Opisany tutaj protokół podkreśla główne etapy różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z mózgo-podobnych komórek śródbłonka, przygotowanie Neisseria meningitidis do infekcji oraz pobieranie próbek do innych analiz molekularnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Neisseria meningitidis Zakażenie indukowanych pluripotencjalnych komórek śródbłonka mózgu pochodzących z komórek macierzystych
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Meningokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych to zagrażająca życiu infekcja, która występuje, gdy Neisseria meningitidis (meningokoki, Nm) może uzyskać dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez penetrację wysoce wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mózgu (BEC). Ponieważ Nm jest patogenem specyficznym dla człowieka, brak solidnych systemów modelowych in vivo sprawia, że badanie interakcji gospodarz-patogen między Nm a BEC jest trudne i stwarza potrzebę stworzenia modelu opartego na człowieku, który naśladuje natywne BEC. BEC mają ściślejsze właściwości barierowe w porównaniu z komórkami śródbłonka obwodowego, charakteryzującymi się złożonymi ścisłymi połączeniami i podwyższonym przezśródbłonkowym oporem elektrycznym (TEER). Jednak wiele modeli in vitro, takich jak pierwotne BEC i unieśmiertelnione BEC, albo nie ma lub szybko traci swoje właściwości barierowe po usunięciu z natywnego mikrośrodowiska neuronalnego. Ostatnie postępy w technologiach ludzkich komórek macierzystych pozwoliły na opracowanie metod pozyskiwania komórek śródbłonka podobnych do mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które lepiej fenoskopują BEC w porównaniu z innymi ludzkimi modelami in vitro. Zastosowanie BEC pochodzących z iPSC (iPSC-BECs) do modelowania interakcji Nm-BEC ma tę zaletę, że wykorzystuje ludzkie komórki, które posiadają właściwości bariery BEC i mogą być wykorzystywane do badania niszczenia bariery, wrodzonej aktywacji immunologicznej i interakcji bakteryjnej. W tym miejscu pokazujemy, jak uzyskać iPSC-BEC z iPSC, oprócz przygotowania bakterii, infekcji i pobrania próbek do analizy.
Wprowadzenie
Bariera krew-mózg (BBB) i bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (mBCSFB) są niezwykle szczelnymi barierami komórkowymi, które oddzielają krążenie od ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i składają się głównie z wysoce wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mózgu (BECs)1,2. Razem BEC utrzymują prawidłową homeostazę mózgu, regulując składniki odżywcze i produkty przemiany materii w mózgu i poza nim, jednocześnie wykluczając wiele toksyn, leków i patogenów1,2. Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych występuje, gdy bakterie przenoszone przez krew są w sta....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania pożywek / odczynników, utrzymania komórek macierzystych i różnicowania są zaadaptowane z Stebbins et al.22.
1. Przygotowanie materiałów wymaganych do hodowli iPSC i różnicowania BEC.
- Powlekanie matrycą z tworzywa sztucznego z hodowli tkankowej (TC) do hodowli iPSC IMR90-4
- Podwielokrotność żelu z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel) w podwielokrotnościach 2,5 mg i przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Podczas pracy z matrycą żelową i podwielokrotnością na lodzie należy pracować szybko, ponieważ tworzy on żel o temperaturze powyżej 4 °C i nie ....
- Podwielokrotność żelu z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel) w podwielokrotnościach 2,5 mg i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany tutaj protokół został opracowany na podstawie pracy Stebbins i wsp. i przedstawia proces różnicowania iPSC w komórki śródbłonka mózgowego posiadające właściwości BBP, a także sposób wykorzystania tego modelu do badań nad infekcją z użyciem iPSC-BEC-ów w przypadku Nm19,22. Prawidłowo zróżnicowane iPSC-BEC-i wykazują szczelne właściwości barierowe mierzone za pomocą TEER, które często przekraczają 2000 Ω·cm2, oraz wykazują ekspresję markerów śród.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modelowanie BEC i BBB wiązało się z wyzwaniami, ponieważ pierwotne i unieśmiertelnione ludzkie BEC in vitro zwykle nie mają silnych fenotypów barierowych. Pojawienie się technologii ludzkich komórek macierzystych pozwoliło na wygenerowanie komórek podobnych do BEC pochodzących z iPSC, które zachowują oczekiwane charakterystyczne fenotypy BBB, takie jak markery śródbłonka, ekspresja ścisłego połączenia, właściwości barierowe, odpowiedź na inne typy komórek OUN i funkcjonalne transportery wypływu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
L.M.E. jest wspierany przez program szkoleniowy DFG zatytułowany GRK2157 zatytułowany "3D Tissue Models for Study Microbial Infections by Human Pathogens" przyznany A. S-U. B.J.K. jest wspierany przez stypendium podoktorskie Fundacji Alexandra von Humboldta. Podziękowania należą się również Lenie Wolter za jej pomoc techniczną w tworzeniu iPSC-BEC w kulturze.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Odczynnik do enzymatycznej dysocjacji komórek |
| Kwas octowy | Sigma | A6283 | |
| Kwas all-trans retinowy (RA) | Sigma | R2625 | |
| Anty-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
| Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
| Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
| Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
| Anty-VE-kadheryna | Santa Cruz | sc-52751 | |
| Anty-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
| Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
| Płytki i kolby do hodowli komórkowych | Sarstedt | ||
| (Heraeus Megafuge 1.0R) | Szafa | ||
| Nuaire | NU-437-400E | ||
| (inkubator z płaszczem powietrznym DHD Autoflow CO2) | Nuaire | ||
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Columbia ager + 5 % krwi owczej | Biomerieux | 43049 | |
| Filtry poliestrowe Costar Transwell (12- lub 24-dołkowe) | Corning | 3460, 3470 | |
| D(+)-Glukoza | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Nabłonkowy woltomierz (Millicell ERS-2) z elektrodą | STX Merck (Millipore) | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| Fibronektyna | Sigma | F1141 | |
| Mikroskop fluorescencyjny (Eclipse Ti) | firmy Nikon | ||
| (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
| Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
| Wolne podłoże w ludzkiej surowicy śródbłonka (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
| Mikroskop odwrócony (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
| iPS(IMR90)-4 komórki | |||
| Kellogg's | , przygotuj 100 ml 4 g/ml glukozy, 0,1 g/ml glutaminy i 0,2 mg/ml pirofosforanu tiaminy oraz 10 ml 5 mg/ml Fe(NO3)3 i połącz roztwory. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. | ||
| Zamiennik surowicy nokautującej (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamina (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | zestaw do syntezy cDNA |
| Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
| Metanol | ROTH | 4627.5 | |
| MgCl2 | Mikropipety ROTH | KK36.1 | |
| (Research Plus) | Eppendorf | ||
| NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
| Aminokwasy endogenne (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| Zestaw do izolacji RNA NucleoSpin | Zestaw do izolacji RNA | Machery-Nagel | 740955 |
| Chłopiec do pipet (Accu-Jet Pro) | Marka | ||
| Surowica pochodząca z osocza ubogiego w płytki krwi, bydlęca (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
| qPCR folia (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
| płytki qPCR (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
| Inhibitor ROCK, Y27632 dichlorowodorek | Tocris | 1254 | |
| Termocykler RT-PCR (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Pipety serologiczne | Sarstedt | ||
| StemFlex podłoże podstawowe + 50x suplement StemFlex | Gibco | A3349401 | Pożywka do konserwacji komórek macierzystych |
| Wahadłowy wirnik kubełkowy (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
| Pirofosforan tiaminy | Sigma | C8754-5G | |
| Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | Nieenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek (EDTA) |
Bibliografia
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
Przeglądaj więcej artykułów
