Artykuł metodologiczny

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

DOI:

10.3791/61365

⸱

10 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny Chlamydia trachomatis przechodzi cykl rozwojowy składający się z dwóch morfologicznie odrębnych form rozwojowych. Niereplikacyjny organizm elementarny (EB) inicjuje infekcję gospodarza. Po wejściu do środka EB różnicuje się w ciało siateczkowate (RB). Następnie RB przechodzi wiele rund replikacji, zanim zróżnicuje się z powrotem do zakaźnej formy EB. Cykl ten ma zasadnicze znaczenie dla przeżycia chlamydii, ponieważ brak przełączania między typami komórek zapobiega inwazji lub replikacji gospodarza.

Ograniczenia w technikach genetycznych wynikające z obligatoryjnego wewnątrzkomórkowego charakteru Chlamydii utrudniły identyfikację mechanizmów molekularnych zaangażowanych w rozwój typu komórkowego. Zaprojektowaliśmy nowatorski system plazmidowy z podwójnym promotorem-reporterem, który w połączeniu z mikroskopią żywych komórek pozwala na wizualizację przełączania typów komórek w czasie rzeczywistym. Aby zidentyfikować geny zaangażowane w regulację rozwoju typu komórki, wykorzystano system promotor-reporter żywej komórki do opracowania przyszłościowego podejścia genetycznego poprzez połączenie mutagenezy chemicznej podwójnego szczepu reporterowego, obrazowania i śledzenia chlamydii ze zmienioną kinetyką rozwojową, a następnie klonalnej izolacji mutantów. Ten postępowy przepływ pracy genetycznej jest elastycznym narzędziem, które można modyfikować w celu ukierunkowania na badanie w szerokim zakresie ścieżek genetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia trachomatis (Ctr) jest obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym patogenem, który przechodzi przez dwufazowy cykl rozwojowy, który jest niezbędny do jego przetrwania i proliferacji1. Cykl ten składa się z dwóch form rozwojowych, ciała elementarnego (EB) i ciała siatkowego (RB). EB jest niekompetentny w replikacji, ale pośredniczy w inwazji komórek poprzez endocytozę indukowaną efektorem2. Po znalezieniu się w żywicielu EB dojrzewa do replikatywnego RB. RB przeprowadza wiele rund replikacji przed konwersją z powrotem do EB w celu zainicjowania kolejnych rund infekcji.

Ograniczony wachlarz narzędzi genetycznych ograniczył większość badań nad chlamydiami do badań biochemicznych lub stosowania systemów zastępczych. W związku z tym wyjaśnienie regulacji genów i kontroli cyklu rozwojowego było trudne3,4. Jednym z ważniejszych wyzwań w dziedzinie chlamydii jest śledzenie czasowe cyklu rozwojowego chlamydii z wysoką rozdzielczością i identyfikacja białek zaangażowanych w jego regulację. Ekspresja genów podczas cyklu rozwojowego chlamydii była tradycyjnie realizowana za pomocą destrukcyjnych metod "punktu końcowego", w tym RNAseq, qPCR i mikroskopii komórek stałych5,6. Chociaż metody te dostarczyły bezcennych informacji, zastosowane techniki są pracochłonne i mają niską rozdzielczość czasową5,6.

W ciągu ostatniej dekady, manipulacja genetyczna Ctr rozwinęła się wraz z wprowadzeniem transformacji plazmidu i metod mutagenezy7,8,9. Na potrzeby tego badania opracowano system oparty na plazmidzie do monitorowania rozwoju chlamydii w poszczególnych inkluzjach w czasie rzeczywistym w trakcie infekcji. Stworzono transformant chlamydiowy, który wykazywał ekspresję promotora-reportera specyficznego zarówno dla komórek RB, jak i EB. Reporter specyficzny dla RB został skonstruowany przez fuzję promotora wczesnego genu RB euo przed fluorescencyjnym białkiem Clover. EUO jest regulatorem transkrypcji, który tłumi podzbiór późnych genów związanych z EB10. Promotor hctB, który koduje białko podobne do histonów biorące udział w kondensacji nukleoidu EB, został sklonowany bezpośrednio przed mKate2 (RFP) w celu stworzenia specyficznej dla EB klasy reporter11. Szkieletem dla hctBprom-mKate2/euoprom-Clover był p2TK2SW27. Promotory hctB i euo amplifikowano z genomowego DNA Ctr-L2. Każda sekwencja promotora składała się z ~ 100 par zasad przed przewidywanym miejscem rozpoczęcia transkrypcji dla określonego genu chlamydiowego oraz pierwszych 30 nukleotydów (10 aminokwasów) odpowiedniego ORF. Fluorescencyjne warianty FP uzyskano komercyjnie jako zoptymalizowane bloki genów kodonu Ctr i sklonowano w ramce z pierwszymi 30 nukleotydami każdego genu i promotora chlamydii. Terminator incD został sklonowany bezpośrednio za mKate2. Drugi promotor-reporter został umieszczony za terminatorem incD. Gen oporności na ampicylinę (bla) w p2TK2południowy zachód2 został zastąpiony genem aadA (oporność na spektynomycynę) z pBam4. W ten sposób powstała ostateczna konstrukcja p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover (Rysunek 1A), która została przekształcona w Ctr-L27. Ten szczep reporterowy RB / EB pozwolił na obserwację cyklu rozwojowego w obrębie pojedynczych inkluzji za pomocą mikroskopii żywych komórek (Rysunek 1B, C).

Wykorzystując nasz konstrukt promotora-reportera w połączeniu z mutagenezą chemiczną, opracowano protokół do śledzenia i izolowania indywidualnych klonów, które wykazywały nieprawidłowości rozwojowe od mutagenizowanych populacji serowara Ctr L2. Protokół ten pozwala na bezpośrednie monitorowanie poszczególnych inkluzji chlamydii, śledzenie profili ekspresji genów w czasie, identyfikację klonów chlamydii, które wyrażają zmieniony rozwojowy wzorzec ekspresji genów oraz klonalną izolację Chlamydii z poszczególnych inkluzji.

Chociaż ten protokół został stworzony specjalnie do identyfikacji genów zaangażowanych w rozwój chlamydii, można go łatwo dostosować do badania dowolnej liczby szlaków genetycznych chlamydii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie skrypty Pythona używane w tym protokole są dostępne na Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenizuje Reporter Chlamydia

UWAGA: Ctr-L2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover EBs zostały bezpośrednio zmutagizowane przy użyciu metanosulfonianu etylu (EMS) w pożywce aksenicznej-1, ponieważ ta pożywka wspomaga metabolizm EB i utrzymanie zakaźności EB12.

  1. Rozmrozić bulion chlamydiowy na lodzie zawierający ~3 x 107 EB przekształconych za pomocą plazmidu reporterowego p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover i osadu w temperaturze >14 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    > UWAGA: Organizmy Chlamydia użyte w tych eksperymentach zostały oczyszczone i zamrożone w temperaturze -80 °C w 1x buforze sacharonowo-fosforanowo-glutaminianu (SPG).
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad EB w 100 μl buforu-1 z sonikacją na lodzie przy 10% mocy przez 10 s. Podzielić 100 μl zawiesiny EB na dwie podwielokrotności po 50 μl dla próbek poddanych działaniu mutagenizacji i próbki.
  3. Przygotować 20 mg/ml roztworu EMS--1 w oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. W tym celu dodaj 6,8 μl EMS w 375 μl całkowitej objętości.
  4. Dodać 50 μl roztworu EMS--1 do jednej z podwielokrotności chlamydiów do mutagenezy i 50 μl-1 tylko do drugiej podwielokrotności chlamydii do pozorowanej mutagenezy.
    UWAGA: Końcowe stężenie EMS wynosi 10 mg/mL. Miano chlamydii, stężenie EMS i czas ekspozycji stosowane w tym protokole prowadzą do około 60-80% redukcji zakaźnego potomstwa. Ten poziom redukcji odpowiada ~5-20 zmianom DNA na genom chlamydii8.
  5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zmutagowane EB zostaną użyte bezpośrednio do infekowania monowarstw w sekcji 2.
    UWAGA: EMS jest znanym czynnikiem rakotwórczym. Wszystkie urządzenia i materiały, które mają kontakt z EMS, muszą być namoczone w 1 M NaOH przez 24 godziny przed usunięciem, rękawice powinny być używane przez cały czas podczas protokołu i czyszczenia materiałów EMS.

2. Obrazowanie zmutowanego Ctr

  1. Hodowla komórek gospodarza do obrazowania i izolacji zmutagenizowanego Ctr
    1. Wysiewaj 6-dołkową szklaną płytkę dolną z 6 x 10 5 komórek Cos-7 (ATCC) na studzienkę w 2 ml kompletnej pożywki (RPMI-1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 10 mg / ml gentamycyny). Użyj tej szklanej płytki dolnej do obrazowania zmutagenizowanego Ctr.
    2. Wysiewaj 24-dołkową płytkę polistyrenową z 1 x 105 komórek Cos-7 (ATCC) na dołek w 1 ml kompletnego podłoża. Użyj tej polistyrenowej płytki do reinfekcji izolowanej chlamydii, która jest przedmiotem zainteresowania.
    3. Inkubować obie płytki w temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez około 18 godzin. Gdy komórki osiągną zlew, zastąp pożywkę kompletną pożywką uzupełnioną 1 μg/ml cykloheksymidu i inkubuj przez noc.
  2. Zakażenie hodowli komórek gospodarza mutagenowanym Ctr
    1. Zainfekuj 5 dołków szklanej płytki dolnej ~ 6 x 105 zmutagenizowanych EB w 1,5 ml / studnię lodowato zimnego HBSS. Spowoduje to MOI na poziomie ~ 0,3, ponieważ oczekuje się, że wskaźnik śmiertelności ~ 70% z powodu mutagenezy.
    2. Zainfekuj pozostałą studzienkę ~ 2 x 105 pozorowanymi zmutagizowanymi EB w 1,5 ml / studni lodowato zimny HBSS. Bez mutagenezy spodziewaj się mniejszej śmiertelności, dlatego jedna trzecia inokulum jest używana do osiągnięcia MOI ~0,3,
      UWAGA: MOI wynoszące ~0,3 zapewnia, że komórki gospodarza są zakażone pojedynczym EB i pozwala na wystarczającą separację między zainfekowanymi komórkami do izolacji klonalnej.
    3. Inkubować płytkę przez 15 minut, kołysząc, w temperaturze 37 °C.
    4. Przemyć zakażone komórki gospodarza wstępnie podgrzanym (37 °C) HBSS zawierającym 1 mg/ml heparyny, a następnie natychmiast przepłukać HBSS. Powtórzyć płukanie heparyną, natychmiast spłukując 2x HBSS, aby upewnić się, że heparyna została usunięta.
      UWAGA: Heparyna hamuje i może odwracać wczesne oddziaływania elektrostatyczne między komórką gospodarza a EBs13. Mycie heparyną usuwa EB, które jeszcze nie dostały się do komórek gospodarza, synchronizując infekcję. Podczas mycia komórek należy to robić delikatnie, aby zapobiec wyrwaniu się komórek z powierzchni studzienek. Roztwory HBSS i heparyny zawierają pozostałości EMS i należy je umieścić w zlewce zawierającej 1 M NaOH na 24 godziny przed usunięciem.
    5. Zastąp HBSS 4 ml / studzienkę wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża do obrazowania (kompletne podłoże, 1 μg / ml cykloheksymidu, 20 mM HEPES i bez czerwieni fenolowej).
    6. Wypełnij przestrzenie międzydołkowe wstępnie podgrzanym (37 °C) dejonizowanymH2O, aby pomóc w kontroli temperatury i zmniejszyć parowanie. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 10 godzin.
  3. Konfiguracja i obrazowanie mikroskopu
    UWAGA: Wielokolorowe, wielopozycyjne, zautomatyzowane obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek służy do zbierania obrazów poklatkowych w celu identyfikacji mutantów chlamydii, które różnią się dynamiką ekspresji genów rozwojowych. Protokół ten wykorzystuje pakiet oprogramowania μManager o otwartym kodzie źródłowym do automatycznego sterowania mikroskopem14.
    1. Rozpocznij konfigurację mikroskopu 10 godzin po zakażeniu. Ustawić inkubator ze stopniem mikroskopu na 5% CO2, 37 °C. Umieścić zainfekowaną 6-dołkową szklaną płytkę dolną w inkubatorze i włożyć termistor próbki do interwell H2O.
    2. Skalibruj stolik XY za pomocą wtyczki High Content Screening (HCS). Kliknij Wtyczki | Narzędzia do pozyskiwania danych | HCS Site Generator w oprogramowaniu sterującym mikroskopem μManager (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
    3. Wybierz szablon płytki 6-dołkowej i wygeneruj listę pozycji obrazowania składającą się z 12 pól widzenia (FOV) na studzienkę w ramach wtyczki HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Otwórz listę pozycji stołu montażowego, a następnie ręcznie ustaw ostrość i ustaw początkową pozycję Z dla każdego pola widzenia za pomocą wtyczki Stage Control (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Dostosuj współrzędne XY dowolnego pola widzenia, w którym brakuje komórek lub który nie zawiera jednolitej monowarstwy.
      UWAGA: Ze względu na czas potrzebny na wykonanie każdego obrazu, w odstępie 30 minut można zarejestrować maksymalną liczbę 72 FOV.
    4. Do obrazowania należy używać obiektywu o powiększeniu 20x. To powiększenie pozwala na zobrazowanie ~8 inkluzji na pole widzenia, zapewniając jednocześnie pożądaną rozdzielczość.
    5. Zapisz listę pozycji, ponieważ będzie ona używana do lokalizowania interesujących wtrąceń po analizie danych (JoVE61365_screenfile7).
    6. Użyj opcji Auto Focus (Automatyczne ustawianie ostrości) w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, aby ustawić ostrość dla automatycznego obrazowania (JoVE61365_screenfile8).
    7. Użyj poniższych wyborów i wartości, aby uzyskać najbardziej spójne wyniki ostrości dzięki autofokusowi opartemu na obrazie w aplikacji μManager. W oknie właściwości autofokusa wybierz OughtaFocus z menu rozwijanego i użyj następujących ustawień. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Tak, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
      UWAGA: Skrócenie okna obrazowania z autofokusem poprzez zmniejszenie współczynnika kadrowania pozwala na bardziej spójne automatyczne ustawianie ostrości. Wybranie opcji Tak dla opcji OughtaFocus-ShowImages umożliwia użytkownikowi wyświetlenie obrazu z autofokusem.
    8. Uchwyć kinetykę cyklu rozwojowego poprzez obrazowanie przez 24 godziny w 30-minutowych odstępach czasu (JoVE61365_screenfile9). Obrazowanie w zakresie 12-36 HPI zapewnia, że Chlamydia kończy cykl rozwojowy, ale nie ulega lizie komórki gospodarza.
    9. Zobrazuj monowarstwy komórek z ekspozycją 250 ms przy intensywności 4% i 18% odpowiednio w kanałach GFP i RFP (JoVE61365_screenfile10). Wykrywanie sygnału Clover (GFP) przez wzbudzenie przy 470 nm za pomocą filtra emisji pasmowoprzepustowej 514/30 nm. Wykrywanie sygnału mKate2 (RFP) przez wzbudzenie przy długości fali 595 nm i za pomocą filtra emisji pasmowo-przepustowej 641/75 nm.
      UWAGA: Minimalizacja intensywności wzbudzenia ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania fotowybielania fluoroforem i fototoksyczności dla Chlamydii. Minimalna intensywność wzbudzenia do wygenerowania obrazu o rozdzielczości przy ekspozycji 200-300 ms powinna być określona empirycznie w badaniach pilotażowych.
    10. Uchwyć wiele plasterków Z z zakresem ostrości, który kończy się po obu stronach wycinka z fokusem. W tym eksperymencie, przy 20-krotnym powiększeniu, osiągnięto to za pomocą 4 warstw w krokach co 10 μm (JoVE61365_screenfile11).
    11. Wybierz opcję Względna Z, aby obrazować wiele plasterków w oknie akwizycji. Opcja względnego Z używa położenia płaszczyzny Z zapisanego na liście pozycji obrazowania jako punktu początkowego dla następnego przedziału czasu. Wprowadź odpowiednie wartości przesunięcia Z dla kanałów obrazowania fluorescencji (JoVE61365_screenfile12).
      UWAGA: System ustawiania ostrości oparty na obrazie jest niedoskonały i w ciągu 24-godzinnego okresu obrazowania prowadzi to do dryfu ostrości. Stwierdzono, że poprzez uchwycenie 3-4 płaszczyzn ogniskowych Z dla każdego punktu czasowego zachowano ostry obraz. Przesunięcie Z jest potrzebne do skorygowania różnic w płaszczyznach ogniskowych między kanałami obrazu fluorescencyjnego a kanałem DIC. Konieczne będzie empiryczne wyznaczenie tego przesunięcia Z.
    12. Zapisz obrazy, wybierając katalog główny i nadając nazwę eksperymentowi. Użyj opcji pliku stosu obrazów μManager, aby zapisać obrazy jako pliki stosu TIFF (JoVE61365_screenfile13).
    13. Zapisz szczegóły eksperymentu w polu Komentarze do przejęć w oknie Akwizycja wielowymiarowa (JoVE61365_screenfile13). tj. Studnia A1: Kontrola nieleczona. Cóż A2-3 i B1-3: mutanty EMS. Obrazowanie: 12-36HPI. Rozpocznij akwizycję obrazu od 12 HPI.
      UWAGA: W przypadku korzystania z programu μManager należy pozostawić uruchomiony program, konfigurację eksperymentalną i sprzęt mikroskopu po zakończeniu eksperymentu. Miejsca obrazowania zostaną ponownie zbadane w celu włączenia izolacji po zakończeniu analizy mutagenizowanej populacji.

3. Zidentyfikuj i wyizoluj zmutagizowaną Chlamydię ze zmienionymi fenotypami rozwojowymi

  1. Tworzenie stosu obrazów z ostrością
    1. Wyodrębnij najbardziej ostry obraz ze stosów Z, korzystając z zapisanych danych obrazu, które zawierają 4 wycinki Z na punkt czasowy. Skorzystaj z opcji pomiaru kurtozy (Analizuj | Zmierz) w ImageJ/FIJI, aby automatycznie zidentyfikować najbardziej ostry wycinek Z (najwyższy wynik kurtozy) i utworzyć nowy stos obrazów tylko z tymi ostrymi obrazami. Skrypt języka Python jest dołączony jako plik uzupełniający (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py), aby zautomatyzować ten proces.
  2. Ilościowe określenie ekspresji fluorescencji w poszczególnych inkluzjach
    UWAGA: Aby określić ilościowo kinetykę wyrażeń dwóch reporterów, należy użyć aplikacji do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym ImageJ/FIJI i wtyczki Trackmate15. Trackmate identyfikuje "plamy" (w tym przypadku odpowiadające inkluzjom) i podąża za nimi przez stos obrazów poklatkowych, rejestrując lokalizację X,Y i intensywność sygnału dla każdego włączenia w czasie (JoVE61365_screenfile14). Te informacje są zapisywane jako plik CSV i zostaną zaimportowane do niestandardowego notesu języka Python w celu analizy.
    1. Otwórz stos obrazów z ostrością zmniejszoną w Z, w ImageJ/FIJI za pomocą importera formatów biologicznych, klikając Wtyczki | Formaty biologiczne | Importer formatów biologicznych. Wybierz pozycję Hyperstack i kompozytowe (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
    2. Odejmij tło obrazu, klikając Proces | Odejmij tło, używając promienia toczącej się kuli wynoszącego 50,0 pikseli i zwiększ kontrast obrazu do 0,3% dla nasyconych pikseli (punkt menu Process | Zwiększ kontrast). Pomnóż wartości obrazu przez 10,0 (punkt menu Process | Matematyka | Mnożenie) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
    3. W Trackmate (Wtyczki | Śledzenie | Trackmate), wybierz szacowaną średnicę plamki wynoszącą 48 pikseli (empirycznie wyznaczoną na podstawie rozmiaru inkluzji na końcu obrazowania). Aby utworzyć niepofragmentowane ścieżki włączenia, wybierz maksymalną odległość łączenia i maksymalną odległość zamykania odstępów wynoszącą 8,0 pikseli oraz maksymalną odległość zamykania odstępów wynoszącą 1 (JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
      UWAGA: Aby poprawić zdolność Trackmate do identyfikowania i śledzenia inkluzji w całym cyklu, tworzony jest oddzielny kanał obrazu poprzez dodanie kanałów euoprom i hctBprom razem za pomocą funkcji matematyki obrazu w ImageJ/FIJI. Ten kanał jest następnie używany przez Trackmate do identyfikowania i śledzenia inkluzji w czasie. Wartości fluorescencyjne kanałów euoprom i hctBprom są następnie rejestrowane w kanałach 2 i 3.
    4. Nagrywaj utwory, które spełniają minimalny ciągły czas trwania: Czas trwania ścieżki: 20 (JoVE61365_screenfile26). Przeanalizuj trasy i zapisz spoty w statystykach torów jako plik CSV (JoVE61365_screenfile27).
      UWAGA: Ten proces został zautomatyzowany przy użyciu niestandardowego skryptu języka Python, który jest dostarczany w danych uzupełniających (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
  3. Zidentyfikuj ścieżki integracji ze zmienionymi profilami rozwojowymi
    UWAGA: Aby zidentyfikować inkluzje zawierające Chlamydię ze zmienionymi profilami rozwojowymi, każda ścieżka inkluzji została zwizualizowana za pomocą notatnika Pythona. Wizualizacje te pozwalają na identyfikację inkluzji z kinetycznymi profilami ekspresji genów, które różniły się od populacji pozorowanej. Notatnik języka Python używany do identyfikacji inkluzji ze zmienionym programowaniem rozwojowym znajduje się w danych uzupełniających (EMS_Screen-Markdown).
    1. Zaimportuj dane śledzenia dołączania z plików CSV Miejsca w statystykach ścieżek do ramki danych biblioteki Pandas przy użyciu komórki Importuj w notesie języka Python EMS_Screen-Markdown.
    2. Linia bazowa koryguje każdą ścieżkę, odejmując minimalną wartość każdej ścieżki od pozostałych wartości ścieżki za pomocą komórek Odejmij linię bazową. Zapisz wynikowe wartości jako plik wytrawianej przy użyciu komórki Zapisz jako wytrawianie. Spowoduje to trwałe zapisanie wartości kanałów po odjęciu linii bazowej w celu późniejszego pobrania.
      UWAGA: Odejmowanie linii bazowej ustawia początkową intensywność fluorescencji każdego wtrącenia na zero.
    3. Wyeliminuj ślady inkluzji w pobliżu krawędzi pola widzenia za pomocą komórki Filter Edges, ponieważ ich profile fluorescencyjne mogą nie być w pełni uchwycone; ślady te mogą powodować fałszywie dodatnie profile rozwojowe.
    4. Skalibruj wartości klatki (totalFrames) z wycinków obrazu z wartościami czasu (startTime, interval) za pomocą komórki Time-lapse Calibration przy użyciu czasu rozpoczęcia eksperymentu i interwału czasu obrazowania. Wyklucz odczyty częściowego włączenia, odfiltrowując ślady, które nie rozciągają się na ostatnie 20 godzin eksperymentu (16-36 HPI) przy użyciu komórki filtru czasu trwania.
    5. Rozdzielanie ścieżek na poszczególne ramki danych według warunków eksperymentalnych za pomocą komórki Przypisz leczenie. Filtruj inkluzje, które wykazują wystarczający wzrost, za pomocą komórki Filtruj wzrost. W komórce Filter for Growth empirycznie ustaw próg intensywności fluorescencji dla kanału euoprom, zmieniając wartości w ostatnich dwóch wierszach kodu. Spowoduje to odfiltrowanie chlamydii, która nie urosła.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas ustawiania filtrów progowych, jeśli filtr jest zbyt niski, wynikowe wykresy punktowe będą zaszumione, ale jeśli filtrowanie jest ustawione zbyt wysoko, ważne mutanty mogą zostać wyeliminowane.
    6. Oblicz procentową śmiertelność spowodowaną przez EMS, dzieląc liczbę mutagenizowanych ścieżek/studzienki przez liczbę pozorowanych ścieżek/studzienki. Pomnóż liczbę próbnych ścieżek poddanych działaniu symulacji przez początkowy współczynnik rozcieńczenia wynoszący 3, aby obliczyć liczbę próbnych ścieżek/studzienki poddanych próbie. Aby wykonać to zadanie, należy użyć komórek Zlicz ścieżki inkluzji i Oblicz procent śmiertelności.
    7. Oblicz czas do połowy maksymalnego wyrażenia zarówno dla wczesnych, jak i późnych reporterów dla każdej ścieżki za pomocą komórki Oblicz. Wartości te zostaną wykorzystane do porównania mutagenizowanych i pozorowanych populacji w celu identyfikacji mutantów rozwojowych.
    8. W komórce Half-Max Plot użyj pakietu kreślenia bokeh, aby zwizualizować czas do połowy maksymalnego wyrażenia każdego promotora, przedstawiając wykres czasu euoprom do połowy maksymalnego wyrażenia w stosunku do hctBprom. Zidentyfikuj inkluzje z populacji mutantów, które znajdują się poza pozorowaną chmurą rozproszenia, korzystając z interaktywnego eksploratora identyfikatorów ścieżek bokeh. Zanotuj współrzędne FOV i XY interesujących inkluzji (Rysunek 2).
      UWAGA: Wybierz kandydujące inkluzje, które wizualnie wykraczają poza chmurę kontrolną, ponieważ weryfikacja i ocena statystyczna każdego klonu zostaną przeprowadzone później.
    9. W komórce Animowany wykres wizualizuj zmiany w kinetyce ekspresji promotora dynamicznie w czasie, przedstawiając na wykresie intensywność wyrażenia euoprom w stosunku do hctBprom za pomocą narzędzia do kreślenia Plotly16. Funkcja rozproszenia Plotly służy do animowania ekspresji genów w czasie (wideo 1).
    10. Wizualizuj migawkę z animowanego wykresu Plotly w komórce Inclusion Locator, wykreślając wyrażenie euoprom i hctBprom w określonym punkcie czasowym (np. 28 HPI) za pomocą pakietu bokeh (Rysunek 3). Zidentyfikuj inkluzje z populacji mutantów zgodnie z opisem w kroku 3.3.8.
      UWAGA: Analizę tę należy przeprowadzić szybko (<4 godziny), ponieważ inkluzje nadal się rozszerzają i zaczną lizować komórki gospodarza ~ 48 godzin po zakażeniu.
  4. Izolowanie mutantów rozwojowych od inkluzji będących przedmiotem zainteresowania
    UWAGA: Aby wyizolować Chlamydię z inkluzji, u których stwierdzono zmienioną regulację genów, zastosowano mikromanipulator z igłami kapilarnymi. Identyfikator odwiertu, współrzędne FOV i X,Y interesujących inkluzji zostały określone za pomocą wizualizacji danych w sekcji 3.3.
    1. Przygotuj igły kapilarne, trzymając środek rurki kapilarnej w płomieniu i ciągnąc oba końce rurki kapilarnej, aż się oddzielą. Utwórz otwór w ciągniętej igle kapilarnej, łamiąc wyciągniętą końcówkę na szkiełku mikroskopowym. Aby złamać igłę, umieść zamkniętą końcówkę na matowej części szkiełka mikroskopowego pod kątem i dociśnij.
      UWAGA: Specyfikacje rurki kapilarnej to średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm.
    2. Sprawdź, czy otwór igły jest w przybliżeniu wielkości inkluzji pod mikroskopem, obiektyw 20x.
    3. Wstępnie wyciągnij ~ 25-30 igieł kapilarnych do izolacji kandydujących wtrąceń (jedna igła na inkluzję).
    4. Napełnij mikrowtryskiwacz olejem mineralnym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    5. Przymocuj szklaną igłę kapilarną do mikrowstrzykiwacza i wylej olej na końcówkę igły, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza. Umieścić igłę kapilarną w kompletnym podłożu i wyciągnąć pożywkę do połowy. Wypełnienie igły kapilarnej pożywką zapobiega zanieczyszczeniu odwiertu ropą.
    6. Korzystając z zapisanej listy pozycji w programie μManager z kroku 2.3.5, przeprowadź migrację do studni i pola widzenia interesującego włączenia zidentyfikowanego w notesie wizualizacji języka Python.
    7. Użyj joysticka mikromanipulatora, aby zlokalizować igłę kapilarną na współrzędnych XY interesującego włączenia.
    8. Użyj kanału wzbudzenia 595 nm do wizualizacji EB do ekstrakcji oraz kanału światła białego fazy/DIC do wizualizacji igły. Manewruj igłą kapilarną do inkluzji, rozerwij inkluzję, a następnie wciągnij EB do igły kapilarnej za pomocą mikrowtryskiwacza.
    9. Usunąć EBs z igły kapilarnej do pojedynczego dołka przygotowanej 24-dołkowej płytki polistyrenowej przygotowanej w kroku 2.1.2. Usuń igłę kapilarną i zastąp ją świeżą igłą kapilarną do następnej ekstrakcji inkluzji. Powtórzyć sekcję 3.4 dla wszystkich włączonych kandydatów.
      UWAGA: W celu ekspansji i zapewnienia wystarczająco wysokiego miana do ponownego obrazowania, inkubuj zmutowane izolaty w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C, aż większość komórek gospodarza zostanie zainfekowana (~1 tydzień). Studnie powinny być ściśle monitorowane, ponieważ różne izolaty mogą wykazywać różne tempo wzrostu.
  5. Żniwa zmutowanych izolatów
    1. Na lodzie rozbić zainfekowaną monowarstwę, zeskrobując ją końcówką do mikropipety o pojemności 1 ml. Przenieś pożywkę, resztki komórek i uwolnioną Chlamydię do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Granulat Chlamydia przez wirowanie przez 30 min w temperaturze 4 °C, >14 000 x g. Usuń supernatant i ponownie zawieś osad w 75 μl lodowatego lodu 1x SPG. Porcjować do trzech mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml z nakrętką. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Weryfikacja fenotypów zmutowanych izolatów

  1. Hodowla komórek gospodarza do obrazowania mutagennych izolatów
    1. Zasiać 96-dołkową szklaną płytkę dolną z 1,6 x 104 komórkami Cos-7 (ATCC) na studzienkę w 100 μl kompletnej pożywki. Inkubować w temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki powinny osiągnąć zbieżność w ciągu około 24 godzin. Po zlaniu się komórek zastąp pożywkę kompletną pożywką uzupełnioną cykloheksymidem o stężeniu 1 μg/mL, inkubuj przez noc.
  2. Zakażenie komórek izolatami kandydującymi do weryfikacji fenotypowej
    1. Rozmrozić zmutowane klony i dzikie chlamydie na lodzie.
    2. Na przygotowanej 96-dołkowej płytce przeprowadzić dwukrotne seryjne rozcieńczanie zmutowanych izolatów, używając jednej kolumny na izolat (11 kolumn). Rozpocząć od początkowego rozcieńczenia 1:20 w 100 μl HBSS.
      UWAGA: Seryjne rozcieńczanie Chlamydii przeprowadza się, aby zapewnić, że próbki zmutowanych mutantów są obrazowane w MOI < 1.
    3. Zainfekuj pozostałą (12.) kolumnę dziką Chlamydią w MOI ~0,5.
      UWAGA: Chlamydia typu dzikiego są używane jako kontrola do porównania z mutagenizowanymi izolatami.
    4. Inkubować przez 15 minut, kołysząc się w temperaturze 37 °C.
    5. Przemyć zakażone komórki gospodarza wstępnie podgrzanym (37 °C) HBSS z 1 mg/ml heparyny i HBSS, jak określono w sekcji 2.2.
    6. Zastąp 200 μl na studzienkę wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża do obrazowania.
    7. Wypełnić przestrzenie międzydołkowe wstępnie podgrzanym (37 °C) dejonizowanymH2O.
    8. Inkubować w temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 godzin.
  3. Konfiguracja mikroskopu
    UWAGA: Zapoznaj się z sekcją 2.3, aby zapoznać się z konfiguracją mikroskopu, ta sekcja zawiera tylko wymagane modyfikacje konfiguracji.
    1. Wybierz szablon płytki 96-dołkowej z wtyczki HCS.
    2. Empirycznie wyznacz studzienki odpowiadające MOI < 1 dla każdego izolatu zmutowanego. Ekspresja koniczyny pod kontrolą promotora euo jest obserwowana przy ~10 HPI, co umożliwia wczesną wizualizację inkluzji (Rysunek 1B).
    3. Wybierz trzy studzienki na izolat mutanta, które odpowiadają MOI < 1 i wygeneruj listę pozycji obrazowania składającą się z dwóch FOV na studzienkę.
      UWAGA: Ze względu na ograniczenia sprzętowe można wykonać tylko 72 obrazy w danym przedziale czasowym, co odpowiada trzem rozcieńczeniom (dołkom) na szczep przy użyciu dwóch miejsc obrazowania na studzienkę, jeśli obrazowanych jest 12 próbek.
    4. Rejestrować cykl rozwojowy każdego izolatu mutanta przez 36 godzin w 30-minutowych odstępach czasu, zaczynając od 12 HPI.
    5. Zapisz szczegóły eksperymentu w polu Komentarze do przejęć. tj. Well ABC1: wildtype control. Cóż, ABC2: Zmutowany szczep 1, ABC3: Zmutowany szczep 2, itd... Obrazowanie: 12-48 HPI.
    6. Rozpocznij akwizycję obrazu od 12 HPI.

5. Analiza danych do weryfikacji izolatu

  1. Twórz ostre stosy obrazów i określaj ilościowo ekspresję fluorescencji w poszczególnych inkluzjach
    1. Sporządzić ślady natężenia fluorescencji dla każdego włączenia, jak określono w sekcji 3.1-3.2.
  2. Sprawdź mutagenizowane izolaty Ctr
    UWAGA: Aby zweryfikować zmienione profile rozwojowe izolatów mutantów, ich profile wyrażeń są porównywane z profilem wyrażeń typu dzikiego przy użyciu notatnika języka Python. Notatnik języka Python używany do weryfikacji zmutowanych klonów ze zmienionym programowaniem rozwojowym jest dostępny w danych uzupełniających (clone_check-Markdown).
    1. Zaimportuj i przefiltruj dane śledzenia dołączania w notesie języka Python clone_check-Markdown, jak to opisano w sekcji 3.3.
    2. Oblicz średnią i odchylenie standardowe (STD) ze śladów każdej izolowanej i dzikiej populacji kontrolnej za pomocą komórki Oblicz średnią i STD.
    3. Za pomocą wykresu komórki Iso vs WT wykreśl średnią i błąd standardowy średniej (SEM) każdego zmutowanego klonu w stosunku do kontroli typu dzikiego, aby określić, czy kinetyka wyrażenia mutanta jest rozbieżna z próbką typu dzikiego (Rysunek 4).
    4. Określ, czy izolowana populacja mutantów jest klonalna, wykreślając ślady mutantów i porównując je ze śladami inkluzji typu dzikiego za pomocą wykresu punktowego, jak pokazano w sekcji 3.3 (kroki 3.3.7-3.3.10) (Rysunek 2, Rysunek 3). Jeśli izolat jest populacją mieszaną, wykres pokaże jedną populację nałożoną na typ dziki i drugą odrębną populację poza chmurą rozproszenia typu dzikiego. Jeśli populacja wygląda na mieszaną, mutant może zostać ponownie odizolowany przy użyciu oryginalnej procedury opisanej w sekcji 3.4.
      UWAGA: Aby określić, czy profil rozwojowy izolatu różni się statystycznie od profilu dzikiego, krzywe dla każdego izolatu należy porównać z krzywymi typu dzikiego za pomocą ANOVA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednia mutageneza EMS naszego szczepu chlamydiowego promotora-reportera spowodowała ~75% zmniejszenie zakaźności. Korzystając z opisanego protokołu obrazowania żywych komórek, zobrazowano ~600 inkluzji i śledzono je w ciągu 24 godzin. Kinetyka wyrażeń fluorescencyjnych obu reporterów w każdym włączeniu została zwizualizowana przy użyciu niestandardowych skryptów notatnika języka Python. Zaimplementowano dwa podejścia wizualizacyjne w celu zidentyfikowania kandydata na mutagenizowaną chlamydię do izolacji. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza mechanizmów kontrolujących cykl rozwojowy chlamydii jest utrudniona ze względu na ograniczenia dostępnych obecnie narzędzi genetycznych. Wykorzystując nasz promotor-reporter Chlamydia w połączeniu z automatyczną mikroskopią żywych komórek, zbudowano system, który umożliwia monitorowanie rozwoju typu komórkowego w poszczególnych inkluzjach przez okres 24 godzin. System ten, w połączeniu z mutagenezą chemiczną i izolacją bezpośredniego włączenia, ustanowił metodę szybkiej i klonalnej selekcji Chlamydii...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Andersowi Omslandowi z Washington State University za dostarczenie nośników aksonicznych-1. Prace te były wspierane przez granty NIH R01AI130072, R21AI135691 i R21AI113617. Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez fundusze startowe z University of Idaho i Center for Modeling Complex Interactions za pośrednictwem grantu NIH P20GM104420.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe płytki polistyrenoweCorning3524Wzrost kultur komórkowych w celu reinfekcji izolatów
6-dołkowe szklane płytki denneCellvisP06-1.5H-NWzrost kultur komórkowych do obrazowania
96-dołkowe szklane płytki denneNunc165305Wzrost kultur komórkowych do obrazowania
Pogrubiona linia Jednostka CO2OKO LabsJEDNOSTKA CO2 BLStage inkubator Kontrola CO2
Bold line T UnitOKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUSInkubator Stage Kontrola temperatury
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowegoSutter InstrumentB1005010Rurki kapilarne
Filtr emisji pasmowo-przepustowej BrightLine (514/30nm)SemrockFF01-514/30-25Filtr fluescencyjny
kostka BrightLine (641/75nm)SemrockFF02-641/ 75-25Kostka filtracyjna fluescencyjna
CellTram VarioEppendorf5196000030Mikroiniektor
Chlamydia trachmatis serowar L2ATCCVR-577Pożywka Chlamydia trachomatis
-1We własnymNAMedia Axenic. IPB uzupełniony o 1% FBS, 25 μ M aminokwasy, 0,5
mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT i 50 μ M GTP, UTP oraz
CTP. (Omsland, A. 2012) wykonane we własnym zakresie.
Komórki Cos-7 (ATCC)ATCCCRL-1651Komórka nerkowa afrykańskiej zielonej małpy (komórki gospodarza)
CykloheksymidMP Biomedicals194527Inhibitor wzrostu komórek gospodarza
Metanosulfonian etylu, 99%Acros OrganicsAC205260100Mutagen
Fetal PlexGemini Bio-Products100-602Suplement do podłoża wzrostowego
Fidżi/ImageJhttps://imagej.net/FijiNAOtwarte źródło Oprogramowanie do analizy obrazu. https://imagej.net/Fiji
Inkubator CO2 Galaxy 170 SEppendorfCO1700100XGbloki inkubacji kultur komórkowych
(warianty fluorescencyjne FP: Clover i mKate2)Zintegrowane technologie DNANA gblock ORF zoptymalizowanych pod kątem Ctr wariantów FP do klonowania do p2TK2południowy
zachód2 Gentamycyna 10mg/mlGibco15710-064Antybiotyk do pożywek wzrostowych
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)Corning21-020-CMPłukanie komórek gospodarza
Heparyna sodowaAmersham Life Science16920hamuje i odwraca wczesne oddziaływania elektrostatyczne między komórką gospodarza a EB
HEPES 1MGE Life SciencesSH30237.01Bufor pH do podłoża wzrostowego
InjectManEppendorf5179 000.018Mikromanipulator
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NAWizualizacja śladów inkluzji. https://jupyter.org/
Lambda 10-3Sutter InstrumentLB10-3Sterownik koła filtrów
Oko TouchOKO LabsOko Interfejsdotykowy do sterowania linią Bold T i CO2
Jednostka Poprzedni etap XYPriorH107Zmotoryzowany stolik mikroskopu XY
Wirówka PrismRLabnetC2500-RMikrowirówka z kontrolowaną temperaturą
Problot Piec hybrydyzacyjnyLabnetH1200AInkubator kołyszany do zakażenia Chlamydia
Proscan IIWcześniejszymikroskopu H30V4XYZ
Oczyszczacz Klasa 2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLabconco362804Praca w hodowli komórkowej
RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej)Gibco11835-030Podstawowa pożywka wzrostowa do obrazowania
RPMI-1640 (czerwień fenolowa) GELife SciencesSH30027.01Podstawowy zakres podłoża wzrostowego
Diody LED wzbudzenia LED (470nm, 595nm)scopeLEDF140Światło wzbudzenia
Dysmembrator soniczny Model 500Fisher Scientific15-338-550Sonicator, ponowne zaparcie granulatu chlamydiowego
Inkubator etapowyOKO LabsH301-K-FRAMEKomora inkubacyjna na płytce studziennej
z sacharozą, fosforanem i glutaminianem bufor 1X (SPG)W domuNABufor do przechowywania chlamydiów. (10 mM fosforan sodu [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sacharozy, 0,50 mM kwas L-glutaminowy; pH 7,4)
Kolby T-75Thermo Scientific 156499Wzrost kultur komórkowych
Mikroskop odwrócony TE 300Mikroskop Nikon16724Mikroskop
THOR LEDThor LabsLEDD1BŚwiatło białe
TrypsynaCorning25-052-CIUsuwa komórki gospodarza z kolby do wysiewu na płytki
Kamera obrazowa Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3
&mikro; Manager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNAPakiet oprogramowania do automatycznego sterowania mikroskopem z otwartym zasobem
sterownik stopnia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
  2. Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
  3. Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
  4. Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
  5. Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).
  6. Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  7. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  8. Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  9. Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817(2016).
  10. Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
  11. Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
  12. Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
  13. Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
  14. Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
  15. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  16. Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
  17. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  18. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
  19. Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
  20. Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Live Cell MicroscopyDual Promoter Reporter SystemChemical MutagenesisCell Type SwitchingDevelopmental CycleElementary BodiesReticulate BodiesClonal Isolation

Powiązane artykuły