Artykuł metodologiczny

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

DOI:

10.3791/61378

⸱

11 września 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) są zaangażowane w różne stany chorobowe i są skutecznymi biomarkerami do wczesnej diagnozy chorób i leczenia u myszy. Jednak standardowe protokoły oczyszczania miRNA i wykrywania ich ekspresji w nerkach myszy z ostrym uszkodzeniem nerek (AKI) nie zostały dobrze ugruntowane. W ramach tego badania opracowano skuteczny i prosty protokół oczyszczania i ilościowego oznaczania miRNA w nerkach mysiego modelu AKI indukowanego przez niedokrwienie nerek-reperfuzję przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten składa się z pięciu etapów: 1) indukcji AKI przez niedokrwienie nerek-reperfuzję, 2) pobrania nerek, 3) oczyszczenia całkowitego RNA, w tym miRNA, z nerek, 4) syntezy cDNA przez odwrotną transkrypcję miRNA oraz 5) qRT-PCR w celu wykrycia ekspresji miRNA. Korzystając z tego protokołu, można wygenerować model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek z łagodnymi lub ciężkimi postaciami AKI. Dodatkowo, jeśli procedura jest przestrzegana prawidłowo, można uzyskać spójny model AKI z minimalnymi różnicami indywidualnymi. Ten test qRT-PCR wykazuje bardzo szeroki zakres dynamiki i umożliwia dyskryminację dojrzałych miRNA, które można dokładnie określić ilościowo z wysoką swoistością. Protokół ten może być wykorzystany do badania profilu ekspresji miRNA w nerkach AKI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) nerki stanowi jeden z głównych czynników ryzyka rozwoju ostrego uszkodzenia nerek (AKI)1. AKI odgrywa znaczącą rolę w rokowaniu pacjentów, ale nie ustalono specyficznych terapii i wczesnych biomarkerów diagnostycznych.

MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA z około 18-25 zasadami. miRNA są stabilne w płynach ustrojowych, a ich sekwencje są wysoce konserwatywne wśród zwierząt2. MiRNA regulują ekspresję wielu białek poprzez tysiące celów, wpływając w ten sposób na różne szlaki sygnałowe2,3,4,5,6,7,8. W ostatnich latach doniesiono, że miRNA biorą udział w różnych stanach chorobowych i są skutecznymi biomarkerami do wczesnej diagnozy wielu chorób.

Ogólnym celem tego protokołu jest skuteczne oczyszczanie i wykrywanie miRNA w nerkach mysiego modelu AKI indukowanego przez IRI. Ten model IRI jest szeroko stosowanym modelem AKI i zwłóknienia nerek. Do zalet modelu IRI należy możliwość wizualnego potwierdzenia, czy osiągnięto niedokrwienie-reperfuzję i określenie dokładnego czasu wystąpienia AKI. Jednak czas trwania zacisku, który jest wystarczająco długi, aby spowodować szerokie uszkodzenie rurek, wiąże się z wysoką śmiertelnością, podczas gdy krótki czas trwania zacisku nie powoduje uszkodzenia przewodów rurowych, co powoduje dużą zmienność progresji uszkodzeń rurek w tym eksperymentalnym modelu. W porównaniu z obustronnym modelem zaciskania, prawa tkanka nefrektomii pobrana w jednostronnym modelu IRI nerki działa jako kontrola i zapewnia niewydolność nerek.

Próbka nerki jest rozgnieżdżana za pomocą szklanego homogenizatora, w którym białka i kwasy nukleinowe są rozdzielane, a DNA i RNA są rozdzielane9. Całkowite RNA, w tym miRNA, jest oczyszczane z próbki nerki za pomocą kolumny spinowej opartej na membranie krzemionkowej9. Następnie przeprowadza się syntezę cDNA (odwrotną transkrypcję) z całkowitego RNA przy użyciu polimerazy poli(A) i starterów oligo-dT10. Wreszcie, ekspresja miRNA jest oznaczana przez qRT-PCR przy użyciu interkalacyjnego barwnika 10. qRT-PCR może dokładniej określić ilościowo ekspresję genów w porównaniu z PCR objętości amplifikacji w punktach końcowych. qRT-PCR mierzy wysokie stężenia i charakteryzuje się szerokim zakresem dynamiki, co pozwala na dokładne oznaczanie ilościowe, które zależy od liczby cykli. Wcześniejsze badania wykazały, że proste procesy mogą być wykorzystane do skutecznego oczyszczania i wykrywania miRNA w tkankach8,9,10. Opisano w tym protokole metody syntezy cDNA (odwrotna transkrypcja) i wykrywania ekspresji miRNA za pomocą qRT-PCR przy użyciu barwnika interkalacyjnego, które wykazują wysoką dokładność i czułość10.

Dodatkowo, ten protokół jest prosty i zapewnia spójne wyniki między laboratoriami. Dlatego protokół ten jest przydatny w badaniach, które wymagają bardzo dokładnego i czułego wykrywania miRNA w nerkach myszy AKI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi.

1. Model IRI

UWAGA: Uważnie monitoruj hipotermię, nawilżenie jelit i głębokość znieczulenia podczas całego zabiegu.

  1. Przygotuj następujące elementy: probówkę wirówkową o pojemności 50 ml zawierającą bawełnę nasączoną izofluranem, podgrzewaną podkładkę chirurgiczną, szalkę Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), sterylne ostrze chirurgiczne i sterylne kleszczyki. Utrzymuj PBS na poziomie 37 °C.
    UWAGA: Ten model IRI został wygenerowany przy użyciu samców myszy C57BL/6 (9 tygodni; 20–25 g) trzymanych w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym.
  2. Znieczulić zwierzę za pomocą izofluranu: stężenie indukcyjne 3%–5%, stężenie podtrzymujące 2%–3%, a stężenie podczas zaciskania 1%–1,5%. Aby zapobiec suchości oka podczas znieczulenia, nałóż maść okulistyczną na oczy. Potwierdź głębokość znieczulenia przez utratę odruchów. Znieczulenie wziewne ma tę zaletę, że czas można dostosować. Zabieg może zająć dużo czasu ze względu na złuszczanie się tkanki otaczającej nerkę. Jednak wadą znieczulenia wziewnego jest to, że temperatura ciała ma tendencję do spadku. Utrzymuj znieczulenie na wystarczającej głębokości, aby zapobiec reakcji na uszczypnięcie palca u nogi podczas zaciskania, unikając jednocześnie niepotrzebnie głębokiego znieczulenia.
  3. Zamontuj znieczuloną mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej na plecach, usuń włosy otaczające obszar nacięcia i zdezynfekuj skórę brzucha myszy za pomocą peelingu na bazie chlorheksydyny i 70% etanolu. Buprenorfinę podaje się podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc., 30 minut przed zabiegiem.
  4. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry brzucha, mięśni i błony otrzewnej za pomocą ostrza chirurgicznego i kleszczy.
  5. Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego PBS delikatnie wypchnij jelito w kierunku lewej strony jamy pozabrzusznej, odsłaniając prawą nerkę i moczowód. Długi czas zabiegu może spowodować pooperacyjne uszkodzenie jelit. Dlatego lepiej jest operować bez usuwania jelit z jamy brzusznej, gdy można uzyskać pole widzenia. Unikaj wysuszania jelit. Suche waciki lub gaza mogą spowodować uszkodzenie jelit.
  6. Podnieś prawy moczowód za pomocą kleszczy kątowych. Dwukrotnie podwiązać prawy moczowód za pomocą szwów 4/0 z jedwabnym oplotem. Przeciąć między szwami, pozostawiając szew znajdujący się bliżej nerki na dłużej.
  7. Ostrożnie przytrzymaj pozostały szew, nie ciągnąc zbyt mocno, i tępo wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz wzdłuż nerki. Uzewnętrznienie nerki i przeprowadzenie zabiegu poza ustrojem zmniejsza ryzyko fizycznego uszkodzenia wątroby.
    1. Zidentyfikuj naczynie krwionośne, inne niż tętnica nadnercza i żyła, które dostarcza krew do prawej nerki, a następnie podwiąż je lub przytnij. Gdy prawa nerka jest wystarczająco odłączona, podwiąż prawą tętnicę nerkową i żyłę za pomocą szwu z jedwabnym plecionym szwem 4/0. Zamiast szycia użyj klipsa hemostatycznego.
    2. Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego PBS delikatnie popchnij jelito w kierunku prawej strony jamy pozabrzusznej, aby odsłonić lewą nerkę, a następnie przykryj jelito zwilżoną serwetą, aby zapobiec jego wysuszeniu. Wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz wokół lewej nerki.
  8. Zidentyfikuj naczynie krwionośne, inne niż tętnica nadnercza i żyła, które dostarcza krew do lewej nerki, a następnie podwiąż je lub przytnij. Zacisnąć tętnicę nerkową i żyłę nerkową, aby wywołać niedokrwienie lewej nerki. Umieść klips hemostatyczny około 1 cm od nerki, aby uniknąć uszkodzenia miąższu nerki. Udane niedokrwienie można wizualnie potwierdzić poprzez stopniowe, równomierne ciemnienie nerki.
  9. Wróć do jamy brzusznej, uważając, aby uniknąć skrętu jelit; tymczasowo zamknij skórę brzucha i ułóż je, aby utrzymać wilgotne środowisko. Utrzymuj znieczulenie na wystarczającej głębokości, aby zapobiec reakcji na uszczypnięcie palca u nogi podczas zaciskania, unikając jednocześnie niepotrzebnie głębokiego znieczulenia. Czas zaciskania wynosi 25–45 min. Dłuższy czas zaciskania powoduje poważniejsze uszkodzenie nerek, ale także zwiększa długoterminową śmiertelność. Dostosuj, analizując wyniki patologii.
  10. Usuń zacisk po zakończeniu okresu niedokrwienia. Upewnij się, że poprawia się przepływ krwi, reperfuzja i kolor nerek. Upewnij się, że jelito nie jest skręcone przed zamknięciem skóry brzucha. Wkraplanić PBS dootrzewnowo jako suplement objętościowy, zanim brzuch zostanie zamknięty w dwóch warstwach. Zamknij skórę brzucha za pomocą nylonowych szwów 4-0. W przypadku dłuższych okresów usuwania nerek możliwość wystąpienia zrostów jelitowych można zmniejszyć poprzez oddzielne zamknięcie ściany brzucha i otrzewnej.
  11. Aby zminimalizować ryzyko infekcji pooperacyjnej, należy zastosować środek antyseptyczny (np. roztwór jodu/alkoholu) na obszar operacyjny. Buprenorfinę podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc. do momentu, gdy będzie to potrzebne.

2. Pobieranie próbek nerek

UWAGA: Ten film ma 45 minut zaciskania, pobierając nerki 24 godziny później.

  1. Znieczulić zwierzę 5% izofluranem i potwierdzić głębokość znieczulenia przez utratę odruchów.
  2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry brzucha, mięśni i błony otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy. Pobrać krew z żyły głównej dolnej nakłutej igłą 27 G.
  3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej ściany klatki piersiowej i wprowadź igłę 23 G do lewej komory. Potwierdź przepływ wsteczny. Wykonaj nacięcie w wątrobie i wstrzyknij 20 ml PBS. Gdy krew odpływa, wątroba zmienia kolor z czerwonego na różowy, potwierdzając, że wystarczająca ilość krwi została odsączona.
  4. Usuń lewą nerkę za pomocą kleszczy i nożyczek i umyj ją PBS na szalce Petriego. Usuń powięź nerkową za pomocą kleszczy, uważając, aby nie wysuszyć nerki.
  5. Przetnij nerkę na pół i użyj jednej połowy do histopatologii, a drugiej połowy do następnego kroku. Omijaj miednicę nerkową i zbierz 30 mg nerki. Przed użyciem przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie miRNA z próbek nerek

UWAGA: Tutaj próbki nerek o wadze 30 mg są homogenizowane za pomocą homogenizatora szklanego i systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki. Następnie miRNA z próbki nerki izoluje się za pomocą kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej.

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 lub 2,0 ml, 100% etanol, chloroform, homogenizator szklany, lód, system rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki9, kolumny wirujące na bazie membrany krzemionkowej9, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania zawierający guanidynę i etanol (bufor do płukania 1) oraz bufor do płukania zawierający etanol (bufor do płukania 2).
  2. Umieścić próbkę nerki o stężeniu 30 mg w szklanym homogenizatorze i dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Wykonaj ten krok na lodzie, ponieważ tkanka ulega denaturacji pod wpływem ciepła.
  3. Homogenizować próbkę nerki, powoli dociskając tłuczek do próbki, przekręcając ją. Powtórz ten proces kilkadziesiąt razy na lodzie, aż próbka nerki całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Gdy miRNA nie zostanie uzyskane w kolejnych pomiarach, jest to prawdopodobnie spowodowane niewystarczającym rozpuszczeniem.
  4. W celu dalszej homogenizacji przenieść homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Odwirować to w temperaturze 14 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść homogenizowany lizat do nowej probówki do mikrowirówki.
  6. Dodać 140 μl chloroformu do homogenizowanego lizatu i szczelnie zamknąć probówkę. Mieszaj probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund.
  7. Próbki należy inkubować przez 2–3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować je w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przenieść supernatant (zwykle 300 μl) do nowej probówki do mikrowirówki bez naruszania osadu i dodać 1,5 objętości (zwykle 450 μl) 100% etanolu. Mieszać próbkę przez wirowanie przez 5 sekund.
  9. Pobrać pipetę do 700 μl próbki do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij pokrywę kolumny i odwiruj przy 15 000 × g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.
  10. Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby dokładnie przepłukać próbkę. Zamknij pokrywę kolumny i odwiruj ją przy 15 000 × g przez 15 s. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.
  11. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby usunąć wszelkie ślady soli. Zamknij pokrywę kolumny i odwiruj przy 15 000 × g przez 15 s. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.
    1. Powtórz krok 3.11.
  12. Ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej o masie 15 000 × g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.
  13. Umieść kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Przenieś 25 μl wody wolnej od RNaz do kolumny i zamknij nasadkę kolumny. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie odwirować ją w temperaturze 15 000 × g przez 1 minutę.
  14. Przenieść 25 μl eluatu zawierającego miRNA do nowej probówki do mikrowirówki. Ponieważ miRNA ulega degradacji przez wielokrotne rozpuszczanie, zaleca się dozowanie próbki do 2 lub 3 probówek. Przed użyciem należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Odwrotna transkrypcja miRNA

UWAGA: Tutaj 1,0 μg wyizolowanego RNA jest transkrybowane wstecznie przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i starterów oligo-dT.

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; 8-dołkowe probówki paskowe; Woda wolna od RNaz; lód; 10x Mieszanka Kwasów Nukleinowych zawierająca deoksynukleotydy, trifosforany rybonukleotydów i startery oligo-dT; mieszanina polimerazy poli(A) i odwrotnej transkryptazy; i bufor aktywujący, w tym Mg2+, dezoksyrybonukleotydy, startery oligo-dT i losowe startery10.
  2. Przygotuj roztwór mieszaniny głównej zawierający 2,0 μl 10x mieszaniny kwasów nukleinowych, 2,0 μl mieszaniny polimerazy poli(A) i odwrotnej transkryptazy oraz 4,0 μl 5x buforu aktywującego, w tym Mg2+, dezoksyrybonukleotydy, startery oligo-dT i losowe startery, w sumie 8,0 μl na probówkę.
  3. Dozować 8,0 μl roztworu mieszanki głównej do każdej probówki.
  4. Do każdej probówki dodać 1,0 μg wyizolowanych miRNA oczyszczonych z próbki nerki.
  5. Dodać wodę wolną od RNaz do każdej probówki, w sumie 20 μl. Dokładnie wymieszać pipetując i odwirować przy 1 500 x g przez 15 sekund.
  6. Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie bezpośrednio inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Ten krok można wykonać w termocyklerze.
  7. Przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej i rozcieńcz 10 razy (1:10) wodą wolną od RNaz.
  8. Rozcieńczone cDNA należy przechowywać przez krótki czas na lodzie i przez długi czas w temperaturze -80 °C przed użyciem.

5. qRT-PCR miRNA

UWAGA: qRT-PCR miRNA jest wykonywany przy użyciu barwnika interkalacyjnego. Zastosowano tu startery dla U6 small nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p i miRNA-574-5p.

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, 96-dołkowe płytki reakcyjne do qRT-PCR, folia adhezyjna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, startery specyficzne dla miRNA, PCR Master Mix składający się z polimerazy DNA Taq, buforu PCR, deoksynukleotydów i uniwersalnych starterów10 oraz instrument do PCR w czasie rzeczywistym.
  2. Przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą 12,5 μl 2x PCR Master Mix, 2,5 μl każdego startera miRNA (5 μM) rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz i 1,25 μl 10x uniwersalnych starterów dla każdej studzienki.
  3. Dozować 22,5 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
  4. Dodaj 2,5 μl matrycowego cDNA do każdej studzienki.
  5. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Następnie odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 30 s.
  6. Korzystając z przyrządu i oprogramowania do PCR w czasie rzeczywistym, uruchom program cykliczny PCR w następujący sposób.
    1. Umieść płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Przypisz nazwę do próbki i docelowego miRNA w każdym dołku za pomocą oprogramowania Real-Time PCR.
    2. Wprowadź następujące warunki cykliczne PCR w oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami: preinkubacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s.
  7. Analizuj dane qRT-PCR za pomocą oprogramowania urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Sprawdź, czy nie występują reakcje niespecyficzne. Przeanalizuj krzywą dysocjacji lub krzywą topnienia, aby potwierdzić, że nie wystąpiło wzmocnienie inne niż zamierzone.
    1. Normalizuj poziom ekspresji docelowych miRNA do RNU-6 jako kontroli endogennej. Oblicz względny poziom ekspresji docelowych miRNA za pomocą metody 2−ΔΔCT 11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj zbadano profil ekspresji miRNA u myszy AKI. Profil ekspresji miRNA został zbadany w różnych narządach i tkankach myszy. MiRNA są ważnymi regulatorami potranskrypcyjnymi i są obecnie szeroko badane w charakterystyce różnych chorób, w tym AKI. MiRNA mogą pomóc w wyjaśnieniu stanów patologicznych i mogą być stosowane w leczeniu AKI12. Głównymi przyczynami AKI są IRI, nefrotoksyczne zapalenie jelit i sepsa. IRI nerki stanowi jeden z głównych czynników ryzyka rozwoju AKI. Doniesiono, że liczne mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z protokołu przedstawionego w tym manuskrypcie, miRNA z nerki myszy IRI zostały pomyślnie oczyszczone i wykryte za pomocą qRT-PCR. Punkty krytyczne procedury indukującej IRI w protokole obejmują dokładne monitorowanie temperatury ciała i stężeń znieczulenia, o których wiadomo, że wpływają na AKI20. Zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia wizualne potwierdzenie, czy osiągnięto niedokrwienie-reperfuzję. Istnieją jednak pewne ograniczenia tego modelu IRI. Wydłużenie czasu zacisku w ce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorowi Nam Nguyenowi za redakcję szkicu tego rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pęseta stożkowa z wygiętą końcówką bez haczykaNatsume SeisakushoMA-47
Bufor RLTQiagen79216bufor myjący 1
Bufor RWTQiagen1067933mycie 2
myszy C57B6SLCnie przypisuje
kleszcza z zębamiKleszcz Natsume SeisakushoMA-49
bez zębówNatsume SeisakushoMA-48-1
Klipsy hemostatyczneNatsume SeisakushoKN− 353
MicroAmp Optical 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR96-dołkowa płytka reakcyjnaThermo Fisher Scientific4316813
Optyczna folia samoprzylepna MicroAmpThermo Fisher Scientific 4311971do 96-dołkowej płytki reakcyjnej
miRNA-132-3p starterQiagenMS000034585'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
starter miRNA-17-5pQiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p starterQiagenMS000315145'UAAGGUGCAUAGUGCAGAGAUAG
miRNA-212-3p starterQiagenMS000038155'UAACAGUCUCCAGAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p starterQiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p starterQiagenMS000038715'UGUCAGUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p starterQiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kitQiagen217004kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej
miScript II RT zestawQiagen218161
miScript SYBR Zielony zestaw PCRQiagen218073
QIA niszczarkaQiagen79654system rozdrabniania biopolimerów w mikrowirówce kolumna wirowa
QIAzol Odczynnik do lizyQiagen79306odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny
System QuantStudio 12K Flex Real-Time PCRThermo Fisher Scientific4472380przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym
QuantStudio 12K Flex Oprogramowanie w wersji 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380oprogramowanie do PCR w czasie rzeczywistym
Starter RNU6-2QiagenMS00033740nieujawnione
nożyczki chirurgiczneNatsume SeisakushoB-2
Aplikator do klipsów naczyniowychVITALITEC1621420

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, K. J. Acute renal failure: much more than a kidney disease. Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).
  2. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  3. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  4. Yang, G., et al. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).
  9. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  10. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  11. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  12. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).
  13. Ichii, O., Horino, T. MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).
  14. Ma, L., et al. Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).
  15. Saikumar, J., et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).
  16. Li, Y. F., et al. MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury. Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).
  17. Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing. Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).
  18. Liu, Y., et al. MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury. Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).
  19. Colbert, J. F., et al. A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).
  20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MicroRNA PurificationqRT PCR DetectionAcute Kidney InjuryRNA IsolationcDNA SynthesisQuantitative PCRKidney Ischemia ModelBiomarker DetectionMicroRNA Quantification

Powiązane artykuły