agarozy (w buforze M9) na szklanym szkiełku mikroskopowym i umieść drugie szkiełko na górze, aby utworzyć płaski dysk.
   2. Umieścić 5 μl 5 mM roztworu lewamizolu (w buforze M9) na ustalonej podkładce agarozowej i przenieść 5 dorosłych robaków dnia 1 do kropli lewamizolu. Pozostaw nicienie do sparaliżowania na 5 minut.
   3. Gdy C. elegans zostanie sparaliżowany, ostrożnie wyrównaj go platynowym druciakiem i usuń nadmiar lewamizolu chusteczką laboratoryjną przed dodaniem szkiełka nakrywkowego.
   4. Krok krytyczny: Upewnij się, że wykonałeś zdjęcia robaków w ciągu 30 minut po przygotowaniu szkiełek mikroskopowych. Sparaliżowane nicienie na szkiełku mikroskopowym mogą wyschnąć i pęknąć, co może zagrozić pomiarom fluorescencji.
4. Ustawienia mikroskopu i analiza obrazu
   UWAGA: Obrazy uzyskuje się za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w kamerę EM-CCD oraz oprogramowanie do automatyzacji i analizy obrazów mikroskopowych.
   1. Wykonuj zdjęcia w 10-krotnych powiększeniach za pomocą lasera 561 nm do wzbudzenia fluorescencji RFP. Upewnij się, że wszystkie obrazy są wykonywane przy użyciu tych samych ustawień mocy lasera, rozmiaru otworu i wzmocnienia fluorescencji, aby umożliwić porównania.
   2. Zapisz wszystkie obrazy jako pliki TIFF.
   3. Wykonaj analizę obrazu za pomocą ImageJ. Zmierz intensywność fluorescencji na każdym obrazie w pikselach na jednostkę powierzchni, z odjętą fluorescencją tła. Normalizuj intensywność fluorescencji dla każdego obrazu w stosunku do obszaru obrazu, a także długości robaków.
   4. Zmierz średnią intensywność za pomocą opcji Analizuj | Pomiar w obrazieJ. Znormalizuj wynikową wartość intensywności do obszaru obrazu, dzieląc intensywność przez obszar.
   5. Aby znormalizować intensywność do długości robaka, zmierz robaka, rysując linię wzdłuż długości robaka w ImageJ i używając opcji Analizuj | Miara. Powodem normalizacji intensywności fluorescencji do długości robaka jest to, że robaki mogą różnić się wielkością, w zależności od genu, który jest powalany przez RNAi, a to może wpływać na średnią intensywność.
   6. Znormalizuj zmierzoną intensywność fluorescencji do nieleczonych kontrolnych (tj. transgenicznego C. elegans hodowane na kontrolnych (EV) płytkach RNAi). Połącz znormalizowane wartości, aby porównać średnie intensywności fluorescencji dla każdego warunku RNAi. Staraj się zobrazować 20 robaków na replikę biologiczną i zebrać co najmniej 3 obrazy replik biologicznych.
   7. Obliczyć wartości P średnich wartości intensywności fluorescencji za pomocą testu t Studenta i wykonać poprawkę dla wielu testów przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga, używając współczynnika fałszywych odkryć wynoszącego 0,05.

Wyniki

Tkankowo specyficzne RNAi na dwa sposoby: Ekspresja konstruktów spinki do włosów lub specyficzna tkankowo komplementacja SID-1
Ekspresja specyficznych tkankowo konstruktów RNAi spinki do włosów pozwala na konstytutywne wyłączenie genu przez cały okres rozwoju. Jednak czasami może to być niepraktyczne, gdy badany gen jest wymagany do organogenezy tej konkretnej tkanki, takiej jak elt-2, która jest wymagana do rozwoju jelita²⁶. Specyficzna tkankowo ekspresja SID-1 w mut...

Dyskusja

Opisane tutaj metody pokazują użycie narzędzi, które pozwalają na specyficzne tkankowo wyciszenie składników PN w sposób konstytutywny i czasowy. Wcześniej zidentyfikowaliśmy TCS, nieautonomiczny mechanizm odpowiedzi na stres w komórce, który jest indukowany przez specyficzną tkankowo zmianę poziomów ekspresji Hsp90¹⁰. Specyficzne tkankowo wyciszenie hsp-90 przez ekspresję RNAi spinki do włosów prowadzi do nieautonomicznej regulacji w górę ekspresji ochronnego białka opiekuńczego hsp-...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protokół 3.1.
DNA Czyste i Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protokół Sekcja 2.2.
IPTG Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd	Merck	367-93-1	Protokół 3.1.
Zestaw do klonowania bram wielostanowiskowych	Thermo Fisher	12537100	Protocol, sekcja 1.2.
Protokół SigmaCote		Merck SL2-25mL	Sekcja 2.3.
Tetracyklina	Merck	T7660-5G	Protokół 3.1.
Zestaw do klonowania Zero Blunt TOPO PCR	Thermo Fisher	K280002	Protokół Sekcja 1.1.