Artykuł metodologiczny

Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

DOI:

10.3791/61359

⸱

24 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji zmian w składzie komórek odpornościowych, profilu cytokin i profilu chemokiny w środowisku płucnym po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspansja, aktywacja i transport komórek odpornościowych do płuc, które są kontrolowane przez ekspresję wielu cytokin i chemokin, mogą być zmienione przez poważne uszkodzenie mózgu. Świadczy o tym fakt, że zapalenie płuc jest główną przyczyną śmiertelności u pacjentów, którzy przeszli udar niedokrwienny. Celem tego protokołu jest opisanie zastosowania wielokolorowej analizy cytometrii przepływowej do identyfikacji 13 typów komórek odpornościowych w płucach myszy, w tym makrofagów pęcherzykowych, makrofagów śródmiąższowych, komórek dendrytycznych CD103 + lub CD11b + (DC), plazmocytoidalnych DC, eozynofili, monocytów / komórek pochodzących z monocytów, neutrofili, limfocytów T i B pochodzących z limff, komórek NK i komórek NKT, po indukcji udaru niedokrwiennego przez przejściową niedrożność tętnicy środkowej mózgu. Ponadto opisano przygotowanie homogenatów płuc przy użyciu metody homogenizacji kulkowej, w celu jednoczesnego określenia poziomów ekspresji 13 różnych cytokin lub chemokin za pomocą wielopoziomowych matryc kulkowych sprzężonych z analizą cytometryczną przepływową. Protokół ten może być również wykorzystany do zbadania odpowiedzi immunologicznej płuc w innych stanach chorobowych, takich jak zakaźna choroba płuc lub choroba alergiczna.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuca są organem barierowym, narażonym na działanie środowiska zewnętrznego i dlatego są stale poddawane wyzwaniom immunologicznym, takim jak patogeny i alergeny1. Aktywacja komórek odpornościowych rezydujących w płucach i infiltracja komórek odpornościowych z obwodu są wymagane do usunięcia patogenów ze środowiska płucnego. Dodatkowo, komórki odpornościowe rezydujące w płucach utrzymują tolerancję na bakterie komensalne, co sugeruje, że komórki te odgrywają rolę w usuwaniu patogenów i utrzymaniu homeostazy1. Makrofagi pęcherzykowe i śródmiąższowe należą do wartowniczych komórek odpornościowych rezydujących w płucach, które wykrywają patogeny za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców i usuwają te patogeny za pomocą fagocytozy2. Komórki dendrytyczne rezydujące w płucach łączą wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną poprzez prezentację antygenu3. Ponadto aktywowane miejscowo wrodzone komórki odpornościowe wytwarzają cytokiny i chemokiny, które wzmacniają odpowiedź zapalną i stymulują infiltrację komórek odpornościowych, takich jak monocyty, neutrofile i limfocyty, do płuc 1. Wykazano, że udar niedokrwienny modyfikuje odporność ogólnoustrojową i prowadzi do zwiększonej podatności na infekcje płuc; Jednak niewiele badań oceniało przedział płucny po udarze niedokrwiennym, chociaż niektóre badania badały go w stanach zapalnych4,5,6,7,8,9. Celem metod opisanych w niniejszym dokumencie jest jednoczesne określenie patologii płuc, składu komórek odpornościowych oraz poziomów ekspresji cytokin i chemokiny w płucach w celu oceny zmian w przedziale płucnym i oceny potencjalnych zmian w odpowiedzi immunologicznej płuc po ataku niedokrwiennym.

Opisany tutaj jest protokół uzyskiwania zawiesin pojedynczych komórek z płuc myszy w celu identyfikacji 13 typów komórek odpornościowych. Protokół ten opiera się na trawieniu tkanek kolagenazą D bez konieczności stosowania automatycznego dysocjatora tkankowego. Dodatkowo opracowaliśmy protokół przygotowania homogenatów tkankowych, które można wykorzystać do określenia poziomów ekspresji 13 różnych cytokin lub chemokin za pomocą wielopoziomowych matryc perełkowych opartych na cytometrii przepływowej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do zbadania wpływu udaru niedokrwiennego na odporność płucną i może być stosowany również w innych modelach choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przeprowadzone protokoły i procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Myszy trzymano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w wiwarium na Uniwersytecie Zachodniej Wirginii.  

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować bufor perfuzyjny (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS). Użyj około dwóch 10 ml porcji lodowatego PBS na mysz.
  2. Przygotować pożywkę z komórek płuca/bufor FACS. Bufor FACS zawiera PBS uzupełniony 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Utrzymuj podłoże w niskiej temperaturze przez cały proces wycinania i transferu płuc. Przygotować około 8 ml na próbkę płuc. Przygotuj świeżą pożywkę/bufor FACS przed eksperymentami.
  3. Przygotuj bufor dysocjacyjny do izolacji pojedynczej komórki. Bufor zawiera 1 mg/ml kolagenazy D i 200 μg/ml DNazy I w buforowanym roztworze soli Hanka (HBSS). Przygotować świeżo z roztworu podstawowego (100 mg/ml kolagenazy D i 10 mg/ml DNazy I) przed eksperymentami. Potrzeba około 6 ml na próbkę płuc. Przed użyciem upewnij się, że bufor osiągnie temperaturę pokojową.
  4. Przygotować bufor homogenizacyjny do homogenizacji tkanki płucnej. Bufor zawiera PBS i 1x koktajl inhibitorów proteinaz i fosfatazy (stock = 100x). Świeżo przygotuj przed eksperymentami. Utrzymuj bufor w niskiej temperaturze podczas całego procesu homogenizacji. Około 200 μl buforu wystarcza do homogenizacji pojedynczego prawego płata płuc.

2. Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAO)

UWAGA: Procedury dla tMCAO poprzez wprowadzenie monofilamentu do tętnicy środkowej mózgu zostały szczegółowo udokumentowane wcześniej10. W tych eksperymentach wykorzystano 8- do 12-tygodniowych samców myszy C57BL/6J o wadze 25-30 g.

  1. Krótko mówiąc, przed zabiegiem należy podać myszom podskórnie 2 mg/kg meloksykamu. Głęboko znieczulij myszy w komorze indukcyjnej przy użyciu 5% izofluranu. Potwierdź głębokie znieczulenie metodą szczypania palców u stóp. Utrzymuj znieczulenie 1-2% izofluranem podczas operacji za pomocą stożka nosowego. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5 - 38 °C przez cały czas trwania zabiegu, umieszczając ciepły koc pod myszami. Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być wysterylizowane w autoklawie na dzień przed zabiegiem.
  2. Ogol i przygotuj skórę na brzusznej szyi za pomocą 70% etanolu, a następnie wykonaj peeling z chlorheksydyną. Podskórnie podać 2 mg/kg mc. bupiwakainy w miejsce nacięcia przed wykonaniem pierwszego nacięcia. Użyj maści do oczu, aby zakryć oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Wykonaj nacięcie szyi w linii środkowej. Delikatnie odciągnij na bok tkanki miękkie wokół tchawicy.
  3. Zidentyfikuj lewą tętnicę szyjną wspólną i tętnicę szyjną zewnętrzną.
  4. Założyć tymczasowy szew (rozmiar 6/0) na tętnicę szyjną wspólną, aby zatamować przepływ krwi. Wykonaj nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej.
  5. Włóż żyłkę pokrytą gumą silikonową (rozmiar 6-0) do tętnicy szyjnej zewnętrznej, a następnie przesuń monofilament do tętnicy środkowej mózgu. Pozostaw żyłkę w środkowej tętnicy mózgowej na 60 minut (okluzja).
  6. Monitoruj szybkość przepływu krwi za pomocą laserowej przepływomierzy dopplerowskiej. Zmniejszenie natężenia przepływu do tętnicy środkowej mózgu, które wynosi > 80%, wskazuje na udaną okluzję.
  7. Po 60 minutach okluzji usuń monofilament, aby umożliwić reperfuzję. Zamknij nacięcie.
  8. U myszy pozorowanych wykonaj kroki 2.1-2.6 bez wkładania żyłki. U tych myszy tempo przepływu krwi powinno pozostać stałe podczas całej procedury.
  9. Monitoruj myszy codziennie i mierz deficyty neurologiczne za pomocą standardowych kryteriów punktacji11. 0 – brak deficytu neurologicznego; 1 – chowa przeciwległą przednią łapę po uniesieniu przez ogon; 2 – zatacza kręgi w kierunku przeciwległym, gdy jest podniesiony przez ogon; 3 – upada na przeciwległą podczas chodzenia; 4 – nie chodzi spontanicznie lub jest w śpiączce; 5 – nie żyje.
  10. Należy wykonywać podskórne wstrzyknięcia zwykłej soli fizjologicznej i środka przeciwbólowego (meloksykam, 2 mg/kg) co 24 godziny przez 3 dni po zabiegu.
  11. Izolować płuca po 24 i 72 godzinach od tMCAO w celu dalszej analizy.

3. Pobieranie tkanek płucnych

  1. Głęboko znieczulij mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Potwierdź głębokie znieczulenie metodą szczypania palców u stóp.
  2. Aby wykonać perfuzję przezsercowącałego ciała 12, przypnij mysz do platformy chirurgicznej i zwilż futro 70% etanolem, aby zmniejszyć dystrybucję sierści do jamy ciała. Użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby wykonać poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej ogona, a następnie nacięcie w linii środkowej otrzewnej, zatrzymując się w jamie piersiowej przed przekłuciem przepony.
    1. Nie przecinaj mięśnia/chowaj się w jamie otrzewnej i nie kontynuuj nacinania poza brzuch
      2. .
  3. Przerwij nacięcie, gdy tylko dojdziesz do jamy klatki piersiowej przed przebiciem przepony. Należy uważać, aby nie uszkodzić serca i płuc, co może pogorszyć jakość perfuzji lub regenerację komórek
  4. Za pomocą drobnych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie otrzewnej w linii środkowej, zatrzymując się w jamie piersiowej przed przekłuciem przepony.
  5. Chwyć mysz za dystalny koniec mostka za pomocą kleszczy i unieś w górę, przecinając przeponę, upewniając się, że nie uszkodzisz serca, płuc ani naczyń krwionośnych. Gdy narządy będą widoczne, wykonaj nacięcie w klatce piersiowej i oddziel i przypnij z powrotem obudowę żeber, aby serce i płuca były w pełni odsłonięte.
  6. Ostrożnie wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku w pobliżu łuku aorty. Będzie to służyć jako odpływ do perfuzji.
  7. Natychmiast po tym delikatnie wprowadzić igłę o wymiarach 25 G x 5/8 przymocowaną do strzykawki wypełnionej 10 ml zimnego PBS w dystalną górną powierzchnię lewej komory. Należy uważać, aby nie wprowadzać przez przegrodę komorową do prawej komory. Igła powinna być ledwo wprowadzona do lewej komory.
    UWAGA: Jeśli przegroda komorowa zostanie przebita, płyn wypłynie z nosa myszy. Obniży to jakość perfuzji i spowoduje utratę komórek.
  8. W razie potrzeby można użyć zacisku, aby bezpiecznie przytrzymać igłę na miejscu w lewej komorze podczas perfuzji.
  9. Równomiernie, ale delikatnie wepchnij 10 ml zimnego PBS do serca. Tkanka myszy powinna zacząć ulegać perfuzji i usuwać krew, gdy płyn wydostaje się z prawego przedsionka.
    1. Wcisnąć drugą porcję 10 ml PBS aż do uzyskania wystarczającego klirensu krwi. Wątroba będzie miała jasnobrązowy wygląd, a płuca zmienią kolor z czerwonawo-różowego na przeważnie biały.
  10. Za pomocą kleszczy i cienkich nożyczek preparacyjnych ostrożnie usuń wszystkie otaczające tkanki, w tym serce, tchawicę, przełyk, grasicę, tkankę łączną, węzły chłonne i duże oskrzela.
  11. Oddzielić poszczególne płaty płuc i umieścić je na szalce Petriego na lodzie zawierającej 1-2 ml podwielokrotności zimnej pożywki z komórek płuc.

4. Homogenizacja tkanki płucnej dla matryc multipleksowych za pomocą homogenizatora kulek

  1. Wstępnie schłodź stożkową probówkę z nakrętką o pojemności 2 ml zawierającą 3 sterylne kulki cyrkonu/krzemionki o średnicy 2,3 mm. Dodać 200 μl zimnego buforu homogenizacyjnego do probówki.
  2. Zważyć płatek, przenieść go do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki zawierającej kulki i bufor homogenizacyjny.
    UWAGA: Około 50-100 mg tkanki homogenizowanej w 200 μl buforu będzie wystarczające do wykrycia ekspresji cytokin i chemokiny w próbce.
    1. Homogenizować krzywkę za pomocą homogenizatora na bazie kulki (patrz tabela materiałów) przy 4,000 obr./min przez 2 min.
    2. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie homogenizowana. W razie potrzeby wydłuż czas.
  3. Po homogenizacji odwirować probówkę w mikrowirówce wstępnie schłodzonej (4 °C) o stężeniu 15 870 x g przez 3 minuty.
  4. Przenieść supernatanty do wstępnie schłodzonej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Umieścić próbkę bezpośrednio na lodzie w celu natychmiastowego użycia lub przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

5. Dysocjacja tkanki płucnej i izolacja pojedynczej komórki

  1. Wylać pożywkę z komórek płuc z pozostałych płatów płuc, aby uniknąć rozcieńczenia buforu dysocjacyjnego. Następnie ostrożnie wprowadzić do tkanki płucnej strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 25 G i igłą 5/8 zawierającą 1 ml buforu dysocjacyjnego.  
  2. Wstrzyknąć małe frakcje (około 1/4 do 1/5) buforu dysocjacyjnego do każdego płata płuc i delikatnie napompować.
    UWAGA: Większość bufora wyleci wkrótce po napompowaniu, ponieważ płat został wycięty.
  3. Powtórzyć wstrzyknięcie buforu dysocjacyjnego 1-2x.
  4. Inkubować płaty płuc z buforem dysocjacyjnym przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Drobno zmiel płaty płuc na małe kawałki za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych.
  6. Przenieść rozdrobnione kawałki płuc z buforem dysocjacyjnym do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Uzupełnić dodatkowym buforem dysocjacyjnym do całkowitej objętości 6 ml. Wirować energicznie przez 1 min.
  7. Inkubować próbkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Energicznie wirować co 7-8 minut.
  8. Po 45 minutach inkubacji energicznie wirować próbkę przez 1 minutę, aby uzyskać optymalne wyniki.
  9. Następnie zdysocjuj próbkę, przechodząc przez sitko komórkowe o wielkości 100 μm w celu usunięcia pozostałości, niepożądanej tkanki łącznej i śródmiąższowej.
  10. Odwirować próbkę przez 10 minut przy sile 380 x g, odrzucić supernatant.
  11. Do próbki dodać 5 ml pożywki z zimnymi komórkami płuc. Ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne wirowanie.
  12. Odwirować próbkę przez 10 minut przy sile 380 x g, odrzucić supernatant.
  13. Dodać 1 ml pożywki z zimnymi komórkami płuc. Ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne wirowanie.
  14. Przepuść przez sitko o wielkości 100 μm i policz komórki.

6. Analiza cytometryczna przepływowa dla niszy komórek odpornościowych płuc

  1. Wysiew 1-2 x 106 komórek / przeciwciała osadzony w 96-dołkowej okrągłej płytce dolnej (w sumie 3 zestawy). Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 830 x g. Odrzucić supernatanty.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl zimnego PBS zawierającego utrwaloną żywą/martwą plamę. Przygotuj plamę zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut, chroniąc je przed światłem. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 830 x g. Odrzucić supernatanty.
  4. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 25 μl zimnego buforu FACS zawierającego 5 μg/ml przeciwciała anty-mysiego CD16/32. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.
  5. Dodać do komórek 25 μl zimnego buforu FACS zawierającego kombinacje przeciwciał wymienione w tabeli 1. Mieszać przez delikatne pipetowanie.
    UWAGA: Całkowita objętość buforu FACS do barwienia przeciwciał wynosi 50 μL. Dlatego przy przygotowywaniu głównej mieszanki przeciwciał w 25 μl, stężenie przeciwciał powinno być dwukrotnie wyższe od stężenia końcowego.  
  6. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut, chroniąc je przed światłem. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 830 x g. Odrzucić supernatanty.
  7. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl zimnego buforu FACS. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 830 x g. Odrzucić supernatanty.
  8. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl zimnego buforu FACS. Przenieść do polistyrenowej probówki FACS o pojemności 5 ml zawierającej 150 μl dodatkowego buforu FAC. Natychmiast przeanalizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego.
    UWAGA: Utrwalenie komórek przy użyciu poniższych kroków umożliwia późniejszą analizę próbek.
  9. Po wykonaniu kroku 6.7 ponownie zawiesić próbkę 100 μl 1% paraformaldehydu w PBS.
  10. Inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut, chroniąc ją przed światłem. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 830 x g. Odrzucić supernatanty.
  11. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl zimnego buforu FACS. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 830 x g. Odrzucić supernatanty.
  12. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl zimnego buforu FACS. Przechowywać ogniwa w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Przeanalizować próbkę w ciągu 72 godzin.

7. Multipleksowe tablice koralikowe do wykrywania cytokin i chemokin.

UWAGA: Dostępne na rynku prozapalne chemokiny i panele multipleksowe do wykrywania stanów zapalnych (patrz Tabela materiałów) zostały użyte do określenia ekspresji chemokin i cytokin w płucach po indukcji tMCAO zgodnie z protokołem producenta, który został szczegółowo opisany13.

  1. Krótko mówiąc, anality należy rozmrozić na lodzie, jeśli były przechowywane w temperaturze -80 °C po homogenizacji tkankowej. Przed użyciem odwirować próbkę o masie 590 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek tkanki.
  2. Wygeneruj krzywą wzorcową poprzez seryjne rozcieńczanie wzorcowego koktajlu (C7) o znanym stężeniu 10 ng / ml do 7 wzorców (C1-6), przy czym ostatnim wzorcem jest sam bufor testowy (C0).
  3. Gdy wszystkie odczynniki ogrzeją się do temperatury pokojowej, dodaj 25 μl każdego wzorca i 25 μl buforu do testu do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
  4. Do każdej studzienki na próbkę dodać 25 μl homogenatu płuc (analitu) i 25 μl buforu do testu na płytkę 96-dołkową z dnem V
  5. Energicznie zmieszać wstępnie powlekane kulki, a następnie dodać 25 μl wstępnie powlekanych kulek do każdego z dołków wzorcowych i dołków na próbki.
  6. Uszczelnij płytkę i chroń przed światłem, przykrywając folią. Potrząsaj płytką z prędkością 110 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Wirować przy 230 x g przez 5 min. Dodać 200 μl buforu do przemywania o sile 1x (roztwór podstawowy 20x, rozcieńczyć do 1x wodą). Inkubować przez 1 minutę.
  8. Wirować przy 230 x g przez 5 minut. Zawiesić wzorzec i pobrać próbkę z 25 μl przeciwciał wykrywających.
  9. Uszczelnij i przykryj płytkę, aby chronić ją przed światłem. Potrząsaj płytką z prędkością 110 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać 25 μl streptawidyny-fikoerytryny (SA-PE) do każdego wzorca i dobrze pobrać próbkę.
  11. Uszczelnij i przykryj płytkę, aby chronić ją przed światłem. Wstrząsać z prędkością 110 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Obracać płytkę o masie 230 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić wzorzec i próbki w 1x buforze do płukania.
  13. Przenieść do dobrze oznakowanej polistyrenowej probówki FACS o pojemności 5 ml z okrągłym dnem zawierającej dodatkowe 150 μl 1x buforu do płukania.
  14. Oznaczyć intensywność fluorescencji sygnału PE dla wzorców i próbek za pomocą cytometru przepływowego.
  15. Skonstruuj krzywą wzorcową dla każdej chemokiny i cytokiny, używając średniej intensywności fluorescencji (MFI) PE w stosunku do wcześniej określonych stężeń.
  16. Oznaczyć stężenie każdej chemokiny i cytokiny za pomocą krzywej wzorcowej i MFI z każdej próbki. Panel multipleksowy zapewnia oprogramowanie do analizy danych, które można wykorzystać do określenia stężenia każdego analitu. Masa płata wierzchołkowego/górnego służy do określenia stężenia cytokin lub chemokiny na miligram tkanki.   

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno informowaliśmy, że indukcja udaru niedokrwiennego u myszy zmienia skład komórek odpornościowych płuc11. W szczególności przemijające niedokrwienie mózgu zwiększyło odsetek makrofagów pęcherzykowych, neutrofili i DC CD11b +, jednocześnie zmniejszając odsetek limfocytów T CD4 +, limfocytów T CD8 +, limfocytów B, komórek NK i eozynofili w przedziale płucnym. Co więcej, zmiany komórkowe odpowiadały znacznie zmniejszonym poziomom wielu chemokin w płucach. Opisano tutaj metodę izolacji i identy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły pozwalają na identyfikację typów komórek odpornościowych płuc i ekspresję chemokin lub cytokin u tej samej myszy. Jeśli pożądane jest badanie histopatologiczne, pojedynczy płat może zostać usunięty i unieruchomiony w tym celu przed przejściem do etapów izolacji pojedynczej komórki. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że podejście to może nie być odpowiednie w niektórych stanach chorobowych, jeśli przewiduje się, że zmiana składu komórek odpornościowych i ekspresji chemokin i/lub cytokin będzie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant NIH P20 GM109098 oraz Program Nagród za Innowacyjność od Praespero do Edwina Wana. Eksperymenty z cytometrią przepływową przeprowadzono w WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, który jest wspierany przez granty NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 i P20 GM103434.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B220-APC, klon RA3-6B2Biolegend103212rozcieńczenie 1:200
Beadbug 3-pozycyjny homogenizator kulkowyBenchmark ScientificD1030Homogenizator tkankowy
CCR2-BV421, klon SA203G11Biolegend150605rozcieńczenie 1:200
CD103-BV421, klon 2E7Biolegend1214221:200 rozcieńczenie
CD11b-PE/Cy7, klon M1/70Biolegend101216rozcieńczenie 1:400
CD11c-PE/Cy7, klon N418Biolegend117318rozcieńczenie 1:200
CD11c-Percp/Cy5,5, klon N418Biolegend117328rozcieńczenie 1:200
CD4-BV421, klon GK1.5Biolegend100443rozcieńczenie 1:200
CD45-FITC, klon 30-F11Biolegend103108rozcieńczenie 1:200
CD64-APC, klon X54-5/7.1Biolegend139306rozcieńczenie 1:200
CD8-PE, klon 53-6,7Biolegend100708rozcieńczenie 1:800
Kolagenaza DSigma Aldrich11088882001Składnik w buforze dysocjacyjnym
Rurka z nakrętką stożkowąThermoFisher02-681-344Probówka do homogenizacji tkanek
DNase ISigma Aldrich10104159001Składnik w buforze dysocjacyjnym
Blok Fc przeciwciało CD16/32Biolegend1013201:100
dysocjator genlteMACSMiltenyi Biotec130-093-235Porównanie trawienia płuc z dysocjatorem mechanicznym lub bez
probówki gentleMACS C MiltenyiBiotec130-093-237Probówka do dysocjacji tkanek z dysocjatorem genlteMACS
Inhibitor proteazy i fosfatazy HaltThermoFisher78442Składnik w buforze homogenizacyjnym Laserowy
monitor dopplerowskiMoorMOORVMS-LDFMonitorowanie przepływu krwi podczas tMCAO
Panel chemokiny prozapalnej LEGENDplexBiolegend740451Matryca koralików Multiplex
LIVE/DEAD naprawialna plama w bliskiej podczerwieniThermoFisherL34976Służy do wykluczania martwych komórek podczas analizy cytometrii przepływowej
Ly6C-PE, klon HK1.4Biolegend128008rozcieńczenie 1:800
Ly6G-BV510, klon 1A8Biolegend127633rozcieńczenie 1:200
Szew MCAO L56 wielokrotnego użytku 6-0 podłożeDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, klon M5/114.15.2Biolegend107636rozcieńczenie
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, klon PK136Biolegend108728rozcieńczenie 1:200
Siglec F-PE, klon E50-2440BD Biosciences552126rozcieńczenie 1:200
Nić do szycia jedwabiu, rozmiar 6/0Fine Science Tools18020-60
System anestezjologiczny tMCAO SomnoSuiteKent ScientificSS-01Znieczulenie myszy do tMCAO
TCRb-BV510, klon H57-897Biolegend109234Rozcieńczenie 1:200
Kulki cyrkonowe/krzemionkowe, 2,3 mmBiospec11079125zKoraliki do homogenizacji tkanek
niego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777(2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051(2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853(2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038(2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440(2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779(2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757(2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73(2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immune Cell AnalysisFlow CytometryLung Homogenate PreparationMultiplex Bead ArrayCytokine Chemokine DetectionIschemic Stroke ModelMiddle Cerebral Artery OcclusionAlveolar MacrophagesInterstitial MacrophagesDendritic Cells

Powiązane artykuły