Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61364

⸱

10 maja 2020

 , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Streszczenie

Ruchliwość jest kluczowa dla przetrwania i sukcesu wielu gatunków bakterii. Istnieje wiele metodologii wykorzystujących ruchliwość w celu zrozumienia szlaków sygnałowych, wyjaśnienia funkcji i montażu części wiciowych oraz zbadania i zrozumienia wzorców ruchu. W tym miejscu przedstawiamy kombinację trzech z tych metodologii. Ruchliwość w miękkim agarze jest najstarsza, oferując silną selekcję do izolowania mutacji supresorowych wzmocnienia funkcji w szczepach o upośledzonej ruchliwości, w których ruchliwość jest przywracana przez drugą mutację. Technika wiązania komórek, po raz pierwszy zastosowana w celu zademonstrowania obrotowego charakteru silnika wiciowego, może być wykorzystana do oceny wpływu efektorów sygnalizacyjnych na prędkość silnika i jego zdolność do zmiany kierunku obrotów. Test "przekraczania granic" jest nowszy, w którym pływające bakterie mogą być przygotowane do przejścia do poruszania się zbiorowo jako rój. W połączeniu, protokoły te reprezentują systematyczne i skuteczne podejście do identyfikacji elementów maszynerii ruchliwości oraz do scharakteryzowania ich roli w różnych aspektach pływania i roju. Można je łatwo przystosować do badania ruchliwości u innych gatunków bakterii.

Wprowadzenie

Bakterie wykorzystują wiele wyrostków do przemieszczania się i rozprzestrzeniania w swoich niszach ekologicznych1. Ruchliwość sterowana wiciami jest najszybszą z nich, promując kolonizację korzystnych miejsc w odpowiedzi na sygnały środowiskowe i znacząco przyczyniając się do zdolności patogennych niektórych gatunków2,3. Bakterie wiciowe mogą pływać pojedynczo w płynie lub roić się jako kolektyw po półstałej powierzchni4. Wici zewnątrzkomórkowe przyczepiają się do silników obrotowych osadzonych w membranie i są przez nie napędzane, które wykorzystują moc gradientów jonów do generowania momentu obrotowego, który powoduje rotację1,2,4,5,6,7,8. W E. coli, którego silniki pracują ze stałym momentem obrotowym9, moc wyjściową silnika można podzielić pod względem prędkości obrotowej i przełączania wirnika między kierunkiem przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (CCW) i zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW). Rotacja CCW sprzyja tworzeniu się spójnej wiązki wiciowej, która popycha komórkę do przodu (bieg), podczas gdy przejściowe przełączanie kierunku rotacji (CW) powoduje częściowy lub całkowity rozkład wiązki10, a komórka zmienia kierunek pływania (tumble). E. coli zazwyczaj biegną przez sekundę i przewracają się przez jedną dziesiątą sekundy. Częstotliwość przełączania wirnika lub "odchylenie wirowania" jest kontrolowane przez system sygnalizacji chemotaksji, w którym transbłonowe chemoreceptory wykrywają zewnętrzne sygnały chemiczne i przesyłają je za pośrednictwem fosfoprzekaźnika do silnika wiciowego w celu przedłużenia przebiegów w odpowiedzi na atraktanty lub stłumienia ich w odpowiedzi na toksyczne chemikalia11,12. Ruchliwość pływania jest oznaczana w 0,3% miękkim agarze .

Podczas roju, bakterie poruszają się po półstałej powierzchni jako gęsty kolektyw, gdzie stada bakterii przepływają ciągłym ruchem wirowym2,13,14,15. Roje E. coli wykazują zmienioną fizjologię chemosensoryczną (mniejsze odchylenie opadania), wyższe prędkości i wyższą tolerancję na środki przeciwdrobnoustrojowe w komórkach pływających w płynie luzem16,17. Roje różnią się między sobą stosowaniem mnóstwa strategii, które wspomagają ruch, w tym produkcji środków powierzchniowo czynnych, hiperbiczowania i wydłużania komórek2. Rój daje bakteriom przewagę konkurencyjną zarówno w środowisku ekologicznym, jak i klinicznym18,19,20. Istnieją dwie kategorie bakterii rojowych: roje umiarkowane, które mogą roić się tylko na pożywkach zestalonych z 0,5-0,8% agarem, oraz silne roje, które mogą poruszać się po wyższych stężeniach agaru21.

Istnieje wiele testów do badania motoryki pływania i jej regulacji. W przypadku upośledzenia przez mutacje lub warunki środowiskowe, ruchliwość sama w sobie oferuje silną selekcję do identyfikacji mutacji supresorowych wzmocnienia funkcji. Te tłumiki mogą być prawdziwymi rewertantami oryginalnej mutacji lub pseudo-rewertanami, w których druga mutacja przywraca funkcjonalność. Takie mutanty można zidentyfikować za pomocą sekwencjonowania całego genomu (WGS). Alternatywą dla bezstronnej selekcji supresorów jest tendencyjna strategia mutagenezy celowanej (np. mutageneza PCR). Metodologie te często rzucają światło na funkcję lub regulację środowiskową aparatu motorycznego. Jeśli celem jest badanie funkcji motorycznych, to przywrócenie motoryki typu dzikiego mierzonej w miękkim agarze niekoniecznie musi wskazywać na przywrócenie mocy motorycznej typu dzikiego. Test wiązania komórek, w którym komórki są przymocowane do szklanej powierzchni za pomocą pojedynczej wici, a następnie monitorowana jest rotacja ciała komórki, może być pierwszym testem z wyboru do oceny zachowania motorycznego. Chociaż obecnie dostępne są bardziej wyrafinowane metodologie monitorowania właściwości silnika, wymagana konfiguracja szybkiej kamery i zastosowanie pakietów oprogramowania do analizy ruchu ograniczają ich powszechne stosowanie22,23,24,25. Test wiązania komórek wymaga jedynie ścinania wici, co pozwala na przymocowanie krótkich włókien do szkiełka szkiełkowego, a następnie nagranie obrotu ciała komórki. Chociaż zarejestrowane prędkości motoryczne są niskie w tym teście ze względu na duże obciążenie, jakie ciało komórki wywiera na wić, test ten przyczynił się jednak do cennych spostrzeżeń na temat reakcji chemotaktycznych26,27,28,29 i pozostaje ważnym narzędziem śledczym, jak omówiono poniżej.

Ruchliwość roju stanowi inny zestaw wyzwań dla badaczy. Wybór tłumików wzmocnienia funkcji działa tylko w rojach, które produkują dużo środków powierzchniowo czynnych i łatwo się roją13. Nieproducenci środków powierzchniowo czynnych, takich jak E. coli, są wybredni pod względem wyboru agaru, składu podłoża i wilgotności otoczenia2,13,14,21. Po ustaleniu warunków roju, test przekraczania granicy17 jest przydatną metodologią do badania zdolności roju do poruszania się w nowych/trudnych warunkach. Chociaż przedstawione poniżej protokoły odnoszą się do E. coli, można je łatwo przystosować do stosowania u innych gatunków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja mutantów supresorowych w szczepach z niedoborem ruchliwości

UWAGA: Użyj tej metody jako szerokiego "uniwersalnego określenia" do określenia ogólnej natury wady ruchliwości.

  1. Przygotowanie płytki z miękkim agarem
    UWAGA: Soft-agar, określany również jako agar motoryczno-pływacki lub pływacki, to agar o niskiej zawartości procentowej (~0,2-0,35% w/v), od dawna używany do oznaczania chemotaksji31,32.
    1. Dodać 3 g bakto-agaru (0,3% w/v) i 20 g LB do kolby okrągłodennej o pojemności 2 l. Dodać 1 l ddH2O (wody podwójnie destylowanej) do kolby i równomiernie wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej.
    2. Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.
    3. Pozostawić do ostygnięcia, delikatnie mieszając, używając pręta/płytki jak powyżej. Gdy temperatura osiągnie około 50 °C, wlać 25 ml do sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić stopiony agar z założoną pokrywką na co najmniej 1 godzinę, do użycia w ciągu 16 godzin.
  2. Przygotowanie hodowli, inokulacja i izolacja mutantów supresorowych
    UWAGA: E. coli zaszczepione w środku pożywki bogatej w składniki odżywcze zestalonej miękkim agarem zużywają składniki odżywcze lokalnie, tworząc gradient składników odżywczych, za którym podążają. Gdy przemieszczają się na zewnątrz, pojawiają się zdefiniowane "pierścienie" (Rysunek 1A), które są związane z określonymi chemoatraktantami, na które reagują bakterie. Wady systemu chemotaksji lub elementów strukturalnych silnika wici mogą pogorszyć wydajność tego testu. Często mutanty z przewagą ruchliwości pojawiają się podczas badań przesiewowych i można je zobaczyć wyłaniające się z jednego lub z wielu punktów na obwodzie pierścienia, skąd "rozbłyskują" (Ryc. 1C). Można zauważyć, że najbardziej zewnętrzna krawędź frontu pływackiego łatwo kontrastuje z nieskolonizowanym dziewiczym miękkim agarem.
    1. Hoduj przez noc kultury pożądanego szczepu z niedoborem ruchliwości w 5 ml bulionu Lennox (LB; 10 g/L tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/L NaCl, tabela materiałów) w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem poziomym (220 obr./min). Następnego dnia subkultura (rozcieńczenie 1:100) w świeżym LB, rosnąca w tych samych warunkach do fazy wykładniczej (OD600 0,6).
    2. Zaszczepić 6 μl kultury w środku miękkiej płytki agarowej (1.1) za pomocą pipety, wciskając obciążoną sterylną końcówkę do agaru, aby delikatnie usunąć zawartość. Przenieść do temperatury 30 °C i inkubować (Rysunek 1B), aż pojawią się "rozbłyski" ruchliwości, emanujące z punktu inokulacji lub obrzeża pierścieni ruchliwości, zwykle w ciągu 24-36 godzin (Rysunek 1C).
      UWAGA: W testach ruchliwości zaszczepić szczep typu dzikiego wraz ze zmutowanymi izolatami dla porównania. Ten dziki szczep pokaże charakterystyczne koncentryczne pierścienie chemotaktyczne (Rysunek 1A) i wypełni płytkę w ciągu 8-10 godzin.
    3. Użyj sterylnej pętli drucianej, aby podnieść komórki z obszaru "rozbłysku" i smugi, aby oczyścić pojedyncze kolonie na twardą płytkę agarową LB (LB przygotowaną jak powyżej, zestaloną z 15 g / l bakto-agarem).
    4. Wybierz pojedyncze kolonie z płytki smugowej za pomocą sterylnej pętli drucianej i ponownie oczyść, tworząc smugi dla pojedynczych kolonii, aby zapewnić izolację "czystego" izolatu kolonii.
  3. Potwierdzenie i charakterystyka mutantów supresorowych
    1. Upewnij się, że izolowany mutant supresorowy (mutanty) przywrócił ruchliwość. Przygotować płytki z miękkim agarem (1.1) i kultury dla szczepów będących przedmiotem zainteresowania (jak w 1.2.1), w tym szczepu typu dzikiego i szczepu wyjściowego z "niedoborem ruchliwości" dla porównania.
    2. Zaszczepić płytki (jak w ppkt 1.2.2) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 8-10 godzin.
    3. Zapisz średnicę najbardziej zewnętrznego pierścienia (krawędzi okręgu) i porównaj, aby ustalić, które z izolatów znacznie przywróciły ruchliwość.
      UWAGA: Zaleca się, aby płyty były fotografowane przez cały czas trwania eksperymentu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj urządzenia "wiadro światła"30, gdzie kamera cyfrowa jest zamontowana nad źródłem światła dla lepszego oświetlenia, aby zmierzyć średnicę kolonii pływackiej i odróżnić ją od nieskolonizowanego agaru.
    4. Tester zweryfikował izolacje WGS zgodnie z wymaganiami, co pozwoliło na wystarczające "pokrycie sekwencji", aby pozytywnie zidentyfikować mutacje, które przywróciły funkcję typu dzikiego.

2. Kwantyfikacja zachowania motorycznego wici za pomocą tetheringu komórkowego

UWAGA: Użyj tej metody, gdy normalne zachowanie podczas przewracania (chemotaksja) wydaje się być zagrożone.

  1. Przygotowanie hodowli i strzyżenie wici
    1. Przygotuj hodowlę fazową wykładniczą interesującego szczepu, jak opisano w kroku 1.2.1.
    2. Osad 10 ml komórek przez odwirowanie przy 2,000 x g przez 3 minuty przed ponownym zawieszeniem w 10 ml wysterylizowanego przez filtr buforu ruchliwości (MB; 10 mM bufor fosforanu potasu [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      UWAGA: MB wspomaga ruchliwość, ale nie wspomaga wzrostu bakterii
    3. Powtórzyć krok 2.1.2 jeszcze dwa razy przed ponownym umieszczeniem ostatniej osadki w 1 ml MB.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocować igłę 23G do końca. Zmontuj identyczną strzykawkę/igłę i połącz je ze sobą za pomocą 6-calowej rurki polietylenowej (średnica wewnętrzna 0,58 mm) szczelnie osłoniętej na każdej końcówce igły.
    5. Ścinaj wici (są kruche i łatwo pękają), delikatnie przesuwając zawiesinę komórkową tam iz powrotem z jednej strzykawki do drugiej 50 razy, z 1-minutowymi przerwami między każdymi 10 przejściami.
    6. Odwirować ścięte komórki w temperaturze 2 000 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić w końcowej objętości 500 μl MB.
  2. Przygotowanie preparatów i wiązanie komórek
    1. Przygotuj komorę do utrwalania komórek, układając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na szklanym szkiełku mikroskopowym o wymiarach 3 cale x 1 cal x 1 mm, oddzielone taśmą dwustronną (Rysunek S1).
    2. Przepłukać komorę 0,01% (w/v) roztworem polilizyny, nakładając na górną część komory. Przechyl dolną krawędź (szkiełko nakrywkowe równo ze szkiełkiem mikroskopowym) na wycieraczkę zadaniową (bibułkę), aby pomóc w przeprowadzeniu roztworu przez komorę (Rysunek S1). Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Przemyć komorę trzykrotnie 40 μl MB, używając zgodnie z opisem w kroku 2.2.2
    4. Dodać 40 μl zawiesiny komórek ściętych (przygotowanej powyżej) do górnej części komory i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do szkiełka nakrywkowego.
    5. Delikatnie przepłukać komorę 40 μl MB, jak w ppkt 2.2.3, w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek.
  3. Rejestrowanie rotacji komórek i kwantyfikacja
    1. Przenieś szkiełko mikroskopowe załadowane komórkami na uwięzi do stolika mikroskopu.
    2. Korzystając z mikroskopii z kontrastem fazowym i obiektywu 100x, zeskanuj populację w poszukiwaniu komórek, które są nieruchome i obracają się wokół jednej osi, tj. płynne obroty w ustalonym punkcie, a nie prezentują się pod kątem, w którym komórka porusza się w pozycji ostrej i nieostrej (Wideo 1).
    3. Użyj komercyjnego mikroskopu i powiązanej kamery. Otwórz powiązane oprogramowanie, upewnij się, że interesujące komórki są ostre i kliknij akwizycję wideo, aby nagrywać obrót komórki przez jedną minutę (przy 10 klatkach na sekundę lub więcej).
    4. Na podstawie odtwarzania wideo określ ilościowo liczbę pełnych obrotów na minutę oraz liczbę zmian kierunku komórki (częstotliwość przełączania).
      UWAGA: Prędkości obrotowe i częstotliwość przełączania mogą być zbyt szybkie, aby można je było ocenić na oko, dlatego zaleca się korzystanie z oprogramowania wideo, które oferuje wolne/dokładne odtwarzanie lub przyjmuje zautomatyzowany system oprogramowania do ilościowego określania wzorców obrotowych33. Alternatywą byłoby zwiększenie lepkości MB za pomocą metylocelulozy (lub podobnego środka), aby pomóc spowolnić i rozwiązać problem rotacji szybszych bakterii lub zrekompensować, gdy używane są kamery o niskiej liczbie klatek na sekundę.
    5. Powtórzyć krok 2.3.2 z kontrpróbami biologicznymi, aby skompilować reprezentację populacji będącej przedmiotem zainteresowania.

3. Przygotowanie rojów w teście przekraczającym granicę

UWAGA: Użyj tej metody do oceny wpływu mutacji lub stanu na ruchliwość grupy. Agar rojowy odnosi się do agaru, w którym procent jest zwykle wyższy niż w przypadku agaru miękkiego. W miękkim agarze (0,3%) komórki pływają pojedynczo wewnątrz agaru. W agarze roju (0,5% i więcej) komórki poruszają się jako grupa na powierzchni. Podczas gdy talerze roju muszą być używane zgodnie z opisem tutaj, talerze do pływania mają dłuższy okres przydatności do spożycia i mogą być używane przez kilka dni. Naszym osobistym preferencjem jest użycie w ciągu 1-2 dni.

  1. Przygotowanie agaru roju
    1. Dodać 5 g agaru Eiken (0,5% w/v) i 20 g LB do kolby okrągłodennej o pojemności 2 l. Dodać 1 l ddH2O do kolby i równomiernie wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej.
    2. Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.
    3. Pozostawić do ostygnięcia, delikatnie mieszając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, używając pręta/płytki jak powyżej. Gdy temperatura wynosi około 50 °C, dodać glukozę sterylizowaną filtrem, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 %.
    4. Wlać 25 ml do sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić do zastygnięcia w temperaturze pokojowej na co najmniej 14 godzin i nie dłużej niż 20 godzin. Nie przechowywać do wykorzystania w przyszłości.
  2. Inokulacja i inkubacja płytek roju
    1. Zaszczepić 6 μl kultury o średniej wykładniczej wielkości (przygotowanej jak w 1.2) przez nakrapianie na wierzchu agaru.
    2. Pozostaw pokrywkę zdjętą na 5-10 minut i wymień, gdy inokulum wyschnie na powierzchni agaru.
    3. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 8 godzin. Należy unikać pokusy sprawdzania postępu roju poprzez zdejmowanie pokrywy, ponieważ przyczyni się to do wysuszenia agaru i zakłóci wydzielanie się roju.
      UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od fenotypu szczepu. Niektóre izolowane mutacje mogą utrudniać zdolność rojowania się i będą wymagały zmniejszonego procentu agaru lub dłuższego okresu inkubacji.
  3. Przygotowanie płytek do oznaczania przekroczeń granicy
    UWAGA: Ten test wykorzystuje zmodyfikowaną szalkę Petriego, w której plastikowa przegroda (granica) tworzy dwie komory, a nie jedną (Rysunek 2A). Każda komora może być przygotowana niezależnie od drugiej, oferując różne warunki do roju, przed "połączeniem" tych dwóch. W zależności od projektu eksperymentalnego, pierwsza komora (oznaczona po lewej) może być przygotowana z agarem do pływania (0,3% w/v) lub agarem rojowym (0,5% w/v), skąd bakterie mogą migrować przez granicę do prawej komory zawierającej agar roju +/- wszelkie wymagane suplementy lub prowokacje (np. antybiotyki). Migracja na którymkolwiek z agarów jest zazwyczaj mierzona/porównywana poprzez rejestrowanie najszerszej średnicy kolonizacji bakteryjnej (od krawędzi do krawędzi) od pierwotnego punktu zaszczepienia.
    1. W razie potrzeby przygotować agar do pływania zgodnie z opisem w ppkt 1.1.
    2. Przygotować agar roju zgodnie z opisem w ppkt 3.1.
    3. Wlej ~30 ml agaru roju (z pożądaną suplementacją, jeśli jest to wymagane) do prawej komory dwukomorowej szalki Petriego (100 mm x 15 mm), do punktu, w którym znajduje się na poziomie plastikowej przegrody między komorami, ale nie przelewa się do lewej (Rysunek 2B).
    4. Po stwardnieniu agaru napełnij lewą komorę ~ 30 ml agaru do pływania lub roju, ponownie do punktu kontaktu z plastikową przegrodą (Rysunek 2C). Zanim zastygnie, użyj sterylnej końcówki pipety, aby delikatnie przeciągnąć agar przez granicę, aby połączyć dwie strony za pomocą mostka agarowego o wysokości ~1 mm, który rozciąga się na całej długości przegrody (Rysunek 2D).
    5. Pozostawić płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (3.1).
      UWAGA: Alternatywną metodą tworzenia mostka jest pozostawienie agaru z lewej komory do wyschnięcia, a następnie powolne pipetowanie ~100 μl stopionego agaru roju wzdłuż plastikowej przegrody, aby połączyć dwie komory (3.4). Zaszczepić płytki w lewej komorze, jak opisano powyżej, dla agaru do pływania (1.2.2) lub roju (3.2), przed inkubacją w temperaturze 30 °C przez 12-16 godzin lub do momentu, gdy roje poczynią wystarczający postęp w prawej komorze, aby umożliwić porównania między interesującymi szczepami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja pseudo-rewertantów w szczepie E. coli, którego ruchliwość jest upośledzona przez wysokie poziomy cząsteczki sygnałowej c-di-GMP, została szczegółowo opisana w niedawnej pracy naszego laboratorium34. Szczep ten (JP142) posiadał dwie mutacje: ΔyhjH oraz ΔycgR. YhjH jest najaktywniejszą fosfodiesterazą degradującą c-di-GMP w E. coli. Brak YhjH prowadzi do podwyższonych poziomów c-di-GMP i zahamowania ruchliwości. YcgR jest efektorem c-di-GMP. W kompleksie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Izolacja i charakterystyka mutacji supresorowych z powodzeniem przyczyniły się do zidentyfikowania kluczowych elementów systemu chemotaksji 35,36,37, a także samej maszynerii motorycznej 38,39,40. Podczas korzystania z Protokołu 1 ważne jest, aby uwzględnić wiele niezależnych powtórzeń, aby zapewnić izolację szerokiego spektrum możliwyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez GM118085 grantowe National Institutes of Health oraz częściowo przez Fundację Roberta Welcha (grant F-1811 dla R.M.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Sól disodowa, dwuwodzianFisher Scientific02-002-786
AgarEiken Eiken Chemical Co. JaponiaE-MJ00Niezbędny do roju E. coli
Glukoza D (+)Fisher Scientific
LB (Lennox)Fisher ScientificBP1427-500
Roztwór poli-L-lizyny (0,1%)Sigma-AldrichP8920
Chlorek potasu (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materiały i sprzęt
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopem CellSense (V. 1.6)OlympusLub równoważne oprogramowanie do używanego mikroskopu
Mikroskopia elektronowa Sciences Scotch 666 Doube Taśma jednostronnaFisher50-285-28
Szkiełka mikroskopowe matowe 3x1x1mmFisher12-550-343
Mikroskop Olympus BX53OlympusBX53Można użyć dowolnego mikroskopu pionowego lub odwróconego mikroskopu fazowego
Szalki Petriego (średnica 100 mm)Fisher ScientificFB0875712Do testów miękkich agarowych
Rurka kapilarna nebulizatora polietylenowego (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)Perkin Elmer
Okrągła szalka Petriego z 2 przegrodamiVWR89200-944Do testów granicznych
Bezpieczne igły podskórne (23G)Fisher Scientific14-826A
Sterylna strzykawka - 1 mlFisher scientific14-955-450
Chusteczki zadaniowe/tkankoweFisher scientific06-666Lub równoważne chusteczki do jednorazowego użytku
VWR mikro szkło osłonowe 18x18mmKamera VWR48366205
XM10OlympusXM10Lub równoważna kamera mikroskopowa
Rosół 4109550009908265

Bibliografia

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396(2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644(2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143(2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329(2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338(2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ruchliwo bakteriitest na mi kkim agarzetechnika przytwierdzania kom rektest przekraczania granicymikroskopia kontrastowaprotok wirowaniaprzygotowanie agaru do swarmowaniaprzygotowanie buforu do badania ruchliwo ciodrywanie wici
Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.