Method Article

Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

DOI:

10.3791/61359

⸱

June 24th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji zmian w składzie komórek odpornościowych, profilu cytokin i profilu chemokiny w środowisku płucnym po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspansja, aktywacja i transport komórek odpornościowych do płuc, które są kontrolowane przez ekspresję wielu cytokin i chemokin, mogą być zmienione przez poważne uszkodzenie mózgu. Świadczy o tym fakt, że zapalenie płuc jest główną przyczyną śmiertelności u pacjentów, którzy przeszli udar niedokrwienny. Celem tego protokołu jest opisanie zastosowania wielokolorowej analizy cytometrii przepływowej do identyfikacji 13 typów komórek odpornościowych w płucach myszy, w tym makrofagów pęcherzykowych, makrofagów śródmiąższowych, komórek dendrytycznych CD103 + lub CD11b + (DC), plazmocytoidalnych DC, eozynofili, monocytów / komórek pochodzących z monocytów, neutrofili, limfocytów T i B pochodzących z limff, komórek NK i komórek NKT, po indukcji udaru niedokrwiennego przez przejściową niedrożność tętnicy środkowej mózgu. Ponadto opisano przygotowanie homogenatów płuc przy użyciu metody homogenizacji kulkowej, w celu jednoczesnego określenia poziomów ekspresji 13 różnych cytokin lub chemokin za pomocą wielopoziomowych matryc kulkowych sprzężonych z analizą cytometryczną przepływową. Protokół ten może być również wykorzystany do zbadania odpowiedzi immunologicznej płuc w innych stanach chorobowych, takich jak zakaźna choroba płuc lub choroba alergiczna.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuca są organem barierowym, narażonym na działanie środowiska zewnętrznego i dlatego są stale poddawane wyzwaniom immunologicznym, takim jak patogeny i alergeny1. Aktywacja komórek odpornościowych rezydujących w płucach i infiltracja komórek odpornościowych z obwodu są wymagane do usunięcia patogenów ze środowiska płucnego. Dodatkowo, komórki odpornościowe rezydujące w płucach utrzymują tolerancję na bakterie komensalne, co sugeruje, że komórki te odgrywają rolę w usuwaniu patogenów i utrzymaniu homeostazy1. Makrofagi pęcherzykowe i śródmiąższowe należą do wartowniczych komórek odpornościowych rezydujących w płucach, kt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przeprowadzone protokoły i procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Myszy trzymano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w wiwarium na Uniwersytecie Zachodniej Wirginii.  

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować bufor perfuzyjny (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS). Użyj około dwóch 10 ml porcji lodowatego PBS na mysz.
  2. Przygotować pożywkę z komórek płuca/bufor FACS. Bufor FACS zawiera PBS uzupełniony 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Utrzymuj podłoże w niskiej temperaturze przez cały proces wyci....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno informowaliśmy, że indukcja udaru niedokrwiennego u myszy zmienia skład komórek odpornościowych płuc11. W szczególności przemijające niedokrwienie mózgu zwiększyło odsetek makrofagów pęcherzykowych, neutrofili i DC CD11b +, jednocześnie zmniejszając odsetek limfocytów T CD4 +, limfocytów T CD8 +, limfocytów B, komórek NK i eozynofili w przedziale płucnym. Co więcej, zmiany komórkowe odpowiadały znacznie zmniejszonym poziomom wielu chemokin w płucach. Opisano tutaj metodę izolacji i identy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły pozwalają na identyfikację typów komórek odpornościowych płuc i ekspresję chemokin lub cytokin u tej samej myszy. Jeśli pożądane jest badanie histopatologiczne, pojedynczy płat może zostać usunięty i unieruchomiony w tym celu przed przejściem do etapów izolacji pojedynczej komórki. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że podejście to może nie być odpowiednie w niektórych stanach chorobowych, jeśli przewiduje się, że zmiana składu komórek odpornościowych i ekspresji chemokin i/lub cytokin będzie.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant NIH P20 GM109098 oraz Program Nagród za Innowacyjność od Praespero do Edwina Wana. Eksperymenty z cytometrią przepływową przeprowadzono w WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, który jest wspierany przez granty NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 i P20 GM103434.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
B220-APC, klon RA3-6B2Biolegend103212rozcieńczenie 1:200
Beadbug 3-pozycyjny homogenizator kulkowyBenchmark ScientificD1030Homogenizator tkankowy
CCR2-BV421, klon SA203G11Biolegend150605rozcieńczenie 1:200
CD103-BV421, klon 2E7Biolegend1214221:200 rozcieńczenie
CD11b-PE/Cy7, klon M1/70Biolegend101216rozcieńczenie 1:400
CD11c-PE/Cy7, klon N418Biolegend117318rozcieńczenie 1:200
CD11c-Percp/Cy5,5, klon N418Biolegend117328rozcieńczenie 1:200
CD4-BV421, klon GK1.5Biolegend100443rozcieńczenie 1:200
CD45-FITC, klon 30-F11Biolegend103108rozcieńczenie 1:200
CD64-APC, klon X54-5/7.1Biolegend139306rozcieńczenie 1:200
CD8-PE, klon 53-6,7Biolegend100708rozcieńczenie 1:800
Kolagenaza DSigma Aldrich11088882001Składnik w buforze dysocjacyjnym
Rurka z nakrętką stożkowąThermoFisher02-681-344Probówka do homogenizacji tkanek
DNase ISigma Aldrich10104159001Składnik w buforze dysocjacyjnym
Blok Fc przeciwciało CD16/32Biolegend1013201:100
dysocjator genlteMACSMiltenyi Biotec130-093-235Porównanie trawienia płuc z dysocjatorem mechanicznym lub bez
probówki gentleMACS C MiltenyiBiotec130-093-237Probówka do dysocjacji tkanek z dysocjatorem genlteMACS
Inhibitor proteazy i fosfatazy HaltThermoFisher78442Składnik w buforze homogenizacyjnym Laserowy
monitor dopplerowskiMoorMOORVMS-LDFMonitorowanie przepływu krwi podczas tMCAO
Panel chemokiny prozapalnej LEGENDplexBiolegend740451Matryca koralików Multiplex
LIVE/DEAD naprawialna plama w bliskiej podczerwieniThermoFisherL34976Służy do wykluczania martwych komórek podczas analizy cytometrii przepływowej
Ly6C-PE, klon HK1.4Biolegend128008rozcieńczenie 1:800
Ly6G-BV510, klon 1A8Biolegend127633rozcieńczenie 1:200
Szew MCAO L56 wielokrotnego użytku 6-0 podłożeDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, klon M5/114.15.2Biolegend107636rozcieńczenie
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, klon PK136Biolegend108728rozcieńczenie 1:200
Siglec F-PE, klon E50-2440BD Biosciences552126rozcieńczenie 1:200
Nić do szycia jedwabiu, rozmiar 6/0Fine Science Tools18020-60
System anestezjologiczny tMCAO SomnoSuiteKent ScientificSS-01Znieczulenie myszy do tMCAO
TCRb-BV510, klon H57-897Biolegend109234Rozcieńczenie 1:200
Kulki cyrkonowe/krzemionkowe, 2,3 mmBiospec11079125zKoraliki do homogenizacji tkanek
niego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immune Cell AnalysisFlow CytometryLung Homogenate PreparationMultiplex Bead ArrayCytokine Chemokine DetectionIschemic Stroke ModelMiddle Cerebral Artery OcclusionAlveolar MacrophagesInterstitial MacrophagesDendritic Cells

Related Articles