Artykuł metodologiczny

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61363

⸱

13 maja 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Lehigh University

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Drosophila służy jako użyteczny model do oceny struktury i funkcji synaps związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi. Podczas gdy wiele prac koncentrowało się na połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u larw Drosophila, ocenie integralności synaptycznej u dorosłych Drosophila poświęcono znacznie mniej uwagi. Tutaj przedstawiamy prostą metodę rozwarstwiania grzbietowych mięśni podłużnych (DLM), które są wymagane do zdolności lotu. Oprócz lotu jako odczytu behawioralnego, ta sekcja pozwala zarówno synapsom DLM, jak i tkance mięśniowej na analizę strukturalną przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał dla markerów synaptycznych lub białek będących przedmiotem zainteresowania. Protokół ten pozwala na ocenę integralności strukturalnej synaps u dorosłych Drosophila podczas starzenia się w celu modelowania postępującego, zależnego od wieku charakteru większości chorób neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

Dysfunkcja synaps jest jedną z najwcześniejszych znanych cech charakterystycznych większości głównych chorób neurodegeneracyjnych1,2,3,4,5,6. Jednak bardzo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób te strukturalne i funkcjonalne zaburzenia odnoszą się do późniejszych etapów postępu choroby. Drosophila okazała się użytecznym systemem modelowym do zrozumienia wzrostu i rozwoju synaps przy użyciu larwalnych NMJs7,8,9. Jednak trzecie stadium rozwoju larwalnego trwa tylko kilka dni, co ogranicza ich użyteczność w badaniu postępującej, zależnej od wieku neurodegeneracji. Alternatywą dla oceny larwalnych NMJ jest zbadanie struktur synaptycznych u dorosłych Drosophila, takich jak synapsy utworzone na grzbietowych mięśniach podłużnych (DLM), które są wymagane do lotu10,11,12,13,14,15,16. Te trójdzielne synapsy są strukturalnie zorganizowane w podobny sposób jak synapsy ssaków17, co zapewnia unikalną przewagę w ocenie modeli chorób neurodegeneracyjnych.

Tutaj opisujemy prostą metodę analizy integralności strukturalnej dorosłych NMJ w modelu neurodegeneracji Drosophila. Poprzednie metody i badania preparacyjne DLM podkreślały znaczenie zachowania tkanki mięśniowej dla różnych zastosowań18,19,20,21,22,23. Nasz protokół zapewnia kompleksową metodę zachowania zarówno tkanki neuronalnej, jak i mięśniowej w celu zbadania chorób neurodegeneracyjnych. Innym ważnym elementem badania tych chorób jest zdolność do zrozumienia utraty neuronów w sposób zależny od wieku. Poprzednia praca zapewnia krytyczne i dogłębne zrozumienie, w jaki sposób NMJ DLM powstają podczas metamorfozy we wczesną dorosłość11,12,14,15,16,24. Nasz protokół ustanawia metodę, która ma opierać się na tej pracy w celu zbadania DLM NMJ w sposób zależny od wieku w starzeniu się i chorobach neurodegeneracyjnych.

Protokół

1. Generacja transgenicznych much

  1. Aby wygenerować muchy transgeniczne do tego eksperymentu, zbierz OK371-Gal425 dziewiczych samic much i samców UAS-TDP-43M337V 26 (Rysunek 1A) poprzez znieczulenie much za pomocą CO2 na podkładce do sortowania.
  2. Sortuj znieczulone muchy do fiolek ze standardową pożywką Drosophila do krzyżowania. Umieścić oznaczone fiolki w temperaturze 25 °C, aby pojawiło się następne pokolenie.
    UWAGA: Usuń dorosłe osobniki z fiolek przed pojawieniem się potomstwa, aby zapewnić prawidłowy genotyp.
  3. Po pojawieniu się potomstwa zbierz transgeniczne muchy do fiolek i posortuj według płci, aby rozpocząć starzenie się w warunkach eksperymentalnych.
  4. Po zebraniu much należy co 2 dni przenosić je do świeżego pokarmu, aż muchy osiągną wiek 21 dni.

2. Przygotowanie do sekcji

  1. Aby przygotować się do sekcji, należy zaopatrzyć się w sól fizjologiczną buforowaną fosforanami w temperaturze pokojowej (1x PBS), 10-centymetrowe naczynie preparacyjne pokryte elastomerem silikonowym, nożyczki preparacyjne o prostych krawędziach, jeden zestaw kleszczy preparacyjnych, pipetę P200 i końcówki do pipet, probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml, standardowe nożyczki biurowe, 70% etanolu, 6 cm szalkę Petriego i 32% formaldehyd rozcieńczony do 4% za pomocą 1x PBS.
  2. Oznacz probówki dla każdego genotypu lub stanu i dodaj 900 μl 1x PBS (temp. pokojowa) i 150 μl 32% formaldehydu do każdej probówki. Podczas przygotowywania utrwalacza 4% formaldehydu należy nosić rękawice i okulary ochronne.
  3. Znieczulić 6-10 much na grupę bezpośrednio z fiolki za pomocą CO2 i zanurzyć muchy w 6 cm szalce Petriego z 70% etanolem. Wciśnij muchy w etanol za pomocą pędzla, aby upewnić się, że próbki są całkowicie zanurzone. Spowoduje to usunięcie warstwy oleju z zewnętrznego naskórka.

3. Izolacja i unieruchomienie klatki piersiowej

  1. Przed wypreparowaniem każdej próbki dodaj około 7\u201210 ml 1x PBS do naczynia preparacyjnego pokrytego elastomerem silikonowym. Objętość ta powinna zapewnić, że próbki tkanek są całkowicie zanurzone.
  2. Przenieś jedną muchę do naczynia preparacyjnego z 70% etanolu za pomocą kleszczy i chwytając za skrzydła lub nogi.
  3. Skoncentruj próbkę w naczyniu preparacyjnym pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie zanurz próbkę w 1x PBS i ostrożnie usuń skrzydełka za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5.
  4. Za pomocą nożyczek do rozwarstwiania sprężyn Vannas z prostą krawędzią usuń nogi, tworząc małe nacięcie po brzusznej stronie naskórka. W kroku 3.8 to nacięcie pozwoli formaldehydowi wniknąć w tkankę.
  5. Weź nożyczki w jedną rękę i przytrzymaj kleszcze w drugiej, aby ustawić muchę brzuszną stroną do góry. Przytrzymując próbkę na miejscu kleszczami, usuń głowę i brzuch nożyczkami preparacyjnymi.
  6. Przenieś izolowaną klatkę piersiową za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety do oznaczonej probówki, zaczynając od kroku 3.2.
    UWAGA: Ustaw pipetę na 40 μl, aby uniknąć dodawania dodatkowego 1x PBS do utrwalacza.
  7. Powtórz kroki 3.2\u20123.6 powyżej dla każdej próbki.
  8. Utrwalaj próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Usuń poprawkę za pomocą pipety Pasteura i wyrzuć ją do odpowiedniego pojemnika na odpady pod wyciągiem. Przepłukać próbki trzykrotnie 1,5 ml 1x PBS każda za pomocą pipety Pasteura. Zakończ czwarte płukanie, używając tylko 750 μl i pozostaw chusteczki w 1x PBS.
    UWAGA: W tym momencie próbki tkanek mogą pozostawać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni przed przejściem do kolejnych kroków.

4. Błyskawiczne zamrażanie i bisekcja klatki piersiowej

  1. Przed rozpoczęciem bisekcji napełnij kolbę Dewara ciekłym azotem, zakładając odpowiednie rękawice krioochronne i okulary ochronne. Zaopatrz się w łamacz ostrzy, ostrza do piór, jedną parę drobnych kleszczy, lód, lodowaty 1x PBS i pęsetę kriogeniczną.
  2. Przygotuj wiaderko na lód, aby 1x PBS był lodowaty w chłodzie.
  3. Użyj łamacza ostrzy, aby chwycić ostrze pióra pod kątem i zegnij ostrze, aby odłamać mały kawałek. Łamacz ostrzy może następnie zablokować ostrze w pozycji, która może być używana jako mały skalpel.
    UWAGA: Jedno ostrze powinno wystarczyć na wszystkie grupy. Przełącz, jeśli ostrze pęknie lub stanie się.
  4. Dodaj czystą końcówkę pipety do P200 i usuń 1/5 końcówki, aby przetransportować próbki.
  5. Przygotuj nową probówkę do mikrowirówki dla każdej grupy i dodaj 200 μl 1x PBS do każdej probówki. Ta druga probówka zostanie użyta do zebrania końcowych preparatów DLM.
  6. Usuń wszystkie 1x PBS z probówek za pomocą pipety Pasteura.
  7. Zakładając odpowiedni sprzęt ochronny, zanurz rurkę w kolbie z ciekłym azotem na 10 s za pomocą pęsety kriogenicznej.
    UWAGA: Rurki powinny być szczelnie zamknięte, aby rurka nie eksplodowała.
  8. Wyjmij probówkę z ciekłego azotu i dodaj około 300 μl lodowatego 1x PBS do próbek za pomocą pipety Pasteura. Próbki należy przechowywać na lodzie.
  9. Dodaj lodowaty 1x PBS do 10-centymetrowego naczynia preparacyjnego pokrytego elastomerem silikonowym i dozuj pierwszą klatkę piersiową zmodyfikowaną pipetą o pojemności 200 μl.
  10. Umieść klatkę piersiową brzuszną stroną do góry. W jednej ręce użyj pary kleszczy, aby ustawić klatkę piersiową, aw drugiej użyj cienkiej pary kleszczy, aby usunąć część zwoju piersiowego, aby odsłonić linię środkową klatki piersiowej.
  11. Użyj linii środkowej klatki piersiowej jako prowadnicy, aby wykonać płytkie cięcie przez 1/3 klatki piersiowej za pomocą ostrza.
  12. Zdejmij ostrze z klatki piersiowej i ustaw klatkę piersiową pod kątem 45° za pomocą kleszczy. Włóż ponownie ostrze i przetnij prosto linię środkową klatki piersiowej. Spowoduje to powstanie dwóch półkrwi.
  13. Weź jeden hemitorax na raz i usuń nadmiar tkanki pod włóknem mięśniowym DLM F (Ryc. 1B), najbardziej brzusznym włóknem. Użyj ostrza, aby ostrożnie wykonać jedno lub dwa cięcia, aby usunąć nadmiar tkanki bez uszkadzania DLM.
  14. Po odizolowaniu przenieś hemitoraks do właściwej probówki z 1x PBS.
  15. Powtarzaj kroki 4.6\u20124.14, aż zostanie wykonanych 10 wypreparowanych półraków w grupie.

5. Barwienie strukturalne

  1. Po przecięciu próbki klatki piersiowej należy umieścić tkankę w buforze blokującym (1x PBS z 0,1% normalną surowicą kozią i 0,2% Triton X-100 o pH 7,4), aby przeniknąć przez tkankę i zapobiec niespecyficznemu barwieniu. Użyj pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar 1x PBS i dodaj 1,5 ml buforu blokującego do każdej probówki. Blokować tkanki przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować próbki do barwienia strukturalnego przy użyciu fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała, peroksydazy chrzanowej 488 (anty-HRP-488) w rozcieńczeniu 1:200 i falloidyny-647 w rozcieńczeniu 1:1000 w buforze blokującym do barwienia neuronów ruchowych i tkanki mięśniowej, odpowiednio. Zrób tyle plamy, aby mieć 150 μl na probówkę. Przechowywać plamę w temperaturze 4 °C, przykrytą folią lub w ciemnym pudełku, aż będzie gotowa do barwienia.
  3. Po zablokowaniu usunąć nadmiar buforu blokującego za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  4. Przed dozowaniem bejcy strukturalnej należy ją wymieszać. Dodaj 150 μl plamy do każdej tubki. Umieścić próbki w ciemnym pudełku na rotatorze w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
  5. Usuń plamę i umyj chusteczki cztery razy w 1,5 ml o temperaturze pokojowej 1x PBS z 0,3% Triton X-100 przez 5 minut na rotatorze w ciemnym pudełku. Próbki są teraz gotowe do zamontowania na szkiełku.

6. Tkanka montażowa

  1. Po umyciu próbek w PBST należy przygotować szkiełko mikroskopowe w celu zamontowania tkanki do barwienia. Przygotuj dodatkowe materiały, w tym szklane szkiełka nakrywkowe, pipetę P200, końcówki do pipet 200 μl, nożyczki, przezroczyste wzmocnienia, kleszczyki o prostych krawędziach, fluorescencyjne media montażowe zapobiegające blaknięciu, lakier do paznokci i ciemne pudełko do zakrycia szkiełek.
  2. Oznacz szkiełko, aby zidentyfikować próbki i wyczyść szkiełko chusteczkami nasuniętymi, aby upewnić się, że nie ma smug.
  3. Aby upewnić się, że próbki hemithorax nie zostaną uszkodzone przez szkiełko nakrywkowe, zbuduj "most" za pomocą etykiet wzmacniających. Weź jedną etykietę wzmacniającą, przetnij ją na pół i umieść każdą połówkę w odległości około 15 mm od siebie. Odległość ta musi być mniejsza niż szerokość szkiełka nakrywkowego. Powtórz ten krok cztery razy, aby ukończyć "most" o wysokości 5 etykiet.
  4. Weź pipetę P200 i zmodyfikuj końcówkę, odcinając 1/5 końcówki, aby przenieść próbki do szkiełka. Próbki należy przenieść na szkiełko znajdujące się pośrodku mostu.
  5. Weź krawędź chusteczki laboratoryjnej i usuń nadmiar PBST. Za pomocą kleszczy ułóż DLM tak, aby wszystkie próbki były skierowane mięśniowo do góry, a naskórek do dołu.
  6. Za pomocą standardowej końcówki do pipet P200 nanieś 70 μl podłoża montażowego na szkiełko, unikając pęcherzyków powietrza. Dozuj media w okrągły wzór wewnątrz wzmocnień, zaczynając od zewnątrz do środka.
  7. Umieść szkiełko nakrywkowe na wzmocnieniach.
  8. Użyj lakieru do paznokci, aby pokryć zewnętrzne krawędzie na obwodzie szkiełka nakrywkowego. Nakładaj obficie, aby uzyskać całkowite uszczelnienie tkanki.
  9. Umieść szkiełko na płaskiej powierzchni w ciemności, pozostawiając co najmniej 10 minut do wyschnięcia i zapobiegając fotowybielaniu lub utracie fluorescencji. Preparaty mogą być teraz natychmiast używane do obrazowania lub w inny sposób przechowywane w folderze slajdów w temperaturze -20 °C w celu późniejszego przeglądania.

7. Alternatywa: Barwienie pierwszorzędowymi przeciwciałami

UWAGA: Ta sekcja jest opcjonalna i powinna być używana bezpośrednio między sekcjami 4 i 5, jeśli jest to pożądane.

  1. Aby wybarwić tkankę przeciwciałami pierwszorzędowymi, należy zanurzyć tkankę w buforze blokującym na co najmniej 1 godzinę.
  2. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe z odpowiednim rozcieńczeniem w buforze blokującym. Przygotuj co najmniej tyle mieszaniny przeciwciał, aby miała 150 μl na grupę. Należy pamiętać, że próbki są nieruchome. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
  3. Usuń nadmiar buforu blokującego za pomocą pipety Pasteura. Krótko zawirować pierwszorzędowe przeciwciało i dodać 150 μl mieszaniny przeciwciał do każdej grupy i umieścić próbki w temperaturze 4 °C na noc.
  4. Następnego dnia należy usunąć przeciwciało pierwotne i przemyć tkankę 4 razy PBST przez 5 minut na rotatorze.
  5. Przygotować wtórną plamę w buforze blokującym. Dodaj wtórną plamę do próbki, a następnie utrzymuj ją w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemnym pudełku na rotatorze.
    UWAGA: Barwienie wtórne może również obejmować HRP i falloidynę.
  6. Po 2 godzinnej inkubacji, aby usunąć wtórną plamę, przemyj chusteczkę 4 razy przez 5 minut PBST i przystąp do montażu.

Wyniki

Generowanie much transgenicznych wykazujących ekspresję zmutowanego ludzkiego białka wiążącego TAR o masie 43 kDa (TDP-43M337V) przedstawiono na schemacie (Rycina 1A). Demonstruje to zastosowanie binarnego systemu Gal4/UAS u Drosophila27. Ilustracja przedstawia hemitoraks z sześcioma włóknami mięśniowymi, A‒F, idącymi od włókna najbardziej grzbietowego A do najbardziej brzusznego F (Rycina 1B)11,12. Aby ocenić integralność synaptyczną, złącza nerwowo-mięśniowe (NMJs) zabarwiono HRP i faloidyną (Rycina 1C‒E). Neurony ruchowe u mutantów TDP-43M337V (Rycina 1F) wykazują słabe lub brak zabarwienia HRP do 21. dnia, podczas gdy w grupie WT (Oregon-R) pozostają one nienaruszone (Rycina 1C). Nie stwierdzono widocznych różnic w zabarwieniu mięśni (Rycina 1D,G). Zmiany w morfologii ogólnej zaobserwowane u mutantów TDP-43M337V demonstrują, w jaki sposób integralność synaptyczna może być zaangażowana w model choroby neurodegeneracyjnej stwardnienia bocznego zanikowego (ALS) z wykorzystaniem modelu dorosłego mięśnia DLM. Oprócz zabarwienia strukturalnego, barwienie NMJs w DLM może również dostarczyć oceny integralności synaptycznej za pomocą markerów presynaptycznych (Rycina 2A‒R) i postsynaptycznych (Rycina 2S‒X). Wspólnie wyniki te ilustrują, w jaki sposób ten protokół sekcji może zostać zastosowany do badania tkanki DLM w chorobach neurodegeneracyjnych.

Kluczowym aspektem tej sekcji jest zastosowanie ciekłego azotu w celu błyskawicznego zamrożenia tkanki, co ułatwia jej rozdzielenie. Użyteczność ciekłego azotu wykazano na przykładach much WT, w których po zastosowaniu ciekłego azotu tkanka mięśniowa nie wykazuje uszkodzeń ani nacięć włókien (Rysunek 3A‒C). Bez użycia ciekłego azotu sekcja tkanki może być trudniejsza. Na przykład postępowanie zgodnie z protokołem z pominięciem etapu błyskawicznego zamrażania w ciekłym azocie sprawia, że tkanka jest bardziej podatna na uszkodzenia narzędziami sekcyjnymi, co objawia się np. uszkodzeniem neuronów (Rysunek 3D) lub uszkodzeniem włókien mięśniowych (Rysunek 3E). Zastosowanie ciekłego azotu pomaga zapobiegać uszkodzeniom tkanki, które mogą wystąpić podczas pracy z tkanką DLM, niezależnie od genotypu preparatu (Rysunek 3C i 3F).

Schemat krzyżówki genetycznej, mikroskopia fluorescencyjna neuronów, analiza struktury mięśni Drosophila.
Rycina 1: Postępująca denerwacja synaps DLM w modelu ALS u Drosophila. (A) Na schemacie przedstawiono generowanie transgenicznych much ALS wykazujących ludzką zmutowaną formę białka wiążącego TAR o masie 43 kDa (TDP-43). (B) Ilustracja przedstawia kształt i orientację półtoraksu u dorosłej Drosophila. Stosując opisany protokół, możemy obserwować postępującą utratę integralności synaptycznej synaps DLM NMJ poprzez barwienie strukturalne neuronów ruchowych HRP (zielony) i tkanki mięśniowej faloidyną (magenta). Nasz model obrazuje utratę integralności synaptycznej w dorosłym modelu ALS poprzez wygenerowanie dorosłych much wykazujących mutant ludzkiego TDP-43M337V w neuronach ruchowych (Rycina 1F‒H) w porównaniu do much WT (Rycina 1C‒E) w włóknie mięśniowym C. Strzałki wskazują przykłady synapsy WT (Rycina 1C) oraz przykład utraty integralności synaptycznej. Pasek skali = 20 µm przy powiększeniu 63x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Lokalizacja białek neuronalnych, markery HRP i Synapsina, schemat mikroskopii fluorescencyjnej.
Rycina 2: Ocena integralności synaptycznej z wykorzystaniem markerów presynaptycznych w dorosłych złączach nerwowo-mięśniowych (NMJ). Integralność synaptyczną można również ocenić za pomocą markerów presynaptycznych i postsynaptycznych u 14-dniowych much WT w włóknie mięśniowym C. Markery presynaptyczne Synapsina (B), Syntaxyna (H) oraz Bruchpilot (BRP) (N) są barwione wspólnie z HRP (A, G, M). Barwienie obrazuje lokalizację tych markerów w terminalach presynaptycznych (C, I, O). Przy większym powiększeniu obrazy bardziej szczegółowo ilustrują lokalizację Synapsiny (E), Syntaxyny (K) i BRP (Q) wraz z HRP (D, J oraz P) (Rycina F, L oraz R). Przedstawiono również postsynaptyczny marker receptor glutaminianu III (GluRIII) (T) barwiony wspólnie z HRP (S). Podwójne barwienie wykazuje przydatność tych markerów (U). Przy większym powiększeniu reprezentatywne obrazy egzemplifikują lokalizację (X) GluRIII (W) oraz HRP (V) odpowiednio w postsynaptycznej tkance mięśniowej i w terminalach presynaptycznych. Pasek skali dla paneli A‒C, G-I, M‒O, S‒U odpowiada 20 µm przy powiększeniu 63x. Pasek skali dla paneli D‒F, 2J-2L, 2P-2R oraz 2V-2X odpowiada 10 µm przy powiększeniu 63x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe tkanki nerwowej z użyciem barwienia HRP i faloidyną, połączone wyniki fluorescencji.
Rysunek 3: Przydatność ciekłego azotu w sekcjach DLM. Aby wykazać przydatność ciekłego azotu w sekcjach DLM, przedstawiamy porównanie 21-dniowych much WT z użyciem i bez użycia ciekłego azotu dla włókna mięśniowego C. Przy zastosowaniu ciekłego azotu faloidyna (B) pozostaje nienaruszona i nie wpływa negatywnie na barwienie HRP (A, C). Bez ciekłego azotu tkanka mięśniowa staje się włóknista i trudna do przecięcia (E), a barwienie HRP (D, F) ulega pogorszeniu z powodu błędu technicznego. Białe strzałki wskazują obszar bez uszkodzeń mięśni przy zastosowaniu ciekłego azotu (B) oraz uszkodzoną tkankę mięśniową (E). Pasek skali = 20 µm przy powiększeniu 63x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Korzystając z metod opisanych w tym protokole, zapewniamy proste podejście do sekcji tkanki DLM i pokazujemy, w jaki sposób można je zastosować do oceny integralności synaptycznej poprzez barwienie strukturalne i markery synaptyczne u dorosłych Drosophila. Jednym z krytycznych kroków w protokole, który ułatwia wypreparowanie tkanki DLM, jest błyskawiczne zamrażanie ciekłym azotem. Bez tego kroku tkanka jest mniej twarda i trudniejsza do precyzyjnego cięcia, jak zaobserwowano na rysunku 3. Protokół ten opiera się na poprzednich metodach preparacji, aby umożliwić zachowanie zarówno neuronów ruchowych, jak i tkanki mięśniowej 18,19,20,21,22,23. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że podczas wykonywania cięcia linii środkowej do bisekcji, może być trudno uzyskać dwa czyste preparaty na klatkę piersiową. Jednym ze sposobów, aby zapewnić co najmniej jedną hemitoraks na muchę, możesz celowo odciąć się na jedną stronę klatki piersiowej, aby uzyskać jedno czyste przygotowanie. Dzięki tej modyfikacji może być również konieczne usunięcie dodatkowego nadmiaru tkanki z nacięcia, aby oczyścić próbkę za pomocą łamacza ostrzy. Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej technice, wraz z ciągłą praktyką, dokładność bisekcji wzrośnie.

Opisana tutaj metoda pozwala naukowcom łatwo ocenić integralność strukturalną dorosłych DLM NMJ w dowolnym momencie ich życia. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość dostępu do integralności synaptycznej w modelach chorób neurodegeneracyjnych za pomocą markerów synaptycznych. Pokazujemy, że ta aplikacja może pomóc w wizualizacji zmian w morfologii ogólnej za pomocą barwienia strukturalnego (Rysunek 1C\u2012H). Dodatkowo integralność synaptyczną można ocenić za pomocą barwienia markerów presynaptycznych, w tym między innymi synapsyny28 (ryc. 2A\u2012F), syntaksyny29 (ryc. 2G\u2012L) i BRP30 (ryc. 2M\u2012R). Postsynaptyczna tkanka mięśniowa może być również oceniana za pomocą przeciwciała podjednostkowego receptora glutaminianuIII 31 (ryc. 2S\u2012X), co świadczy o użyteczności tego protokołu.

Naukowcy mogą również wykorzystać tę metodę preparacji do uzupełnienia danych funkcjonalnych w celu kompleksowego zbadania integralności strukturalnej synaps związanych z wieloma różnymi chorobami. Synapsy te pozwalają również na analizę funkcjonalną poprzez zapisy elektrofizjologiczne 32,33,34 i test lotu 10. Protokół ten może również zapewnić łatwy dostęp do tkanki w wielu zastosowaniach i testach. Przyszłe badania, na przykład, mogą wykorzystać ten protokół do ilościowego określenia zmian synaptycznych poprzez kwantyfikację gęstości i liczby synaps15,16. Podczas gdy opisany tutaj protokół w szczególności bada integralność synaptyczną neuronów ruchowych, uzupełniające protokoły oceny utraty komórek mięśniowych można również wykonać z tą sekcją przy użyciu barwienia TUNEL35. Aby zbadać utratę neuronów, można również zastosować rozwarstwienie zwoju piersiowego36 z barwieniem TUNEL. Spodziewamy się, że opisana tutaj sekcja będzie miała więcej zastosowań w przyszłych badaniach oceniających patologie związane z wiekiem, a także choroby neurodegeneracyjne.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01 NS110727) dla D.T.B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
32% FormaldehydMikroskopia elektronowa Nauki15714Konserwacja tkanek
Alexa Fluor 568 koza anty myszyFisher ScientificA11031Etykiety przeciwciała pierwotne. Stosowany w stężeniu 1:200.
Alexa Fluor 568 koza anty królikFisher ScientificA11036Etykiety przeciwciał pierwotnych. Stosowany w stężeniu 1:200.
anty-Bruchpilot (BRP)Badania rozwojowe Hybridoma BankNC82Barwiąc strefy aktywne w neuronach presynaptycznych. Stosowany w stężeniu 1:25.
anty-GluRIIIPrezent od Aarona DiAntonioN/AEtykietuje podjednostki receptora glutaminianu. Stosowany w stężeniu 1:1000.
anty-SynapsinDevelopmental Studies Hybridoma Bank3C11Znakuje synapsynę białka synaptycznego. Stosowany w stężeniu 1:50.
przeciwciało anty-SyntaxinDevelopmental Studies Hybridoma Bank8C3znakuje syntaksynę białek synaptycznych. Stosowany w stężeniu 1:10.
BenchRockerGenesee Scientific31-302Obracanie próbek podczas barwienia
Blade BreakerFine Science Tools10053-09Służy do przytrzymywania
szkiełek osłonowychFisher Scientific12548ADo montażu rękawic
kriogenicznychdo tkanek VWR97008-198ochrona rąk przed
kriogenicznym azotemVWR82027-432Trzymaj probówkę 2,0 ml w kolbie Dewara z ciekłym
mlThomas Scientific5028M54Trzymaj ciekły azot
Ostrza z piórMikroskopia elektronowa Nauki72002-01Ostrza skalpela
Fine Forecps x 2Fine Science Tools11252-20Jedna drobna para do oczyszczania linii środkowej klatki piersiowej. Drugą parę można stępić za pomocą kamienia do ostrzenia.
Sprzężone z FITC anty HRPJackson Laboratories123-545-021Plami neurony ruchowe. Używany w zamrażarce o stężeniu 1:100
()Fisher Scientific14100FChroni próbki przed
pipetami Pasteura z jasnego szkłaVWR14637-010Służy do przenoszenia próbek
szkiełka podstawoweFisher Scientific 12550143Do montażu nośników do mocowania tkanek
(vectashield) zapobiegających blaknięciuVWR101098-042Nośniki montażowe fluorescencyjny lakier do paznokci sygnalizacyjny
Mikroskopia elektronowa Sciences72180Uszczelki szkiełka mikroskopowe normalna
surowica koziaFisher ScientificPCN5000Zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał
pędzel malarskiGenesee Scientific59-204Przenoszenie much
PBSFisher Scientific10-010-023Roztwór soli fizjologicznej do preparowania i barwienie
falloidyny 647AbcamAB176759Barwie F-aktynę w tkance mięśniowej. Stosowany w stężeniu 1:1000
plastikowa szalka Petriego (100 mm)VWR25373-100naczynie rozwarstwiające
W.B. MasonAVE05722Zapewnia podparcie dla szkiełka nakrywkowego na zamontowanym
bloku do ostrzeniaGrainger1RDF5Utrzymywanie ostrości cienkich kleszczyków, a także tępienie
teczki na suwakiVWR10126-326Próbka przechowywanie
standardowe nożyczki biuroweW.B. MasonACM40618Etykiety wzmacniające do cięcia
Sylgard 184Mikroskopia elektronowa Nauki24236-10Powłoka do naczynia preparacyjnego
Triton-X-100Mikroskopia elektronowa Nauki22140Pomaga przenikać tkanki
Vannas Disssection SissorsFine Science Tools1500-00Służy do usuwania odnóży muchowych i wykonywania nacięcia na klatce piersiowej
przeciwciało przeciwciało przeciwciało ostrza z piór azotem-1900 Etykiety wzmacniające tkanek dla oddzielnych par

Bibliografia

  1. Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS. Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).
  2. Lodato, M. A., et al. Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons. Science. 359, 555-559 (2018).
  3. López-Erauskin, J., et al. ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS. Neuron. 100, 816-830 (2018).
  4. Munsie, L., et al. Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N. Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).
  5. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Aβ and synaptic dysfunction. Neuron. 39, 409-421 (2003).
  6. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science. 298, 789-791 (2002).
  7. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).
  8. Jan, L., Jan, Y. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).
  9. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
  10. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. , e51223(2014).
  11. Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
  12. Fernandes, J., VijayRaghavan, K. The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster. Development. 118, 215-227 (1993).
  13. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
  14. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila. Development. 125, 1769-1779 (1998).
  15. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila. Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).
  16. Hebbar, S., Fernandes, J. J. A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila. Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).
  17. Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. A tripartite synapse model in Drosophila. PloS One. 6, (2011).
  18. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).
  19. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of Visualized Experiments. , e2438(2010).
  20. Llamusi, B., et al. BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Disease Models & Mechanisms. 6, 184-196 (2013).
  21. Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila. Development. 140, 136-146 (2013).
  22. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464, 287-291 (2010).
  23. Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance. Frontiers in Physiology. 6, 116(2015).
  24. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila. Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).
  25. Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).
  26. Ritson, G. P., et al. TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97. Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  28. Klagges, B. R., et al. Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila. Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).
  29. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).
  30. Wagh, D. A., et al. a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
  31. Marrus, S. B., DiAntonio, A. Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release. Current Biology. 14, 924-931 (2004).
  32. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e2412(2011).
  33. Maccioni, R., et al. Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS. Scientific Reports. 8, 16002(2018).
  34. Siddiqi, O., Benzer, S. Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).
  35. Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation. Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).
  36. O'Sullivan, A., et al. Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight. Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Degeneracja synaptyczna u Drosophilaanaliza z cza nerwowo mi niowegogrzbietowy mi sie pod u nyocena integralno ci synaptycznejanaliza mikroskopii konfokalnejfluorescencyjne barwienie przeciwcia amiprotok sekcji tkanekb yskawiczne zamra anie w ciek ym azociemodel choroby neurodegeneracyjnejocena synaps zale na od wieku
Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.