Artykuł metodologiczny

Izolacja bakterii w formie L z moczu metodą filtracji

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61380

⸱

13 czerwca 2020

 ,  , 
1Centre for Bacterial Cell Biology, Biosciences Institute, Medical School, Newcastle University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji bakterii L-form z moczu, przy użyciu metody filtracji. Opisano również uzupełniające metody otrzymywania pożywki w postaci L, obserwacji form L za pomocą mikroskopii kontrastowej fazowej oraz indukcji form L w warunkach laboratoryjnych.

Streszczenie

Uważa się, że przejście bakterii do stanu L-form może odgrywać możliwą rolę w unikaniu odporności i utrzymywaniu się bakterii podczas leczenia antybiotykami ukierunkowanymi na ścianę komórkową. Jednak izolacja i obchodzenie się z bakteriami w formie L jest trudne, głównie ze względu na ich wysoką wrażliwość na zmiany osmolarności. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły przygotowania pożywki w postaci L, izolacji form L z moczu metodą filtracji, wykrywania form L w próbkach moczu za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego oraz indukcji form L in vitro. Dokładne wymagania dotyczące przetrwania i wzrostu form L mogą się różnić w zależności od szczepu. W związku z tym przedstawione tutaj metody mają służyć jako podstawowe wytyczne do ustanawiania protokołów L-form w poszczególnych laboratoriach, a nie jako precyzyjne instrukcje. Metoda filtracji może prowadzić do zmniejszenia liczby form L w próbce i nie powinna być stosowana do oznaczania ilościowego. Jest to jednak jedyna dotychczas stosowana metoda do skutecznego oddzielania wariantów z niedoborem ściany komórkowej od ich ściennych odpowiedników oraz do identyfikacji szczepów bakteryjnych, które są zdolne do przełączania się w formę L u pacjentów z infekcjami dróg moczowych. Metoda filtracji może zostać dostosowana do izolacji form L od pacjentów z innymi kategoriami zakażeń bakteryjnych oraz z próbek środowiskowych.

Wprowadzenie

Praktycznie wszystkie bakterie są otoczone strukturą zwaną ścianą komórkową. Ściana jest ważna dla ochrony przed stresami środowiskowymi, pomaga w regularnym podziale i nadaje bakteriom kształt1. Jednak ściana jest również celem dla części układu odpornościowego i niektórych z najlepszych i najczęściej stosowanych antybiotyków, w tym penicyliny2,3. Pomimo swojego znaczenia, zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne mogą czasami przetrwać bez wall4,5,6,7,8. Jeśli warunki otoczenia zapewniają wystarczającą osmoprotekcję, aby zapobiec ich pękaniu, a czynniki celujące w ścianę komórkową są również obecne, bakterie mogą przejść w stan bez ścian, określany jako forma L4,5,6,7,8.

Liczne raporty wskazują, że przejście do stanu L-form i z powrotem do stanu murowanego może być ważne in vivo jako mechanizm przetrwania bakterii zarówno ataku układu odpornościowego gospodarza, jak i leczenia antybiotykami ukierunkowanymi na ścianę komórkową9,10,11,12,13,14,15. Takie przejście potencjalnie stanowi skuteczną strategię na ponowne pojawienie się infekcji bakteryjnej9,10,11,12,13,14,15. Zrozumienie podstawowej biologii bakterii L-form i ich interakcji z gospodarzem ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania ich roli w patogenezie. Jednak radzenie sobie z bakteriami w formie L jest trudne.

Po pierwsze, z powodu braku ściany komórkowej, bakterie w formie L są podatne na pękanie w odpowiedzi na zmiany w osmolarności. Dodatkowo, formy L dzielą się w bardzo nieregularny sposób, mają nieprzewidywalne wzorce wzrostu (zwykle znacznie wolniejsze niż ich ścienne odpowiedniki) i, w zależności od szczepu, mogą lepiej rozmnażać się na podłożach półpłynnych, a nie stałych lub płynnych. Wszystkie powyższe względy utrudniają kwantyfikację i porównanie stóp wzrostu. Różne gatunki bakterii (a nawet szczepy) mają różne wymagania metaboliczne dotyczące przełączania i wzrostu formy L. Na przykład L-formy niektórych bakterii Gram-dodatnich, które opierają się na oddychaniu tlenowym, są bardziej wrażliwe na reaktywne formy tlenu niż ich ścienne odpowiedniki16.

Indukcja form L w warunkach laboratoryjnych i w organizmie gospodarza jest zwykle napędzana przez czynniki celujące w ścianę komórkową, takie jak antybiotyki i lizozym9. Takie leczenie może spowodować tylko częściową utratę ściany komórkowej, a zatem niektóre bakterie o ściankach (lub częściowo zaściankowane) mogą być obecne w próbkach, co utrudnia odróżnienie, czy jakiekolwiek zaobserwowane wyniki eksperymentalne są spowodowane obecnością form L, czy form ściennych bakterii. Częstość występowania form L indukowanych in vivo jest zwykle niska, co oznacza, że mogą być trudne do znalezienia i wyizolowania. Wreszcie, ze względu na ich polimorficzną morfologię, formy L można łatwo pomylić in situ ze strukturami pochodzenia eukariotycznego, takimi jak ciała apoptotyczne lub różne granulki.

Od czasu ich odkrycia w 1935 roku17, opracowano kilka metod obsługi L-form w laboratorium. Większość z nich polega na dodaniu środka osmoprotekcyjnego do podłoża wzrostowego; zazwyczaj cukier lub sól9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Jak wspomniano powyżej, formy L często występują obok bakterii o ściankach w próbkach pobranych od pacjentów, a oddzielenie tych dwóch populacji może być trudne. Wykazano jednak, że w przeciwieństwie do bakterii o ściankach, formy L mogą przechodzić przez filtr 0,45 μm ze względu na swoją elastyczność i zmienne rozmiary. Metoda wykorzystująca taki filtr została zastosowana do wyizolowania form L z moczu10,19,20,21.

Tutaj prezentujemy protokół izolacji bakterii L-form z moczu, przy użyciu metody filtracji (Rysunek 1). Opisano również uzupełniające protokoły przygotowania pożywki w postaci L, obserwacji mikroskopowej form L oraz indukcji form L in vitro.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża L-form (LM)

  1. Odważyć sacharozę (ilość dostosowaną do osiągnięcia końcowego stężenia 0,58 M),MgSO4 (stężenie końcowe 8 mM) i napar z mózgu i serca (BHI) (ilość zalecana przez dostawcę) w szklanej butelce dwukrotnie większej niż żądana objętość podłoża. Aby przygotować 0,5 l pożywki, odważyć 100 g sacharozy, 1 gMgSO4 i 18,5 g BHI i umieścić w szklanej butelce o pojemności 1 l. Pozwoli to na łatwiejsze ponowne zawieszenie składników przed sterylizacją w autoklawie.
  2. Jeśli wymagane są podłoża stałe lub półstałe, dodaj żądaną ilość agaru. W przypadku pożywek stałych dodać 5 g agaru, aby uzyskać końcowe stężenie 1% w 0,5 l podłoża. W przypadku pożywek półstałych dodać 1 g agaru, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2% w 0,5 l podłoża.
  3. Uzupełnij wodą dejonizowaną (DI) do ostatecznej pożądanej objętości.
  4. Zamknij butelkę i dobrze wymieszaj, wstrząsając. Nie ma potrzeby całkowitego ponownego zawieszania składników, należy tylko upewnić się, że nie są one zbite ze sobą na dnie butelki. Poluzuj nakrętkę i przelej autoklaw w cyklu na wrażliwych podłożach (115 °C przez 15 minut). Zaleca się mieszanie składników przed autoklawowaniem i stosowanie wrażliwego cyklu pożywki, aby zapobiec zbrylaniu się składników i karmelizacji sacharozy.
  5. Zbadaj wzrokowo podłoże po autoklawowaniu. Nie powinno być żadnych grudek, a podłoże powinno mieć kolor bursztynowy (Rysunek 2A).
  6. Po sterylizacji w autoklawie pozwól pożywce ostygnąć do temperatury, która pozwoli na wygodne trzymanie butelki w dłoni.
  7. Jeżeli pożywka jest wymagana do indukcji form L, należy dodać w tym momencie antybiotyk i/lub środek lityczny (na przykład fosfomycynę w końcowym stężeniu 400 μg/ml, penicylinę G w stężeniu 200 μg/ml, D-cykloserynę w stężeniu 400 μg/ml, ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml, moenomycynę w stężeniu 50 μg/ml, lizozym w stężeniu 100 μg/ml lub lizostafina w stężeniu 5 μg/ml). Empirycznie ustalić rodzaj czynnika indukującego formę L (lub środków, jeśli wymagany jest więcej niż jeden) i jego stężenie dla każdego z badanych gatunków bakterii.
  8. Aby przygotować indywidualne porcje, należy nosić rękawice i pracować w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego lub użyć palnika Bunsena. Pożywka może wymagać inkubacji przez dłuższy czas, a sterylność ma ogromne znaczenie.
    1. Aby przygotować porcje pożywki stałej, przenieś 25 ml na pojedyncze szalki Petriego o średnicy 92/16 mm i pozwól im zastygnąć. Zaleca się używanie pipetora zamiast bezpośredniego nalewania płytek, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Nie przesuszaj talerzy.
    2. Aby przygotować półpłynne podwielokrotności, przenieś 5 ml pożywki do wielu uniwersalnych pojemników polistyrenowych o pojemności 30 ml za pomocą pipety i pozwól im stężeć.
  9. Podłoże należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia przed użyciem. Sprawdź zalecenia producenta przed przechowywaniem pożywki zawierającej antybiotyki, ponieważ stężenie może się zmniejszyć z powodu degradacji związku z czasem.

2. Izolacja L-form z moczu

UWAGA: Podczas zabiegów laboratoryjnych należy nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Pracuj w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego lub użyj palnika Bunsena. Podczas filtracji należy nosić okulary ochronne.

  1. Co najmniej 1 godzinę przed przewidywanym przybyciem próbek moczu przetrzeć obszar roboczy 70% etanolem i określić wymaganą liczbę półpłynnych podwielokrotności pożywki LM.
    UWAGA: Do zademonstrowania protokołu zostanie użyta zawiesina form L E. coli ST14410 indukowanych w laboratorium w ciekłym pożywce LM, a nie w próbkach moczu ludzkiego.
  2. Ponownie przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem przed przetworzeniem próbek. Po jednej stronie stołu rozłóż żądaną liczbę filtrów odcinających 0,45 μl, strzykawki o pojemności 20 ml i kilka pustych, sterylnych uniwersalnych pojemników o pojemności 30 ml z polistyrenu równą liczbie próbek. Dodaj kilka zapasowych filtrów do liczby oczekiwanych próbek moczu, na wypadek, gdyby do przetworzenia niektórych próbek potrzebny był więcej niż jeden filtr. Umieść podwielokrotności pożywki LM i opróżnij sterylne uniwersalne pojemniki z polistyrenu o pojemności 30 ml w stabilnym stojaku na środku ławki. Jeśli badanie mikroskopowe ma być przeprowadzane równolegle, należy również przygotować szklane szkiełka mikroskopowe, szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm, pipety 2 μl i 1 ml, sterylne końcówki 10 μl i 1 ml, sterylne probówki 1,5 ml i upewnić się, że dostępna jest mikrowirówka stołowa.
  3. Próbki moczu od dawcy należy przetransportować do laboratorium tak szybko, jak to możliwe po oddaniu krwi, aby zapobiec potencjalnemu pogorszeniu stanu bakterii w formie L w próbce.
  4. Załóż rękawice i okulary ochronne, wyjmij próbki moczu z bezpiecznej torby, spryskaj je etanolem, wytrzyj i umieść w stojaku, w pobliżu podwielokrotności pożywki LM i sterylnych zapasowych pojemników polistyrenowych o pojemności 30 ml. Od tego momentu przetwarzaj jedną próbkę na raz.
  5. Poluzować nakrętki na probówce zawierającej podłoże LM, zapasowy uniwersalny pojemnik z polistyrenu i probówkę z moczem.
  6. Wyjąć strzykawkę z opakowania, wyjąć tłok i umieścić po prawej stronie.
  7. Wyciągnij papier zabezpieczający z tyłu opakowania filtra i mocno przymocuj strzykawkę do filtra (trzymaj filtr ekranem do dołu w plastikowym uchwycie producenta, aby upewnić się, że pozostaje sterylny).
  8. Pracując szybko, ale ostrożnie, zdjąć i wyrzucić nakrętkę z rurki pożywki LM i umieścić filtr ze strzykawką na górze probówki.
  9. Zdejmij nakrętkę z próbki moczu i delikatnie wlej ~10 ml do strzykawki (tylko 2 ml zostaną przefiltrowane, ale nadmierna objętość zapobiega rozpryskiwaniu), upewniając się, że do badania mikroskopowego pozostało ponad 1 ml. Zostanie użyte tylko 0,5 ml, ale precyzyjne zmierzenie takiej objętości podczas wstępnej filtracji jest niepraktyczne, dlatego zachowuje się przybliżony nadmiar objętości.
  10. Bardzo ostrożnie umieścić tłok w tylnej części strzykawki. Przed umieszczeniem tłoka w pełnej gotowości do pracy można wyczuć niewielki opór i łatwo jest rozlać próbkę poza ten punkt. Przećwicz kilka razy przy użyciu wody przed przetworzeniem próbek moczu.
  11. Delikatnie nacisnąć tłok i przepuścić 2 ml moczu przez filtr, aż do wyczucia narastającego oporu. Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku, aby zapobiec rozlaniu się próbki i pęknięciu filtra. Jeśli próbka jest szczególnie gęsta i wytwarza zbyt duży opór, przepuść próbkę przez wiele filtrów, zamiast przepuszczać ją przez jeden.
  12. Delikatnie postukaj filtrem o probówkę zawierającą pożywkę LM, aby usunąć pozostałą przefiltrowaną próbkę, podnieś filtr i strzykawkę i szybko umieść nakrętkę z zapasowego uniwersalnego pojemnika polistyrenowego o pojemności 30 ml na probówce zawierającej pożywkę LM i przefiltrowany mocz, uważając, aby nie dotknąć wnętrza probówki krawędzią nakrętki. Bezpiecznie zutylizować filtr, strzykawkę i zapasowy pojemnik z polistyrenu.
  13. Próbki należy inkubować w pozycji stacjonarnej w temperaturze 30 °C przez okres do 1 miesiąca. Pozwoli to L-formom, które przeszły przez filtr, zregenerować swoje ściany i zacząć rosnąć jako bakterie o ściankach.
  14. Codziennie obserwuj próbki pod kątem śladów wzrostu, przytrzymując probówki zawierające przefiltrowane próbki przy źródle światła. W przypadku próbek dodatnich wzrost pojawia się zwykle w ciągu 3 do 7 dni.
  15. Po wykryciu wzrostu należy przenieść próbkę do komory bezpieczeństwa mikrobiologicznego lub w pobliże palnika Bunsena. Otwórz próbkę i ostrożnie zanurz ją w plastikowej pętli o pojemności 5 μl, kierując się w stronę obszaru wzrostu, a następnie rozprowadź próbki na standardowym stałym podłożu BHI bez osmoprotekcji, dążąc do uzyskania pojedynczych kolonii22.
  16. W tym samym czasie zbadaj niewielką ilość próbki wraz z frakcją półpłynnego podłoża (~5 μL), pod mikroskopem, jak opisano w kroku 3. Przeniesienie próbki na szkiełko mikroskopowe wraz z pożywką zapewni, że wszelkie formy L, które mogą być nadal obecne w próbce, nie pękną i będą mogły zostać wykryte. Oczekuje się jednak, że większość bakterii w tym momencie powróciła do form otoczonych murami i pojawia się jako zwykłe pręciki lub ziarniaki.
  17. Próbki rozsiane smugami na płytkach BHI inkubować w pozycji nieruchomej w temperaturze 37 °C przez noc.
  18. Zbadaj pod kątem śladów wzrostu, wybierz pojedynczą kolonię z każdej płytki za pomocą pętli o pojemności 5 μl i zaszczepij w 5 ml płynnego BHI. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając.
  19. Użyj kultur nocnych do przygotowania zapasów glicerolu lub do wyizolowania DNA w celu identyfikacji gatunku przy użyciu preferowanej metody (np. Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Badanie próbek moczu na obecność L-form za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego

  1. Umieść pozostałe 0,5 ml próbki moczu w probówce do mikrowirówki i wiruj z prędkością 8 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce stołowej.
  2. Delikatnie usunąć supernatant, pozostawiając około 20 μl i ponownie zawiesić granulkę, delikatnie pipetując 3 razy w górę i w dół.
  3. Umieścić 1 μl na szklanym szkiełku mikroskopowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm (aby zbadać próbkę o objętości 5 μl (patrz krok 2.16), użyj szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 x 50 mm, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe dobrze przylega do szkiełka). Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe za pomocą sterylnego wacika, aby utworzyć uszczelnienie i sprawdzić, czy szkiełko nakrywkowe nie jest w stanie się poruszać. Wyrzuć wacik.
  4. Zbadaj szkiełko za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektyw ze 100-krotnym kontrastem fazowym pod kątem obecności struktur podobnych do L-form (Rysunek 3).
    UWAGA: Aby potwierdzić bakteryjne pochodzenie struktur podobnych do formy L w próbkach pobranych od pacjentów, zaleca się zbadanie próbek za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) przy użyciu sond oligonukleotydowych specyficznych dla sekwencji bakteryjnych10,23.

4. Indukcja L-form in vitro

  1. Bakterie o ściankach smugowych do pojedynczych kolonii22 na płytce zawierającej pożywkę nieosmoprotekcyjną (na przykład BHI) i inkubować nieruchomo w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Następnego dnia przygotuj osmoprotekcyjne podłoże LM, zawierające wybrany środek indukujący L-formę, jak opisano w kroku 1. Przygotuj żądaną liczbę płytek ze stałym podłożem.
  3. Używając sterylnej plastikowej pętelki o pojemności 5 μl lub wykałaczki, wybierz dużą ilość (o wartości ~ 4-5 kolonii) z nieosmoprotekcyjnej płytki BHI inkubowanej poprzedniej nocy.
  4. Smugi bakterii na płytce LM za pomocą płaskiej powierzchni pętli (a nie krawędzi). Smugi bakterii jednym ciągłym ruchem na krawędzi płytki, a następnie obróć płytkę o 90°. Dotknij pętli do krawędzi pierwszej smugi i ciągłym ruchem rozprowadź smugę na kwadrancie płytki, stopniowo rozcieńczając bakterie wieloma nakładającymi się na siebie smugami (w razie potrzeby można użyć całej płytki. Jeśli używasz tylko ćwiartki płytki, inne ćwiartki mogą być używane do wielokrotnych indukcji).
    UWAGA: Rysunek 4A pokazuje schematycznie kierunek smug. Celem jest uzyskanie obszaru wzrostu zawierającego jak najwięcej czystych form L, a nie pojedynczych kolonii. Z tego powodu nie ma potrzeby zmiany pętli między smugami. Pojedyncze kolonie L-form mogą być bardzo trudne do uzyskania, a użycie zbyt małej liczby bakterii może spowodować całkowity brak wzrostu L-formy. Z drugiej strony, jeśli do indukcji użyto zbyt wielu bakterii o ściankach, nie wszystkie bakterie przejdą przełączenie, a niektóre mogą nadal zachować ścianę. Najlepszy obszar wzrostu w kształcie litery L można zwykle wykryć w środku smugi.
  5. Umieścić płytkę w plastikowej torbie lub innym pojemniku, aby zapobiec jej wysuszeniu i inkubować w temperaturze 30 °C (L-formy niektórych gatunków bakterii mogą lepiej rosnąć w warunkach beztlenowych, więc można przetestować komorę beztlenową pod kątem bardziej wydajnego wzrostu formy L). Codziennie sprawdzaj płytkę pod kątem oznak wzrostu. Zwykle pojawia się w ciągu 3 do 7 dni. Wielkość wzrostu zależy od odmiany. Przykład wzrostu formy L jest pokazany w Rysunek 4B.
  6. Potwierdź obecność form L za pomocą mikroskopu. Umieścić kroplę pożywki LM o wielkości 2 μl na szkiełku mikroskopowym i za pomocą końcówki pipety pobrać niewielką ilość komórek ze środka smugi i ponownie zawiesić w kropli.
    1. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm i sprawdź obecność form L za pomocą mikroskopu z obiektywem z kontrastem fazowym 100x. Reprezentatywny przykład można znaleźć w Rysunek 4C.

Wyniki

L-form podłoża zawierające sacharozę mogą ulegać różnym stopniom karmelizacji po autoklawowaniu, co wiąże się ze zmianą koloru. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki autoklawowania pożywek zawierających sacharozę. Rysunek 2A pokazuje typowy przykład medium LM, które zmieniło kolor na bursztynowy po autoklawowaniu. Rysunek 2B pokazuje typowy przykład 1,16 M roztworu sacharozy (2 x stężenie wymagane do wytworzenia pożywki LM) po autoklawowaniu. Czasami pożywka LM lub sacharoza mogą ulegać rozległej karmelizacji podczas autoklawowania i nie zaleca się stosowania pożywki, jeśli tak się stanie. Rysunek 2C pokazuje przykład nadmiernie karmelizowanego podłoża sacharozowego.

Bakterie w formie L mogą być wysoce heterogeniczne i Rysunek 3 pokazuje przykłady struktur podobnych do L, które można zaobserwować w próbkach moczu pacjentów. Aby potwierdzić bakteryjne pochodzenie struktur podobnych do formy L znalezionych w próbkach moczu, zaleca się FISH z sondami fluorescencyjnymi ukierunkowanymi na sekwencje bakteryjne10,23.

Poziomy wzrostu form L indukowane w warunkach laboratoryjnych są specyficzne dla szczepu. Rysunek 4B pokazuje przykład wzrostu formy L Bacillus subtilis i Rysunek 4C pokazuje mikroskopijny wygląd L-form indukowanych w Rysunek 4B.

Proces pobierania próbki moczu: identyfikacja szczepu, izolacja DNA; Schemat przedstawia inkubację, etapy hodowli.
Rysunek 1: Izolacja form L metodą filtracji – przedstawienie schematyczne. Próbka moczu przepuszczana jest przez filtr 0,45 μm do uniwersalnego pojemnika polistyrenowego, zawierającego osmoprotekcyjne podłoże LM uzupełnione 0,2% agarem. Próbka jest następnie inkubowana w pozycji stacjonarnej w temperaturze 30 °C przez okres do miesiąca i codziennie sprawdzana wzrokowo pod kątem śladów wzrostu. Ten okres inkubacji pozwala wszelkim formom L, które są obecne w próbce, na regenerację ścian komórkowych. Po wykryciu wzrostu bakterie można ponownie rozsiać na płytce zawierającej zwykłą, stałą, nieosmoprotekcyjną pożywkę (taką jak agar odżywczy lub napar mózgowo-sercowy) w celu wyizolowania pojedynczych kolonii, które można następnie poddać ekstrakcji DNA i sekwencjonowaniu w celu identyfikacji wyizolowanych gatunków bakterii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki eksperymentu z chromatografią cieczową; wariacje kolorystyczne w próbkach A, B, C.
Rysunek 2: Pożywka w kształcie litery L. (A) Pożywka LM po autoklawowaniu. (B) 1,16 M sacharozy (2 x stężenie) po autoklawowaniu. (C) Intensywnie karmelizowane podłoże LM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza morfologii komórek za pomocą obrazów mikroskopowych A-H; różne struktury komórkowe, czerwone strzałki podświetlają cechy.
Rycina 3: Przykłady struktur podobnych do formy L obserwowanych w moczu pacjentów z nawracającym ZUM za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. (A,B) Struktury typowe dla dzielących się bakteryjnych form L zawieszonych w moczu. (C,D) Struktury typowe dla dzielących się bakteryjnych form L związanych z komórkami eukariotycznymi. (E,F) Struktura w kształcie półksiężyca charakterystyczna dla Gram-ujemnych form L (czerwona strzałka). (F,G) Struktury typowe dla pośrednich etapów przejścia między komórkami ściennymi a formami L (czerwona strzałka w G). (H) Pęcherzyki wewnątrzkomórkowe typowe dla dużych form L. Podziałka = 5 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Techniki hodowli bakteryjnych; schemat płytki smugowej, smugi na szalce Petriego, obraz mikroskopu mikrokolonii.
Rysunek 4: Technika smugowo-płytkowa do indukcji form L na podłożach stałych. (A) Schematyczne przedstawienie bakterii smugowych za pomocą ćwiartki płytki do indukcji form L. Strzałka wskazuje kierunek, w którym mają być smugi bakterii. (B) Przykład wzrostu formy L Bacillus subtilis po smugach, jak pokazano w (A), po 3 dniach inkubacji w temperaturze 30 °C. (C) Formy L indukowane w (B) uwidocznione za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego. Podziałka = 5 μm. Panele B i C zostały zmodyfikowane z16 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokoły opisane w tym manuskrypcie zostały wykorzystane do wyizolowania i postępowania z L-formami różnych gatunków bakterii z ludzkiego moczu, w tym E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus i Enterobacter spp, z których wszystkie są zwykle związane z ZUM10,24. Jednak metody postępowania z L-formami, ustalone w jednym laboratorium, mogą nie działać natychmiast w innym, a to, co działa w przypadku jednego szczepu bakteryjnego, może nie działać w przypadku innego. W związku z tym opisane tutaj protokoły prawdopodobnie będą wymagały wielu prób i dodatkowej optymalizacji. W szczególności może być konieczne zbadanie zapotrzebowania na składniki odżywcze, dostępności tlenu, stężenia osmoprotekcji i płynności pożywki. Warunki optymalne dla przejścia i wzrostu formy L mogą różnić się od warunków optymalnych dla wzrostu form ściennych tego samego gatunku. Co więcej, podczas próby uruchomienia protokołów można napotkać kilka problemów technicznych.

Częstym problemem związanym z przygotowaniem pożywek w formie L jest karmelizacja sacharozy po autoklawowaniu. Jeśli podłoże zmieni kolor na ciemnobrązowy, należy je wyrzucić i przygotować świeżą partię. Może być konieczne przygotowanie sacharozy w wodzie w jednej butelce, a pozostałych składników w drugiej, w obu przypadkach o stężeniu 2x. 2x stężone roztwory można następnie połączyć w stosunku 1:1 po autoklawowaniu, aby osiągnąć pożądane stężenia końcowe. Sacharoza autoklawizowana oddzielnie może zmienić kolor na lekko żółty (ryc. 2B), co jest dopuszczalne, ale jeśli zmieni kolor na ciemnobrązowy (ryc. 2C), nie należy jej używać do eksperymentów. Dostosowanie długości i temperatury cyklu autoklawowania może być konieczne w celu złagodzenia karmelizacji sacharozy. Zaleca się badanie sterylności pożywek przygotowanych przy użyciu dostosowanego cyklu autoklawu, poprzez inkubację podwielokrotności każdej z pożywek przez co najmniej 3 dni w temperaturze 37 °C. Wreszcie, może być konieczne przetestowanie alternatywnego środka osmoprotekcyjnego, takiego jak sól, jeśli problem z karmelizacją utrzymuje się18.

Kilka problemów można również napotkać podczas izolowania form L od próbek pobranych od pacjentów. Jak wspomniano w protokole, formy L obecne w próbkach mogą potencjalnie ulec pogorszeniu; Dlatego ważne jest, aby przetransportować próbki do laboratorium tak szybko, jak to możliwe po oddaniu krwi. Z tego samego powodu zdecydowanie odradza się przechowywanie próbek w niskich temperaturach lub modyfikowanie składu próbki (na przykład przez dodanie PBS).

Sama metoda filtracji ma swoje ograniczenia. Niektóre formy L mogą zostać rozerwane z powodu sił ścinających generowanych przez przepływ mediów przez filtr. W badaniu Mickiewicza i wsp. tylko 41% form L w próbkach kontrolnych, które zawierały indukowane laboratoryjnie L-formy E. coli , przeszło przez filtr10. Pokazuje to, że metoda filtracji może prowadzić do niedoszacowania liczby próbek dodatnich i nie jest zalecana w badaniach ilościowych.

W bardzo rzadkich przypadkach, po filtracji, następnego dnia można zaobserwować znaczny wzrost podwielokrotności półpłynnych pożywek stosowanych do izolacji L-formy. Może to wskazywać, że albo filtr pękł podczas protokołu, umożliwiając przejście bakterii otoczonych ścianami, albo próbka była zanieczyszczona. Dobrą praktyką jest wyrzucanie takich próbek lub przynajmniej obchodzenie się z nimi z ostrożnością. Codzienna kontrola wzrokowa próbek ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania fałszywie dodatnim wynikom. Przed przetworzeniem próbek moczu przez filtrację zaleca się przepuszczenie przez wybrany filtr kilku próbek indukowanych laboratoryjnie form L, bakterii ściennych i sterylnego podłoża, w celu kontroli skuteczności separacji formy L, potencjalnego przejścia bakterii ściennych z powodu pęknięcia filtra i upewnienia się, że zastosowana sterylna technika działa prawidłowo.

W rzadkich przypadkach stabilne formy L mogą być izolowane przez filtrację, bez form ściennych wykrywalnych pod mikroskopem. Aby utrzymać żywotne bakterie w formie L, zaleca się przeniesienie kilku "pętli" próbki do probówki zawierającej świeżą półpłynną pożywkę LM lub ponowne smugowanie na stałym podłożu osmoprotekcyjnem co 3-7 dni, w zależności od wydajności wzrostu. Jeżeli po kilku przejściach nie pojawią się formy o ściankach, można podjąć próbę zamrożenia próbek w 40% glicerolu w temperaturze –80 °C w celu zachowania izolatu; jednak niektóre formy L mogą nie tolerować dobrze takiej procedury.

Pomimo swoich ograniczeń, metoda filtracji jest jedyną stosowaną do tej pory do oddzielania form L od form ściennych w próbkach pacjentów. Pozwala na identyfikację szczepów bakteryjnych zdolnych do zmiany formy L in vivo. Istnieje możliwość opracowania i dostosowania metody filtracji do izolacji form L z innych rodzajów próbek ludzkich lub środowiskowych (na przykład krwi lub roślin).

Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe rozważania, zalecamy protokoły przedstawione w tym manuskrypcie jako dobry punkt wyjścia do opracowania dostosowanych do potrzeb protokołów L-form w poszczególnych laboratoriach, a nie jako sztywne instrukcje. Praca z L-formami wymaga wielkiej staranności, poświęcenia i cierpliwości, ale z praktyką może być niezwykle satysfakcjonująca. Mamy nadzieję, że wytyczne przedstawione w tym manuskrypcie staną się punktem odniesienia dla rozwoju protokołów L-form i zachęcą więcej podstawowych i klinicznych grup badawczych do zbadania tych fascynujących form bakterii.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (numer grantu 670980) dla Jeffa Erringtona (Dyrektora Centrum Biologii Komórek Bakteryjnych, Uniwersytet w Newcastle).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 &mikro; L filtry odcinająceSarstedt83.1826
Strzykawki 20 mlFisher17955460
30 ml uniwersalne probówki z polistyrenuStarlabE1412-3010
92 x 16 mm Szalki PetriegoStarstedt82.1473
AgarOxoidLP0011
AmpicillinSigma-AldrichA9518
OxoidCM1135
Szkiełka nakrywkowe (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)VWR631-0137/-0125
D-cykloserynaSigma-AldrichC6880
Szkiełka mikroskopoweVWR631-1550P
LizostafinaSigma-AldrichL7386
LizozymSigma-AldrichL4919
MgSO4VWR25165.26
MoenomycynaSigma-Aldrich32404
Penicylina GSigma-Aldrich13752
FosfomycynaSigma-AldrichP5396
SacharozaSigma-Aldrich84100

Bibliografia

  1. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews Microbiology. 10, 123-136 (2011).
  2. Wolf, A. J., Underhill, D. M. Peptidoglycan recognition by the innate immune system. Nature Reviews Immunology. 18, 243-254 (2018).
  3. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  4. Leaver, M., et al. Life without a wall or division machine in Bacillus subtilis. Nature. 457, 849-853 (2009).
  5. Mercier, R., Kawai, Y., Errington, J. General principles for the formation and proliferation of a wall-free (L-form) state in bacteria. eLife. 3, 642(2014).
  6. Cross, T., et al. Spheroplast-Mediated Carbapenem Tolerance in Gram-Negative Pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (9), 00756(2019).
  7. Ramijan, K., et al. Stress-induced formation of cell wall-deficient cells in filamentous actinomycetes. Nature Communications. 9, 5164(2018).
  8. Errington, J., et al. L-form bacteria, chronic diseases and the origins of life. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371, 20150494(2016).
  9. Kawai, Y., Mickiewicz, K., Errington, J. Lysozyme counteracts β-Lactam antibiotics by promoting the emergence of L-form bacteria. Cell. 172, 1038-1049 (2018).
  10. Mickiewicz, K. M., et al. Possible role of L-form switching in recurrent urinary tract infection. Nature Communications. 10, 4379(2019).
  11. Domingue, G. J. Sr, Woody, H. B. Bacterial persistence and expression of disease. Clinical Microbiology Reviews. 10, 320-344 (1997).
  12. Clasener, H. Pathogenicity of the L-phase of bacteria. Annual Review of Microbiology. 26, 55-84 (1972).
  13. Onwuamaegbu, M. E., Belcher, R. A., Soare, C. Cell wall-deficient bacteria as a cause of infections: a review of the clinical significance. Journal of International Medical Research. 33, 1-20 (2005).
  14. Allan, E. J., Hoischen, C., Gumpert, J. Bacterial L-forms. Advances in Applied Microbiology. 68, 1-39 (2009).
  15. Domingue, G. J. Demystifying pleomorphic forms in persistence and expression of disease: Are they bacteria, and is peptidoglycan the solution. Discovery Medicine. 10, 234-246 (2010).
  16. Kawai, Y., et al. Crucial role for central carbon metabolism in the bacterial L-form switch and killing by β-lactam antibiotics. Nature Microbiology. 4, 1716-1726 (2019).
  17. Klieneberger, E. The natural occurrence of pleuropneumonia-like organisms in apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and other bacteria. The Journal of Pathology and Bacteriology. 40, 93-105 (1935).
  18. Osawa, M., Erickson, H. P. L form bacteria growth in low-osmolality medium. Microbiology. 165 (8), 842-851 (2019).
  19. Domingue, G. J., Schlegel, J. U. The possible role of microbial L-forms in pyelonephritis. The Journal of Urology. 104, 790-798 (1970).
  20. Braude, A. I., Siemienski, J., Jacobs, I. Protoplast formation in human urine. Transactions of the Association of American Physicians. 74, 234-245 (1961).
  21. Kalmanson, G. M., Hubert, E. G., Guze, L. B. Production and therapy of Proteus mirabilis pyelonephritis in mice undergoing chronic diuresis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9, 458-462 (1969).
  22. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
  23. Takada, T., Matsumoto, K., Nomoto, K. Development of multi-color FISH method for analysis of seven Bifidobacterium species in human feces. Journal of Microbiological Methods. 58, 413-421 (2004).
  24. Drage, L. K., et al. Elevated urine IL-10 concentrations associate with Escherichia coli persistence in older patients susceptible to recurrent urinary tract infections. Immunity & Ageing. 16, 1-11 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja z moczumikroskopia fazowo kontrastowapo ywka dla form Lwra liwo na osmolaritybrak ciany kom rkowejpersistencja bakteryjnazaka enia dr g moczowychindukcja form L
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły