Method Article

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

DOI:

10.3791/61375

⸱

May 24th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culex quinquefasciatus jest wektorem różnorodnych chorób przenoszonych przez wektory, takich jak malaria ptaków, wirus Zachodniego Nilu (WNV), japońskie zapalenie mózgu, wschodnie zapalenie mózgu koni, filarioza limfatyczna i zapalenie mózgu Saint Louis. Warto zauważyć, że ptasia malaria odegrała główną rolę w wyginięciu wielu endemicznych gatunków ptaków wyspiarskich, podczas gdy WNV stała się ważną chorobą przenoszoną przez wektory w Stanach Zjednoczonych. Aby uzyskać więcej informacji na temat biologii C. quinquefasciatus i poszerzyć ich zestaw narzędzi do kontroli genetycznej, musimy opracować bardziej wydajne i przystępne cenowo metody inżynierii genomu u tego gatunku. Jednak niektóre cechy biologiczne unikalne dla komarów Culex, w szczególności ich tratwy jajowe, utrudniają wykonywanie procedur mikroiniekcji wymaganych do inżynierii genomu. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodków, który koncentruje się na łagodzeniu przeszkód technicznych związanych z unikalnymi cechami komarów Culex. Procedury te demonstrują zoptymalizowane metody zbierania jaj, oddzielania tratw jajowych i innych procedur obchodzenia się z C. quinquefasciatus. W połączeniu z technologią edycji genomu CRISPR/Cas9, procedury te pozwalają nam uzyskać specyficzne dla danego miejsca, wydajne i dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które są niezbędne do przeprowadzenia zaawansowanej inżynierii genomu i opracowania technologii kontroli genetycznej w tym ważnym, ale obecnie niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. quinquefasciatus, powszechnie znany jako południowy komar domowy, jest kompetentnym wektorem wielu patogenów, w tym wirusa Zachodniego Nilu (WNV), japońskiego zapalenia mózgu, zapalenia mózgu Saint Louis i wschodniego zapalenia mózgu koni. W szczególności, odkąd po raz pierwszy wykryto ją w Nowym Jorku w 1999 roku, WNV stała się główną chorobą przenoszoną przez wektory w kontynentalnych Stanach Zjednoczonych (USA) z ponad 50 000 zgłoszonymi przypadkami u ludzi, które spowodowały około 2 300 zgonów w latach 1999-20181, a także ponad 4 500 zgłoszonych przypadków koni w latach 2008-20192. Ponadto co najmniej 23 gatunki ptaków występujące w Ameryce Północnej zostały dotknięte infekcjami WNV, przy czym co najmniej 12 gatunków zostało sklasyfikowanych jako nieodwracalne w wyniku WNV3. Wpływ WNV na populacje ludzi, koni i ptaków wynika z oportunistycznych zachowań żywieniowych jego wektorów. Zazwyczaj ptaki są głównymi żywicielami WNV, a ludzie i konie są przypadkowymi lub ślepymi zaułkami. Niektóre patogeny przenoszone przez C. quinquefasciatus infekują tylko ptaki, takie jak ptasi pasożyt malarii, Plasmodium relictum. Na Hawajach C. quinquefasciatus jest głównym wektorem ptasiej malarii i spowodował wyginięcie wielu rodzimych gatunków ptaków4,5.

Aby kontrolować choroby przenoszone przez C. quinquefasciatus, badacze i agencje kontroli wektorów korzystali z powszechnie uznanych narzędzi kontroli populacji komarów, takich jak stosowanie środków owadobójczych6, jednak te metody są kosztowne, nie są specyficzne dla gatunku i mają ograniczoną skuteczność, ponieważ odporność na insektycydy jest wysoka w wielu populacjach C. quinquefasciatus6,7,8,9. Inne techniki kontroli, takie jak strategie kontroli populacji oparte na Wolbachii, zostały opracowane w ostatnich latach10,11, ale koszty przystosowania związane z infekcją Wolbachia ograniczają wykonalność tego podejścia dla tego wektora12. Istnieją również metody zwalczania oparte na genetyce, które zostały opracowane u innych gatunków komarów, takich jak Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 i Anopheles stephensi16, w tym rozwój komarów odpornych na patogeny17,18,19, które mogą również zostać opracowany dla C. quinquefasciatus, jeżeli zostaną opracowane niezbędne narzędzia inżynierii genomu dla tego gatunku. Jednak biologia C. quinquefasciatus znacznie różni się od innych wektorów komarów Aedes i Anopheles, co utrudniło rozwój podobnych technologii genetycznych w tym wektorze. Wraz z pojawieniem się technologii inżynierii genomu opartych na CRISPR, precyzyjna inżynieria genomu stała się coraz bardziej trywialna, przystępna cenowo i elastyczna, a w konsekwencji doprowadziła do opracowania nowych narzędzi genetycznych u wielu różnych gatunków.

Aby wygenerować mutacje za pomocą technologii opartych na CRISPR, do zarodków w stadium preblastoderm mikrowstrzykuje się mieszaninę białka Cas9 i syntetycznego przewodnika RNA (sgRNA), komplementarnego do pożądanych loci. Ponieważ samice C. quinquefasciatus składają jaja w grupach połączonych w pływającą strukturę tratwy (Ryc. 1), w przeciwieństwie do składania jaj pojedynczych, co jest cechą komarów Aedes i Anopheles, mikroiniekcje zarodków są coraz bardziej skomplikowane u tego gatunku. Larwy Culex wyłaniają się również z przedniej strony każdego jaja, która styka się z powierzchnią wody (Ryc. 1), więc u tego gatunku ważna jest manipulacja orientacją jaja. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół przeznaczony do mikroiniekcji białka Cas9 i sgRNA do zarodków C. quinquefasciatus. Protokół ten został opracowany w celu uwzględnienia cech unikalnych dla biologii Culex w celu poprawy przeżywalności zarodków i wskaźników mutacji genomu poprzez pewne kroki, które są kluczowe dla terminowego pobrania jaj i przeżycia jaj.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla kolonii C. quinquefasciatus

  1. Zakładaj wiele kolonii dorosłych osobników C. quinquefasciatus w klatkach dla owadów.
    UWAGA: Kolonie zostały dostarczone przez dr Laurę Harrington z Cornell University20. Szczegółowe protokoły hodowli komarów Culex można znaleźć w innej literaturze21.
    1. Utrzymuj komary w temperaturze 25 ± 1 °C przy wilgotności 30% w cyklu dzień-noc o godzinie 12:12.
    2. Dostarczyć 20% roztwór cukru ad libitum, wprowadzając do klatki pojemnik z roztworem cukru z lub nasycając waciki roztworem cukru i umieszczając go w klatce.
  2. Pozwól komarom łączyć się w pary przez co najmniej 3 dni przed karmieniem krwią (Rysunek 2A).

2. Zbiór zarodków C. quinquefasciatus w stadium preblastoderm

  1. Po 3-6 dniach od eclozji podaj samicom 1-2 ml cytrynowanej mączki z krwi bydlęcej przez syntetyczną membranę i podgrzej do około 40 °C w systemie karmienia krwią (Ryc. 2B). Istnieją również alternatywne protokoły nawożenia krwią, które można stosować w przypadku komarów Culex (np. patrz ref21).
    UWAGA: C. quinquefasciatus jest znany z preferencji do ptasiej krwi. Niektóre laboratoria używają znieczulonych żywych ptaków lub ptasiej krwi jako mączki krwiodawczej source21,22,23. Jednak kolonie mogą być trenowane/selekcjonowane do żywienia się krwią bydlęcą lub małymi gryzoniami, jeśli ta cecha jest wybrana na wiele pokoleń.
    1. Pozwól samicom odpocząć przez co najmniej 3 dni po karmieniu krwią, aby poddały się oogenezie i dojrzewaniu jaj przed wywołaniem składania jaj do eksperymentów z mikrowstrzyknięciami.
  2. W dniu mikroiniekcji embrionalnych należy utworzyć miseczkę do składania jaj z organicznie nasyconą wodą do składania jaj. Woda do składania jaj powinna być wytwarzana przez fermentację odchodów królika (50 g/L), rozkładu trawy (4,5 g/L) lub pokarmu dla ryb (25 g/L) w wodzie w ciągu 5 lub więcej dni24,25.
  3. Umieść miseczkę do składania jaj w klatce i umieść całą klatkę w ciemnym miejscu ( Rysunek 2C).
  4. Po każdych 30 minutach sprawdzaj, czy w kubku nie ma tratwy z jajkami.
    1. Jeśli obecne są tratwy z jajkami, zbierz je, zgarniając je pędzlem i umieść na mokrej bibule filtracyjnej (Rysunek 2D,E).

3. Wyrównanie zarodków C. quinquefasciatus w stadium preblastoderm

  1. Oddziel jaja od tratwy, naciskając na tratwę i oddzielając jajka pojedynczo za pomocą pędzla z cienką końcówką i kleszczyków (Rysunek 2E).
  2. Ułóż pojedyncze jajka na cienkim pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonej na górze szklanego szkiełka (Rysunek 2F).
  3. Podczas wyrównywania staraj się skierować przednią stronę każdego jajka w tym samym kierunku, aby ułatwić dostępność.
    UWAGA: Alternatywną metodę wyrównywania jaj bez dwustronnej taśmy klejącej można znaleźć we wcześniej opublikowanym protokole mikroiniekcji zarodka Nasonia vitripennis26.
  4. Przykryj jajka mieszanką oleju halowęglowego.
    UWAGA: Mieszankę halowęglowodorów można przygotować z wyprzedzeniem, delikatnie mieszając dwa odczynniki halowęglowodorowe i wodę (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : woda ultraczysta), a następnie inkubując mieszaninę przez noc w temperaturze 25οC, aby ułatwić nasycenie oleju halowęglowodorowego wodą.

4. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji

  1. Wygeneruj igły ze szkła kapilarnego glinokrzemianowego za pomocą ściągacza do szklanych mikropipet.
    1. Umieść glinokrzemianową szklaną szklankę kapilarną w ściągaczu do igieł, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza igieł.
      UWAGA: Można również użyć igieł kapilarnych kwarcowych i borokrzemianowych, ale w tym eksperymencie preferowany jest glinokrzemian ze względu na jego względną przystępność cenową i trwałość.
    2. Ustaw ciepło na 516, prędkość na 100, opóźnienie na 70, pociągnięcie na 97 i nacisk na 500 na ściągaczu igły.
    3. Aktywuj ściągacz igieł zgodnie z instrukcjami ściągacza i powtórz w razie potrzeby dla dodatkowych igieł.
      UWAGA: Podczas procesu wstrzykiwania igły często się zatykają lub przypadkowo łamią, dlatego zdecydowanie zaleca się wyciągnięcie dodatkowych igieł do pojedynczego eksperymentu.
  2. Ukosuj końcówkę igły, delikatnie dotykając końcówki ciągniętej igły na obracającej się diamentowej płycie ściernej przez około 10 sekund pod kątem 50°.
    UWAGA: Ukosowanie igły otwiera ją, aby umożliwić przepływ płynu, jednocześnie tworząc ostrzejszą końcówkę dla łatwiejszej penetracji zarodka. Przykład prawidłowej igły można zobaczyć w poprzednim artykule26.
  3. Ciągnięte i fazowane igły należy przechowywać, osadzając je w liniach gliny modelarskiej na szalce Petriego.
    UWAGA: Aby zapewnić najlepszą jakość końcówek igieł, igły powinny być świeżo wyciągnięte i skośne jak najbliżej czasu wstrzyknięcia.

5. Ładowanie mieszanki iniekcyjnej

  1. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników do modyfikacji genomu (np. 200 ng/μL sgRNA i 200 ng/μL mieszaniny Cas9) lub preferowane roztwory do wstrzykiwań i przechowywać ją na lodzie.
    UWAGA: Tę mieszankę można przygotować w oczekiwaniu na złożenie jaj. Więcej szczegółów na temat produkcji i przygotowania Cas9 i sgRNA do mikroiniekcji można znaleźć w poprzednich publikacjach27,28,29,30.
  2. Załadować 2 μl mieszaniny iniekcyjnej do igły iniekcyjnej za pomocą końcówki do mikroładowania.

6. Konfiguracja mikroiniekcji

  1. Umieścić napełnioną igłę do wstrzykiwań w zestawie mikromanipulacyjnym połączonym z elektronicznym mikrowstrzykiwaczem.
  2. Umieść szklane szkiełko zawierające wyrównane jaja na stoliku mikroskopu złożonego.
  3. Za pomocą mikromanipulatora i mikroskopu złożonego ustaw igłę tak, aby celowała w tylny koniec zarodka pod kątem 25-35°.

7. Mikroiniekcja zarodka (Rysunek 2G)

  1. Ostrożnie wprowadzić igłę do zarodka i wstrzyknąć mieszaninę w ilości około 10% objętości zarodka (700-800 pL w zależności od wielkości jaj).
    UWAGA: Podczas wstrzykiwania jajo powinno lekko pęcznieć, jednak jeśli wstrzyknie się zbyt dużo płynu, jaja mogą pęknąć lub płyn cytoplazmatyczny może wyciekać.
  2. Wstrzyknąć około 20 komórek jajowych na raz, a następnie przerwać i wykonać zabieg odzyskiwania zarodków.
    UWAGA: Podczas wstrzykiwania istnieje duże prawdopodobieństwo zatkania lub złamania igieł. Jeśli dojdzie do zatkania, które może być spowodowane brakiem płynu iniekcyjnego przepływającego przez igłę, należy spróbować wyczyścić igłę za pomocą funkcji czyszczenia w elektronicznym mikrowstrzykiwaczu lub spróbować ponownie ukosować igłę. Jeśli żaden z tych kroków nie zadziała, szybko zmień igłę na nową, upewniając się, że przygotowane jajka pozostają zwilżone.

8. Odzyskiwanie i wylęganie się zarodków

  1. Pozostaw jajka w spokoju na co najmniej 5 minut. W ciągu 20 minut po wstrzyknięciu ostrożnie usuń olej halowęglowy, delikatnie szczotkując czystym pędzlem (Rysunek 2H).
  2. Delikatnie podnieś jajka za pomocą pędzla i umieść je w filiżance z podwójnie destylowaną wodą (Rysunek 2I). Uważaj, aby jaja trzymały się na powierzchni wody.
  3. Sprawdzaj jaja codziennie przez 7 dni pod kątem wylęgu (Rysunek 2J).
  4. Postępuj zgodnie z normalnymi procedurami hodowli larw21.

9. Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu

  1. Przebadaj wstrzyknięte komary pod kątem zmutowanych fenotypów za pomocą stereoskopu (Rysunek 2K).
    1. Zweryfikuj mutacje, które nie mają łatwo rozpoznawalnego fenotypu, poprzez amplifikację PCR, test endonukleazy T7 I i sekwencjonowanie przez subklonowanie regionu docelowego31.
  2. Ustaw dodatkowe krzyżówki między osobami, którym wstrzyknięto implant, aby wykryć dziedziczne mutacje w linii zarodkowej.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W poprzednio opublikowanych eksperymentach ta metoda została wykorzystana do pomyślnego wygenerowania mutacji somatycznych i germinalnych genu krytycznego dla rozwoju ciemnej pigmentacji oczu, białego (CPIJ005542)30 (Tabela 1). Mutacje somatyczne generowane przez CRISPR/Cas9 oceniano za pomocą badań przesiewowych pod kątem utraty pigmentacji w oczach w stadium poczwarki osób, którym wstrzyknięto (G0). Mutacje somatyczne były na ogół obecne jako fenotypy mozaikowe, w których niektóre, ale nie wszystkie komórki mają zmutowany fenotyp. Na przykład, mutacje somatyczne genu white spowodowały mieszaninę ommatidiów z fenotypami, które nie mają pigmentacji, oraz tych z fenotypem pigmentowanym typu dzikiego30. Kiedy jednak doszło do mutacji genu białego w linii zarodkowej, następne pokolenie (G1) odziedziczyło pełny fenotyp białych oczu. Wskaźniki mutacji linii zarodkowej określono poprzez krzyżowanie mozaiki G0 osobników i punktację dla całkowicie białookiego potomstwa (G1). Eksperymenty te wykazały wskaźnik przeżywalności zarodków od 64% do 82%, a także wskaźnik mutagenezy somatycznej od 37% do 57% i wskaźnik mutagenezy linii zarodkowej >61% (Tabela 1). Dzięki multipleksowaniu sgRNA w celu ukierunkowania na wiele loci w tym samym genie, wskaźniki mutagenezy somatycznej i linii zarodkowej wzrosły nawet do 86% (Tabela 1). Ponadto przez wiele pokoleń zdolne do życia homozygotyczne stada białych mutantów były z powodzeniem utrzymywane w laboratorium.

figure-results-1
Ryc. 1: Tratwa jajowa C. quinquefasciatus i morfologia pojedynczego jaja.
Widok grzbietowy (A), boczny (B) i brzuszny (C) tratw jajowych C quinquefasciatus. Samice C. quinquefasciatus składają jaja z bardziej bulwiastą przednią stroną dotykającą powierzchni wody, podczas gdy bardziej spiczastą tylną stroną od powierzchni wody (D). A- przedni; P- posterior Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Oś czasu tworzenia mutantów C. quinquefasciatus metodą mikroiniekcji.
Kalendarium przygotowania kolonii C. quinquefasciatus i pobierania zarodków do mikroiniekcji (A-D). Zebrane jaja są następnie oddzielane (E), ustawiane w tej samej orientacji i pokrywane olejem halowęglowym (F). Jaja są następnie wstrzykiwane (G) i pozostawiane do odpoczynku przez co najmniej 5 minut przed usunięciem oleju halowęglowego (H). Jaja są następnie przenoszone do źródła czystej wody (I) w celu wylęgu (J) i badane pod kątem zmutowanych fenotypów (K). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: Rozdział powiedział: Rozdział powiedział: Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział
PrzetrwanieMozaicyzm somatyczny (G0)Mutageneza linii zarodkowej (G1)
sgRNA (sgRNA)#injected♂♀Ogółem (%)♂♀Ogółem (%)Mutanty G1 (%)
wsgRNA-1501520art. 35(70)7(47)13(65)20(57)128(69)
wsgRNA-2509Rozdział 32art. 41(82)art. 3 ust. 33art. 12 ust. 38art. 15 ust. 3751(61)
wsgRNA-350171532(64)7(41)art. 8(53)art. 15(47)157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-250716art. 23 ust. 465(71)art. 12 ust. 7517(74)123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-350139art. 22(44)10(77)6(67)16(73)72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-3501710art. 27(54)13(76)art. 8(80)21(78)101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3501110art. 21(42)9(82)9(90)18(86)149(86)

Tabela 1: Wskaźniki przeżywalności i mutacji zarodków, którym wstrzyknięto pojedyncze i multipleksowane gRNA skierowane do rasy białej. Tabela została przedrukowana za zgodą od30

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W związku z ostatnimi wysiłkami zmierzającymi do stworzenia genetycznie zmodyfikowanych narzędzi do zwalczania komarów, istnieje potrzeba opracowania i optymalizacji protokołów mikroiniekcji zarodków dla powszechnych wektorów chorób komarów. Chociaż metody zostały opracowane dla komarów Aedes i Anopheles , protokół opracowany specjalnie dla Culex został minimalnie zbadany. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły wstrzykiwania zarodków komarów można podzielić na 3 ogólne etapy: 1) pobranie i przygotowanie zarodków, 2) wstrzyknięcie zarodka i 3) powrót do zdrowia po wstrzyknięciu. Aby skutecznie wygenerować mutanty, wszystkie trzy kroki muszą być zoptymalizowane pod kątem gatunku docelowego. Ten zmodyfikowany protokół mikroiniekcji zarodków jest specyficzny dla udanej inżynierii genomu komarów Culex .

Maksymalizacja pobierania zarodków jest częstym wąskim gardłem w protokołach mikroiniekcji zarodków. W celu zwiększenia liczby jaj zbieranych w krótkim czasie, komary nie miały dostępu do podłoża do składania jaj przez 2-3 dni po posiłku z krwi. Ważne jest, aby pamiętać, że C. quinquefasciatus ma tendencję do preferowania źródeł krwi ptaków w przeciwieństwie do źródeł ssaków lub karmienia błonowego krwią ssaków. Jednak wielu badaczy ma trudności ze znalezieniem wiarygodnego źródła żywego ptasiego źródła krwi ptaków do karmienia krwią, więc zapasy laboratoryjne można dostosować do żywienia się bardziej dostępnymi źródłami krwi. Bardzo ważne jest również stosowanie wody bogatej w składniki odżywcze jako podłoża do składania jaj, ponieważ zapewnia ona wskazówki dotyczące składania jaj dla C. quinquefasciatus i większości innych wektorów Culex . Istnieje wiele metod wytwarzania wody bogatej w składniki odżywcze, które mogą wymagać optymalizacji między laboratoriami, aby zapewnić dostępność odpowiedniej liczby jaj do mikroiniekcji. Na przykład, podczas gdy ta metoda była najbardziej skuteczna w przypadku odchodów królików fermentowanych w wodzie dejonizowanej przez 5 lub więcej dni, inni badacze odnieśli większy sukces z trawą lub pokarmem dla ryb jako źródłem składników odżywczych, a niektórzy nawetz wodą destylowaną.

Ponieważ komary Culex składają grupy jaj na tratwach, zbieranie jaj jest dość proste. Jajka można po prostu zbierać, zgarniając całą tratwę pędzlem. Separacja komórek jajowych jest bardziej skomplikowana, ale niezbędna do udanego wstrzyknięcia. Jaja można ostrożnie oddzielić od tratwy, delikatnie uciskając je w dół między jajkami za pomocą pędzla lub kleszczy. Przy pewnej wprawie wielu użytkowników było w stanie niezawodnie oddzielić pojedyncze jaja od tratw z jajami. Po oddzieleniu każdego jajka, jaja są ustawiane w tej samej orientacji na dwustronnej taśmie klejącej, która stabilizuje jaja podczas mikroiniekcji. Jaja są wstrzykiwane do zwężającego się tylnego końca, a dodatek oleju halowęglowego utrzymuje jaja wilgotne podczas manipulacji.

Aby ograniczyć uszkodzenia zarodków podczas mikroiniekcji, igły iniekcyjne muszą mieć odpowiednią wytrzymałość i być ukosowane pod odpowiednim kątem. Igły glinokrzemianowe fazowane przez 10 sekund pod kątem 50° przyniosły najlepsze rezultaty, ale igły borokrzemianowe i kwarcowe również mogą się sprawdzić, mimo że mogą być mniej trwałe i droższe. Ponadto odpowiednie ukosowanie igły ułatwia lepszy przepływ mieszanin Cas9 i sgRNA oraz tworzy ostrzejszy punkt ułatwiający penetrację zarodka. W wielu przypadkach ukosowanie jest również skutecznym sposobem na szybkie naprawienie zatkanych igieł zamiast poświęcania czasu i wysiłku na wymianę zatkanych igieł.

Po wstrzyknięciu jaja powinny pozostać nienaruszone przez co najmniej 5 minut, a olej halowęglowy należy natychmiast usunąć poprzez delikatne zetrzepanie go czystym pędzlem. Po usunięciu oleju halowęglowego, wstrzyknięte jaja można umieścić w wodzie w celu wylęgu, co zwykle następuje w ciągu 3 dni po wstrzyknięciu. Przy odrobinie wprawy i wystarczającej liczbie jaj protokół ten może osiągnąć spójne mutacje somatyczne i germinalne u C. quinquefasciatus i jest na tyle wszechstronny, że powinien łatwo przystosować się do innych komarów Culex .

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze startowe UCSD skierowane do O.S.A.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
9 uncji przezroczystego plastikowego kubka dla zwierzątKaratC-KC9Hodowla owadów i zbieranie jaj
Rurka kapilarna ze szkła glinokrzemianowego 1 mm (średnica zewnętrzna) X 0,58 mm (średnica wewnętrzna)Sutter InstrumentsBF100-58-10również użyć igieł do mikroiniekcji, borokrzemianów i kwarcu, ale woleliśmy glinokrzemian
BloodColorado Serum Company31025Kolonia potrzebowała wielu pokoleń, aby przystosować się do tego źródła krwi. Inne źródła krwi są prawdopodobnie równie odpowiednie. Patrz uwagi protokolarne dotyczące wyboru źródła krwi.
BugdormBugdorm4F2222Klatka do hodowli owadów
Białko Cas9 z NLSPNABioCP01mikroiniekcji
Mikroiniekcja Olympus BX41, do wstrzykiwań zarodków
Diamentowa płytka ścierna (rozmiary końcówek od 0,7 u do 2,0 u)Mikroiniekcja Sutter Instruments104E, do stosowania z ukosowarem
Destylowany bez DNaz / RNaz WaterInvitrogen10977-015
Dwustronna taśmaScotchB084NVQGXDMikroiniekcja, wyrównanie zarodków
Programowalny mikrowtryskiwacz Femtojet 4x lub 4iEppendorfMicroinjection
Femtotips Końcówki do mikroładowarekFisher ScientificE5242956003filtracyjna do mikroiniekcji
Whatman1001-090Mikroiniekcja, pobieranie zarodków
Pędzel z cienką końcówkąZEM2595Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków
Olej halowęglowy 27Sigma-AldrichH8773Mikroiniekcja, wyrównanie zarodka
Olej halowęglowy 700Sigma-AldrichH8898Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków
HemotekHemotekPS5Konserwacja linii
Mikroelektroda BevelerSutter InstrumentsBV10Mikroiniekcja, ukosowanie igły
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-1000 lub P-2000Mikroiniekcja, ciągnięcie igły
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-A3Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków
Nieschnąca plastelinaJoviB0025Z71IMMikroiniekcja, igła przechowywanie
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ51Mikroiniekcja, do wyrównania zarodków
SugarDomino20% roztwór cukru dla dorosłego źródła cukru.
T7 Endonukleaza INEBM0302Przygotowanie materiałów do mikroiniekcji
TOPO TA Zestaw do klonowaniaThermoFischer ScientificK451020Przygotowanie materiałów do mikroiniekcji
Ultracienkie kleszczyki z końcówkąFisher Scientific16-100-121Mikroiniekcja, wyrównanie zarodka
Można Mikroskop do do mikroiniekcji Bibuła

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).">Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
  2. https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).">APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
  3. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).">Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
  4. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).">van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
  5. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).">Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).
  6. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).">Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).
  7. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).">Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
  8. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).">Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
  9. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).">Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).
  10. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).">Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).
  11. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).">Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).
  12. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).">Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
  13. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).">Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).
  14. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).">Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).
  15. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).">Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  16. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).">Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  17. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).">Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  18. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).">Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).
  19. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).">Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).
  20. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).">Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).
  21. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).">Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).
  22. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).">Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).
  23. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).">Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).
  24. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).">Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
  25. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).">Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
  26. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).">Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).
  27. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).">Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
  28. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).">Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  29. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).">Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
  30. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).">Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
  31. https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).">New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryo MicroinjectionCulex QuinquefasciatusEgg Raft SeparationCRISPR Cas9Germline MutagenesisNeedle PreparationHalocarbon OilMicromanipulator UseSomatic MutationsEgg Collection

Related Articles