Method Article

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

DOI:

10.3791/61394

⸱

July 11th, 2020

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to klasa endogennie wyrażanych, niekodujących, ~21 nt małych RNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów zarówno u roślin, jak i zwierząt. Większość miRNA działa jako ujemne przełączniki ekspresji genów ukierunkowanych na kluczowe geny. U roślin pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) są generowane przez polimerazę RNA II i tworzą różne długości stabilnych struktur pętli łodygowych zwanych pre-miRNA. Endonukleaza, podobna do Dicer-like1, przetwarza pre-miRNA w dupleksy miRNA-miRNA*. Jedna z nici z dupleksu miRNA-miRNA* jest wybierana i ładowana do białka Argonaute 1 lub jego homologów, aby pośredniczyć w rozszczepianiu docelowych mRNA. Chociaż miRNA są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi, ich wykrywanie często odbywa się za pomocą mniej niż optymalnych metod opartych na PCR, zamiast czułej analizy northern blot. Opisujemy prostą, niezawodną i niezwykle czułą metodę północną, która jest idealna do ilościowego oznaczania poziomów miRNA z bardzo wysoką czułością, dosłownie z każdej tkanki roślinnej. Dodatkowo metoda ta może być wykorzystana do potwierdzenia wielkości, stabilności i obfitości miRNA i ich prekursorów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawne odkrycie małych regulatorowych RNA, mikroRNA, doprowadziło do badań nad ich zrozumieniem i ich rolą w roślinach i zwierzętach1. Długie prekursory miRNA są przetwarzane na dojrzałe miRNA od 21 do 24 nt przez HYL1 i specyficzne białka podobne do dicer2,3. 22 nt miRNA może zainicjować kaskadowe wyciszanie poprzez generowanie wtórnych siRNAs4. Badania wykazały rolę miRNA i drugorzędowych siRNA w rozwoju, losie komórek i reakcjach na stres5,6.

Hybrydyzacja północna jest met....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie 15% denaturującego żelu poliakrylamidowego

  1. Zważyć i dodać 4,8 g mocznika, dodać 3,75 ml 40% roztworu akryloamidu: bisakryloamidu (19:1) i 1 ml 10x TBE pH 8,2 do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Rozpuścić mocznik w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C do klarownego roztworu.
  3. Uzupełnić objętość do 10 ml za pomocą świeżo autoklawowanej sterylnej wody i schłodzić mieszaninę żelu do temperatury pokojowej.
  4. Przygotować świeży 10% (w/v) roztwór nadsiarczanu amonu.

2. Montaż szklanych płytek i jednostki do elektroforezy

  1. Umyj wszystkie urządzenia potrzebne do elektrofore....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej demonstracji wykryliśmy i określiliśmy ilościowo ekspresję miR397 w różnych tkankach ryżu indica var whiteponni (Rysunek 1). miR397 to miRNA 22 nt i konserwatywne miRNA. Ekspresję miR397 można wykryć we wszystkich badanych próbkach. Zgodnie z danymi sekwencjonowania nowej generacji, próbka 1 (tkanka siewki) ma miR397 przy 5 odczytach na milion (obr./min). Wykryliśmy jego sygnał w komfortowy sposób, co wskazuje, że metoda jest bardzo czuła i może być stosowana do wykrywania nawe.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta może być szeroko stosowana do wykrywania i kwantyfikacji małych RNA, w tym mniej obfitych miRNA. Protokół opisuje głównie etapy denaturacji całkowitego RNA w buforze ładującym, separacji wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, transferu RNA do membrany, sieciowania RNA na błonie i hybrydyzacji przy użyciu pożądanych radioznakowanych sond oligo.

Krytycznym krokiem w każdym eksperymencie z blottingiem jest użycie dobrej jakości RNA do przygotowania próbki. Przed załadowaniem żeli na.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za dostęp do laboratorium radiacyjnego zapewnionego przez instytut goszczący i BRIT dla radioizotopów. Laboratorium PVS jest wspierane przez National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research i granty (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Szwajcarski/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) z Departamentu Biotechnologii rządu Indii. MP uznaje DBT-Research Associateship, DBT, rząd Indii.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40% roztwór akryloamidu i bisakryloamiduSigmaA9926
Nadsiarczan amonu (APS)BioRad1610700
BibułaWhatmann Bibuła I1001-125
Błękit bromofenolowySigmaB5525-5G
Końcówki do ładowania kapilarBioRad2239915
Dejonizowany formamidAmbion AM9342
Blok grzewczyEppendorff5350
Hybond N + membrana nylonowaGERPN203B
Butelka do hybrydyzacjiSigmaZ374792-1EA
Piec do hybrydyzacjiThermo Scientific1211V79
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)SigmaT7024-25ml
PhosphorImagerGE- Skaner Typhoon29187194
Ekran i kaseta PhosphorImagerGE healthcareGE28-9564-75
PipetyGilson, modele: P20 i P10FA10002M, FA10003M
Pipeta plastikowaFalcon357550
Aparat z żelem poliakrylamidowymBioRad1658003EDU
Sephadex G-25 kolumnaGE healthcare27532501
Koncentrator Speed VacThermo Scientific20-548-130
Kinaza polinukleotydowa
Aparat transblotBioRad1703946
Bufor hybrydyzacyjnyAmbionAM8670
MocznikFischer Scientific15985
Środek sieciujący UVPCL-1000L
VortexTarsons3020
Kąpiel wodnaNEOLABD-8810
Ksylen cyjanolSigmaX4126-10G
Spinwin Tarsons 1010 T4 (PNK)NEB M0201S ULTRAHyb

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Blot AnalysisMicroRNA DetectionNorthern BlotPlant MicroRNAsSmall RNA AnalysisGel ElectrophoresisUV Cross linkingHybridization ProbeImageJ QuantificationLoading Controls

Related Articles