Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Podsumowanie

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Streszczenie

MikroRNA (miRNA) to klasa endogennie wyrażanych, niekodujących, ~21 nt małych RNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów zarówno u roślin, jak i zwierząt. Większość miRNA działa jako ujemne przełączniki ekspresji genów ukierunkowanych na kluczowe geny. U roślin pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) są generowane przez polimerazę RNA II i tworzą różne długości stabilnych struktur pętli łodygowych zwanych pre-miRNA. Endonukleaza, podobna do Dicer-like1, przetwarza pre-miRNA w dupleksy miRNA-miRNA*. Jedna z nici z dupleksu miRNA-miRNA* jest wybierana i ładowana do białka Argonaute 1 lub jego homologów, aby pośredniczyć w rozszczepianiu docelowych mRNA. Chociaż miRNA są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi, ich wykrywanie często odbywa się za pomocą mniej niż optymalnych metod opartych na PCR, zamiast czułej analizy northern blot. Opisujemy prostą, niezawodną i niezwykle czułą metodę północną, która jest idealna do ilościowego oznaczania poziomów miRNA z bardzo wysoką czułością, dosłownie z każdej tkanki roślinnej. Dodatkowo metoda ta może być wykorzystana do potwierdzenia wielkości, stabilności i obfitości miRNA i ich prekursorów.

Wprowadzenie

Niedawne odkrycie małych regulatorowych RNA, mikroRNA, doprowadziło do badań nad ich zrozumieniem i ich rolą w roślinach i zwierzętach¹. Długie prekursory miRNA są przetwarzane na dojrzałe miRNA od 21 do 24 nt przez HYL1 i specyficzne białka podobne do dicer^2,3. 22 nt miRNA może zainicjować kaskadowe wyciszanie poprzez generowanie wtórnych siRNAs⁴. Badania wykazały rolę miRNA i drugorzędowych siRNA w rozwoju, losie komórek i reakcjach na stres^5,6.

Hybrydyzacja północna jest metodą eksperymentalną rutynowo stosowaną do wykrywania specyficznych cząsteczek RNA. Ta metoda dostosowuje jej zastosowanie do wykrywania około 19 -24 nt długich małych RNA z puli całkowitych RNAs⁷. W tej demonstracji ilustrujemy zastosowanie tej techniki do wykrywania i kwantyfikacji miRNA. Metoda ta wykorzystuje znakowanie sond przy użyciu izotopów promieniotwórczych; w ten sposób poziomy miRNA w próbce można wykryć ze zwiększoną czułością. W przeciwieństwie do metod opartych na PCR, metoda ta zapewnia kwantyfikację ekspresji, a także określenie wielkości miRNA. W tym protokole pokazujemy kluczowe kroki, które poprawiają wykrywanie miRNA. Zmodyfikowaliśmy etapy blottingu i hybrydyzacji w celu uzyskania detekcji sygnału miRNA o wysokiej rozdzielczości. Technika ta może być również stosowana do wykrywania innych endogennych małych RNA, takich jak siRNA, tasi-drugorzędowe RNA i snoRNA.

Protokół

1. Przygotowanie 15% denaturującego żelu poliakrylamidowego

1. Zważyć i dodać 4,8 g mocznika, dodać 3,75 ml 40% roztworu akryloamidu: bisakryloamidu (19:1) i 1 ml 10x TBE pH 8,2 do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
2. Rozpuścić mocznik w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C do klarownego roztworu.
3. Uzupełnić objętość do 10 ml za pomocą świeżo autoklawowanej sterylnej wody i schłodzić mieszaninę żelu do temperatury pokojowej.
4. Przygotować świeży 10% (w/v) roztwór nadsiarczanu amonu.

2. Montaż szklanych płytek i jednostki do elektroforezy

1. Umyj wszystkie urządzenia potrzebne do elektroforezy żelowej i elektrobibuły detergentem. Delikatnie wyszoruj je miękką gąbką, aby usunąć resztki buforu i akrylamidu, spłucz wodą i pozostaw do wyschnięcia.
2. Zmontuj obie szklane płytki razem i mocno umieść je na gąbce. Do tej konfiguracji użyj płyty o grubości 1 mm. Upewnij się, że płytki są na tym samym poziomie, aby uniknąć wycieków.
3. Do 10 ml żelu dodać 8 μl TEMED i 80 μl świeżo przygotowanego 10% (w/v) roztworu nadsiarczanu amonu.
4. Nie zwlekając, delikatnie wymieszaj i wlej to między zmontowane szklane płytki. Ostrożnie umieść grzebień. Na tym etapie należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.
5. Pozostawić żel do polimeryzacji przez około 45 minut.
6. Umyj spolimeryzowany żel sterylną wodą przed umieszczeniem go w zestawie do biegania po żelu.
7. Zamontuj płytki wewnątrz kasety jezdnej i delikatnie wyjmij grzebień.
8. Wlać do zbiornika świeżo przygotowany sterylny 1x TBE, pH 8,2.
9. Dokładnie umyć studzienki, pipetując bufor w celu usunięcia kryształków soli. Ten krok pomaga próbce RNA przebiegać równomiernie po żelu.
10. Wykonaj rozruch wstępny przy napięciu 80 V przez 30 minut.

3. Przygotowanie barwnika i próbek

1. Na 10 ml barwnika ładującego żel odważyć 5 mg błękitu bromofenolowego, 5 mg cyjanolu ksylenowego, dokładnie dodać 10 ml dejonizowanego formamidu i dobrze wymieszać.
2. Porcję 10 μg całkowitego RNA do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i wysuszyć próbki za pomocą speedvac. Nie przesuszaj próbek.
3. Zawiesić próbki RNA w 8 μl ładunku.
4. Podgrzewać próbki w temperaturze 98 °C przez 2 minuty, schładzać przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, wirować i obracać próbki 3 razy. Ten krok jest niezbędny do prawidłowego ponownego zawieszenia, a to z kolei pomaga w równym załadowaniu próbek.

4. Elektroforeza żelowa

1. Zatrzymaj bieg wstępny i umyj studzienki przed załadowaniem próbki.
2. Podgrzewać próbki w temperaturze 98 °C przez 1 minutę i ładować gorące próbki do studzienki za pomocą końcówek kapilarnych. Włóż końcówkę do dna studzienki tak, aby próbka zajmowała jedną cienką warstwę w studzience.
3. Pełne załadowanie wszystkich próbek. Dołącz do załadowania znacznika dekady RNA.
4. Uruchom żel pod napięciem 80 V, aż niebieski barwnik bromofenolowy zniknie prawie całkowicie. Błękit bromofenolowy działa w temperaturze 10 pz w 15% denaturującym żelu akrylowym.

5. Przygotowanie do elektroblottingu

1. Przytnij membranę N+nylon do wymiarów płyty szklanej i oznacz membranę w prawym górnym rogu ołówkiem HB.
2. Delikatnie umieść membranę na powierzchni sterylnej wody, kierując się oznaczoną stroną w kierunku powierzchni wody. Namocz membranę przez 15 minut.
3. Wytnij 4 kawałki bibuły I do wymiarów podkładki z włókna.
4. Przygotuj kanapkę z żelem do umieszczenia szarej strony kasety w dół na czystej tacy.
5. Wstępnie zwilż podkładkę z włókna i umieść ją na kasecie. Usuń pęcherzyki powietrza.
6. Wstępnie zwilż jeden kawałek bibuły w 1x TBE i umieść na podkładce z włókna. Usuń pęcherzyki powietrza, tocząc plastikową pipetę po papierze. Połóż kolejny kawałek wstępnie zwilżonej bibuły i usuń pęcherzyki powietrza.
7. Ostrożnie wyjmij żel z kasety biegowej i umieść go na zestawie kanapkowym, tak aby pierwsza załadowana próbka RNA znajdowała się w prawo.
8. Delikatnie zanurz wstępnie nasączoną membranę w 1x TBE i umieść ją na żelu, stroną skierowaną do dołu. Rozwałkuj, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
9. Zanurz kawałek bibuły, połóż go na membranie i usuń pęcherzyki powietrza. Zanurz kolejny kawałek bibuły, połóż go na kanapce i usuń pęcherzyki powietrza.
10. Uzupełnij kanapkę, umieszczając wstępnie zwilżoną podkładkę z włókna na zestawie i mocno zamknij kasetę.
11. Umieść kasetę z transblotem w module i napełnij 1x TBE, pH 8,2 do kreski bibuły.
12. Przelew przy napięciu 10 V, przez noc w temperaturze 4 °C.
13. Po przeniesieniu umieść wilgotną membranę na arkuszu papieru i natychmiast usieciuj RNA z membraną poprzez napromieniowanie światłem UV o długości 254 nm (120 000 μdżuli/cm²). Usieciowana plama może być przechowywana w temperaturze 4 °C w celu dalszej hybrydyzacji.

6. Przygotowanie sondy znakowanej radioaktywnie

1. Zaprojektuj sondę, która jest całkowicie komplementarna w stosunku do małego RNA, które ma być wykryte.
2. Oznacz końcówkę sondy za pomocą ƳP³²ATP (otrzymanego z BRIT) na jej końcu 5', łącząc składniki zgodnie z recepturą podaną w Tabeli 1.
3. Inkubować powyższą mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
4. Oddzielić nieoznakowany ƳP³²ATP od sondy za pomocą kolumny Sephadex G-25 zgodnie z protokołem producenta.

7. Hybrydyzacja plamy

1. Umieść skrzyżowaną usieciowaną plamę, RNA stroną skierowaną do góry w butelce do hybrydyzacji.
2. Energicznie wymieszać ultraczuły bufor do hybrydyzacji, dodać do niego 10 ml i inkubować blot w piecu do hybrydyzacji utrzymywanym w temperaturze 35 °C, z rotacją.
3. Wykonaj wstępną hybrydyzację przez 20 minut.
4. Wyjmij butelkę z piekarnika i delikatnie dodaj opisaną sondę do buforu hybrydyzacyjnego.
5. Hybrydyzować blot w temperaturze 35 °C, obracając się przez 12 godzin.
6. Po hybrydyzacji ostrożnie przenieść roztwór hybrydyzacyjny do probówki o pojemności 15 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ponownego użycia.
7. Wykonaj szybkie płukanie blot przez 2 minuty, aby usunąć nadmiar roztworu hybrydyzacyjnego, dodając 2x bufor SSC plus 0,5% SDS. Wyrzuć roztwór.
8. Inkubować blot z 2x buforem SSC plus 0,5% SDS przez 35 °C, z rotacją przez 30 min.
9. Ponownie przemyć blot 0,5x buforem SSC plus 0,5% SDS przez 35°C, obracając się przez 30 min.
10. Umieść plamę w pokrywie hybrydyzacyjnej, usuń nadmiar buforu i zamknij go.
11. Wystaw go na noc na ekran kamery z wolnym luminoforem w kasecie.
12. Wykryj sygnał hybrydyzacji za pomocą obrazowania biomolekularnego i przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
13. Usunąć blot poprzez inkubację w temperaturze 80 °C, z rotacją przez 30 minut z buforem 0,5 X SSC plus 0,1% SDS i 0,1 X buforem SSC plus 0,1% SDS przez 30 min.

Wyniki

W niniejszej demonstracji wykryliśmy i określiliśmy poziom ekspresji miR397 w różnych tkankach indica ryż zmienna whiteponni (Rysunek 1). miR397 jest konserwatywnym miRNA o długości 22 nt. Ekspresję miR397 można wykryć we wszystkich badanych próbkach. Zgodnie z danymi sekwencjonowania nowej generacji, próbka 1 (tkanka siewki) wykazuje poziom miR397 na poziomie 5 odczytów na milion (rpm). Sygnał ten został wyraźnie wykryty, co wskazuje na bardzo wysoką czułość metody, która ...

Dyskusja

Metoda ta może być szeroko stosowana do wykrywania i kwantyfikacji małych RNA, w tym mniej obfitych miRNA. Protokół opisuje głównie etapy denaturacji całkowitego RNA w buforze ładującym, separacji wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, transferu RNA do membrany, sieciowania RNA na błonie i hybrydyzacji przy użyciu pożądanych radioznakowanych sond oligo.

Krytycznym krokiem w każdym eksperymencie z blottingiem jest użycie dobrej jakości RNA do przygotowania próbki. Przed załadowaniem żeli na...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
40% roztwór akryloamidu i bisakryloamidu	Sigma	A9926
Nadsiarczan amonu (APS)	BioRad	1610700
Bibuła	Whatmann Bibuła I	1001-125
Błękit bromofenolowy	Sigma	B5525-5G
Końcówki do ładowania kapilar	BioRad	2239915
Dejonizowany formamid		Ambion AM9342
Blok grzewczy	Eppendorff	5350
Hybond N + membrana nylonowa	GE	RPN203B
Butelka do hybrydyzacji	Sigma	Z374792-1EA
Piec do hybrydyzacji	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Skaner Typhoon	29187194
Ekran i kaseta PhosphorImager	GE healthcare	GE28-9564-75
Pipety	Gilson, modele: P20 i P10	FA10002M, FA10003M
Pipeta plastikowa	Falcon	357550
Aparat z żelem poliakrylamidowym	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 kolumna	GE healthcare	27532501
Koncentrator Speed Vac	Thermo Scientific	20-548-130
Kinaza polinukleotydowa
Aparat transblot	BioRad	1703946
Bufor hybrydyzacyjny	Ambion	AM8670
Mocznik	Fischer Scientific	15985
Środek sieciujący UVP		CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Kąpiel wodna	NEOLAB	D-8810
Ksylen cyjanol	Sigma	X4126-10G

Spinwin Tarsons 1010 T4 (PNK)NEB M0201S ULTRAHyb