Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Neisseria meningitidis Zakażenie indukowanych pluripotencjalnych komórek śródbłonka mózgu pochodzących z komórek macierzystych

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61400

⸱

14 lipca 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół podkreśla główne etapy różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z mózgo-podobnych komórek śródbłonka, przygotowanie Neisseria meningitidis do infekcji oraz pobieranie próbek do innych analiz molekularnych.

Streszczenie

Meningokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych to zagrażająca życiu infekcja, która występuje, gdy Neisseria meningitidis (meningokoki, Nm) może uzyskać dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez penetrację wysoce wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mózgu (BEC). Ponieważ Nm jest patogenem specyficznym dla człowieka, brak solidnych systemów modelowych in vivo sprawia, że badanie interakcji gospodarz-patogen między Nm a BEC jest trudne i stwarza potrzebę stworzenia modelu opartego na człowieku, który naśladuje natywne BEC. BEC mają ściślejsze właściwości barierowe w porównaniu z komórkami śródbłonka obwodowego, charakteryzującymi się złożonymi ścisłymi połączeniami i podwyższonym przezśródbłonkowym oporem elektrycznym (TEER). Jednak wiele modeli in vitro, takich jak pierwotne BEC i unieśmiertelnione BEC, albo nie ma lub szybko traci swoje właściwości barierowe po usunięciu z natywnego mikrośrodowiska neuronalnego. Ostatnie postępy w technologiach ludzkich komórek macierzystych pozwoliły na opracowanie metod pozyskiwania komórek śródbłonka podobnych do mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które lepiej fenoskopują BEC w porównaniu z innymi ludzkimi modelami in vitro. Zastosowanie BEC pochodzących z iPSC (iPSC-BECs) do modelowania interakcji Nm-BEC ma tę zaletę, że wykorzystuje ludzkie komórki, które posiadają właściwości bariery BEC i mogą być wykorzystywane do badania niszczenia bariery, wrodzonej aktywacji immunologicznej i interakcji bakteryjnej. W tym miejscu pokazujemy, jak uzyskać iPSC-BEC z iPSC, oprócz przygotowania bakterii, infekcji i pobrania próbek do analizy.

Wprowadzenie

Bariera krew-mózg (BBB) i bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (mBCSFB) są niezwykle szczelnymi barierami komórkowymi, które oddzielają krążenie od ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i składają się głównie z wysoce wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mózgu (BECs)1,2. Razem BEC utrzymują prawidłową homeostazę mózgu, regulując składniki odżywcze i produkty przemiany materii w mózgu i poza nim, jednocześnie wykluczając wiele toksyn, leków i patogenów1,2. Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych występuje, gdy bakterie przenoszone przez krew są w stanie wchodzić w interakcje i przenikać przez barierę utworzoną przez BEC i powodować stan zapalny. Neisseria meningitidis (Nm, meningokoki) jest bakterią Gram-ujemną, która kolonizuje nosogardziel 10-40% zdrowych osób, ale w niektórych przypadkach może powodować poważną chorobę ogólnoustrojową3. U osób dotkniętych chorobą Nm może uzyskać dostęp do krwiobiegu, gdzie może powodować plamicę piorunującą, a także przenikać do BEC, uzyskując dostęp do OUN, powodując zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych3. Nm jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych na całym świecie i pomimo wysiłków związanych ze szczepieniami, nadal jest główną przyczyną zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych4. Nowoczesne interwencje medyczne, takie jak antybiotykoterapia, sprawiły, że te warunki są możliwe do przeżycia, jednak osoby dotknięte zapaleniem opon mózgowych często pozostają z trwałym uszkodzeniem neurologicznym5,6.

Poprzednie badania zidentyfikowały czynniki bakteryjne i sygnalizację gospodarza, które przyczyniają się do interakcji Nm-BEC7,8,9,10,11. Zidentyfikowane adhezyny i inwazyny, takie jak białko zmętnienia Opc i pili typu IV, a także receptory, takie jak CD147, przeprowadzono na różnych modelach BEC in vitro, jednak modele te nie mają wielu definiujących właściwości BBB7,9,11,12. Pełne zrozumienie interakcji Nm-BEC pozostaje nieuchwytne, częściowo ze względu na niemożność wykorzystania modeli in vivo, niepełną ochronę poszczepienną i brak solidnych modeli BEC u ludzi in vitro.

Modelowanie hBECs in vitro było wyzwaniem ze względu na unikalne właściwości BECs. W porównaniu z komórkami śródbłonka obwodowego, BEC mają szereg fenotypów, które wzmacniają ich właściwości barierowe, takie jak wysoka trans-śródbłonkowa opór elektryczny (TEER) ze względu na złożone połączenia ścisłe12. Po usunięciu z mikrośrodowiska mózgu, BEC szybko tracą swoje właściwości barierowe, ograniczając użyteczność pierwotnych lub unieśmiertelnionych modeli in vitro, które tworzą tylko słabą barierę12,13. Połączenie swoistości zakażeń Nm u ludzi, braku solidnych modeli in vivo oraz wyzwań związanych z modelowaniem ludzkich BEC in vitro stwarza potrzebę opracowania lepszych modeli, aby zrozumieć złożoną interakcję gospodarz-patogen między Nm a BECs. Ostatnio, korzystając z technologii indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), komórki podobne do BEC uzyskano z iPSC, które lepiej naśladują BEC in vivo12,13,14,15. iPSC-BEC są pochodzenia ludzkiego, łatwo skalowalne i posiadają oczekiwane fenotypy BEC w porównaniu do swoich pierwotnych lub unieśmiertelnionych odpowiedników12,13,14,15. Ponadto my i inni wykazaliśmy, że iPSC-BEC są przydatne do modelowania różnych chorób OUN, takich jak interakcja gospodarz-patogen, choroba Huntingtona i niedobór MCT8, który powoduje zespół Allana-Hurndona-Dudleya16,17,18,19,20,21. Tutaj pokazujemy, jak uzyskać iPSC-BEC z odnawialnych źródeł iPSC i zakażenie iPSC-BEC Nm prowadzące do aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Uważamy, że model ten jest przydatny do badania interakcji gospodarz-patogen, której nie można zrekapitulować w innych modelach in vitro i jest szczególnie przydatny podczas badania interakcji z patogenami specyficznymi dla człowieka, takimi jak Nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania pożywek / odczynników, utrzymania komórek macierzystych i różnicowania są zaadaptowane z Stebbins et al.22.

1. Przygotowanie materiałów wymaganych do hodowli iPSC i różnicowania BEC.

  1. Powlekanie matrycą z tworzywa sztucznego z hodowli tkankowej (TC) do hodowli iPSC IMR90-4
    1. Podwielokrotność żelu z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel) w podwielokrotnościach 2,5 mg i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Podczas pracy z matrycą żelową i podwielokrotnością na lodzie należy pracować szybko, ponieważ tworzy on żel o temperaturze powyżej 4 °C i nie można go porcjować po zestaleniu.
    2. W celu pokrycia tworzywa sztucznego TC należy szybko dodać jedną porcję żelu matrycowego do 30 ml pożywki Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 firmy Dulbecco w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 1 ml pożywki do zamrożonego żelu matrycowego, pipetować w górę i w dół, aż do rozmrożenia, a następnie natychmiast przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pozostałym podłożem.
    3. Użyć 1 ml tego roztworu do powlekania żelem matrycowym na zagłębienie płytki 6-dołkowej i 12 ml na kolbę T75.
      UWAGA: Tworzywo sztuczne TC pokryte żelem Matrix można przygotować do dwóch tygodni przed użyciem. Bardzo ważne jest jednak, aby uniknąć wyschnięcia roztworu żelu matrycowego, co może wymagać okazjonalnego dodania większej ilości DMEM / F12 na wierzch studzienek.
  2. Przygotuj pożywkę do konserwacji komórek macierzystych, dodając 50 ml 50-krotnego suplementu do 450 ml podstawowej pożywki do utrzymania komórek macierzystych w sterylnym środowisku komory bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Inne podłoża podtrzymujące komórki macierzyste (mTeSR i E8) były używane w innych badaniach13,14,15, 22,23,24,25.
  3. Aby przygotować 500 ml bezkondycjonowanej pożywki (UM), połącz 392,5 ml DMEM/F12 ze 100 ml zastępczej surowicy nokautującej (KOSR), 5 ml aminokwasów endogennych, L-glutaminą w końcowym stężeniu 1 mM i 3,5 μl β-merkaptoetanolu. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  4. Aby przygotować 200 ml pożywki z komórek śródbłonka (EC) plus kwas retinowy (RA) plus bFGF, połącz 198 ml wolnej pożywki ludzkiej surowicy śródbłonka (hESFM), 2 ml sterylizowanej filtrem surowicy ubogiej w płytki krwi (PDS) i 20 ng/ml bFGF. Filtrować, sterylizować i przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C. Tuż przed dodaniem do komórek dodać 10 μM RA do pożywki EC.
    UWAGA: Ponieważ PDS został wycofany i w związku z tym może być ograniczony, ten protokół został pomyślnie przeprowadzony przy użyciu B27 zamiast PDS15,23,26.
  5. Aby przygotować 200 ml pożywki EC bez RA lub bFGF, połącz 198 ml hESFM i 2 ml PDS sterylizowanego filtrem i wysterylizuj filtrem. Przechowywać do 4 tygodni w temperaturze 4 °C.

2. Konserwacja hodowli komórkowej IMR90-4

UWAGA: Tutaj używamy linii komórkowej IMR90-4 jako przykładu, jednak inne indukowane linie pluripotencjalnych komórek macierzystych, takie jak CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR i CS03iCTRn2 zostały z powodzeniem wykorzystane do różnicowania na BECs13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Hodować iPSC w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i zazwyczaj utrzymywać na płytkach 6-dołkowych o różnej gęstości z 2 ml pożywki do konserwacji komórek macierzystych na studzienkę.
  2. W celu utrzymania kultury iPSC należy wybrać pojedynczą studzienkę do przejścia, która nie zlewa się i ma otwarte przestrzenie między koloniami.
    1. Odessać pożywkę hodowlaną, dodać 1 ml nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut. Podczas inkubacji należy zastąpić roztwór żelu matrycowego na nowej 6-dołkowej płytce 2 ml świeżej pożywki podtrzymującej komórki macierzyste na dołek.
    2. Ostrożnie odessać nieenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek, uważając, aby nie zasysać komórek nadal przyczepionych do płytki.
    3. Dodać 6 ml pożywki do konserwacji komórek macierzystych i kilkakrotnie spłukać dno studzienki, aż wszystkie komórki zostaną całkowicie oderwane. Następnie wysiewaj nową 6-dołkową płytkę o różnej gęstości, zwykle 1:6 lub 1:12 do normalnej konserwacji.
      UWAGA: Korzystając z wyżej wymienionych proporcji, komórki są dzielone około dwa razy w tygodniu.
    4. Przenieś płytkę do inkubatora i rozprowadź wysiane komórki równomiernie w dołkach, potrząsając płytką w przód iw tył oraz od lewej do prawej, zatrzymując się między naprzemiennymi ruchami wstrząsania, aż podłoże opadnie.

3. Różnicowanie komórek śródbłonka mózgu od ludzkich iPSC

  1. Posiewanie iPSC w celu różnicowania (dzień -3 protokołu różnicowania)
    1. Na dobrze przystosowaną do hodowli podtrzymującej IMR90-4 do płytki w celu różnicowania, odessać pożywkę hodowlaną, dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
    2. Dezaktywować enzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek, przenosząc 1 ml zawiesiny zdysocjowanych komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z co najmniej 2 ml świeżej pożywki podtrzymującej komórki macierzyste na 1 ml komórek. Obracać zawiesinę komórek w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki podtrzymującej komórki macierzyste na studzienkę użytych komórek IMR90-4 i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Pomocne może być rozcieńczenie 1:1 0,4% błękitu trypanowego, aby rozróżnić żywe i martwe komórki podczas liczenia. W zależności od gęstości iPSC, z jednej studzienki na płytce 6-dołkowej zwykle uzyskuje się 1–10x 6 komórek.
    4. W celu różnicowania w kolbie T75 dodać 7,5 x 105 komórek do 12 ml pożywki podtrzymującej komórki macierzyste i inhibitora ROCK (dichlorowodorku Y27632) o końcowym stężeniu 10 μM. Odessać roztwór żelu do powlekania matrycą z kolby T75 i przenieść zawiesinę komórek do kolby. Rozprowadzić komórki równomiernie, potrząsając kolbą w przód i w tył, od lewej do prawej (patrz krok 2.2.4) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest dodanie inhibitora ROCK, aby zwiększyć przeżywalność zdysocjowanych pojedynczych komórek macierzystych25,29. Komórki powinny być równomiernie rozmieszczone w kolbie i w podkoszulkach wykazujących rozsianą, mezenchymalną morfologię ze względu na leczenie inhibitorem ROCK22.
  2. W dniu -2 i w dniu -1 zmień pożywkę na świeżą pożywkę podtrzymującą komórki macierzyste; 12 ml na T75.
  3. W dniu 0 rozpocznij różnicowanie, zmieniając pożywkę na UM; 12 ml na T75.
  4. Zmieniaj UM codziennie (dzień 1 – dzień 5).
    UWAGA: Komórki zazwyczaj osiągają konfluencję po 2 do 3 dniach w UM, co można zaobserwować gołym okiem lub pod mikroskopem odwróconego jasnego pola. W miarę postępu różnicowania, "drogi nerwowe" nestin+ stają się widoczne z komórkami PECAM-1+ pomiędzy nimi, jak opisano wcześniej13,14.
  5. Selektywnie rozszerzaj populację komórek śródbłonka, przechodząc na pożywkę EC z 20 ng/ml bFGF i 10 μM kwasu retinowego (RA) (dzień 6) i inkubując przez dwa dni. Pożywkę EC z bFGF można przygotować do dwóch tygodni wcześniej. RA dodaje się z zamrożonego wywaru w dniu użycia (np. 1 μl 10 mM RA na 1 ml EC + bFGF).
    UWAGA: Skuteczne różnicowanie można również osiągnąć bez suplementacji RZS w 6 i 8 dniu. Pominięcie RA spowoduje jednak BEC o obniżonym TEER12,13,14.
  6. Pokryj płytki do hodowli komórkowych i wkładki błonowe (np. Transwell) kolagenem dożylnym i fibronektyną (dzień 7), w celu oczyszczenia BEC i przeprowadzenia eksperymentów.
    1. Aby pokryć wkładki membranowe, połącz 4 części kolagenu IV (1 mg / ml w 0,5 mg / ml kwasu octowego), 1 część fibronektyny (1 mg / ml) i 5 części sterylnej wody tkankowej. Roztwór ECM można rozcieńczyć w stosunku 1:5 w celu pokrycia płytek do hodowli komórkowych (tj. 4 części kolagenu dożylnego, 1 część fibronektyny, 45 części wody). Inkubować z roztworem powlekającym w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Płytki i wkładki membranowe mogą być również powlekane przez co najmniej 4 godziny przed subkulturacją w tym samym dniu etapu oczyszczania.
  7. Oczyść BEC poprzez subkulturację zróżnicowanych komórek na płytkach pokrytych kolagenem IV i fibronektyną lub wkładkach błonowych (dzień 8).
    1. Odessać pożywkę EC i dodać odczynnik enzymatyczny do dysocjacji komórek (12 ml na T75). Inkubować w temperaturze 37 °C aż do momentu, gdy 90% komórek oderwie się od kolby.
      UWAGA: Dysocjacja komórek może trwać do 1 godziny.
    2. W czasie inkubacji należy usunąć roztwór powlekający kolagen IV/fibronektynę z wcześniej przygotowanych płytek/wkładek i pozostawić do wyschnięcia w sterylnym kapturze. Wyschnięcie wkładek zajmuje około 20 minut.
    3. Po oderwaniu się komórek zmyć je z kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
      UWAGA: Zawiesina pojedynczych komórek jest ważna dla niezawodnego zliczania komórek i uzyskania stałych monowarstw.
    4. Rozcieńczyć co najmniej równą objętością świeżego hESFM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    5. Granulować komórki w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut.
    6. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości świeżo przygotowanego EC + bFGF + RA, aby uzyskać zawiesinę 2 x 106 komórek/ml do wysiewu na wkładkach membranowych. Dodaj 500 μl (1 x 106 komórek) na wierzch 12-dołkowej wkładki i 1,5 ml pożywki EC + bFGF + RA na dnie. W przypadku wysiewu na płytkach 24- i 48-dołkowych należy rozcieńczyć zawiesinę komórkową w stosunku 1:2 i dodać odpowiednio 500 μl (5 x 105 komórek) i 250 μl (2,5 x 105 komórek) na dołek. Rozmieścić komórki równomiernie w poprzek studzienki/wkładki (patrz krok 2.2.4) i inkubować w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
  8. Zmień pożywki na płytkach/transwellach na EC bez bFGF lub RA (dzień 9).
  9. Przeprowadzić eksperymenty z infekcjami, pomiar TEER i barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w poniższych sekcjach (dzień 10).
    UWAGA: Pomyślnie zróżnicowane i oczyszczone BEC zazwyczaj osiągają szczyt TEER w dniu 10 i wyrażają charakterystyczne markery komórek śródbłonka mózgu, takie jak PECAM-1 (CD31) i VE-kadheryna, transporter glukozy GLUT-1, transportery wypływu, takie jak p-glikoproteina i składniki ścisłego połączenia ZO-1, Occludin i Claudin-5 13,14,16,17,19,22. Zapoznaj się z Lippmann et al., Stebbins et al. i innymi, aby uzyskać więcej szczegółów i obrazów typów komórek, morfologii i ekspresji markerów specyficznych dla typu komórki podczas procesu różnicowania13,14,15,16,17,19,22. Reprezentatywne obrazy komórek IMR90-4 na różnych etapach procesu różnicowania BEC można znaleźć na rysunku uzupełniającym 1.

4. Przezśródbłonkowy opór elektryczny (TEER) jako miara szczelności bariery

UWAGA: TEER jest zwykle odczytywany na wkładkach membranowych w 9 i 10 dniu różnicowania, aby potwierdzić pomyślne wygenerowanie barier tworzących iPSC-BEC (Rysunek 1A).

  1. Umieść nabłonkowy woltomierz i omowy (EVOM) w sterylnym środowisku okapu bezpieczeństwa biologicznego i podłącz elektrodę do EVOM.
  2. Zdezynfekuj elektrodę, zanurzając ją w 70% EtOH na co najmniej 5 minut i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
    UWAGA: W razie potrzeby możliwa jest dłuższa inkubacja w 70% EtOH lub odkażenie elektrody przy użyciu 5% roztworu podchlorynu.
  3. Pobrać iPSC-BEC z wkładek membranowych z inkubatora i zmierzyć TEER.
    UWAGA: Ważne jest, aby szybko odczytać TEER po wyjęciu z inkubatora, ponieważ zmiana temperatury może mieć wpływ na pomiar TEER.
  4. Odczytaj TEER, zanurzając elektrodę w medium tak, aby krótsza elektroda była umieszczona na górze wkładki, a dłuższa elektroda sięgała do medium otaczającego wkładkę.
    UWAGA: Upewnij się, że elektrody na końcach "pałeczek" są całkowicie pokryte płynem. W razie potrzeby przechyl studnię, aby to osiągnąć, zanim ponownie odłożysz płytkę do pomiaru.

5. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) w celu walidacji fenotypu BEC

UWAGA: Aby potwierdzić jakość w pełni zróżnicowanych i oczyszczonych komórek, monowarstwy iPSC-BEC są barwione pod kątem charakterystycznych markerów komórek śródbłonka mózgu w 10 dniu procesu różnicowania, jak opisano wcześniej (Rysunek 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Odessać pożywkę i przemyć 1x PBS.
  2. Utrwal komórki lodowatym metanolem w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
  3. Przemyć 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i zablokować 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Odessać i dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów i Stebbins et al., aby uzyskać informacje dotyczące źródła i rozcieńczenia przeciwciał22.
  5. Przemyć 3x PBS przed dodaniem przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Od tego momentu należy chronić próbki przed światłem.
  6. Umyj 2x PBS. Następnie dodaj DAPI w rozcieńczeniu 1:5 000 w PBS i zabarwiaj w RT przez 15 minut.
  7. Umyj 1x pozostawiając włączony PBS i rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Przygotowanie bakterii i infekcja iPSC-BECs

  1. W dniu poprzedzającym eksperyment z infekcją (9 dzień różnicowania) rozpocznij nocną hodowlę bakterii z zamrożonego bulionu. W przypadku zakażenia Nm należy nanieść bakterie na agar Columbia z 5% krwią owczą (agar z krwią). Inkubować kultury bakteryjne w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  2. Następnego dnia (dzień 10) przygotuj świeży PPM+, uzupełniając pożywkę z peptonem proteazy (PPM) o 50 μl 2 M MgCl2, 50 μl 2 M NaHCO3 i 100 μl suplementu Kellogg's na 10 ml. Zaszczepić 10 ml pożywki PPM+ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z Nm z płytki do hodowli na noc za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. Inkubować wytrząsanie z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny (tj. do momentu, gdy bakterie znajdą się w logarytmicznej fazie wzrostu).
  3. Podczas inkubacji bakteryjnej należy przygotować iPSC-BEC na 24-dołkowej płytce lub na wkładkach membranowych w celu zakażenia, zastępując starą pożywkę 400 μl świeżej pożywki EC (bez bFGF lub RA) na dołek/górną część wkładki membranowej.
  4. Odwirować kulturę bakteryjną przy 4000 x g przez 10 minut i odessać pożywkę. Zawiesić osad bakteryjny w 250 μl PBS.
  5. W 4 ml świeżego PBS użyj porcji zawiesiny komórek bakteryjnych i dostosuj do OD600 0,4 (około 1 x 108 CFU/ml).
  6. Następnie rozcieńczyć bakterie w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka EC) zgodnie z pożądaną wielokrotnością infekcji (MOI).
    UWAGA: Na przykład, dla MOI 10, rozcieńczyć 1:10 lub 1:5 podczas infekowania iPSC-BEC odpowiednio w 24-dołkowej płytce lub na wkładkach membranowych (1 x 105 komórek na monowarstwę w 24-dołkowej płytce). Dodanie ludzkiej surowicy nie jest uwzględnione w przygotowaniu Nm do zakażenia, jak opisano w innych manuskryptach, ponieważ zaobserwowano, że ma to szkodliwy wpływ na fenotyp bariery iPSC-BEC mierzony za pomocą TEER (dane nie pokazane)30,31. Jednak interakcja Nm i iPSC-BEC nie jest zakłócona z surowicą ludzką lub bez niej (dane nie pokazane).
  7. Zakażone iPSC-BEC w każdym dołku należy zainfekować 100 μl przygotowanej zawiesiny bakteryjnej i inkubować przez żądany czas infekcji.
    UWAGA: Ekspresja wielu cytokin i chemokin prozapalnych jest podwyższona w iPSC-BEC po zakażeniu Nm, najbardziej widocznie po 8 godzinach od infekcji, jak wcześniej opisali Martins-Gomes i inni (Rysunek 2)19.

7. Wrodzona aktywacja immunologiczna za pomocą ilościowego PCR

UWAGA: Korzystając z preferowanej izolacji RNA, syntezy cDNA i protokołu qPCR, zbierz próbki i uruchom qPCR na wybranych cytokinach.

  1. 7.1. Pobrać RNA z próbek BEC po zakażeniu w 10 dniu protokołu różnicowania, używając odczynników z dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Unikaj zanieczyszczenia próbek nukleazą, pracując ostrożnie w czystym i wysterylizowanym środowisku.
    1. Przygotować bufor do lizy i dodać 350 μl do każdej studzienki/monowarstwy iPSC-BECs.
    2. Próbki należy pobierać, wielokrotnie pipetując w górę i w dół (np. 20 razy) i przenosząc zawiesinę do sterylnej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do izolacji RNA.
    3. Postępuj zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawem do izolacji RNA w celu oczyszczenia RNA z hodowanych komórek i tkanek.
    4. Po elucji w wodzie wolnej od nukleaz próbki RNA należy przechowywać na lodzie, aby zminimalizować potencjalną aktywność RNazy.
    5. Oszacuj stężenia RNA na spektrofotometrze (np. Nanodrop).
  2. Wygeneruj bibliotekę cDNA z pobranego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA (patrz tabela materiałów).
    1. Przygotuj reakcje składające się z głównej mieszanki syntezy cDNA, co najmniej 200 ng (najlepiej 500 ng) próbki RNA i wody wolnej od nukleaz w określonej całkowitej objętości reakcji, zgodnie z opisem w protokole zestawu do syntezy cDNA.
    2. Na standardowym termocyklerze uruchom program, który jest odpowiedni dla używanych odczynników z zestawu do syntezy cDNA. Na przykład: 25 °C przez 2 min, 55 °C przez 10 min, 95 °C przez 1 min.
    3. Po syntezie rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od nukleaz i przenieść próbki do temperatury 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Mniejsze rozcieńczenie może być konieczne, jeśli stężenie RNA było niskie (np. poniżej 50 ng). Rozcieńczone cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do roku.
  3. Wykonaj qPCR na próbkach cDNA ukierunkowanych na transkrypty genów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, takich jak cytokiny i chemokiny, za pomocą starannie zaprojektowanych i zwalidowanych starterów.
    UWAGA: Ponieważ konstrukcja startera jest bardzo ważna dla jakości wyników qPCR, skuteczność startera powinna być testowana przeprowadzając serię rozcieńczeń, a brak wielu produktów powinien zostać potwierdzony na żelu DNA.
    1. Na 25 μl reakcji użyj 0,5 μl startera do przodu i 0,5 μl do tyłu (10 mM w wodzie wolnej od nukleaz), 1 μl cDNA, 10,5 μl H2Owolnego od nukleaz i 12,5 μl qPCR master mix.
    2. Przeprowadzić reakcję na maszynie qPCR przy użyciu następującego protokołu cyklera: a) 4 °C przez 2 minuty; b) 95 °C przez 15 min; c) 95 °C przez 15 s; d) 60 °C przez 1 min; przechodzić przez (c) i (d) 45 razy; e) opcjonalna krzywa topnienia: 30–99 °C w krokach co 1 °C; 25 °C przez 5 min.
    3. Do analizy danych należy użyć obliczenia ΔΔCT, aby porównać poziomy ekspresji cytokin i chemokin z referencyjnym genem porządkowym, takim jak 18S lub GAPDH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół został opracowany na podstawie pracy Stebbins i wsp. i przedstawia proces różnicowania iPSC w komórki śródbłonka mózgowego posiadające właściwości BBP, a także sposób wykorzystania tego modelu do badań nad infekcją z użyciem iPSC-BEC-ów w przypadku Nm19,22. Prawidłowo zróżnicowane iPSC-BEC-i wykazują szczelne właściwości barierowe mierzone za pomocą TEER, które często przekraczają 2000 Ω·cm2, oraz wykazują ekspresję markerów śród...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modelowanie BEC i BBB wiązało się z wyzwaniami, ponieważ pierwotne i unieśmiertelnione ludzkie BEC in vitro zwykle nie mają silnych fenotypów barierowych. Pojawienie się technologii ludzkich komórek macierzystych pozwoliło na wygenerowanie komórek podobnych do BEC pochodzących z iPSC, które zachowują oczekiwane charakterystyczne fenotypy BBB, takie jak markery śródbłonka, ekspresja ścisłego połączenia, właściwości barierowe, odpowiedź na inne typy komórek OUN i funkcjonalne transportery wypływu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

L.M.E. jest wspierany przez program szkoleniowy DFG zatytułowany GRK2157 zatytułowany "3D Tissue Models for Study Microbial Infections by Human Pathogens" przyznany A. S-U. B.J.K. jest wspierany przez stypendium podoktorskie Fundacji Alexandra von Humboldta. Podziękowania należą się również Lenie Wolter za jej pomoc techniczną w tworzeniu iPSC-BEC w kulturze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Accutase (1x)SigmaA6964Odczynnik do enzymatycznej dysocjacji komórek
Kwas octowySigmaA6283
Kwas all-trans retinowy (RA)SigmaR2625
Anty-CD31 (PECAM-1)Thermo Scientific (Labvision)RB-10333
Anti-Claudin-5Invitrogen4C3C2
Anti-Glut-1Thermo Scientific (Labvision)SPM498 (MA5-11315)
Anti-OccludinInvitrogen33-1500
Anty-VE-kadherynaSanta Cruzsc-52751
Anty-ZO-1Invitrogen33-9100
Bacto Proteose PeptoneBD211684
b-MercaptoethanolMerck (Sigma-Aldrich)805740
Płytki i kolby do hodowli komórkowychSarstedt
(Heraeus Megafuge 1.0R)Szafa
NuaireNU-437-400E
(inkubator z płaszczem powietrznym DHD Autoflow CO2)Nuaire
Collagen IVSigmaC5533
Columbia ager + 5 % krwi owczejBiomerieux43049
Filtry poliestrowe Costar Transwell (12- lub 24-dołkowe)Corning3460, 3470
D(+)-GlukozaMerck (Sigma-Aldrich)G8270
DAPIInvitrogenD1306
DMEM/F12Gibco31330-038
DMSOROTHA994.1
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)Gibco21600-069
Nabłonkowy woltomierz (Millicell ERS-2) z elektrodąSTX Merck (Millipore)MERS00002
Fe(NO3)3ROTH5632.1
FibronektynaSigmaF1141
Mikroskop fluorescencyjny (Eclipse Ti)firmy Nikon
(Neubauer)A. HartensteinZK06
Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)PeproTech100-18B
Wolne podłoże w ludzkiej surowicy śródbłonka (hESFM)Gibco11111-044
Mikroskop odwrócony (Wilovert)Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 komórki
Kellogg's, przygotuj 100 ml 4 g/ml glukozy, 0,1 g/ml glutaminy i 0,2 mg/ml pirofosforanu tiaminy oraz 10 ml 5 mg/ml Fe(NO3)3 i połącz roztwory. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Zamiennik surowicy nokautującej (KOSR)Gibco10828-028
L-glutamina (GlutaMAX)Invitrogen35050-038
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010Lzestaw do syntezy cDNA
Matrigel MatrixCorning354230
MetanolROTH4627.5
MgCl2Mikropipety ROTHKK36.1
(Research Plus)Eppendorf
NaHCO3ROTH6329
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140-035
Zestaw do izolacji RNA NucleoSpinZestaw do izolacji RNAMachery-Nagel740955
Chłopiec do pipet (Accu-Jet Pro)Marka
Surowica pochodząca z osocza ubogiego w płytki krwi, bydlęca (PDS)Fisher50-443-029
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742qPCR master mix
qPCR folia (MicroAmp Optical Adhesive Film)Applied Biosystems4211971
płytki qPCR (MicroAmp Fast 96-well)Applied Biosystems4346907
Inhibitor ROCK, Y27632 dichlorowodorekTocris1254
Termocykler RT-PCR (StepOnePlus)Applied Biosystems4376600
Pipety serologiczneSarstedt
StemFlex podłoże podstawowe + 50x suplement StemFlexGibcoA3349401Pożywka do konserwacji komórek macierzystych
Wahadłowy wirnik kubełkowy (Heraeus #2704)Thermo Scientific
Pirofosforan tiaminySigmaC8754-5G
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco15250061
VerseneGibco15040-033Nieenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek (EDTA)
Wirówka bezpieczeństwa biologicznego Thermo Scientific klasy II Inkubator CO2 Hemacytometr Abyprzygotować 110 ml suplementu

Bibliografia

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26(2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

Tagi

komórki śródbłonka mózgu pochodzące z iPSCmodel bariery krew-mózgtransepitelialna oporność elektrycznaróżnicowanie komórek macierzystychmarkery komórek śródbłonkaprotokół przygotowania bakteriiutrzymanie hodowli komórkowychanaliza właściwości barierowychoddziaływanie gospodarz-patogen
Neisseria meningitidis Zakażenie indukowanych pluripotencjalnych komórek śródbłonka mózgu pochodzących z komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.