Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka makroreologiczna śluzu grabi skrzelowej w tołpyga, Hypophthalmichthys molitrix

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61379

⸱

10 lipca 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania charakterystyki reologicznej śluzu znajdującego się na grabiach skrzelowych (GR) karasia srebrzystego. Właściwości lepkosprężyste śluzu GR, uzyskane przez pomiar modułów lepkości, magazynowania i strat, są oceniane dla pozornej granicy plastyczności, aby zrozumieć mechanizm podawania filtra w GR.

Streszczenie

Karp srebrzysty, Hypophthalmichthys molitrix, jest inwazyjną roślinożerną rybą filtracyjną, która zaatakowała naturalne drogi wodne górnego dorzecza rzeki Missisipi dzięki wysoce wydajnemu mechanizmowi filtrowania. Charakterystyczne narządy zwane grabiami skrzelowymi (GR), znajdujące się w wielu takich filtratorach, ułatwiają skuteczną filtrację cząstek pokarmu, takich jak fitoplankton, które mają wielkość kilku mikronów.

Motywacja do zbadania reologii śluzu GR wynika z naszego pragnienia zrozumienia jego roli we wspomaganiu procesu filtrowania u karpia srebrzystego. Płyn bogaty w śluz, w stanie "gęstym i lepkim" może ułatwiać przyleganie cząstek pokarmowych. Przenikanie i transport przez membranę GR są ułatwione przez działanie zewnętrznych sił ścinających, które indukują różne szybkości odkształcania przy ścinaniu. Dlatego reologia śluzu może dostarczyć istotnej wskazówki na temat ogromnej przewagi konkurencyjnej karpia srebrzystego w puli ryb filtrujących. Na tej podstawie założono, że śluz GR może pełnić funkcję adhezyjną do cząstek żywności i działać jako pojazd transportowy, który wspomaga proces podawania filtra.

Głównym celem protokołu jest określenie granicy plastyczności śluzu, przypisanej minimalnemu naprężeniu ścinającemu wymaganemu do zainicjowania przepływu, przy którym po raz pierwszy obserwuje się nieodwracalne odkształcenie plastyczne na strukturalnym materiale lepkosprężystym. W związku z tym właściwości reologiczne śluzu GR, tj. lepkość, magazynowanie i moduły strat, badano pod kątem jego nienewtonowskiego, rozrzedzającego się przy ścinaniu charakteru za pomocą reometru rotacyjnego.  

Przedstawiony tutaj protokół służy do analizy właściwości reologicznych śluzu wydobytego z grabi skrzelowych karasia srebrzystego, złowionego w Hart Creek, na rzece Missouri. Protokół ma na celu opracowanie skutecznej strategii badań reologicznych i charakterystyki materiału śluzu, który przyjmuje się, że jest ustrukturyzowanym materiałem lepkosprężystym.

Wprowadzenie

Srebrzysty karp, Hypophthalmichthys molitrix, jest planktonożernym filtratorem i inwazyjnym gatunkiem, który przeniknął do kilku naturalnych dróg wodnych w Stanach Zjednoczonych. Gatunek ten został początkowo wprowadzony w górnym dorzeczu rzeki Missisipi w celu zwalczania zakwitów glonów1,2,3. Karp srebrzysty jest niezwykle wydajnym karmnikiem. Zazwyczaj rozmiary cząstek żywności spożywczej wahają się od 4 do 20 μm do większych zooplanktonów, które wynoszą około 80 μm3,4,5. Gatunek ten wyprzedził inne rodzime ryby i może potencjalnie wyrządzić ogromne szkody rodzimym drogom wodnym, ograniczając dostępne zasoby1,2,6. W związku z tym ryby filtrujące, takie jak karp srebrzysty i karp grubogłowy, stanowią poważne zagrożenie dla Wielkich Jezior1,2,6,7,8.

Ryby żywiące się filtrem posiadają specjalne organy zwane grabiami skrzelowymi (GRs) z cienką warstwą śluzu znajdującą się na ich powierzchni. Narządy te poprawiają skuteczność filtracji i agregacji małych cząstek z dopływającego płynu. Celem przedstawionego w niniejszym dokumencie protokołu jest scharakteryzowanie nienewtonowskich, ścinających się ścinanie właściwości materiału i granicy plastyczności śluzu GR uzyskanego z wewnętrznej powierzchni grabi skrzelowych u karpia srebrzystego. Wartość granicy plastyczności śluzu GR, określona za pomocą reometru rotacyjnego, jest przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Zmierzona granica plastyczności, zwana również "pozorną granicą plastyczności", zależy od metod testowania, takich jak stała szybkość ścinania lub dynamiczne odkształcenie oscylacyjne typu 9,10. Rozrzedzany przy ścinaniu, 'płyn o granicy plastyczności', przechodzi od zachowania przypominającego ciało stałe do zachowania podobnego do cieczy przy krytycznym przyłożonym naprężeniu9,11. Pozorna granica plastyczności to minimalne naprężenie ścinające wymagane do zainicjowania przepływu lub takie, przy którym po raz pierwszy obserwuje się nieodwracalne odkształcenie plastyczne, gdy śluz przechodzi z materiału żelowego do materiału podobnego do płynu. Takie zachowanie można zaobserwować w strukturalnych materiałach lepkosprężystych. Przejście śluzu GR od żelowego do płynnego wiąże się z dwiema funkcjami, tj. rolą adhezyjną do zbierania cząstek pokarmu oraz rolą pojazdu transportowego, która pomaga w procesie dostarczania i filtracji cząstek stałych. Rozszerzona funkcja śluzu obejmuje tworzenie barier dyfuzyjnych w odporności na choroby i oddychaniu, zapewnianie kontrolowanego uwalniania czynników odżywczych, składników toksycznych i wydalania, tworzenie szlaków metabolicznych do żerowania i gniazdowania, pomoc w ochronie drapieżników oraz wytwarzanie modyfikacji warstwy granicznej, które poprawiają lokomocję i wydajność napędową12,13,14.

W przeciwieństwie do prostych płynów, złożone płyny, takie jak śluz, mają właściwości, które zmieniają się w zależności od warunków przepływu i wymagają dodatkowych parametrów pomiarowych, aby określić ich fizyczne zachowanie na dużą skalę. Aby monitorować lepkość i granicę plastyczności śluzu GR, pomiary reologiczne wykonuje się za pomocą reometru rotacyjnego. Reometr rotacyjny przykłada stałe lub oscylacyjne naprężenie ścinające lub odkształcenie za pomocą obracającego się dysku stykającego się z próbką płynu i mierzy jego reakcję. Uzasadnieniem stosowania tego instrumentu i techniki jest to, że reometr może dostarczyć zestaw pomiarów opisujących właściwości materiałowe śluzu GR karasia srebrzystego, których nie można określić na podstawie samej lepkości.

Śluz jest materiałem lepkosprężystym, a jego mechaniczna reakcja na narzucone odkształcenie jest pomiędzy reakcją czystego ciała stałego (podlegającego prawu sprężystości Hooke'a) a czystą cieczą (podlegającą prawu lepkości Newtona)15,16. Złożona sieć makromolekularna zawarta w śluzie może rozciągać się i zmieniać orientację w odpowiedzi na siły zewnętrzne lub deformację. Reometr rotacyjny składa się z geometrii stożka i płytki Peltiera, jak pokazano na Rysunek 1 i Rysunek 2 (patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze specyfikacją oprzyrządowania). Celem pracy było opracowanie protokołu do określania właściwości reologicznych śluzu GR. Przewagą reometru rotacyjnego nad lepkościomierzem jest jego zdolność do wykonywania pomiarów dynamicznych przy użyciu małych objętości próbek. Objętość próbki śluzu GR w tym badaniu wynosiła około 1,4 ml. Z drugiej strony lepkościomierz jest ograniczony do stałych szybkości ścinania i wymaga dużych objętości próbek.

Oczekuje się, że właściwości reologiczne śluzu będą się znacznie różnić w obrębie anatomii karpia srebrzystego. Na przykład właściwości śluzu znajdującego się na powierzchni GR mogą różnić się od właściwości narządu epibranchialnego. Aby uwzględnić potencjalną zmienność właściwości śluzu w różnych regionach ryby, uzyskaną próbkę śluzu GR rozcieńczono, a następnie stworzono roztwory o trzech stężeniach i przetestowano je za pomocą reometru rotacyjnego. Dane i wyniki dotyczące reologii śluzu zgłoszone po wykonaniu protokołu wykazały skuteczność techniki pomiaru. Dane poglądowe przedstawione w niniejszej pracy nie mają na celu uogólnienia na całą populację karasia srebrzystego. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół może zostać rozszerzony w celu zbadania reologii śluzu w większych zestawach próbek w celu przetestowania innych hipotez.

Celem tego badania jest pokazanie zmienności właściwości reologicznych reologii śluzu GR przy trzech różnych stężeniach śluzu (400 mg/mL, 200 mg/ml i 100 mg/mL). Stężenie 400 mg/ml reprezentuje próbkę surowego śluzu pobraną z ryb GR. Do rozcieńczenia próbki surowego śluzu użyto wody dejonizowanej (DI) do rozcieńczenia próbki surowego śluzu do stężeń 200 mg/ml i 100 mg/ml. Rozcieńczenie próbek śluzu pozwoliło na ocenę stopnia rozrzedzenia przy ścinaniu i pozornej granicy plastyczności w funkcji stężenia oraz określenie stężenia, przy którym śluz GR przechodzi w zachowanie nienewtonowskie. Wytrząsarka została użyta do rozbicia wszelkich dużych grudek śluzu w próbkach w celu złagodzenia błędów w danych reologicznych spowodowanych niejednorodnością.

U większości kręgowców, w tym ryb, dominującymi makrocząsteczkami tworzącymi śluz są glikoproteiny (mucyny), które mają tendencję do pęcznienia w wodzie przez splątanie lub chemiczne sieciowanie i tworzą materiał podobny do żelu12,13,17,18,19,20. Makrocząsteczki o dużej masie cząsteczkowej, tworzące żel i wysoka zawartość wody odzwierciedlają śliskość śluzu w klasie mucus13. Wysoki stopień interakcji międzycząsteczkowych prowadzi do tworzenia żelu, podczas gdy niższe poziomy interakcji międzymakromolekularnych lub zerwanych wiązań skutkują płynami o wysokiej lepkości21.

Procesy filtracji cząstek pokarmowych u ryb filtrujących są wspomagane przez właściwości związane ze śluzem GR, takie jak kohezja i lepkość, które określają jego potencjał adhezji i przyczepności22. Siła adhezji na bazie śluzu zależy od określonych oddziaływań międzycząsteczkowych, elektrostatycznych lub hydrofobowych23. Sanderson i wsp.24 przeprowadzili badanie karmienia zawiesinową u czarnych ryb, w którym znaleźli dowody na adhezję śluzu. Stwierdzili oni, że po przyleganiu zawieszonych cząstek pokarmu do powierzchni błony śluzowej następuje transport zagregowanych grudek cząstek związanych ze śluzem przez skierowany przepływ wody działający na niego24. Śluz wystawiony na odkształcanie ścinające generowane przez przepływ wody ułatwia dostarczanie cząstek pokarmowych do narządów trawiennych. Do obserwacji przefiltrowanych cząstek wykorzystano techniki endoskopowe24.

Literatura na temat zakresu szybkości ścinania i praktycznych ograniczeń w testach reologicznych śluzu GR jest skąpa. W związku z tym zwrócono się o wskazówki do badań reologicznych dotyczących śluzu żołądkowego, nosowego, szyjkowego i płucnego, śluzu skóry łososia, śluzu śluzu śluzu śluzicy i smaru powierzchni stawów kostnych, w których badano charakterystykę reologiczną i atrybuty nienewtonowskie11,12,25,26,27,28,29,30,31. Ostatnio badano wpływ śluzu skóry ryb na lokomocję i sprawność napędową przy użyciu wiskozymetrii o stałej szybkości ścinania. Badania reologii śluzu skórnego (bez rozcieńczenia lub homogenizacji) dotyczące dorady, labraksa i dolara wykazały nienewtonowskie zachowanie przy zazwyczaj niskich szybkościach ścinania14. W innym powiązanym badaniu stwierdzono, że surowe próbki śluzu skórnego z grzbietowej i brzusznej strony podeszwy senegalskiej wykazują zachowanie nienewtonowskie, co wskazuje na wyższą lepkość śluzu brzusznego przy wszystkich rozważanych szybkościach ścinania32. Inne protokoły reologiczne odnoszące się do rozwoju rusztowania hydrożelowego i dla wysoce skoncentrowanych zawiesin przy użyciu lepkościomierzu o stałej szybkości ścinania zostały również opisane w literaturze33,34.

W tym badaniu, właściwości śluzu GR zostały zbadane za pomocą kontrolowanego szybkości odkształcania, reometru rotacyjnego, który był szeroko stosowany w eksperymentach reologicznych na złożonych płynach biologicznych25. W przypadku płynów Newtona lepkość pozorna pozostaje stała, jest niezależna od szybkości ścinania, a naprężenia ścinające zmieniają się liniowo wraz z szybkością odkształcenia ścinającego (Rysunek 3A, B). W przypadku płynów nienewtonowskich (takich jak płyny rozrzedzające się przy ścinaniu) lepkość jest zależna od szybkości ścinania lub historii odkształceń (Rysunek 3A, B). Moduł stratności (G") reprezentuje stopień, w jakim materiał opiera się tendencji do płynięcia i jest reprezentatywny dla lepkości płynu (Rysunek 4). Moduł akumulacyjny (G') reprezentuje tendencję materiału do odzyskiwania swojego pierwotnego kształtu po odkształceniu wywołanym naprężeniami i jest równoważny elastyczności (Rysunek 4). Kąt fazowy (δ) lub wartość styczną strat oblicza się z odwrotności tangensa G"/G'. Reprezentuje równowagę między utratą energii a magazynowaniem i jest również powszechnym parametrem do charakteryzowania materiałów lepkosprężystych (δ = 0° dla ciała stałego Hooke'a; δ = 90° dla lepkiej cieczy; δ < 45° dla lepkosprężystego ciała stałego i δ > 45° dla cieczy lepkosprężystej) (Rysunek 4)25. Pozorna granica plastyczności (σy) w płynach strukturalnych reprezentuje zmianę stanu, którą można zaobserwować w danych reologicznych z przemiatania w stanie ustalonym i dynamicznego przemiatania naprężenie-odkształcenie10. Jeśli zewnętrzne przyłożone naprężenie jest mniejsze niż pozorne naprężenie plastyczności, materiał odkształci się elastycznie. Gdy naprężenie przekroczy pozorną granicę plastyczności (oznaczone jako "naprężenie średnie" w Rysunek 3B), materiał przejdzie z odkształcenia sprężystego do plastycznego i zacznie płynąć w stanie ciekłym35. Pomiar modułu spichcjonalnego (G') i modułu strat (G") w próbce śluzu w warunkach naprężenia oscylacyjnego (lub odkształcenia) określa ilościowo zmianę stanu materiału z żelowego na lepkosprężyste zachowanie podobne do cieczy.

Rodzaje testów reometrycznych wykonywanych w celu monitorowania danych dotyczących modułu przechowywania (G'), modułu strat (G") i lepkości pozornej (η) są opisane tutaj. Testy oscylacji dynamicznej (przemiatanie odkształceń i przemiatanie częstotliwości) monitorowały G' i G" przy kontrolowanych oscylacjach geometrii stożka. Dynamiczne testy przemiatania odkształceń określiły liniowy obszar lepkosprężysty (LVR) śluzu, monitorując wewnętrzną odpowiedź materiału (Rysunek 4). Wymiatanie szczepów wykorzystano do określenia zachowania plonowania przy stałej częstotliwości oscylacji i temperaturze. Testy dynamicznego przemiatania częstotliwości monitorowały reakcję materiału na rosnącą częstotliwość (szybkość odkształcania) przy stałej amplitudzie (odkształceniu lub naprężeniu) i temperaturze. Odkształcenie utrzymywano w liniowym obszarze lepkosprężystym (LVR) dla dynamicznych testów przemiatania częstotliwości. Testy szybkości ścinania w stanie ustalonym monitorowały lepkość pozorną (η) przy stałym obrocie geometrii stożka. Śluz GR poddano stopniowym stopniom naprężeń i monitorowano lepkość pozorną (η, Pa.s) pod kątem różnej szybkości ścinania (ý, 1/s).

Protokół przedstawiony w tym artykule traktuje śluz GR jako złożony materiał o nieznanej lepkosprężystości z pewnym liniowym zakresem lepkosprężystości. Śluz rybi został wyekstrahowany z GR karpia srebrzystego podczas ekspedycji wędkarskiej w miejscu Hart Creek na rzece Missouri przez profesor L. Patricię Hernandez (Wydział Nauk Biologicznych, Uniwersytet George'a Washingtona) 1,2,36. Tablica GR wewnątrz pyska karasia srebrzystego jest pokazana w Rysunek 5A a schematyczny rysunek jest przedstawiony w Rysunek 5B. Wycięty GR jest pokazany w Rysunek 5C.Ekstrakcja śluzu z GR karasia srebrzystego jest przedstawiona jako przykład na rysunkach schematycznych Rysunek 5D, E. Wszystkie testy reometryczne zostały przeprowadzone w stałej, kontrolowanej temperaturze 22 ± 0,002 °C, temperaturze zarejestrowanej w miejscu połowu1,2,36. Każda próbka śluzu została trzykrotnie przebadana reometrem, a uśrednione wyniki przedstawiono wraz ze słupkami błędu statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów śluzu o różnych stężeniach

UWAGA: Do tego eksperymentu przygotowano trzy stężenia roztworu śluzu (400 mg/mL, 200 mg/mL i 100 mg/mL z przybliżonymi objętościami odpowiednio 1 mL, 1 mL i 2 mL). 

  1. Aby obliczyć masę śluzu, zmierz średnią masę probówek ze śluzem (Mwith-mucus ; mg) oraz bez śluzu (Mvials ; mg). Następnie odejmij masę probówek bez śluzu od masy probówek ze śluzem (Mmucus = Mwith-mucus - Mvials ; mg).  
  2. Rozcieńcz śluz do trzech stężeń (400, 200, 100 mg/mL) za pomocą wody dejonizowanej (DI).
    1. Przygotuj pierwsze stężenie roztworu śluzu, 400 mg/mL, dodając 0,6 mL wody DI do śluzu za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Ponieważ przybliżona objętość wyekstrahowanego śluzu wynosiła 1,4 mL, roztwór 400 mg/mL będzie miał całkowitą objętość ~ 2 mL.
    2. Umieść probówkę z roztworem śluzu 400 mg/mL na wytrząsarce, aby upewnić się, że roztwór śluzu jest odpowiednio zhomogenizowany, a wszelka aglomeracja cząsteczek śluzu została zminimalizowana.
    3. Przygotuj drugie stężenie roztworu śluzu, 200 mg/mL, pobierając połowę objętości roztworu śluzu o pierwszym stężeniu do nowej probówki za pomocą mikropipety i dodając 1 mL wody DI do nowej probówki.
    4. Powtórz krok 1.2.2 dla pierwszej i drugiej probówki z roztworami śluzu.
    5. Przygotuj trzecie stężenie roztworu śluzu, 100 mg/mL, pobierając połowę objętości (1 mL) roztworu 200 mg/mL do nowej probówki za pomocą mikropipety i dodając wody DI do nowej probówki.
    6. Powtórz krok 1.2.2 dla wszystkich trzech stężeń roztworów śluzu w ich odpowiednich probówkach (patrz Supplementary Figure 1).
    7. Przechowuj probówki z roztworami śluzu w lodówce do czasu przeprowadzenia kalibracji i pomiarów reometrem.

2. Pomiary i pozyskiwanie danych przy użyciu reometru

UWAGA: Oprogramowanie wykorzystane w niniejszym protokole do sterowania urządzeniem i akwizycji danych z reometru zostało wymienione w Tabeli materiałów. Oprogramowanie to będzie określane jako „oprogramowanie do sterowania reometrem”.

  1. Przygotuj i skalibruj reometr.
    1. Włącz zasilanie sprężonym powietrzem do reometru i upewnij się, że stół pneumatyczny oraz reometr są wypoziomowane za pomocą poziomicy. Odkręć nasadkę ochronną z wału reometru, trzymając wał nieruchomo podczas odkręcania.
    2. Włącz główne przełączniki reometru, aby aktywować łożyska magnetyczne urządzenia.
    3. Uruchom komputer sterujący z zainstalowanym oprogramowaniem do sterowania reometrem i uruchom aplikację (patrz Supplementary Figure 2).
    4. Przeprowadź kalibrację urządzenia, wybierając z okna oprogramowania karty „Calibration | Instrument”. Wybierz opcję „Instrument”. Kliknij „Calibrate” w sekcji „Inertia”. Zapisz wartość kalibracji bezwładności urządzenia w μN.m.s2 i powtórz kalibrację co najmniej 3 razy, aby upewnić się, że wartości kalibracji różnią się od siebie o nie więcej niż 10% (patrz Supplementary  Figure 3).
  2. Zainstaluj geometrię reometru na wale urządzenia.
    1. Kliknij kartę „Geometries” w oprogramowaniu sterującym reometrem.
    2. Oczyść stożek o wymaganej geometrii (średnica 40 mm, stożek 1◦ 0’ 11’’) oraz płytkę Peltiera izopropanolem (patrz Table 1, Table of Materials, Figure 1 oraz Figure 2).
      UWAGA: Płytka Peltiera jest zainstalowana w reometrze; można ją czyścić izopropanolem, gdy jest bezpośrednio przymocowana do urządzenia.
    3. Upewnij się, że mocowanie płytki Peltiera jest wolne od widocznego kurzu; w razie potrzeby oczyść je izopropanolem. Zainstaluj płytkę Peltiera, jeśli nie jest ona fabrycznie zamontowana w reometrze, i podłącz przewody radiatora.
    4. Naciśnij przycisk „Lock button” na reometrze, aby zablokować wał połączony z geometrią stożkową. Powstrzymuje to pozycję wału, ale pozwala mu na swobodny obrót w tej pozycji.
    5. W karcie oprogramowania sterującego reometrem kliknij „Smart Swap | Enabled”, aby umożliwić automatyczne wykrywanie geometrii (patrz Supplementary Figure 4).
    6. Obróć wał na górze reometru, aby przykręcić geometrię. Na tym etapie oprogramowanie wykryje geometrię stożka o średnicy 40 mm i kącie 1◦ 0’ 11’’ (patrz Table 1 i Table of Materials).
    7. Powtórz kroki 2.2.5 – 2.2.6, aby upewnić się, że geometria została wykryta.
    8. W sekcji „Control Panel” oprogramowania sterującego reometrem wybierz „Gap”, kliknij ikonę „Options” i wybierz opcję „Axial Force”. Ustaw siłę osiową na „1 Newton”; ma to na celu zapewnienie kontaktu geometrii stożkowej z płytką Peltiera w celu inicjalizacji przerwy zerowej (patrz Supplementary Figure 5).
  3. Przeprowadź kalibrację geometrii reometru.
    1. Z okna oprogramowania wybierz kartę „Geometry”. Kliknij „Calibrate” w sekcji „Inertia”. Zapisz wartość kalibracji bezwładności geometrii w μN.m.s2 i powtórz tę czynność 2-3 razy, aby upewnić się, że wartości kalibracji różnią się od siebie o nie więcej niż 10%.
    2. W oknie oprogramowania kliknij „Calibrate” w sekcji „Friction”. Zapisz wartość kalibracji tarcia geometrii w μN.m/(rad/s) i powtórz tę czynność 2-3 razy, aby upewnić się, że wartości kalibracji różnią się od siebie o nie więcej niż 10% (patrz Supplementary Figure 6).
  4. Przeprowadź inicjalizację przerwy zerowej
    UWAGA: Ponieważ geometrię nie można precyzyjnie podnieść nad płytkę Peltiera w celu wykonania pomiarów bez referencyjnej pozycji „zero”, przeprowadza się inicjalizację przerwy zerowej. Do celów pomiarowych geometria posiada wbudowaną przerwę geometryczną wynoszącą 24 µm oraz przerwę przycinającą (trim gap) wynoszącą 28 µm. Przerwa przycinająca służy do efektywnego usunięcia nadmiaru cieczy, która może wypłynąć poza powierzchnię geometrii. Przerwy te są niezbędne do dokładnego pomiaru danych z wykorzystaniem próbki i reometru. Krok 2.4.1 jest absolutnie wymagany, aby upewnić się, że geometria jest ustawiona na przerwę zerową, co pozwoli na uzyskanie odpowiednio przerwy geometrycznej 24 µm i przerwy przycinającej 28 µm.
    1. Kliknij ikonę „Zero gap” w karcie „Gap” w sekcji „Control Panel” w oknie oprogramowania. Inicjalizacja jest zakończona, gdy siła osiowa działająca na geometrię jest większa lub równa 1 N w momencie dotknięcia płytki Peltiera. Upewnij się, że przerwa reometru została wyzerowana, aby jej pozycja referencyjna była dokładna (patrz Supplementary Figure 7 i Supplementary Figure 8).
    2. Użyj przycisków „strzałka w górę i w dół” na urządzeniu lub ikon „podnoszenia i opuszczania geometrii” w karcie „Gap” oprogramowania sterującego reometrem, aby podnieść geometrię na dowolną wysokość. Ekran sterujący reometru oraz panel sterowania w oprogramowaniu wyświetlą tę samą wysokość przerwy.
  5. Skonfiguruj procedurę eksperymentalną w oprogramowaniu sterującym reometrem. Przeprowadź charakterystykę właściwości reologicznych, korzystając z geometrii stożek-płytka Peltiera w temperaturze 22 °C.
    UWAGA: Strona internetowa US Geological Survey została wykorzystana do ustalenia temperatury wody w rzece w dniu 20 września 2018 r., kiedy to w lokalizacji Hart Creek odłowiono karpie srebrzyste wykorzystane w eksperymentach z śluzem GR36. Temperatura śluzu może wpływać na właściwości reologiczne. Dostosowanie wartości do temperatury rzeki ma na celu przybliżenie warunków, w których można realistycznie oszacować właściwości śluzu.  
    1. W oprogramowaniu sterującym reometrem wybierz kartę „Experiments” i uzupełnij odpowiednie informacje, takie jak „Name” (nazwa), „Operator”, „Project” itp.  (patrz Supplementary Figure 9)
    2. Wybierz kartę „Geometry” i upewnij się, że informacje są zgodne z krokami 2.2.5. – 2.2.7. (patrz Supplementary Figure 10).
    3. Wybierz kartę „Procedure” i za pomocą klawiszy strzałek ustaw procedurę „1: Oscillation Amplitude” (patrz Supplementary Figure 11).
    4. Zainicjuj ustawienia „Environmental Control” w następujący sposób: „Temperature = 22 °C”; „Soak Time = 120 s” i zaznacz pole „Wait for Temperature” (patrz Supplementary Figure 11).
    5. Zainicjuj ustawienia „Test Parameters” w następujący sposób: „Frequency = 1 Hz”; ustaw „Logarithmic sweep”; „Torque = 10 do 10000 μN.m”; „Points per decade = 5” (patrz Supplementary Figure 11).
  6. Przygotuj eksperyment w celu wyznaczenia liniowego zakresu lepkosprężystego (LVR) śluzu o znanym stężeniu (100 mg/mL).
    1. Używając odpowiedniej mikropipety i końcówki do pipety, pobierz około 0,3 mL roztworu śluzu rybiego o stężeniu 100 mg/mL (patrz Krok 1.2, Table of Materials).
    2. Nanieś roztwór śluzu na płytkę Peltiera za pomocą mikropipety (patrz Figure 2).
    3. Naciśnij przycisk „Trim Gap” na reometrze, aby opuścić geometrię na płytkę Peltiera. Alternatywnie kliknij ikonę „Trim Gap” w karcie „Gap” w opcjach „Control Panel” w oprogramowaniu sterującym reometrem (patrz Supplementary Figure 12).
    4. Użyj mikropipety z końcówką, aby usunąć nadmiar roztworu śluzu i upewnić się, że ciecz znajduje się pod geometrią, bez wycieków w pobliżu jej obwodu.
      UWAGA: Nieprawidłowe naniesienie cieczy doprowadzi do błędów w pomiarach. Zbyt mała ilość próbki obniży rozkład momentu obrotowego, a zbyt duża ilość doprowadzi do błędnych rozkładów naprężeń z powodu wycieku wzdłuż krawędzi.
    5. Przełączaj karty „Motor” i „Velocity” na 5 rad/s i 0 rad/s naprzemiennie, aż bezwładność i prędkość próbki pod geometrią zostaną zminimalizowane. Ekran sterujący reometru oraz panel sterowania w oprogramowaniu wyświetlą prędkość (patrz Supplementary Figure 13).
    6. Naciśnij przycisk „Geometry Gap” na reometrze, aby opuścić geometrię do zadanego, odpowiedniego odstępu dla konkretnej geometrii. Alternatywnie kliknij ikonę „Geometry Gap” w karcie „Gap” w opcjach „Control Panel” w oprogramowaniu sterującym reometrem (patrz Supplementary Figure 14).
  7. Uruchom eksperyment w celu wyznaczenia liniowego zakresu lepkosprężystego (LVR) śluzu o znanym stężeniu (100 mg/mL).
    1. Kliknij ikonę „Start” w oprogramowaniu sterującym reometrem (patrz Supplementary Figure 15).
      UWAGA: Reometr wykonuje pomiary automatycznie; po naciśnięciu przycisku „Start” reometr będzie potrzebował około 20 min na zakończenie testu. Ustawienie „Points per decade” w Kroku 2.5.5 określa czas potrzebny na wykonanie pomiarów.
    2. Uruchom eksperyment, klikając „Yes” w pojawiającym się oknie pop-up, które sugeruje obniżenie przerwy geometrycznej do właściwej odległości w celu rozpoczęcia eksperymentu, jeśli nie zostało to jeszcze wykonane.  
    3. Obserwuj generowany w czasie rzeczywistym wykres z reometru, przedstawiający moduły magazynowania (G’) i strat (G’’).
      UWAGA: G’ i G” to odpowiednio moduł magazynowania i moduł strat. Moduł magazynowania reprezentuje tendencję materiału do powrotu do pierwotnego kształtu po deformacji wywołanej naprężeniem i jest równoważny sprężystości. Moduł strat reprezentuje stopień, w jakim materiał stawia opór tendencji do płynięcia, i jest reprezentatywny dla lepkości cieczy (patrz Figure 4).
    4. Ustaw oś X wykresu na „Oscillation strain percentage” (procentowe odkształcenie oscylacyjne). Aby to zrobić, kliknij prawym przyciskiem myszy na wyświetlanym wykresie i wybierz kartę „Graph Variables” (patrz Supplementary Figure 16).
    5. Po zakończeniu testu zapisz z wykresu zakres procentowego odkształcenia oscylacyjnego, zanim materiał wejdzie w nieliniowy zakres lepkosprężysty.
    6. Użyj przycisków „strzałka w górę i w dół” na urządzeniu lub ikon „podnoszenia i opuszczania geometrii” w karcie „Gap” oprogramowania sterującego reometrem, aby podnieść geometrię na dowolną wysokość nad płytkę Peltiera.
    7. Zapisz plik zawierający zarówno procedurę eksperymentalną, jak i wyniki w natywnym formacie oprogramowania sterującego reometrem, aby określić liniowy zakres lepkosprężysty (LVR) próbki śluzu.
      UWAGA: Można to zrobić, ustawiając oś X wykresu na amplitudę odkształcenia (%) i/lub naprężenie oscylacyjne figure-protocol-1  przed wejściem danych w nieliniowy zakres lepkosprężysty (NLVR) (patrz Supplementary Figure 16).
  8. Przeprowadź eksperymenty dynamicznych sweepów i testy przepływu przy stałej szybkości ścinania w liniowym zakresie lepkosprężystym (LVR) dla śluzu o znanym stężeniu 100 mg/mL, aby uzyskać wyniki z trzech niezależnych próbek śluzu o stężeniu 100 mg/mL. Wykonaj te kroki pojedynczo dla dostępnych próbek o różnych stężeniach śluzu. 
    1. Powtórz kroki 2.5.1 – 2.5.4.
    2. Zainicjuj ustawienia „Test Parameters” w następujący sposób: „Frequency = 1 Hz”; ustaw „Logarithmic sweep”; „Strain % = 100 do 10000 %; „Points per decade = 10”.
    3. Wybierz kartę „Procedure” i za pomocą klawiszy strzałek ustaw procedurę „2: Oscillation Frequency”.
    4. Zainicjuj ustawienia „Environmental Control” w następujący sposób: „Temperature = 22 °C”; „Soak Time = 0.0 s”.
    5. Zainicjuj ustawienia „Test Parameters” w następujący sposób: „Strain % = 1 %”; ustaw „Logarithmic sweep”; „Frequency = 20 do 1 Hz”; „Points per decade = 10”.
    6. Wybierz kartę „Procedure” i za pomocą klawiszy strzałek ustaw procedurę „3: Flow Sweep”.
    7. Zainicjuj ustawienia „Environmental Control” w następujący sposób: „Temperature = 22 °C”; „Soak Time = 0.0 s”.
    8. Zainicjuj ustawienia „Test Parameters” w następujący sposób: „Shear rate = 1 do 10000 1/s”; „Points per decade = 10”; zaznacz pole „Steady state sensing”.
    9. Powtórz kroki 2.7.1 – 2.7.2 i poczekaj do zakończenia eksperymentu, co potrwa około 45 minut.
    10. Użyj przycisków „strzałka w górę i w dół” na urządzeniu lub ikon „podnoszenia i opuszczania geometrii” w karcie „Gap” oprogramowania sterującego reometrem, aby podnieść geometrię na dowolną wysokość.
    11. Użyj jednorazowych chusteczek i rękawiczek, aby usunąć śluz z płytki Peltiera i oczyścić ją roztworem izopropanolu (patrz Table of Materials).
    12. Zapisz plik zawierający zarówno procedurę eksperymentalną, jak i wyniki w natywnym formacie oprogramowania sterującego reometrem. 

3. Powtórz protokół dla innych stężeń roztworów śluzu wynoszących 200 mg/mL i 400 mg/mL.

  1. Wykonać kroki 2.5 – 2.8, w tym wszystkie wymienione w nich podpunkty, dla pozostałych dwóch stężeń roztworów śluzu: 200 mg/mL oraz 400 mg/mL.  

4. Reprezentacja graficzna i analiza danych

UWAGA: Kod dostarczony w dodatkowym pliku z kodem wykonuje uśrednianie danych, generuje błędy powtarzalności i nakłada na siebie dane ze wszystkich eksperymentów. Funkcje obliczania odchylenia standardowego nie są dostępne w oprogramowaniu sterującym reometrem. Kod został napisany w języku programowania służącym do analizy danych, postprocesingu i reprezentacji graficznej (szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów).   

  1. Wyeksportuj dane wygenerowane w kroku 2.8 dotyczące stężenia śluzu GR wynoszącego 100 mg/mL oraz w kroku 3.1 dotyczące stężeń śluzu GR wynoszących 200mg/mL i 400 mg/mL  do arkusza kalkulacyjnego, klikając zakładkę „File | Export | Excel” w oprogramowaniu sterującym reometrem (patrz Rycina uzupełniająca 17).
  2. Uruchom kody uzupełniające, aby wygenerować wykresy lepkości pozornej (η) dla zmiennych szybkości odkształcenia ścinającego (figure-protocol-2), a także modułu stratności (G”), modułu sprężystości (G’) i kąta fazowego (δ) dla zmiennego naprężenia oscylacyjnego (figure-protocol-3), i przygotuj reprezentatywne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiamy wyniki eksperymentów przeprowadzonych na śluzie GR z użyciem reometru rotacyjnego z geometrią stożkową (średnica 40 mm, kąt 1° 0’ 11’’) i płytą Peltiera. Eksperymenty pomogły w scharakteryzowaniu nienewtonowskiego zachowania rozrzedzanego ścinaniem śluzu GR oraz pozornego granicznego naprężenia ścinania, obrazującego przejście śluzu z materiału przypominającego żel w materiał przypominający ciecz. Reprezentatywne wyniki obejmują ilościowe opisy limitów niskiego momentu obrotowego oraz efektów p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z głównych celów opracowania niniejszego protokołu jest wykazanie, że nadaje się on do charakterystyki reologicznej śluzu z GR w sytuacjach, gdy dostępne są bardzo małe objętości próbek. Przyznajemy, że do pełnej charakterystyki właściwości reologicznych śluzu z GR konieczne jest pobranie większej liczby próbek z populacji karpia srebrzystego, a dane przedstawione w niniejszej pracy nie stanowią uogólnienia dla całej populacji tego gatunku. Zastosowanie naszej techniki jest uzasadnione jej skutecznością w charakte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie i finansowanie ze strony GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Dziękujemy profesor L. Patricii Hernandez z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona za zainspirowanie badań i ciągłą współpracę, dostarczenie biologicznej wiedzy na temat fizjologii karasia srebrzystego i dostarczenie próbek śluzu. Dziękujemy studentom, Panu Davidowi Palumbo, Pani Carly Cohen, Panu Isaacowi Finbergowi, Panu Dominickowi Petrosino, Panu Alexisowi Renderosowi, Pani Priscilli Varghese, Panu Carterowi Tegenowi i Panu Raghavowi Pajjurowi za pomoc w laboratorium oraz Panu Thomasowi Evansowi i Panu Jamesowi Thomasowi z TA Instruments, New Castle, DE za wsparcie w szkoleniu i konserwacji reometru. Zdjęcia do rysunków 5A,C zostały wykonane podczas sekcji przeprowadzonej przez profesor L. Patricię Hernandez z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
Kim ChusteczkiVWR470224-038Do czyszczenia próbki z płytki
RękawiceVWR89428-750Aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki
PipetaVWR89079-974Do transportu próbki z fiolki do reometru
Końcówki do pipetThermo Scientific72830-042Do transportu próbki z fiolki do reometru
WytrząsarkaVWR89032-094Do jednorodnego mieszania próbki śluzu
FiolkiVWR66008-710Zawiera zmierzone objętości próbek
WagaOhausScout – Wagi SPXDo ważenia masy próbek śluzu
< silny> Odczynniki chemiczne< / mocny>
Woda dejonizowana (H20) -Płyn
Sterylny 70% Izopropanol (C3H8O)VWR89108-162Ciecz
GR Śluz
100 mg/ml stężenie, 2mL--Materiał wiskoelastyczny
Stężenie 400 mg / ml, 1 ml-materiał lepkosprężysty
Stężenie 200 mg / ml, 1 ml-lepkosprężysty
< strong>Software< / strong>
MATLABMathworksR2017aAnaliza danych, przetwarzanie końcowe i reprezentacja graficzna
TriosTA Instrumentsv4.5.042498Oprogramowanie do sterowania i analizy przyrządów reometrycznych
materiał

Bibliografia

  1. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
  2. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
  3. Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
  4. Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36(2015).
  5. Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
  6. Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , University of Illinois, Kaskaskia Biological Station. Urbana-Champaign, IL. (2012).
  7. Nico, L., Fuller, P., Li, J. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
  8. Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
  9. Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
  10. Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
  11. Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. Spagnolie, S. , Springer. (2015).
  12. Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
  13. Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
  14. Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
  15. Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
  16. Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , Wiley. New York. 1255-1284 (1987).
  17. Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
  18. Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). Nugent, J., O'Conner, M. , Pitman. London. 137-156 (1984).
  19. Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
  20. Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
  21. Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
  22. Hills, B. The Biology of Surfactants. , Cambridge Univ. Press. Cambridge. 408(1988).
  23. Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
  24. Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
  25. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
  26. Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710(2019).
  27. Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
  28. Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
  29. Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
  30. Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
  31. Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
  32. Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410(2019).
  33. Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377(2017).
  34. Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
  35. Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. An Introduction to Rheology. , Elsevier. Amsterdam. (1989).
  36. National Water Information System. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey. , Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka reologicznapłyny nienewtonowskieszacowanie granicy płynięciareometr rotacyjnywłaściwości wiskoelastycznezachowanie pseudoplastyczneamplituda oscylacjiprocedura pomiaru przepływulepkość pozorna
Charakterystyka makroreologiczna śluzu grabi skrzelowej w tołpyga, Hypophthalmichthys molitrix
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.