Artykuł metodologiczny

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

DOI:

10.3791/61383

⸱

27 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA, które zazwyczaj regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym poprzez wiązanie się z częściowo komplementarnymi miejscami docelowymi w nietranslowanym regionie 3' (UTR) informacyjnego RNA (mRNA), co zmniejsza translację i stabilność mRNA. Profile ekspresji miRNA w różnych narządach i tkankach myszy zostały zbadane, ale standardowe metody oczyszczania i oznaczania ilościowego miRNA w nerkach myszy nie były dostępne. Opracowaliśmy skuteczną i wiarygodną metodę ekstrakcji i oceny ekspresji miRNA w nerce myszy ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Protokół wymagał pięciu kroków: (1) stworzenia myszy z pozorowaną i jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO); (2) ekstrakcja próbek nerek od myszy UUO; (3) ekstrakcja całkowitego RNA, w tym miRNA, z próbek nerek; (4) komplementarna synteza DNA (cDNA) z odwrotną transkrypcją z miRNA; oraz (5) qRT-PCR przy użyciu cDNA. Korzystając z tego protokołu, z powodzeniem potwierdziliśmy, że w porównaniu z kontrolami ekspresja miRNA-3070-3p była znacznie zwiększona, a ekspresja miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p była znacznie zmniejszona w nerkach mysiego modelu zwłóknienia śródmiąższowego nerek. Protokół ten można wykorzystać do określenia ekspresji miRNA w nerkach myszy z UUO.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) — krótkie, niekodujące RNA, które powodują degradację i hamowanie transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA)1 — wykazano, że regulują ekspresję różnych mRNA, które odgrywają kluczową rolę zarówno w fizjologii, jak i chorobie (np. zapaleniu, zwłóknieniu, zaburzeniach metabolicznych i raku). Niektóre z miRNA mogą być zatem kandydatami na nowe biomarkery i cele terapeutyczne dla różnych chorób2,3,4,5. Chociaż opisano profile ekspresji miRNA w narządach i tkankach myszy, w tym mózgu, sercu, płucach, wątrobie i nerkach6,7,8,9,10, nie ma standardowych metod ekstrakcji i oceny miRNA w nerkach myszy ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek.

Zaprojektowaliśmy protokół do niezawodnego oczyszczania i wykrywania ekspresji miRNA w nerkach myszy ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek. Protokół składa się z pięciu głównych kroków, które są następujące. (1) 8-tygodniowe samce myszy C57BL / 6 są podzielone na grupy myszy, które przechodzą pozorowaną operację (kontrole) i myszy, które są poddawane operacji zapewniającej jednostronną niedrożność moczowodu (UUO), która jest związana ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek. (2) Próbki nerek są ekstrahowane od myszy pozorowanych i mysz UUO, homogenizowane oddzielnie w homogenizatorze silikonowym, a następnie przenoszone do systemu rozdrabniania biopolimerów na kolumnie wirowej mikrowirówki11,12. (3) Całkowity RNA zawierający miRNA jest ekstrahowany z próbek nerek za pomocą kolumny wirowej opartej na błonie krzemionkowej12,13. (4) Korzystając z tego wyekstrahowanego całkowitego RNA, komplementarne DNA (cDNA) jest syntetyzowane z całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT14,15. (5) Ekspresje miRNA są oceniane za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) przy użyciu barwnika interkalacyjnego 14,15.

Ten protokół jest oparty na badaniach, które uzyskały znaczące ekstrakcje i oceny miRNA w różnych tkankach11,12,13,14,15, a system rozdrabniania biopolimerów zastosowany w protokole okazał się oczyszczać wysokiej jakości, całkowite RNA z tkanek w 2006 roku12. Ponadto wcześniejsze badania potwierdziły dokładność i czułość aspektów protokołu (tj. syntezy cDNA z odwrotną transkryptazą, polimerazą poli(A) i starterami oligo-dT z wyekstrahowanego całkowitego RNA) do oznaczania ekspresji miRNA metodą qRT-PCR z barwnikiem interkalacyjnym 14,15. Ponieważ nowy protokół ma zalety w postaci prostoty, oszczędności czasu i redukcji błędów technicznych, protokół może być stosowany w badaniach, które wymagają dokładnej i czułej identyfikacji profilu miRNA w nerkach myszy. Co więcej, protokół może być stosowany do badań nad wieloma stanami patologicznymi.

Następnie opisujemy określanie profili ekspresji miRNA u myszy z UUO, co jest związane ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek. U ludzi zwłóknienie śródmiąższowe nerek jest powszechną i ważną cechą zarówno przewlekłej choroby nerek, jak i schyłkowej niewydolności nerek, niezależnie od ich etiologii16,17. To zwłóknienie śródmiąższowe nerek jest związane z postępem niewydolności nerek i charakteryzuje się zwiększoną ekspresją składników macierzy zewnątrzkomórkowej w przestrzeniach śródmiąższowych (np. kolagenu, fibronektyny i aktyny α mięśni gładkich)17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi.

1. Pozorowana operacja

  1. Przygotuj następujące przedmioty: izofluran, arkusz korkowy, krem do depilacji, chusteczki laboratoryjne, szalkę Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), nylon 4-0, pęsetę, nożyczki chirurgiczne, waciki i 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6.
  2. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Następnie nałóż krem do depilacji na brzuch myszy. Po kilku minutach zetrzyj krem do depilacji chusteczką laboratoryjną nasączoną PBS.
  3. Wstrzyknij 70% etanolu do brzucha myszy, a następnie umieść mysz na arkuszu korka w pozycji leżącej.
  4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.
  5. Zwilż dwa waciki PBS, a następnie ostrożnie odciągnij jelita na bok. Umieść zwilżone waciki, aby zidentyfikować lewą nerkę i moczowód.
  6. Zamknij błonę otrzewną, a następnie zamknij nacięcie nylonem 4-0.

2. Operacja UUO

  1. Przygotuj następujące przedmioty: izofluran, arkusz korkowy, krem do depilacji, chusteczki laboratoryjne, szalkę Petriego z PBS, jedwab 4-0, nylon 4-0, strzykawkę 2,5 ml, waciki, pęsetę, nożyczki chirurgiczne i 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6.
  2. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Następnie nałóż krem do depilacji na brzuch myszy. Po kilku minutach zetrzyj krem do depilacji chusteczką laboratoryjną nasączoną PBS.
  3. Wstrzyknij 70% etanolu w brzuch myszy myszy, a następnie umieść mysz w pozycji leżącej na arkuszu korka.
  4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.
  5. Umieścić strzykawkę o pojemności 2,5 ml pod myszką. Weź dwa bawełniane waciki i zwilż je PBS. Ostrożnie odciągnij jelita na bok za pomocą pęsety i umieść zwilżone waciki odpowiednio, aby zidentyfikować lewy moczowód. Za pomocą pęsety podnieś lewą nerkę.
  6. Za pomocą jedwabiu 4-0 podwiązać lewy moczowód w dwóch miejscach oddalonych od siebie o ok. 1 cm. Przeciąć moczowód w środkowym punkcie dwóch podwiązania, a następnie użyć nylonowych szwów 4-0, aby zamknąć błonę otrzewną i nacięcie.

3. Pobieranie próbek nerek

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, izofluran, arkusz korka, 70% etanol, szalkę Petriego z PBS, pęsetę i nożyczki chirurgiczne.
  2. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Wstrzyknij 70% etanolu do jego brzucha i połóż mysz na arkuszu korka w pozycji leżącej.
  3. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.
  4. Podnieś błonę otrzewnową za pomocą pęsety. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj boczne nacięcie na górnej krawędzi błony otrzewnej i kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber.
  5. Następnie zidentyfikuj lewą nerkę, refluksuj ją za pomocą PBS, aż nerka zmieni kolor na żółto-biały, aby wypłukać krew z naczyń, i usuń nerkę, przecinając lewą tętnicę nerkową i żyłę nożyczkami chirurgicznymi. Umieść nerkę na szalce Petriego i dokładnie umyj ją PBS.
  6. Pokrój nerkę na próbki 10 mg za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety (10 mg to odpowiedni rozmiar do następnego kroku). Umieść każdy kawałek nerki w osobnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zamknij nakrętkę probówki.
  7. Przenieś każdą probówkę do mikrowirówki do ciekłego azotu i utrzymuj probówki w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania przed użyciem.

4. Ekstrakcja całkowitego RNA z próbek nerek

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml, 100% etanol, chloroform, homogenizator krzemowy, lód, mieszalnik wirowy, biopolimerowe kolumny wirowe w probówkach zbiorczych 2,0 ml11,12, kolumny wirujące zakotwiczone w membranie w probówkach zbiorczych 2,0 ml12,13, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do przemywania zawierający guanidynę i etanol (bufor do przemywania 1), bufor do płukania zawierający etanol (bufor do przemywania 2) i woda wolna od RNaz.
  2. Umieścić próbkę nerki 10 mg w homogenizatorze silikonowym. Dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny do homogenizatora.
  3. Przygotuj homogenizator, a następnie powoli dociśnij/przekręć tłuczek homogenizatora do próbki nerki, aby homogenizować próbkę. Powtarzać prasowanie/skręcanie, aż próbka nerki całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny.
  4. W celu dalszej homogenizacji próbki należy przenieść homogenizowany lizat (w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml) do biopolimerowej kolumny wirowej.
  5. Wirować homogenizowany lizat o masie 14 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść wytrącony lizat do nieużywanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Połączyć lizat w probówce ze 140 μl chloroformu, a następnie szczelnie zamknąć nakrętkę probówki. Aby wymieszać lizat i chloroform, odwróć probówkę 15 razy.
    UWAGA: Chloroform może być używany bez kaptura.
  7. Inkubować każdą próbkę przez 2–3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirować każdą próbkę w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.
  8. Nie naruszając osadu, przenieś supernatant (który zwykle ma ~300 μl) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 1,5-krotność jego objętości (zwykle ~450 μl) 100% etanolu. Wiruj mieszaninę przez 5 sekund.
  9. Załadować 700 μl próbki na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 x g przez 15 s. Wyrzuć wytrącony lizat do probówki zbiorczej.
  10. Dokładnie przepłukać próbkę, dodając 700 μl buforu płuczącego 1 do zakotwiczonej w membranie kolumny wirowej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 x g przez 15 s. Wyrzuć wytrącony lizat do probówki zbiorczej.
  11. Załadować 500 μl buforu płuczącego 2 na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml w celu usunięcia śladowych ilości. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 x g przez 15 s. Wylać wytrącony lizat do probówki zbiorczej.
    UWAGA: Zakotwiczona w błonie kolumna wirowa może oddzielać RNA i DNA.
  12. Ponownie wykonaj krok 4.11.
  13. Ponownie obracać zakotwiczoną w membranie kolumnę wirującą w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml przy 15 000 x g przez 1 minutę. Wyrzuć wytrącony lizat z probówki zbiorczej.
  14. Przenieś zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Rozpuść całkowite RNA, dodając do kolumny 30 μl wody wolnej od RNaz. Zamknij nasadkę kolumny i odczekaj 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie obracaj kolumnę w temperaturze 15 000 x g przez 1 minutę.
  15. Przenieść całkowitą ilość próbki zawierającej całkowite RNA do nowej probówki do mikrowirówki. Umieść każdą z probówek na lodzie i zmierz stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometrii.
  16. Probówki z próbkami należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania przed użyciem.

5. Synteza cDNA z odwrotną transkrypcją całkowitego RNA

UWAGA: Wytyczne MIQE (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) zostały wydane, aby zachęcić do lepszych praktyk eksperymentalnych i pomóc w uzyskaniu wiarygodnych i jednoznacznych wyników19. W tym protokole cDNA jest syntetyzowane z 1,0 μg oczyszczonego całkowitego RNA w dwuetapowej procedurze przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT.

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, ośmiodołkowe probówki paskowe z nakrętkami, nakrętka każdej probówki z ośmioma paskami, woda destylowana, lód, zestaw do odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela Materiałów)14,15 w stanie stopionym, termocykler i mieszalnik wirowy.
  2. Uruchom termocykler.
  3. Przygotuj roztwór mieszanki wzorcowej: Dodaj 2,0 μl mieszanki odwrotnej transkryptazy (dołączonej do zestawu) i 2,0 μl 10-krotnej mieszanki kwasów nukleinowych do 4,0 μl 5-krotnego buforu hi-spec (aby uzyskać łącznie 8,0 μl mieszanki głównej na probówkę).
  4. Umieścić 8,0 μl roztworu mieszanki głównej do każdej probówki z ośmiodołkową probówką paskową.
  5. Dostosuj całkowitą gęstość RNA. Aby wyizolować 1,0 μg całkowitego RNA z próbek nerek w 12 μl wody wolnej od RNaz, przenieś odpowiednią ilość całkowitego RNA do wody destylowanej, korzystając z danych dotyczących gęstości zmierzonych zgodnie z opisem w kroku 4.15.
    UWAGA: Jeśli występuje jakiekolwiek zanieczyszczenie DNA, zanieczyszczone DNA zostanie poddane koamplifikacji w qRT-PCR.
  6. Umieścić 12 μl podwielokrotności całkowitego RNA w każdej probówce i zamknąć nakrętkę probówki. Odwirować probówkę przez 15 x.
  7. Umieścić probówkę w termocyklerze i inkubować próbkę przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Następnie natychmiast inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C w celu syntezy cDNA.
  8. Po zakończeniu inkubacji przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozcieńcz cDNA dziesięć razy (1:10) wodą destylowaną. Wirować i odwirowywać probówkę przez 5 sekund.
  9. Rozcieńczone cDNA należy tymczasowo przechowywać na lodzie i przed użyciem przenieść próbki do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

6. qRT-PCR miRNA

UWAGA: Użyliśmy metody interkalatora do przeprowadzenia qRT-PCR miRNA. Użyto starterów dla RNA U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p.

  1. Przygotuj następujące elementy: probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, mieszalnik wirowy, 96-dołkową płytkę reakcyjną do qRT-PCR, folię adhezyjną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, aplikator folii samoprzylepnej, 96-dołkowy wirnik wirówki, startery specyficzne dla miRNA, przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym oraz zestaw do PCR na bazie zielonego barwnika (patrz Tabela Materiałów)14,15 zawierający 2x mieszankę główną PCR i 10x uniwersalny starter.
  2. Po wymieszaniu ich w 1,5 ml probówkach mikrowirówek, zmieszaj następujące elementy: 6,25 μl wody destylowanej, 1,25 μl każdego 5 μM startera miRNA rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz, 12,5 μl 2× mieszanki głównej PCR i 2,5 μl 10x uniwersalnego startera.
  3. Przygotuj zsyntetyzowane cDNA zgodnie z opisem w kroku 5 i rozpuść je. Wirować i odwirowywać cDNA przez 5 s.
  4. Umieścić 22,5 μl podwielokrotności odczynnika (utworzonego zgodnie z opisem w kroku 6.2) w każdym dołku płytki 96-dołkowej.
  5. Umieść 2,5 μl porcji cDNA w każdym dołku płytki.
  6. Za pomocą aplikatora folii samoprzylepnej mocno przymocuj folię samoprzylepną do płytki 96-dołkowej. Odwirować płytkę z 96-dołkowym wirnikiem wirówki o sile 1 000 x g przez 30 s, aby ustabilizować reakcje na dnie każdej studzienki.

7. Cykl PCR

  1. Uruchom system PCR w czasie rzeczywistym i umieść utworzoną płytkę zgodnie z opisem w kroku 6.6. w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Następnie ustaw właściwości eksperymentu; Zidentyfikuj nazwę eksperymentu. Wybierz następujące: "96-dołkowy (0,2 ml)" jako typ eksperymentu systemu, "Porównawczy CT (ΔΔCT)" jako metodę oznaczania ilościowego, "Zielone odczynniki SYBR" jako odczynniki do wykrywania sekwencji docelowej i "standardowy" jako przebieg systemu.
  2. Przypisz nazwę do próbki i docelowego miRNA, a następnie przypisz nazwę do próbki i docelowego miRNA w każdym dołku. Próbki powinny być przypisane w dwóch egzemplarzach w celu uzyskania odpowiednich danych potwierdzających wyniki. Należy wybrać próbkę referencyjną i kontrolę endogenną, a następnie wybrać wartość "brak" dla barwnika, który ma być użyty jako bierne odniesienie. Upewnij się, że ustawiłeś ujemną odwrotną transkryptazę i kontrolę bez matrycy dla ekspresji miRNA, aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe odczynników.
  3. Upewnij się, że objętość reakcji jest ustawiona na "20 μl", a warunki cykliczne PCR są ustawione na 95 °C przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 70 °C przez 30 s.
  4. Po zakończeniu procesu qRT-PCR użyj oprogramowania systemowego do analizy danych qRT-PCR. Upewnij się, że linia progowa, która jest automatycznie wybierana przez oprogramowanie, jest odpowiednia dla każdej studzienki.
  5. Sprawdź wartość cyklu progowego (CT) endogennej kontroli i docelowego miRNA analizowanego w każdej próbce. Wartość CT jest określana przez przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej. W niniejszym badaniu użyliśmy RNU6-2 jako endogennej kontroli docelowego poziomu ekspresji miRNA i zastosowaliśmy metodę ΔΔCT do określenia względnego poziomu ekspresji każdego docelowego miRNA20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model myszy UUO został stworzony przez podwiązanie lewego moczowodu zgodnie z opisem21 u 8-tygodniowych samców myszy o wadze 20–25 g. Moczowody były całkowicie zablokowane przez podwójne podwiązanie za pomocą jedwabnych szwów 4-0. Lek przeciwbólowy (meloksykam 5 mg/kg, wstrzyknięcie podskórne) podawano przed operacją, a także codziennie przez 2 dni po operacji. Po 8 dniach od operacji nerki pobrano, przepłukano PBS, wypreparowano i przechowywano w ciekłym azocie do dalszej analizy. Pozorowane mysz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół z qRT-PCR z powodzeniem określił poziomy ekspresji docelowych miRNA. Ocena wyekstrahowanych miRNA jest ważna przy dążeniu do uzyskania miarodajnych danych qRT-PCR, a w celu potwierdzenia jakości miRNA przed wykonaniem qRT-PCR, należy sprawdzić stosunek absorbancji przy 260 nm do absorbancji przy 280 nm za pomocą spektrofotometru. Jeżeli za pomocą qRT-PCR nie można uzyskać pojedynczej amplifikacji PCR o oczekiwanej długości i temperaturze topnienia lub monomodalnej krzywej topnienia, może dojść do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Michelle Goody z Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) za redakcję szkicu tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Qiagen79216Bufor do płukania 2
Qiagen1067933Bufor do płukania 1
Tokyo Laboratory Animals ScienceNie przypisano
Thermo Fisher Scientific431681396-dołkowa płytka
Thermo Fisher Scientific4311971Folia samoprzylepna do 96-dołkowej płytki
reakcyjnejQiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUGGGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004Spin zakotwiczony w membranie kolumna w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml
Przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym
Zobacz materiał 9968-32
reakcyjna Qiagen 218161 Zestaw do odwrotnej transkryptazy Qiagen 218073 Zestaw do PCR na bazie zielonego barwnika Qiagen 79654 Biopolimerowe kolumny wirowe w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml Qiagen 79306 Odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny Thermo Fisher Scientific 4472380 Thermo Fisher Scientific 4472380 Oprogramowanie przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 Nieujawnione Takara Bio 9790B Homogenizator krzemowy ASKUL GA04SW JAKO JEDEN ER1004NA45-KF2,62 - TGL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
  2. Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
  3. Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
  4. Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147(2018).
  5. Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
  6. Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645(2014).
  7. Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
  8. Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192(2018).
  9. Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802(2019).
  10. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  11. Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94(2014).
  14. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  15. Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536(2012).
  16. Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
  17. Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
  18. Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
  21. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  22. Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
  23. Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
  24. Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja mikroRNAekstrakcja RNAsynteza cDNAmiRNA 3070 3pmiRNA 7218 5pmiRNA 7219 5pw knienie nerek

Powiązane artykuły