Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Yiling Yang; Qianye Chen; Siru Zhou; Xinyi Gong; Hongyuan Xu; Yueyang Hong; Qinggang Dai; Lingyong Jiang

doi:10.3791/61390

Method Article

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

DOI:

10.3791/61390

⸱

July 3rd, 2020

Yiling Yang*¹ , Qianye Chen*² , Siru Zhou¹ , Xinyi Gong¹ , Hongyuan Xu¹ , Yueyang Hong¹ , Qinggang Dai³ , Lingyong Jiang¹

¹Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, ²Department of Stomatology, Dalian Medical University, ³The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczne modele myszy są potężne w zrozumieniu kluczowych genów kontrolujących różnicowanie i aktywność osteoklastów, a także w badaniu mechanizmów i leczenia farmakologicznego osteoporozy. Myszy katepsyna K (Ctsk)-Cre są szeroko stosowane do badań funkcjonalnych osteoklastów. Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest istotny w homeostazie kości, ale jego rola w osteoklastach in vivo pozostaje słabo zdefiniowana. Aby dostarczyć dowodów in vivo, że STAT3 uczestniczy w różnicowaniu osteoklastów i metabolizmie kości, stworzyliśmy swoisty dla osteoklastów mysi model delecji Stat3 (Stat3^fl/fl; Ctsk-Cre) i przeanalizował jego fenotyp szkieletowy. Skanowanie mikro-CT i rekonstrukcja 3D sugerowały zwiększoną masę kostną u myszy z warunkowym nokautem. Przeprowadzono barwienie H&E, podwójne barwienie kalceiną i czerwienią alizarynową oraz barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP) w celu wykrycia metabolizmu kości. Krótko mówiąc, protokół ten opisuje niektóre kanoniczne metody i techniki analizy fenotypu szkieletu i badania krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość szkieletowa jest głównym organem nośnym ludzkiego ciała i jest pod presją zarówno ze strony środowiska wewnętrznego, jak i zewnętrznego podczas chodzenia i ćwiczeń¹. Przez całe życie kości nieustannie przechodzą samoodnowę, która jest równoważona przez osteoblasty i osteoklasty. Proces oczyszczania starych kości przez osteoklasty i tworzenie nowych kości przez osteoblasty utrzymuje homeostazę i funkcję mechaniczną układu kostnego². Zaburzenia równowagi mogą wywoływać choroby metaboliczne kości, takie jak osteoporoza. Osteoporoza, która jest spowodowana nadmierną aktywnością osteoklastyczną, jest powszechna na całym ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody związane z opisywanymi tutaj zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju.

1. Hodowla myszy z delecją Stat3 specyficzną dla osteoklastów

UWAGA: Myszy^{Stat3 fl/fl} zostały pozyskane komercyjnie. Mysz Ctsk-Cre dostarczył S. Kato (Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia¹²). Myszy były hodowane i utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w instytucjonalnym obiekcie dla zwierząt w znormalizowanych warunkach.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z obecnego protokołu, wygenerowano myszy z delecją Stat3 specyficzną dla osteoklastów, aby zbadać wpływ delecji STAT3 na różnicowanie osteoklastów. Myszy Stat3^Ctsk i ich rodzeństwo z miotu typu dzikiego (WT) zostały wyhodowane i utrzymane po genotypowaniu. Makrofagi szpiku kostnego wyizolowano i wyhodowano w osteoklastach i wykazano delecję STAT3 u myszy Stat3^Ctsk (Ryc. 1).

Rekonstrukcja .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetycznie modyfikowane modele myszy są powszechnie stosowane do badania mechanizmu i leczenia farmakologicznego chorób u ludzi¹³. Myszy Ctsk-Cre są szeroko stosowane do badań funkcjonalnych osteoklastów⁶. W niniejszej pracy opisano protokoły metod analizy fenotypu szkieletu oraz badania krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo.

Analiza histologiczna jest najlepszą intuicyjną metodą wykrywania metabolizmu kości. A.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. Weiguo Zou i S. Kato za odczynniki i myszy oraz członkom laboratorium Zou za przydatne dyskusje. Dziękujemy również Laboratorium Stomatologii Cyfrowej i Centrum Badawczemu Anomalii Twarzoczaszki Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju za pomoc. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, funduszu SHIPM-mu z Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], Projektu Motywacyjnego Zespołu ds. Innowacji Wysokiego Szczebla dla Shanghai Jiao Tong....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
4% roztwór paraformaldehydu	Sangon biotech Co., Ltd.
Aceton	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Roztwór amoniaku	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Myszy
Ctsk-Cre	prezent od S. Kato, Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia



EDTA	Szanghaj Eksperymentalny odczynnik Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 ŻYWICA	Mikroskopia elektronowa Sciences	14900
mikroskop fluorescencyjny	Olympus	IX73
Roztwór hematoksyliny	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μ CT 80
NaHCO3	Eksperymentalny odczynnik w Szanghaju Co., Ltd.
Neutralny balsam	Sangon biotech Co., Ltd.
NMA	Mikroskopia elektronowa Nauki	19000
Parafina	Sangon biotech Co., Ltd.
mikrotom obrotowy	Leica	RM2265
Stat3^fl/fl	myszy GemPharmatech Co., Ltd	D000527
Zestaw do barwienia TRAP	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	Numer katalogowy: 1330-20-7

E67200280000360 Calcein Sigma-Aldrich C0875Nauki o mikroskopii elektronowej DDSA 13710 DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100 DMP-30 Mikroskopia elektronowa Sciences 13600 10018918E675007A601889

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
Cummings, S. R., Melton, L. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles