Artykuł metodologiczny

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61360

⸱

16 lipca 2020

 ,  , 
1Division of Biological and Environmental Sciences and Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Division of Computer, Electrical and Mathematical Sciences and Engineering, King Abdullah University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Streszczenie

Nanomateriały magnetyczne cieszą się dużym zainteresowaniem w różnych zastosowaniach biomedycznych. Biofunkcjonalizacja tych nanomateriałów za pomocą specyficznych środków celujących jest kluczowym aspektem zwiększającym ich skuteczność w diagnostyce i leczeniu przy jednoczesnej minimalizacji skutków ubocznych. Zaletą nanomateriałów magnetycznych w porównaniu z nanomateriałami niemagnetycznymi jest ich zdolność do reagowania na pola magnetyczne w sposób bezkontaktowy i na duże odległości. Pozwala to na ich prowadzenie lub gromadzenie, a także na ich monitorowanie. Niedawno opracowano nanodruty magnetyczne (NW) o unikalnych właściwościach do zastosowań biomedycznych. Duży moment magnetyczny tych NW umożliwia efektywniejsze zdalne sterowanie ich ruchem za pomocą pola magnetycznego. Zostało to wykorzystane z dużym powodzeniem w leczeniu raka, dostarczaniu leków, śledzeniu komórek, różnicowaniu komórek macierzystych lub obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego. Ponadto wytwarzanie NW metodą osadzania elektrochemicznego wspomaganego matrycą zapewnia wszechstronną metodę ze ścisłą kontrolą właściwości NW. Szczególnie NW żelaza i tlenek żelaza (rdzeń-powłoka) NW nadają się do zastosowań biomedycznych, ze względu na ich wysokie namagnesowanie i niską toksyczność.

W tej pracy przedstawiamy metodę biofunkcjonalizacji żelaza/tlenku żelaza NW za pomocą specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko specyficznemu markerowi powierzchni komórki, który ulega nadekspresji w dużej liczbie komórek nowotworowych. Ponieważ metoda wykorzystuje właściwości powierzchni tlenku żelaza, ma również zastosowanie do superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza. NW są najpierw powlekane 3-aminopropylo-tri-etoksy-silanem (APTES) działającym jako łącznik, do którego przeciwciała są kowalencyjnie przyłączane. Powłoka APTES i biofunkcjonalizacja przeciwciał są udowodnione za pomocą spektroskopii strat energii elektronów (EELS) i pomiarów potencjału zeta. Ponadto antygenowość przeciwciał na NW jest badana za pomocą immunoprecypitacji i western blot. Specyficzne ukierunkowanie biofunkcjonalizowanych NW i ich biokompatybilność są badane za pomocą mikroskopii konfokalnej i testu żywotności komórek.

Wprowadzenie

Unikalną właściwością nanomateriałów magnetycznych jest ich zdolność do reagowania na pola magnetyczne1, co może być korzystnie wykorzystane do ich aktywacji na wiele sposobów, podczas gdy mogą być również monitorowane, na przykład, za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI). Stosując zmienne pole magnetyczne o wysokiej częstotliwości, mogą generować ciepło, które może wywołać hipertermię, zapewniając opcję terapeutyczną1. Innym podejściem jest obróbka fototermiczna, którą można przeprowadzić za pomocą lasera bliskiej podczerwieni (NIR)2,3.

Spośród dużej liczby nanomateriałów magnetycznych, tlenek żelaza zyskał największą uwagę w zastosowaniach biologicznych, takich jak separacja magnetyczna, hipertermia2,4, cell guidance5, drug delivery6,7,8, oraz jako środek kontrastowy w MRI9,10. Wynika to z ich wysokiej biokompatybilności11,12, duże namagnesowanie11,12, możliwość powlekania9,13,14,15, zdolność do przenoszenia narkotyków2,16, możliwość funkcjonalizacji za pomocą leków2,16 lub/i agentów celujących12,13,17,18, oraz zdolność do konwersji energii optycznej na ciepło2. Niedawno firma MagForce rozpoczęła badania kliniczne na pacjentach z rakiem przy użyciu nanocząsteczek tlenku żelaza do leczenia hipertermią19.

Ostatnio, magnetyczne nanoprzewody (NW) są coraz częściej wykorzystywane do zastosowań biomedycznych3,11,16,20,21,22. Mają podobne właściwości jak nanokulki magnetyczne, ale oferują anizotropowy kształt i bardzo duży moment magnetyczny, co umożliwia bardzo wydajne zdalne sterowanie za pomocą pola magnetycznego23,24, w tym uruchamianie o niskiej częstotliwości w celu wywołania efektów magnetomechanicznych25,26,27,28,29. W związku z tym, NW zostały wdrożone do różnych zastosowań biologicznych, takich jak izolacja egzosomów30 cell tracking21, leczenie raka3,11,16, drug delivery16,31,32, oraz jako środek kontrastowy MRI33.

Biofunkcjonalizowane nanomateriały magnetyczne o specyficznej zdolności do celowania w komórki mają ogromny potencjał do zastosowań biomedycznych i w medycynie precyzyjnej34,35. Aby przymocować te środki celujące, wymagana jest modyfikacja powierzchni nanomateriałów. Zazwyczaj potrzebują powłoki, która zapewnia grupę funkcyjną, która ułatwia mocowanie środków leczniczych. W literaturze istnieje duża liczba organicznych i nieorganicznych powłok nanomateriałów magnetycznych. W oparciu o grupę funkcyjną, która może zostać unieruchomiona przez nanomateriał, powłoki te można podzielić na cztery główne grupy: cząsteczki oparte na grupach kwasów karboksylowych, polimery, histydyna i cząsteczki oparte na grupach silanowych.

Cząsteczki oparte na grupach kwasów karboksylowych to jedna z metod modyfikacji powierzchni. Wykorzystuje wysokie powinowactwo
Między ujemną grupą kwasu karboksylowego na powłoce a dodatnim ładunkiem na nanomateriałach magnetycznych36,37,38. Proces wiązania kwasu karboksylowego z powierzchnią metalu może obejmować wytwarzanie soli karboksylowych metali lub adhezję grupy karboksylowej do metalu. Jednak w przypadku wielosegmentowych NW, takich jak żelazo/złoto lub nikiel/złoto NW, które mają doskonałe właściwości do zastosowań biologicznych39,40, ten rodzaj powłoki nie może być łatwo nałożony. Wymaga dwóch różnych powłok w tym samym czasie: grup tiolowych do modyfikacji segmentów złota i grup karboksylowych do segmentów magnetycznych (żelazo lub nikiel)38. Niektóre przykłady cząsteczek opartych na grupach karboksylowych to hematoporfiryna, kwas pimelowy, kwas palmitynowy i kwas 3-[(2-aminoetylo)ditiono] propionowy (AEDP)38. Modyfikacja powierzchni nanomateriałów magnetycznych z wykorzystaniem polimerów ma pewne wyraźne zalety. Ze względu na dużą masę cząsteczkową polimerów zwiększa stabilność nanomateriału magnetycznego w roztworze38. Spowoduje to jednak znaczne zwiększenie rozmiaru nanomateriału38. Poliwinylopirolidon (PVP), polietylenoimina (PEI), kwas asparaginowy arginina-glicyna-D (RGD) i glikol polietylenowy (PEG) to tylko niektóre przykłady najczęściej stosowanych polimerów do modyfikacji powierzchni. Każdy z nich ma swoje własne funkcje i używa38. Trzecią metodą modyfikacji powierzchni jest zastosowanie powłoki histydyny. Histydyna jest białkiem z łańcuchem bocznym aminokwasu histydyny, które ma wysokie powinowactwo do ograniczonej liczby nanomateriałów magnetycznych, takich jak nikiel38. Może być stosowany w procesach oczyszczania białek38,41,42. Powłokę histydynową można również nakładać na wielosegmentowe NW, takie jak nikiel/złoto NWs38. Silanizacja powierzchni nanomateriału jest dobrze znanym procesem38,43,44. Opiera się na atomie krzemu połączonym z dowolną powierzchnią tlenku metalu za pomocą trzech pojedynczych wiązań, a jednocześnie ten atom krzemu wiąże się z grupą funkcyjną na końcu za pomocą łańcucha alkilowego38,43,44. Zaletą tej powłoki jest dostarczanie wolnych grup aminowych i ma zdolność powlekania zarówno materiałów magnetycznych, jak i niemagnetycznych38,45, takich jak odpowiednio nikiel i złoto. Dlatego stosowanie cząsteczek opartych na grupie soli fizjologicznej jest praktyczną drogą biofunkcjonalizacji wielosegmentowych NW. Przykładami cząsteczek opartych na grupach silanowych są (3-aminopropylo) trietoksysilan (APTES) i (3-aminopropylo)trimetoksysilan (APTMS)38,45.

Dodanie środka celującego do powłoki może odegrać znaczącą rolę zarówno w diagnostyce, jak i leczeniu chorych komórek, a jednocześnie zminimalizować skutki uboczne dla zdrowych tkanek46,47. Dodanie czynnika celującego na powierzchni nanomateriałów wzmacnia zarówno selektywne wiązanie komórek, jak i internalizację poprzez receptory endocytozy7. Bez tych ligandów docelowych nanomateriały oddziałują niespecyficznie z błonami komórkowymi, które wiążą się z mniejszą szybkością w porównaniu z nanomateriałami z ligandami48. Jednym z wyzwań związanych z celowaniem w tkanki nowotworowe jest ich charakterystyczne podobieństwo do zdrowych tkanek. W związku z tym powodzenie targetowania zależy głównie od określenia odpowiedniego liganda do użycia jako cel biologiczny49,50. Zastosowano różne czynniki celujące, aby skierować nanomateriały do komórek nowotworowych48,51 (np. CD44, ze względu na jego wysoką ekspresję w komórkach rakowych w porównaniu ze zdrowymi komórkami52,53,54,55).

Czynniki celujące można podzielić na trzy główne grupy, w zależności od komponentów, z których są zbudowane i ich złożoności: celowanie oparte na aptamerach, celowanie oparte na ligandach i celowanie oparte na przeciwciałach. Aptamery to krótkie, chemicznie syntetyzowane nici DNA lub oligonukleotydów RNA, które są złożone w dwu- i trójwymiarowe struktury, dzięki czemu są zdolne do celowania w określony antygen, najczęściej białka56. Targetowanie oparte na ligandach obejmuje peptydy i krótkie łańcuchy aminokwasów57. Celowanie oparte na przeciwciałach polega na użyciu całego przeciwciała lub fragmentów przeciwciała, takich jak zmienne fragmenty jednołańcuchowe lub fragmenty wiążące antygen51. Zastosowanie tej metody ma tę zaletę, że posiada dwa miejsca wiązania o wysokim powinowactwie wiązania do specyficznego antygenu docelowego, co zapewnia mu niezwykle wysoką selektywność58. Miejsca wiązania są analogiczne do zamka, a antygen do key58.

W tej pracy, użyte NW zostały wytworzone przez elektroosadzanie na membranach z tlenku glinu, metoda opisana szczegółowo w poprzedniej publikacji59. Nacisk kładziony jest tutaj na uwolnienie tych NW tlenku żelaza (rdzeń-powłoka) z błon i biofunkcjonalizacja ich specyficznymi przeciwciałami, aby zapewnić zdolność celowania. Przeciwciała nie mogą wiązać się bezpośrednio z NW tlenku żelaza i żelaza i wymagają łącznika. Powlekanie NW APTES zapewnia wolne grupy aminowe, umożliwiając kowalencyjne przyłączanie przez grupę karboksylową na przeciwciałach (Rysunek 1). Zaletą powłoki APTES jest jej zdolność do pracy zarówno z materiałami magnetycznymi21, jak i niemagnetycznymi60, takimi jak żelazo/złoto lub nikiel/złoto NWs45. Wszystkie etapy powlekania i biofunkcjonalizacji wyjaśnione w tym protokole można ogólnie wykorzystać z dowolnym nanomateriałem żelaza/tlenku żelaza. Jako przykład użyto tutaj NW żelaza/tlenku żelaza. Wyniki pokazują, że funkcjonalizowane przeciwciałami NW mają wysoką antygenowość w stosunku do specyficznych receptorów powierzchniowych komórek, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań. Przykłady obejmują separację komórek, dostarczanie leków, leczenie specyficznymi komórkami nowotworowymi za pomocą zabiegów fototermicznych i/lub magnetomechanicznych.

Protokół

UWAGA: Zawsze sprawdzaj wszystkie istotne karty charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Stosuj wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami). Przeprowadzić wszystkie reakcje biologiczne w dygestoriach biologicznych.

UWAGA: Ten protokół ma na celu wyprodukowanie 2 x10 10 biofunkcjonalizowanych NWs/ml odpowiadających 0,36 mg żelaza/ml pokrytych przeciwciałami anty-CD44 o gęstości 3 x 104 przeciwciał/NW. NW żelazo-tlenek żelaza (rdzeń-powłoka) mają długość 2,5 μm i średnicę 41,5 nm.

1. Uwolnienie nanodrutów żelaznych

UWAGA: Proces wytwarzania żelaza/tlenku żelaza NW został szczegółowo opisany w poprzedniej publikacji59.

  1. Na macie do cięcia pokrój aluminiowe (Al) krążki (Rysunek 2A) na małe kawałki (Rysunek 2B) za pomocą pojedynczego ostrza krawędziowego i małego młotka, aby zmieściły się w probówce o pojemności 2 ml. Użyj pęsety, aby przenieść małe kawałki Al do tuby.
  2. Napełnij probówkę o pojemności 2 ml, zawierającą małe kawałki Al, 1 ml 1 M wodorotlenku sodu (NaOH). Upewnij się, że wszystkie kawałki Al są pokryte NaOH.
  3. Pozostaw roztwór działający przez 30 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz dygestorium chemicznego.
  4. Za pomocą pęsety usuń tylko kawałki Al i trzymaj uwolnione NW (czarne skupiska, Rysunek 3A) w roztworze NaOH przez dodatkowe 30 minut. Nie zmieniaj roztworu NaOH.
  5. Zbierz NWs, umieszczając probówkę o pojemności 2 ml w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty przed wyjęciem starego roztworu 1 M NaOH. Zastąp go świeżym roztworem NaOH.
  6. Sondować 2 ml probówkę zawierającą NW przez 30 s i pozostawić ją na 1 godzinę w dygestoriach chemicznych.
  7. Powtórz kroki 1.5-1.6 co najmniej cztery razy.
  8. Umyj NWs, umieszczając probówkę o pojemności 2 ml w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty.
  9. Wyrzucić roztwór NaOH i zastąpić go 1 ml absolutnego etanolu.
  10. Sonikuj rurkę przez 30 sekund.
  11. Umieść probówkę o pojemności 2 ml w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty.
  12. Wyrzuć stary roztwór etanolu absolutnego i zastąp go 1 ml świeżego etanolu absolutnego i sonikuj przez 30 s.
  13. Powtórz kroki 1.11 i 1.12 co najmniej cztery razy.
  14. Przechowuj NW w 1 ml bezwzględnego etanolu w temperaturze pokojowej, aż będą potrzebne.
  15. Zmierz stężenie żelaza, a tym samym NW, za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Jednak w przypadku długotrwałego przechowywania nie należy zwalniać NW z szablonu Al, dopóki nie będą potrzebne. Utrzymywanie uwolnionych NW wytrącających się w etanolu przez długi czas bez częstej sonikacji stworzy agregacje, które będą wymagały dłuższych czasów sonikacji, aby zostały oddzielone.

2. Powlekanie nanodrutów APTES

UWAGA: W tym protokole 100 μL roztworu APTES (gęstość 0,946 g/mL61) wystarcza do pokrycia 1,6 x 107 m2/g NWs. W przypadku zmiany proporcji lub masy nanomateriału należy odpowiednio dostosować objętość APTES.

  1. Przenieś NW z kroku 1.14 do szklanej probówki o pojemności 5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  2. Aby zebrać resztki NW w probówce o pojemności 2 ml, należy dwukrotnie umyć pustą probówkę o pojemności 2 ml, dodając 1 ml bezwzględnego etanolu i przenieść ją do szklanej probówki o pojemności 5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  3. Za pomocą pipety pobrać 100 μl APTES i dodać go bezpośrednio do roztworu NW.
  4. Wiruj szklaną probówkę o pojemności 5 ml przez 10 sekund.
  5. Wyreguluj szklaną probówkę o pojemności 5 ml na zacisku laboratoryjnego stojaka na retortę.
  6. Umieść połowę szklanej probówki o pojemności 5 ml w wodzie łaźni ultradźwiękowej i sonikuj przez 1 godzinę.
  7. Wyjąć szklaną probówkę o pojemności 5 ml z łaźni ultradźwiękowej i dodać 400 μl wody dejonizowanej (DI), a następnie 20 μl 1 M NaOH (kataliza zasadowa).
    UWAGA: Ważne jest, aby najpierw dodać wodę DI.
  8. Wyreguluj szklaną probówkę o pojemności 5 ml, jak wyjaśniono w krokach 2.5-2.6, i poddaj się sonikacji przez kolejną 1 godzinę.
  9. Wyjmij szklaną probówkę o pojemności 5 ml z kąpieli ultradźwiękowej.
  10. Umieść magnes obok szklanej rurki na 5 minut, aby zebrać NW.
  11. Zastąp supernatant 1 ml świeżego absolutnego etanolu i poddaj sonikacji przez 10 s.
  12. Powtórz kroki 2.10-2.11 cztery razy.
  13. Przenieś cały zawieszony etanol NW do nowej szklanej probówki o pojemności 5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    UWAGA: NW z powłoką APTES można przechowywać w szklanej probówce z etanolem, dopóki nie będą potrzebne. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Biofunkcjonalizacja nanodrutów

  1. Aktywacja przeciwciał
    UWAGA: Aby uzyskać około 3 x 104 części przeciwciała/NW, użyj 30 μl przeciwciała (1 mg/ml) na 0,1 mg żelaza.
    1. W probówce o pojemności 2 ml rozpuścić 0,4 mg 3-3-dimetylo-aminopropylokarbodimidu (EDC) i 1,1 mg sulfo-N-hydroksysulfosukcynimidu (Sulfo-NHS) w 1 ml hydratu kwasu 2-N-morfolinoetanosulfonowego (MES) (pH 4,7).
      UWAGA: Mieszanina EDC/sulfo-NHS powinna być świeża i przygotowana przed użyciem.
    2. Do nowej probówki o pojemności 2 ml dodać odpowiednio 30 μl przeciwciała anty-CD44 (1 mg/ml), 960 μl 0,1 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS, pH 7) i 10 μl mieszaniny EDC/sulfo-NHS (przygotowanej w kroku 3.1.1).
    3. Umieścić probówkę o pojemności 2 ml w wytrząsarce o pojemności 10 x g na 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotowanie nanodrutów powlekanych APTES
    1. Podczas 15-minutowej inkubacji w kroku 3.1.3 umyj NWs, umieszczając magnes obok rurki NWs pokrytej APTES (z kroku 2.13) na 2 minuty w celu zebrania NWs.
    2. Wyrzuć etanol i zastąp go 1 ml 0,1 M PBS (pH 7), a następnie poddaj sonikacji przez 10 s.
    3. Powtórz kroki 3.2.1-3.2.2 cztery razy.
    4. Zbierz NWs, jak wyjaśniono w kroku 3.2.1, i wyrzuć 0,1 M PBS. Utrzymuj NW w tubie bez żadnego roztworu.
  3. Przyłączenie przeciwciał
    1. Przenieść cały aktywowany roztwór przeciwciała (przygotowany w kroku 3.1.3) do probówki NWs (przygotowanej w 3.2.4) i sonikować przez 10 s.
    2. Umieścić szklaną rurkę w rotatorze na noc w temperaturze 4 °C.
    3. Zebrać NW za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i wyrzucić supernatant.
    4. Dodanie 1 ml 2% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zablokowania reakcji.
    5. Sprawdź antygenowość NW funkcjonalizowanych przeciwciałami, na przykład za pomocą testów immunoprecypitacji (IP) i western blot (WB).
      UWAGA: Aby uzyskać lepsze wyniki, należy użyć biofunkcjonalizowanych NW w teście IP, WB lub teście biokompatybilności natychmiast po etapie blokowania.

4. Test biokompatybilności

UWAGA: Do badania biokompatybilności NW można zastosować różne testy żywotności komórek i różne linie komórkowe. Stężenie NW użyte tutaj jest oparte na poprzedniej publikacji16. Wysiew komórek należy wykonać dzień przed biofunkcjonalizacją NW.

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki powinny być wykonane pod szafką bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Na 96-dołkowej płytce wysiewaj dziewięć dołków z 4 x 104 komórek raka jelita grubego (linia komórkowa HCT116) zawieszonych w pożywce do hodowli komórkowych McCoya (100 μl / dołek) i umieść je w inkubatorze na noc w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2).
  2. Przemyć NW (z kroku 3.3.4) PBS, zbierając je za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i zastąpić stary roztwór 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Powtórz ten krok trzy razy.
  3. Umyj NW (z kroku 4.2) podgrzaną pożywką McCoya, zbierając je za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i zastąp stary PBS 1 ml podgrzanej pożywki McCoya. Powtórz ten krok trzy razy.
  4. Zbieranie NW (z kroku 4.3) za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i zastąp 1 ml podgrzanej pożywki McCoya 900 μl podgrzanej pożywki McCoya. Stężenie NW powinno wynosić 0,02 mg NW na ml.
  5. Przenieść 96-dołkową płytkę (z kroku 4.1) z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.
  6. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego wyrzuć stare pożywki z komórek i zastąp je 100 μl zawieszonych NW (przygotowanych w kroku 4.4).
  7. Wstrząsnąć płytką (przygotowaną w kroku 4.6) ręcznie, a następnie inkubować ją przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Następnego dnia wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę (przygotowaną w kroku 4.7). Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego dodać 11 μl odczynnika do żywotności komórek (tabela materiałów) do każdej studzienki za pomocą pipety wielościennej.
  9. Potrząsać płytką wytrząsarką z prędkością 10 x g przez 10 s.
  10. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze.
  11. Wyjąć 96-dołkową płytkę (przygotowaną w kroku 4.10) z inkubatora. Odczytać płytkę w czytniku mikropłytek (tabela materiałów), mierząc absorbancję odczynnika żywotności komórek (wzbudzenie 540 nm, emisja 590 nm).

Wyniki

Ważne jest, aby pociąć aluminiowe (Al) dyski (Rysunek 2A) na małe kawałki (Rysunek 2B), aby zmieściły się w używanej probówce. Po dodaniu 1 M NaOH do kawałków Al powinna natychmiast rozpocząć się reakcja, co objawia się powstawaniem pęcherzyków. Jeśli w ciągu 1 min nie zajdzie reakcja lub jeśli reakcja przebiega bardzo gwałtownie i roztwór staje się całkowicie mętny z białą chmurą, należy natychmiast usunąć zużyty roztwór NaOH i zastąpić go świeżym roztworem. Należy sprawdzić wartość pH roztworu NaOH; powinno ona wynosić pH>12. Gdy NW zostaną uwolnione z kawałków Al w ciągu pierwszych 30 min w obecności NaOH, NW (czarne skupiska, Rysunek 3A) będą unosić się w roztworze NaOH. W ostatnim etapie uwalniania NW roztwór powinien być jednorodny. Nie powinny występować żadne skupiska NW (Rysunek 3B). Jeśli NW zostały zebrane magnesem przez 3 min, roztwór powinien być klarowny, a osad NW powinien mieć kolor czarny (Rysunek 3C). Jeśli osad jest szary, należy wyrzucić probówkę i rozpocząć procedurę ponownie z nową próbką Al.

Podczas procesu uwalniania NW tworzy się naturalna warstwa tlenku żelaza o grubości około 5 nm, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami11,16,20. Warstwa tlenkowa ta ma istotny wpływ na biokompatybilność16, funkcjonalizację16,18 oraz właściwości magnetyczne20 NW. Jednakże pozostawienie NW w matrycy (tj. rezygnacja z ich uwalniania) do momentu ich użycia zapobiegnie wpływowi czynników środowiskowych. Średnica i długość NW po procesie uwalniania wynosiły odpowiednio 2,5 µm i 41,5 nm. Masę pojedynczego NW można obliczyć zgodnie z wyjaśnieniami w Tabeli 1, co zostało potwierdzone za pomocą spektrometrii mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS). W tym przypadku każdy dysk z tlenku glinu zawierał około 0,3 mg żelaza.

Aby zmniejszyć agregację nanodrutów (NWs) po ich uwolnieniu i umożliwić dalszą funkcjonalizację, NWs zostały pokryte APTES. Powłoka ta zapewnia wolne grupy aminowe i posiada zdolność do pokrywania zarówno materiałów magnetycznych, jak i niemagnetycznych39,45, co czyni ją odpowiednią do pokrywania wielosegmentowych NWs, takich jak nanodruty żelazowo-złote. Podczas pokrywania nanodrutów należy skupić się na dwóch kwestiach. Po pierwsze, należy obliczyć potrzebną objętość cząsteczek APTES62 na podstawie powierzchni właściwej i masy NWs. Obliczenia te przedstawiono w tabeli 2. Po drugie, nanodruty należy utrzymywać w ciągłym ruchu, aby zapobiec ich aglomeracji oraz blokowaniu dostępu do niektórych części powierzchni NWs podczas nakładania powłoki APTES. Na przykład w niniejszym protokole nanodruty inkubowano odpowiednio w kąpieli ultradźwiękowej oraz na rotatorze podczas pokrywania APTES i funkcjonalizacji przeciwciałami. Każda cząsteczka APTES zawiera atom krzemu i końcową funkcjonalną grupę aminową21. W związku z tym mapy spektroskopii strat energii elektronów (EELS) mogą zostać wykorzystane do potwierdzenia obecności powłoki APTES poprzez wykazanie atomów krzemu (kolor różowy) na powierzchni NWs (rycina 4A). W przeciwieństwie do nich, niepokryte NWs wykazują atomy żelaza w kolorze ciemnoniebieskim (rycina 4B) oraz mieszaninę atomów żelaza i tlenu w kolorze jasnoniebieskim (rycina 4B). Odpowiadające im mapowanie EELS niepokrytych NWs (rycina 4C,4D) wykazuje wyższą intensywność żelaza w stosunku do tlenu w centrum (rycina 4C) niż na powierzchni (rycina 4D), co wskazuje na strukturę żelazo-tlenek żelaza (rdzeń-powłoka). Na podstawie mapowania EELS (rycina 4C,4D) zidentyfikowano, że warstwa tlenku żelaza na NWs to w większym stopniu Fe3O4 niż Fe2O3, co jest zgodne z poprzednią publikacją20.

Antygoniczność przyłączonych przeciwciał można potwierdzić za pomocą analiz IP i WB, w których prążek jest widoczny w próbce pozytywnej, ale nie w kontrolach negatywnych (Rycina 5). Należy pamiętać, że aby zaobserwować wyraźny prążek, nie należy używać mniej niż 0,1 mg NWs/10 x 106 komórki. Metoda BCA (Lista materiałów) w połączeniu z niektórymi obliczeniami przedstawionymi w Tabela 3 wykorzystano do ilościowego oznaczenia liczby przeciwciał na NW.

Ponadto pomiar potencjału zeta został wykorzystany do wyjaśnienia funkcjonalizacji powierzchni. Końcowa grupa aminowa w APTES zredukowała ładunek ujemny niepowlekanych NW, co przedstawiono na Rysunku 6. NW funkcjonalizowane przeciwciałami również wykazały zmianę ładunku w porównaniu do NW powlekanych APTES (Rysunek 6). Wszystkie pomiary potencjału zeta przeprowadzono przy pH 7.

Specyficzną celowalność komórkową nanowłókien (NWs) funkcjonalizowanych przeciwciałami można potwierdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rysunek 7). Biokompatybilność każdego nowego nanomateriału powinna zostać przetestowana przed rozpoczęciem jakiejkolwiek aplikacji. W związku z tym przeprowadzono test żywotności komórek, który potwierdził, że NWs niepowlekane, powlekane APTES oraz powlekane przeciwciałami są biokompatybilne nawet w wysokim stężeniu (Rysunek 8).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający metodę powlekania i biofunkcjonalizacji nanowłókien. (A) Powlekanie żelaznych NW APTES. (B) Aktywacja przeciwciał przy użyciu EDC + Sulfo-NHS, aby w rezultacie otrzymać (C) nanowłókno funkcjonalizowane przeciwciałami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Aluminiowa tarcza z osadzonym żelazem. (A) Tarcza aluminiowa przed wycinaniem. (B) Czerwone linie wskazują miejsca wycięcia tarczy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Etapy uwalniania nanowłókien. (A) Agregaty nanowłókien unoszące się w roztworze NaOH. Obraz wykonano 10 min po dodaniu NaOH i po usunięciu membrany Al. (B) Nanowłókna zawieszone w etanolu. Zdjęcie wykonano w ostatnim etapie uwalniania, bezpośrednio po sonikacji. (C) Czarny osad nanowłókien zebrany za pomocą magnesu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Mapa spektroskopii strat energii elektronów (EELS). (A) Nanodrut pokryty APTES (APTES-NW). Kolory niebieski i różowy reprezentują odpowiednio atomy żelaza i krzemu. (B) Nanodrut niepokryty (NW). Kolory ciemnoniebieski i jasnoniebieski reprezentują odpowiednio mapowanie żelaza oraz mieszaniny żelaza i tlenu. Odpowiednie mapowanie EELS (C) rdzenia oraz (D) otoczki niepokrytych NW. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Potwierdzenie funkcjonalizacji i aktywności nanowires sprzężonych z przeciwciałami. Antygenowość CD44-NWs została potwierdzona przy użyciu immunoprecypitacji (IP) i western blotu (WB). +Ve: oznacza kontrolę pozytywną (pełny lizat komórkowy). -Ve: oznacza kontrolę negatywną (wyłącznie niepowlekane NW). – CD44 cells: oznacza komórki, które nie wykazują ekspresji antygenu CD44; + CD44 cells: oznacza komórki raka jelita grubego wykazujące ekspresję antygenu CD44. Jest to reprezentatywny obraz z n = 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Wartości potencjału zeta dla NW, APTES-NW i przeciwciał. Słupki przedstawiają średnią ± błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Obrazy z mikroskopu konfokalnego pokazujące specyficzne celowanie. Przedstawiono przyleganie CD44-NWs (A i C), podczas gdy Isotype-NWs (kontrola negatywna) nie przylegały (B i D). Kolory czerwony, niebieski i zielony reprezentują odpowiednio błonę komórkową, jądro oraz skupiska CD44-NWs. A i B są odpowiednio obrazami w polu jasnym dla C i D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Badanie żywotności komórek raka jelita grubego (HCT116) inkubowanych z różnymi formulacjami nanodrutów. Komórki poddano działaniu NWs po 24h inkubacji, a następnie inkubowano je z NWs przez kolejne 24h. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Słupki reprezentują średnią ± błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

ParametrWartośćJednostka
Długość nanodrutu (NW) z Fe (h)2.6µm
Promień (średnica/2) (r)0.01679231µm
Gęstość Fe (D)7.87g/cm3
Objętość 1 NW z Fe (V)= π r^2h2.30E-15cm3
Masa 1 NW z Fe = V x D1.80E-08µg
Powierzchnia właściwa 1 NW z Fe = 2π r^2 + 2πrh2.76E-01µm22.8E+05nm2

Tabela 1: Obliczanie masy nanodrutów żelaznych.

ParametrWartośćJednostka
Gęstość APTES/100 µL*9,50E-01g
Masa cząsteczkowa (MW) APTES2,21E+02g/mol
Liczba moli APTES = masa/MW4,29E-03mol
Liczba cząsteczek APTES/100 µL**2,57E+21cząsteczki
wielkość APTES ***5,00E-01nm
powierzchnia właściwa APTES2,00E-01nm2
powierzchnia właściwa NW2,76E+05nm2
Liczba NW w 0,3 mg NW1,70E+10NWs
Liczba cząsteczek APTES potrzebna do utworzenia jednej warstwy wokół NW1,38E+06cząsteczka APTES
Liczba cząsteczek APTES potrzebna dla 0,3 mg NWs2,35E+16cząsteczka APTES
*Numer referencyjny 61
** Liczba cząsteczek = Liczba moli * liczba Avogadra (6E+23)
***Numer referencyjny 62
****Z Tabeli 1

Tabela 2: Obliczanie liczby cząsteczek APTES wymaganych do powlekania NWs.

 przeciwciało IgG w kształcie litery YNW
Masa jednego przeciwciała2,3E-13 µg1,8E-08 µg*
Powierzchnia właściwa jednego przeciwciała23 nm22,6E+05 nm2
Na podstawie testu BCA0,3 mg na 1 mg
Liczba cząsteczek przeciwciała i NW w 0,3 mg przeciwciała na mg NW~1E+15 przeciwciał ** na ~5,6E+10 NWs
Liczba cząsteczek przeciwciał na NW~2E+04 przeciwciał na 1 NW***
*Obliczone na podstawie tabeli 1
Liczbę przeciwciał w 0,3 mg obliczono, dzieląc liczbę przeciwciał uzyskaną z testu BSA (0,3 mg) przez średnią masę cząsteczkową przeciwciał IgG w kształcie litery Y (180 kDa = 3E-16 mg).
Biorąc pod uwagę powierzchnię jednej cząsteczki przeciwciał IgG w kształcie litery Y (~23 nm2) oraz powierzchnię jednego NW (~2,6E+05 nm2), około 1E+04 przeciwciał byłoby wystarczające do utworzenia monowarstwy na NW. W naszym przypadku gęstość przeciwciał była dwukrotnie wyższa od spodziewanej ilości. Może to być związane z powłoką APTES, która zapewnia więcej grup funkcyjnych, co umożliwia silne przyłączenie przeciwciał. Taka sytuacja gwarantuje, że NW jest w pełni pokryte przeciwciałami, a prawdopodobieństwo związania przeciwciała z antygenem powierzchniowym komórki, niezależnie od orientacji NW, będzie wysokie. Jednakże, jeśli gęstość przeciwciał będzie niższa od spodziewanej liczby (1E+04 cząsteczek przeciwciała), szansa na związanie komórki z NW będzie mniejsza.

Tabela 3: Obliczenie liczby przeciwciał na nanodrucie.

Dyskusja

Podobnie jak w przypadku każdej metody wytwarzania i powlekania nanomateriałów, wymagana jest wysoka jakość stosowanych rozwiązań. Roztwory uwalniające (1 M NaOH) i funkcjonalizujące (MES) mogą być wielokrotnie wykorzystywane. Jednak sprawdzenie ich wartości pH przed rozpoczęciem nowego procesu jest bardzo ważne. Na etapie uwalniania płukanie NW NaOH należy przeprowadzić co najmniej cztery razy. Im lepsze mycie, tym lepsza stabilność NW i tym mniej są one zagregowane. Warstwa tlenku zwiększa stabilność NW po zanurzeniu w etanolu lub wodzie63.

Średnica i długość NW uległy zmianie po pokryciu ich APTES i przeciwciałami. W tym przypadku średnica wzrosła z 41,5 nm do 70 nm, a długość zmniejszyła się z 2,5 μm do 1,6 μm, ze względu na etapy sonikacji, które łamią NW. Dlatego ważne jest, aby scharakteryzować morfologię NW po etapie biofunkcjonalizacji.

Przyłączenie przeciwciał do NW opiera się na oddziaływaniu kowalencyjnym między grupą aminową (na APTES) a grupą karboksylową (na przeciwciałie). Dlatego potwierdzenie obecności powłoki APTES jest ważnym krokiem, do którego zastosowaliśmy mapowanie EELS. Metoda powlekania jest bezpieczna i prosta. Nie potrzebuje wysokich temperatur ani długiego czasu inkubacji. Powłoka APTES działa również jako łącznik, aby umożliwić kowalencyjne przyłączanie innych przeciwciał lub białek, które mają grupę karboksylową.

W przypadku biofunkcjonalizacji NW za pomocą przeciwciała może to mieć wpływ na antygenowość miejsc wiązania przeciwciał po procesie biofunkcjonalizacji. Do zbadania tego problemu można użyć metody IP i WB. Zastosowanie metody biofunkcjonalizacji wymienionej w tym protokole pozwoli przeciwciałom związać się z NW o wysokiej antygenowości do określonego receptora komórkowego. Co więcej, biofunkcjonalizacja NW za pomocą przeciwciał dodała zdolność do celowania w komórki za pomocą interesującego receptora, CD44. Zostało to potwierdzone mikroskopią konfokalną. Chociaż biokompatybilność niepowlekanych NW była wysoka (>95%), dodanie powłoki APTES lub przeciwciał do NW zwiększyło ich biokompatybilność o 100%.

Co więcej, protokół powlekania i biofunkcjonalizacji jest wydajny, ekonomiczny i powtarzalny. Powinna ona mieć zastosowanie do każdego innego nanomateriału żelaza-tlenku żelaza, przy czym stężenie zarówno powłoki, jak i przyłączonych przeciwciał powinno być zoptymalizowane w oparciu o powierzchnię i masę nanomateriału. Protokół ten można bezpiecznie wykonać w warunkach otoczenia w laboratorium ogólnym. Biofunkcjonalizacja znacznie poprawiła biokompatybilność nanomateriałów i ich zdolność do celowania. Ogólnie rzecz biorąc, NW są niezwykle obiecującymi materiałami do zastosowań nanomedycznych (w tym zabiegów multimodalnych lub kombinatorycznych, wykrywania lub naprowadzania komórek oraz wykrywania biologicznego). W połączeniu z biofunkcjonalizacją, jak opisano tutaj, można osiągnąć specyficzne ukierunkowanie na komórki w celu zwiększenia precyzji i skuteczności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha (KAUST).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 2 ml (mikrowirówka zatrzaskowa)Eppendorf, Fisherscientific05-402-7
2-N-Morfolino EtaneKwas sulfonowy hydrat 99% (MES)Thermscientific AC172590250Stężenie 0,1 m i pH 4,7
3-3-dimetylo-aminopropylokarbodimid (EDC)ThermofisherPG82079
3-amino-tri-etoksy-silan (APTES)Sigma Aldrich
Szklana probówka 5 mlFisherscientific03-339-22C
Płytka 96-dołkowa (płaska denna)Sigma AldrichCLS3595
Przeciwciało anty-CD44BD Biosciences550990Klon 515, stężenie 1 mg / ml
APTES ((3-aminopropylo)trietoksysilan), 99%Sigma Aldrich919-30-2Stężenie 99%
Test BCA (Pierce Zestaw do oznaczania białek BCA)Thermofisher23225
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Aldrich9048-46-8Stężenie 35%
Inkubator komórkowyThermofisher50116047
Odczynnik żywotności komórekAlamarBlue,ThermofisherDAL1025
Komórki raka jelita grubego - linia komórkowa HCT116ATCC430641
MłotekMożna użyć dowolnego narzędzia młotkowego, nie ma konkretnej marki.
Spektrometr masowy z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)Perkin ElmerELAN 9000 ICP-MSUżywane oprogramowanie to "Sesja kontroli przyrządu Elan"
Laboratoryjny stojak retortowy z zaciskiemRVFM13-0140Służy do obsługi szklanej rurki o pojemności 5 ml w kąpieli sonikatora.
Stojak magnetyczny (DynaMag-2 Magnet)Thermofisher12321D
McCoy' s 5A Medium 1xGibco16600082
(spektrofotometr absorbancji Bio-Rad xMark)Oprogramowanie Bio-Rad1681150Microplate Manager 6 (#168-9520)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10xGibco14200067Stężenie 0,1 M (bez wapnia, bez magnezu)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xGibco14190136Stężenie 0,01 M (bez różniczkowania, bez magnezu)
Wytrząsarka płytkowa (Microplate Genie)Przemysł naukowy (Genie)SI-0400
Żyletki jednoostrzowePolysciences08410-1
Wodorek sodu (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2Stężenie 1 M, pH 13
Sulfo-N-hydroksysulfosukcynimid (sulfo-NHS)Thermofisher106627-54-7
TrypsynaATCC30-2101
Obracacz rurVWR10136-084
Wytrząsarka do rur (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL)Eppendorf, Fisherscientific05-400-204
Kąpiel ultradźwiękowa (2510)Branson2489502
919302 do drewna liściastego Czytnik mikropłytek

Bibliografia

  1. Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
  2. Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
  3. Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
  4. Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
  5. Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
  6. Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7(2018).
  7. Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103(2016).
  8. Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
  9. Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
  10. Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
  11. Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141(2015).
  12. Perez, J. E., et al. Cytotoxicity. , IntechOpen. Ch. 12 (2018).
  13. Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
  14. Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
  15. Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
  16. Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786(2016).
  17. Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
  18. Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
  19. Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742(2017).
  20. Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189(2016).
  21. Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4(2016).
  22. Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
  23. Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101(2012).
  24. Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111(2019).
  25. Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306(2009).
  26. Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
  27. Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
  28. Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
  29. Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
  30. Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
  31. Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
  32. Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
  33. Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
  34. Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
  35. Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. Applications of Nanomaterials. , Elsevier. 345-389 (2018).
  36. Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
  37. Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
  38. Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45(2018).
  39. Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1(2019).
  40. Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
  41. Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
  42. Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
  43. Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
  44. Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
  45. Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
  46. Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
  47. Kumar, C. S. Magnetic nanomaterials. , John Wiley & Sons. (2009).
  48. Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
  49. Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
  50. Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410(2018).
  51. Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
  52. Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849(2013).
  53. Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
  54. Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286(2016).
  55. Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
  56. Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L. Post-SELEX optimization of aptamers. Analytical Bioanalytical Chemistry. 408 (17), 4567-4573 (2016).
  57. Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
  58. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, Garland Pub. New York. (2001).
  59. Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111(2019).
  60. Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
  61. Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en®ion=SA (2020).
  62. Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
  63. Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika biofunkcjonalizacjinanodruty elaznesprz ganie przeciwciapow oka APTESspektroskopia strat energii elektron wpomiar potencja u zetamikroskopia konfokalnatest ywotno ci kom rekimmunoblotting po immunoprecypitacji

Powiązane artykuły