Artykuł metodologiczny

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61401

⸱

11 marca 2021

 ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Streszczenie

Opracowaliśmy metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z nienaruszonymi, funkcjonalnymi receptorami transbłonowymi w środowisku komórkowym lub błonowym. Metoda ta łączy ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnym niekanonicznym aminokwasem ANAP i FRET między ANAP a fluorescencyjnymi (trinitrofenylowymi) pochodnymi nukleotydów. Przedstawiamy przykłady wiązania nukleotydów z kanałami jonowymi KATP znakowanymi ANAP, mierzonymi w niezadaszonych błonach plazmatycznych i wyciętych łatach błonowych wywróconych na lewą stronę pod zaciskiem napięciowym. Ten ostatni pozwala na jednoczesne pomiary wiązania ligandów i prądu kanału, bezpośredni odczyt funkcji białka. Przetwarzanie i analiza danych są szeroko omawiane, wraz z potencjalnymi pułapkami i artefaktami. Metoda ta dostarcza bogatych informacji mechanistycznych na temat zależnego od ligandu bramkowania kanałów KATP i może być łatwo zaadaptowana do badania innych białek regulowanych nukleotydami lub dowolnego receptora, dla którego można zidentyfikować odpowiedni ligand fluorescencyjny.

Wprowadzenie

Kilka ważnych klas białek jest bezpośrednio regulowanych przez wiązanie ligandów. Obejmują one zarówno rozpuszczalne enzymy, jak i białka osadzone w błonie, w tym receptorowe kinazy tyrozynowe, receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) i kanały jonowe. GPCR i kanały stanowią odpowiednio ~34% i ~15% wszystkich obecnych celów leków1,2. W związku z tym istnieje znaczne zainteresowanie biochemiczne, a także medyczne opracowywaniem metod, które zapewniają mechanistyczny wgląd w interakcje ligand-receptor. Tradycyjne metody pomiaru wiązania ligandów, w tym znakowanie fotopowinowactwem i badania wiązania radioligandów, wymagają dużych ilości częściowo oczyszczonego białka i są zwykle wykonywane w niefizjologicznych warunkach i skalach czasowych. Idealna metoda wymagałaby jedynie niewielkich ilości białka, mogłaby być wykonywana na nienaruszonych białkach ulegających ekspresji w środowisku komórkowym lub błonowym, mogłaby być monitorowana w czasie rzeczywistym i byłaby kompatybilna z bezpośrednimi odczytami funkcji białek.

Förster resonance energy transfer (FRET) to metoda, która wykrywa bliskość między dwiema fluorescencyjnie oznaczonymi cząsteczkami3. FRET występuje, gdy wzbudzony fluorofor donorowy przekazuje energię w sposób nieradiacyjny do cząsteczki akceptora (zwykle innego fluoroforu). Transfer energii powoduje wygaszenie emisji fluorescencji donora i uwrażliwienie emisji akceptora (jeśli akceptorem jest fluorofor). Wydajność transferu zależy od6-tej potęgi odległości między dawcą a akceptorem. Ponadto dawca i akceptor muszą znajdować się w pobliżu (zwykle mniej niż 10 nm), aby wystąpił FRET. W związku z tym FRET można wykorzystać do pomiaru bezpośredniego wiązania między znakowanym fluorescencyjnie receptorem białkowym a fluorescencyjnym ligandem.

Kilka różnych białek jest regulowanych lub aktywowanych przez wiązanie wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych nukleotydów adeninowych (ATP, ADP, AMP, cAMP). Wiele białek transportowych wymaga hydrolizy ATP w swoim cyklu reakcji, w tym transportery kasetowe wiążące ATP i ATPazy typu P, takie jak Na+/K+ pump4,5. Kanały K+ wrażliwe na ATP (KATP), transbłonowy regulator przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i kanały regulowane cyklicznymi nukleotydami to wszystkie kanały jonowe, które są bramkowane przez wiązanie wewnątrzkomórkowych nukleotydów adeninowych, dzięki czemu są wyjątkowo wrażliwe na zmiany w metabolizmie komórkowym i transdukcji sygnału6,7,8. Purynergiczne receptory P2X i P2Y reagują na zmiany w zewnątrzkomórkowym ATP, które może być uwalniane jako neuroprzekaźnik lub w wyniku uszkodzenia tkanki9. Opracowaliśmy test oparty na fret do pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z białkami błonowymi w czasie rzeczywistym. Wcześniej zastosowaliśmy tę metodę do badania wiązania nukleotydów z kanałami KATP10,11.

Aby zmierzyć wiązanie nukleotydów za pomocą FRET, interesujące nas białko musi najpierw zostać oznaczone fluoroforem. Znacznik fluorescencyjny musi być umieszczony w białku będącym przedmiotem zainteresowania w sposób specyficzny dla danego miejsca, tak aby znajdował się wystarczająco blisko miejsca wiązania liganda, aby wystąpił FRET, ze szczególną ostrożnością w celu zapewnienia, że znacznik nie wpływa na ogólną strukturę i funkcję białka. Aby to osiągnąć, stosujemy technikę opracowaną przez Chatterjee i wsp., wykorzystującą bursztynową supresję kodonu stop do wprowadzenia fluorescencyjnego niekanonicznego aminokwasu (l-3-(6-acetylonaftaleno-2-ylamino)-2-aminopropionowego; ANAP) w żądanej witrynie12. Mierzymy wiązanie nukleotydów jako FRET między białkiem znakowanym ANAP a fluorescencyjnymi pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych (TNP) (Rysunek 1A). Widmo emisyjne dla ANAP pokrywa się z widmem absorbancji nukleotydów TNP, co jest warunkiem niezbędnym do wystąpienia FRET (Rysunek 1B). Poniżej przedstawiamy dwa różne rodzaje eksperymentu z wiązaniem. W pierwszym przypadku wiązanie nukleotydów z wewnątrzkomórkową stroną kanałów KATP znakowanych ANAP mierzy się w komórkach, które zostały odłupane przez sonikację, pozostawiając przylegające fragmenty błony plazmatycznej na szklanym szkiełku nakrywkowym10,11,13,14.

W drugiej metodzie, wiązanie nukleotydów z kanałami KATP znakowanymi przez ANAP jest mierzone w łatce membranowej pod zaciskiem napięcia, co pozwala na jednoczesny pomiar prądów jonowych i fluorescencji. Łącząc te dwa eksperymentalne podejścia, zmiany w wiązaniach mogą być bezpośrednio skorelowane ze zmianami w funkcji kanału11. Omówiono typowe wyniki, potencjalne pułapki i analizę danych.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Te kroki muszą odbywać się w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. Podane są ilości do przygotowania 10 potraw.

  1. Umieść dziesięć autoklawowanych, 30-milimetrowych szkiełek z borokrzemianowego szkła nakrywkowego pojedynczo w dziesięciu sterylnych naczyniach o średnicy 35 mm i spłucz raz 2 ml sterylnej, destylowanej wody.
  2. Rozcieńczyć 1 ml 0,1% m/v roztworu poli-L-lizyny w sterylnej, destylowanej wodzie do całkowitej objętości 10 ml (końcowe stężenie 0,01% w/v). Dobrze wymieszać, a następnie odpipetować 1 ml na każde szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  3. Odessać poli-L-lizynę i umyć każde szkiełko nakrywkowe dwukrotnie co najmniej 2 ml sterylnej wody destylowanej. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia, tj. co najmniej 3 godziny.

2. Wysiewanie komórek HEK-293T

UWAGA: Te kroki muszą odbywać się w kapturze do hodowli tkankowej. Komórki HEK-293T zostały wybrane ze względu na ich niskie tło prądowe i łatwość hodowli w hodowli. Protokół ten może być dostosowany do innych typów komórek.

  1. Przepłukać 80-90% zlewającą się kolbę T75 komórek HEK-293T raz 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przed inkubacją z 2 ml trypsyny przez 2-5 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie odłączone i prawie całkowicie zdysocjowane.
  2. Ponownie zawiesić komórki, dodając 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Delikatnie przyłożyć pipetą do dna kolby, aby rozbić pozostałe grudki komórek.
  3. Dodać 2 ml uzupełnionego DMEM do żądanej liczby szalek o średnicy 35 mm zawierających powlekane szkiełka nakrywkowe. Do każdego naczynia dodać 100 μl zawieszonych komórek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Transfekcja

UWAGA: Te kroki muszą odbywać się w kapturze do hodowli tkankowej. Ilości podane są dla transfekcji 10 szalek. W celu inkorporacji ANAP specyficznej dla miejsca, kodon DNA w miejscu przeznaczonym do znakowania musi zostać zastąpiony kodonem stop bursztynowym (TAG). Ten konstrukt jest współtransfekowany z dwoma plazmidami: pANAP i peRF1-E55D12,15. pANAP koduje kilka kopii specyficznej dla ANAP pary syntetazy tRNA/tRNA. W obecności ANAP transfekcja tego plazmidu wytwarza tRNA naładowane ANAP, które rozpoznaje bursztynowy kodon stop. peRF1-E55D koduje dominujący ujemny czynnik uwalniania rybosomów, który zwiększa wydajność pełnowymiarowego białka znakowanego ANAP.

  1. Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml z 10 μg pANAP, 10 μg peRF1-E55D i DNA dla konstruktu przeznaczonego do znakowania za pomocą ANAP. Doprowadzić do końcowej objętości 500 μl za pomocą nieuzupełnionego DMEM.
  2. W oddzielnej probówce przygotować 3 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów) na każdy 1 μg DNA i doprowadzić do końcowej objętości 500 μl nieuzupełnionym DMEM.
  3. Połączyć mieszaniny DNA i odczynników do transfekcji w jednej probówce i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 400 μl 1 mM podstawowego ANAP (sól trifluorooctanu w 30 mM NaOH) do 20 ml uzupełnionego DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μM ANAP. Zastąp stare podłoża z posianych komórek 2 ml pożywki zawierającej ANAP na miskę.
  5. Odpipetować 10% mieszanki transfekcji DNA na każdą szalkę. Inkubować w temperaturze 33 °C przez 2-4 dni przed eksperymentami. Inkubacja w temperaturze 33 °C spowalnia podział komórkowy i zwiększa wydajność białka na komórkę16.

4. Eksperymenty z membranami bez dachu

  1. Użyj kleszczy, aby rozbić szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami na mniejsze fragmenty.
  2. Postępuj zgodnie z jedną z poniższych procedur, aby odblokować ogniwa.
    1. W przypadku użycia wstępnie powlekanych szkiełek nakrywkowych spłucz fragment PBS, a następnie umieść go na dnie naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 2 ml PBS. Krótko sonikować za pomocą sonikatora sondy (50 W, amplituda 20%-40%, sonda 3 mm) umieszczonego 3-5 mm nad próbką, aby odsłonić komórki i pozostawić przylegające fragmenty błony plazmatycznej (Rysunek 2A,C).
      UWAGA: Moc, czas trwania i wysokość sondy nad próbką można zmieniać, aby uzyskać wysoką wydajność niezadaszonych membran bez całkowitego usuwania szkiełka nakrywkowego.
      2. Jeśli nie używasz wstępnie powlekanych szkiełek nakrywkowych, spłucz fragment szkiełka nakrywkowego PBS, a następnie zanurz w probówce zawierającej 0,1% w/v poli-L-lizyny na ~30 s przed krótką sonikacją (jak w kroku 4.2.1) w celu odsłonięcia komórek i pozostawienia niezadaszonych/częściowo niepokrytych fragmentów błony plazmatycznej (Rysunek 2 A,C,D).
    2. Wykazano, że krótka ekspozycja na poli-L-lizynę poprawia przyleganie do szkiełka nakrywkowego13.
  3. Umieść sonikowany fragment w naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem zawierającym 2 ml roztworu do kąpieli i zamontuj na odwróconym mikroskopie wyposażonym w obiektyw o wysokim NA, 60-krotnym zanurzeniu w wodzie. Port kamery mikroskopu jest połączony szeregowo ze spektrografem z kamerą CCD o wysokiej czułości. Wypełnić komorę kąpieli (0,5 – 1 ml/min) buforem za pomocą pompy perystaltycznej. Skład buforu będzie się różnić w zależności od badanego białka.
    UWAGA: Jeśli użytkownik nie ma dostępu do obiektywu o dużej odległości roboczej, ustawienie ostrości na niezadaszonych fragmentach membrany może być niemożliwe ze względu na dodatkową wysokość szkiełka nakrywkowego. Alternatywą jest wysiewanie komórek bezpośrednio na naczyniach z dnem ze szkła poli-L-lizynowego (patrz przykład w Tabeli materiałów). Zmniejszy to również potencjalne aberracje w obrazie związane z ustawianiem ostrości przez dwa kawałki szkła. Aberracje te nie wpływają na kształt uzyskanych widm.
  4. Zidentyfikuj niezadaszone fragmenty membrany wyrażające kanał znakowany ANAP, szukając fluorescencji kanału (Rysunek 2C,D).
    UWAGA: Zaleca się stosowanie dodatkowej etykiety fluorescencyjnej (gdzie widmo emisyjne można odróżnić od widma emisyjnego ANAP), aby pomóc w identyfikacji niepokrytych membran zawierających białko będące przedmiotem zainteresowania. Eksperymenty w Rysunek 2C,D przeprowadzono na kanałach znakowanych ANAP z C-końcowymi fluorescencyjnymi znacznikami białkowymi.
  5. Częściowo zazębić maskę spektrometru (podnieś ~10%) między portem kamery w mikroskopie a spektrografem. Cień maski pojawi się na obrazie z kamery. Dopasuj niezadaszoną membranę do maski spektrometru, regulując stolik mikroskopu. Uzyskaj jasne pole i obraz fluorescencyjny odsłoniętej membrany. Zostaną one wykorzystane do wybrania obszaru zainteresowania do analizy.
  6. Zbliżyć końcówkę systemu perfuzji mikroobjętościowej do niezadaszonej membrany.
    UWAGA: Aby zmniejszyć fluorescencję tła, odpływ systemu perfuzyjnego został zastąpiony niestandardową końcówką wykonaną ze szkła borokrzemianowego.
  7. Aby zobrazować widma fluorescencji, należy wzbudzić membranę za pomocą diody LED 385 nm przez filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowy 390/18 nm i dichroik krawędziowy 416 nm. Zbieraj emitowane światło przez długoprzepustowy filtr emisyjny o długości fali 400 nm (Rysunek 2B).
  8. Włącz maskę spektrometru i upewnij się, że emitowane światło jest przepuszczane. Zaczepić siatki spektrometru (300 rowków/mm). Po umieszczeniu siatek światło załamujące się przez spektrometr będzie rzutowane na chip kamery CCD w celu uzyskania obrazów spektralnych (Rysunek 3A). Obrazy te zachowują informacje przestrzenne w wymiarze y. Wymiar x jest zastępowany długością fali.
  9. Opcjonalnie, jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczone białkiem fluorescencyjnym, uzyskaj obraz spektralny białka fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów.
  10. Wykonaj jedną lub więcej ekspozycji w ciągu 0,1-10 s na początku eksperymentu, jednocześnie perfundując roztwór buforowy wolny od nukleotydów. Zostaną one wykorzystane do poprawienia i znormalizowania danych w pozostałej części eksperymentu (patrz sekcja 5 poniżej).
    UWAGA: Wybór czasu ekspozycji będzie zależał od osiągniętego poziomu ekspresji, jasności fluoroforu i optyki. Czas ekspozycji powinien być tak dobrany, aby zmaksymalizować sygnał i zminimalizować obserwowaną szybkość bielenia. Zakres czasu ekspozycji podany w 4.10 jest odpowiedni do pomiarów wiązania równowagi, ale może być przydatny do pomiaru wolniejszych zmian kinetycznych10. Możliwość wykorzystania krótkich czasów naświetlania do śledzenia szybszej kinetyki będzie ograniczona przez poziomy ekspresji białek i fotowybielanie, a nie przez sprzęt.
  11. Zastosować zakres stężeń TNP-ATP (zwykle przygotowywanego w roztworze kąpieli) w celu ustalenia krzywej stężenie-odpowiedź. Utrzymuj każdy roztwór przez co najmniej 1 minutę, aby upewnić się, że osiągnięty jest stan stacjonarny i wypłukiwać każde stężenie roztworem kąpieli przez co najmniej 1 minutę.
    UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że system perfuzyjny może szybko osiągnąć równowagę ( Rysunek 2E) i osiągnąć prawidłowe lokalne stężenie TNP-ATP (Rysunek 2F).
  12. Poddać się ekspozycji (o takim samym czasie trwania, jak w kroku 4.10) przy każdym stężeniu i na końcu każdego wymywania.

5. Analiza spektralna

UWAGA: Te instrukcje są napisane do użycia z kodem analizy "pcf.m", który można znaleźć na GitHubie. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Dodatkowy i alternatywny kod można znaleźć pod adresem https://github.com/smusher/KATP_paper_201911. Opisaliśmy tutaj operacje wykonywane przez oprogramowanie, aby użytkownik mógł stworzyć własny kod lub zdecydować się na ręczną analizę danych.

  1. Uruchom program do analizy, wpisując nazwę programu ("pcf") w wierszu polecenia.
  2. Gdy otworzy się okno dialogowe otwierania pliku/folderu z monitem: "Wybierz pliki dla ROI", wybierz nazwy plików powiązane z obrazami jasnego pola i fluorescencji niezadaszonej membrany. W wierszu poleceń pojawi się monit o wpisanie nazwy pliku wyjściowego.
  3. Wpisz nazwę pliku i naciśnij Enter.
  4. Gdy oprogramowanie wyświetla obrazy jasnego pola i fluorescencji, wybierz obszar zainteresowania (ROI) na obrazie spektralnym odpowiadający lokalizacji niezadaszonego fragmentu membrany lub wyciętej łaty (patrz rozdział 6), postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania. Wybierz obszar tła na tym samym obrazie spektralnym (reprezentujący ten sam zakres długości fali, co w ROI) odpowiadający sekcji szkiełka nakrywkowego lub naczynia bez dołączonej membrany (Rysunek 3A). Oprogramowanie poprosi o kliknięcie górnej części ROI i naciśnięcie Enter, kliknięcie dolnej części ROI i naciśnięcie Enter, a następnie powtórzenie tego procesu dla regionu tła.
  5. Gdy otworzy się okno dialogowe otwierania pliku/folderu z monitem: "Wybierz plik dla widma FP", wybierz nazwę pliku skojarzoną z widmem białka fluorescencyjnego (FP) (opcjonalny krok 4.9). Jeśli nie uzyskano widma FP, wybierz inny plik widma. Widmo FP służy jako kontrola jakości w celu rozróżnienia między znakowanym białkiem a fluorescencją tła.
  6. Gdy otworzy się okno dialogowe otwierania pliku/folderu z monitem: "Wybierz pliki do analizy", wybierz wszystkie pliki odpowiadające widmom ANAP (od kroków 4.10 do 4.12), w tym pliki potrzebne do korekcji wybielacza.
  7. Gdy otworzy się okno dialogowe otwierania pliku/folderu z monitem: "Wybierz pliki do wybielania kolekcji", wybierz podzbiór plików z kroku 5.6 odpowiadający początkowym widmom uzyskanym w roztworze wolnym od nukleotydów na początku eksperymentu lub widmom uzyskanym podczas płukania w roztworze wolnym od nukleotydów, które mają być użyte do korekcji (od kroków 4.10 do 4.12).
  8. Uśrednij liniowo każdy obraz, aby uzyskać widma, tj. uśrednij intensywność wszystkich pikseli w wymiarze y obszaru ROI lub tła na każdej długości fali. (Rysunek 3B). Odejmij wynikowe uśrednione widmo tła od uśrednionego widma uzyskanego z ROI, aby usunąć fluorescencję tła i fluorescencję z niezwiązanego TNP-ATP (Rysunek 3C). Te kroki są wykonywane automatycznie przez oprogramowanie.
  9. Określ intensywność ANAP dla każdej ekspozycji, uśredniając intensywność okna 5 nm wyśrodkowanego wokół piku ANAP odjętych widm (zwykle ~470 nm, ale może się różnić w zależności od lokalnego mikrośrodowiska pozostałości ANAP).
    UWAGA: Rysunek 3D pokazuje 6 widm uzyskanych z kolejnych 10-sekundowych ekspozycji fragmentu membrany bez dachu wyrażającego kanały oznaczone ANAP. Wstawka pokazuje uśrednioną intensywność piku każdego spektrum. Oprogramowanie automatycznie znajdzie szczytową długość fali w pierwszym uzyskanym widmie i użyje tej wartości przez cały czas. Intensywność zostanie obliczona automatycznie przez oprogramowanie.
  10. Znormalizuj intensywności ANAP dla każdego eksperymentu, dzieląc intensywność ANAP danej ekspozycji (F) przez intensywność ANAP pierwszej ekspozycji w szeregu czasowym, która została podjęta w kroku 4.10 (Fmax). Również w tym przypadku oprogramowanie wykonuje te obliczenia automatycznie.
  11. Wykonaj poniższe czynności, aby uzyskać dane.
    1. Aby skorygować fotowybielanie ANAP, najpierw dopasuj pojedynczy rozkład wykładniczy, (F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A), gdzie t to skumulowany czas ekspozycji, τ to stała czasowa, a A to amplituda) albo do pośrednich etapów prania między aplikacjami TNP-ATP, albo do wielu początkowych ekspozycji wykonanych przed praniem na TNP-ATP (Rysunek 3D, wstawka).
      UWAGA: Oprogramowanie wyświetli to dopasowanie i poprosi o jego zaakceptowanie lub odrzucenie. Jeśli dopasowanie zostanie odrzucone, pojawi się kolejna możliwość wybrania plików do korekty wybielania.
    2. Podziel znormalizowane (w kroku 5.10) widma ANAP przez przewidywaną wartość dopasowania wykładniczego z kroku 5.11.1 w każdym punkcie czasowym (Rysunek 3E).
      UWAGA: W przedstawionym przykładzie obserwowana znormalizowana pikowa fluorescencja po 50 s wynosi 0,65, a przewidywana fluorescencja z dopasowania wykładniczego wynosi 0,64. Aby skorygować bielenie, podziel obserwowaną wartość (0,65, Figura 3E wstawka, puste kółko) przez przewidywaną wartość (0,64, Figura 3E wstawka, linia przerywana), aby uzyskać skorygowaną wartość (~1, Figura 3E wstawka, kolorowe kółko). Jeśli korekta bielenia jest odpowiednia, intensywność ANAP ze wszystkich ekspozycji nabytych przy braku nukleotydów powinna być w przybliżeniu równa (Rysunek 3E). Obliczenia te są wykonywane automatycznie przez oprogramowanie.
    3. Uzyskaj dane wyjściowe w postaci obrazu przedstawiającego dane i arkusz kalkulacyjny z zakładkami zawierający surowe widma, odjęte widma, widma skorygowane pod kątem fotowybielania oraz dane dotyczące pików dla każdego pliku, aby można było przeprowadzić dalszą analizę.

6. Eksperymenty z fluorometrią patch-clamp

  1. Wyciągnij pipety krosowe z grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji od 1,5 MΩ do 2,5 MΩ po napełnieniu roztworem pipet. Skład roztworu pipetowanego będzie się różnić w zależności od badanego białka.
  2. Przenieść szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami na naczynie o średnicy 35 mm ze szklanym dnem zawierającym 2 ml roztworu do kąpieli i zamontować na mikroskopie odwróconym wyposażonym w obiektyw o wysokim NA, 60-krotnym zanurzeniu w wodzie. Ukrwić komorę kąpieli (0,5 – 1 ml/min) roztworem do kąpieli za pomocą pompy perystaltycznej. Jeśli chodzi o roztwór do pipetowania, roztwór do kąpieli będzie się różnił w zależności od badanego białka.
  3. Zidentyfikuj komórkę wykazującą ekspresję kanałów znakowanych ANAP, szukając fluorescencji na błonie komórkowej.
  4. Napełnij pipetę z plastrem roztworem pipety. Zastosuj delikatny nadciśnieniowy nacisk na pipetę i umieść w komorze kąpieli. Dociśnij pipetę do błony celi i zastosuj delikatne ssanie, aby uzyskać uszczelnienie GΩ (Rysunek 4A).
  5. Wytnij łatkę, szybko odsuwając uchwyt pipety od celi (Rysunek 4A).
    UWAGA: Wycięcie plastra w ten sposób powinno utworzyć plaster wywrócony na lewą stronę, z cytozolowymi domenami białka wystawionymi na działanie systemu perfuzyjnego. Jeśli lokalizacja badanego miejsca wiązania nukleotydów nie jest cytozolowa, konieczne będzie użycie plastrów na zewnątrz lub nagrań z całych komórek w celu przeprowadzenia eksperymentów PCF.
  6. Zbliżyć końcówkę pipety do plastra do końcówki systemu perfuzyjnego i sprawdzić, czy plaster znajduje się w szczelinie maski spektrometru (Rysunek 4A).
  7. Zastosuj TNP-ATP i widma obrazu, jak w krokach 4.10-4.12, jednocześnie rejestrując odpowiedź prądu jonowego na aplikację nukleotydów.
    UWAGA: Szkło pipety może wprowadzać aberracje przestrzenne i odbicia w pozyskanych obrazach. Jednak aberracje te nie wpłyną na kształt uzyskanych widm, a odbite światło wzbudzenia można łatwo oddzielić od fluorescencji za pomocą spektrografu lub długoprzepustowego filtra emisyjnego.
  8. Przeanalizuj widma. Widma zobrazowane z wyciętych plastrów mogą wykazywać nadmierną subturcję niezwiązanej fluorescencji TNP-ATP z powodu wykluczenia TNP-ATP ze szkła pipety z plastrem (Rysunek 4CE). To nadmierne odejmowanie nie wpływa na widmo emisji ANAP i dlatego może być ignorowane.
    UWAGA: Ponieważ sygnał fluorescencji w wyciętych łatach będzie niższy niż w membranach niezadaszonych, ważne jest, aby użyć czasu ekspozycji, który daje wystarczająco wysoki stosunek sygnału do szumu bez zbyt szybkiego wybielania ANAP.

Wyniki

Rycina 2 przedstawia podstawowy układ doświadczalny służący do pomiaru wiązania nukleotydów z białkami fluorescencyjnymi w fragmentach błon pozbawionych dachu, otrzymanych w drodze sonikacji (Rysunek 2A,B). W celu uzyskania membran bez pokrywy (unroofed membranes) zastosowano dwa różne podejścia: bezpośrednią hodowlę komórek na poli-L- lisynekowe szkiełka nakrywki lub hodowanie komórek na nieobrobionym szkle i krótkie poddawanie ich działaniu poli-L-lizyną (0,1% w wodzie) przed usunięciem dachu (unroofing). Rysunek 2C przedstawia typowy fragment odsłoniętej błony z komórki HEK-293T wykazującej ekspresję KATP kanały oznakowane pomarańczowym białkiem fluorescencyjnym (OFP). Membrany z „odsłoniętym dachem” (unroofed membranes) były praktycznie niewidoczne w obrazach w jasnym polu i identyfikowano je za pomocą fluorescencji oznakowanych białek błonowych lub poprzez kontrastowe barwienie barwnikiem błonowym, takim jak rodamina B oktadecylowa13Oprócz membran z odsłoniętym wnętrzem, sonikacja komórek HEK-293T doprowadziła również do powstania częściowo odsłoniętych fragmentów komórek (Rycina 2D)10,17Fragmenty te były widoczne w polu jasnym. Może to być wynik pofałdowania błon plazmatycznych, które słabo przylegają do szkiełka podstawowego. Alternatywnie, fragmenty te mogą zawierać pęcherzyki i błony organelli wewnątrzkomórkowych. W związku z tym zaleca się pozyskiwanie obrazów wyłącznie z „prawdziwych” błon odsłoniętych (unroofed), ponieważ białko docelowe znakowane w obrębie błon wewnątrzkomórkowych może odzwierciedlać pośrednie etapy przetwarzania potranslacyjnego i składania. Hodowanie komórek na poli-LZaleca się stosowanie szkła pokrytego lizyną, ponieważ pozwoliło to na uzyskanie większej wydajności „prawdziwych” błon pozbawionych dachu po sonikacji.

W celu zminimalizowania ilości fluorescencyjnych nukleotydów potrzebnych w typowym eksperymencie zastosowano mikroobjętościowy system perfuzji (Rycina 2B). W naszej konfiguracji perfuzyjnej dostarczoną szklaną końcówkę powlekaną poliimidem zastąpiono ręcznie wyciąganą końcówką ze szkła borokrzemowego, co pozwoliło zredukować tło fluorescencji. Aby zminimalizować gromadzenie się nukleotydów wokół obrazowanych membran bez dachu, całą komorę kąpielową powoli perfundowano buforem. W związku z tym chcieliśmy zmierzyć szybkość wymiany roztworu w naszym mikroobjętościowym systemie perfuzji i zweryfikować, czy jesteśmy w stanie osiągnąć zamierzone stężenie ligandu w obszarze zainteresowania, tj. czy ligand z systemu perfuzji nie ulega bezpośredniemu rozcieńczeniu w medium kąpielowym przed dotarciem do membrany bez dachu. Aby skontrolować te możliwości, zmierzono czas napływu (wash-in) i wypłukiwania (wash-out) roztworu tetrametylorodaminy-5-maleimidu (TMRM) o stężeniu 50 μM z naszego mikroobjętościowego systemu perfuzji, skierowanego na powierzchnię szalki z dnem z laminki szklanej perfundowanej wodą (Rycina 2E). Kinetyka wymiany roztworu była powtarzalna i dobrze opisana pojedynczym zanikiem wykładniczym z stałymi czasowymi krótszymi niż 1 s zarówno dla napływu, jak i wypłukiwania. Takie czasy wymiany roztworu ograniczają nasze możliwości pomiaru kinetyki wiązania i odwiązania ligandu w obecnej konfiguracji. Aby zweryfikować, czy jesteśmy w stanie osiągnąć pożądane stężenie ligandu na powierzchni laminki, porównaliśmy intensywność fluorescencji 50 μM TMRM dostarczonego na laminkę przez nasz mikroobjętościowy system perfuzji z intensywnością 50 μM TMRM w statycznej kąpieli (Rycina 2F). Nie zaobserwowano różnic w intensywności, co potwierdziło, że za pomocą naszego mikroobjętościowego systemu perfuzji można osiągnąć odpowiednie stężenia ligandu na powierzchni laminki, nawet gdy kąpiel jest perfundowana.

Rycina 3A przedstawia obraz spektralny uzyskany z kanałów KATP znakowanych ANAP w obranej błonie komórki HEK-239T poddanej działaniu 5 μM TNP-ATP. Aby uzyskać takie obrazy, światło emitowane z obranej błony kierowano przez spektrometr połączony szeregowo z kamerą CCD. Emitowana fluorescencja ulegała dyfrakcji na siatkach i była rzutowana na matrycę kamery, generując widma. Powstałe obrazy zachowują informacje przestrzenne w wymiarze y, natomiast wymiar x został zastąpiony długością fali. Obszar zainteresowania (ROI), odpowiadający obranej błonie, jest obrysomowany na pomarańczowo. Na obrazie widoczne są dwa obszary o wysokiej intensywności, odpowiadające szczytom emisji ANAP i TNP-ATP. Najlepiej obrazuje to widmo uśrednione dla każdej długości fali (w całym ROI), przedstawione na Rycynie 3B. Pik przy ~470 nm odpowiada ANAP wbudowanemu w KATP; pik przy ~535 nm odpowiada TNP-ATP. W celu skorygowania fluorescencji tła oraz bezpośredniego wzbudzenia TNP-ATP w roztworze, z każdego obrazu wybrano obszar tła (Rycina 3A, kolor szary). Uśrednione widmo tła przedstawiono na Rycynie 3B. Końcowe widmo uzyskano poprzez odjęcie uśrednionego widma tła od uśrednionego widma ROI (Rycina 3C).

ANAP jest podatny na artefakty fotoblaknięcia. Rysunek 3D przedstawia spadek szczytowej fluorescencji ANAP po wielokrotnych ekspozycjach. Szczytowa fluorescencja z kilku ekspozycji w obecności TNP-ATP (lub z etapów płukania pomiędzy stężeniami TNP-ATP) została dopasowana do pojedynczego wykładniczego zaniku, co posłużyło do korekty artefaktów fotoblaknięcia (Rysunek 3E). Zaleca się przeprowadzanie eksperymentów zależnych od stężenia zarówno od niskich do wysokich, jak i od wysokich do niskich stężeń nukleotydów. Jeśli korekta blaknięcia nie wprowadza dodatkowych artefaktów, wyniki powinny być porównywalne11.

Rysunek 5A przedstawia reprezentatywne obrazy widmowe uzyskane z odsłoniętej membrany komórki ekspresującej kanały KATP z etykietą ANAP w obecności i przy braku TNP-ATP. Skorygowane widma przedstawiono na Rysunku 5B. Analiza widm emisji wykazała wyraźne rozdzielenie emisji fluorescencji donora i akceptora. Ze względu na zaobserwowane niespecyficzne wiązanie TNP-ATP do natywnych błon plazmatycznych nieprzetransfekowanych komórek HEK-293T, zaleca się ilościowe określanie FRET jako redukcji fluorescencji donora (ANAP)10,11. Pik ten był specyficzny dla znakowanego receptora.

W przypadku ligandów indukujących zmianę konformacyjną w ich receptorze, badania wiązania prowadzone w izolacji nie dostarczają bezpośrednich, istotnych mechanistycznie informacji o procesie wiązania ligandu18. Zależność stężenie-odpowiedź w wiązaniu ligandu zależy nie tylko od wewnętrznej powinowactwa wiązania, ale także od zmiany konformacyjnej indukowanej przez wiązanie ligandu oraz od wrodzonej skłonności receptora do zmiany konformacji w obecności ligandu. Aby lepiej zrozumieć procesy leżące u podstaw oddziaływań ligand-receptor, pomiary wiązania można połączyć z eksperymentami zapewniającymi odczyt funkcji białka. W tym celu kanały jonowe stanowią idealny system modelowy, ponieważ ich prądy można mierzyć z rozdzielczością czasową poniżej ms, aż do poziomu pojedynczych cząsteczek, stosując metodę clampy napięciowej. Historycznie, sprzężone pomiary prądu i fluorescencji dostarczyły istotnych informacji na temat otwierania i zamykania (bramkowania) kanałów jonowych sterowanych napięciem i ligandami19,20,21. Przeprowadzono eksperymenty w celu jednoczesnego pomiaru prądów jonowych i fluorescencyjnego wiązania nukleotydów cyklicznych do różnych kanałów regulowanych przez nukleotydy cykliczne22,23,24. W badaniach tych zastosowano ligand, którego wydajność kwantowa wzrastała po związaniu. Fluorescencję z niezwiązanego ligandu w objętości roztworu w pobliżu patcha można odjąć poprzez obrazowanie patchy za pomocą mikroskopii konfokalnej22,23. W naszych badaniach wiązanie mierzono za pomocą redukcji fluorescencji ANAP. Ponieważ sygnał ten jest specyficzny dla kanału, a FRET między ANAP a TNP-ATP jest silnie zależny od odległości (połowa maksymalnej wartości przy ~43 Å), uniknięto zanieczyszczenia sygnału przez nukleotydy związane niespecyficznie oraz niezwiązane.

Rycina 4A przedstawia typowy eksperyment fluorometrii patch-clamp (PCF). Uszczelnienie o wysokiej rezystancji (GΩ) zostało utworzone pomiędzy wypełnioną solą fizjologiczną pipetą z borokrzemianowego szkła (podłączoną do wzmacniacza voltage-clamp) a komórką eksponującą KATP znakowany ANAP. Po utworzeniu uszczelnienia pipetę odsunęto od komórki, aby umożliwić dostęp do wewnątrzkomórkowych miejsc wiązania nukleotydów. Następnie pipetę ustawiono nad obiektywem mikroskopu, centrując ją względem szczeliny maski spektrometru, a wylot mikroobjętościowego systemu perfuzji (zmodyfikowanego końcówką z borokrzemianowego szkła) zbliżono do pipety (Rycina 4D). Kontrolowano napięcie i mierzono prądy z kanałów w patchu. Reprezentatywne prądy i widma kanałów KATP znakowanych ANAP przedstawiono na Rycynie 4B, gdzie kodowanie kolorami pozwala dopasować widma do prądów. Widma emisji zostały skorygowane o tło i blaknięcie, analogicznie jak w przypadku błon bezkryształycznych (unroofed membranes).

Struktury chemiczne TNP-ATP i ANAP, widma emisji i absorbancji; schemat; analiza emisji.
Rysunek 1: ANAP i TNP-ATP tworzą odpowiednią parę FRET. (A) Struktury ANAP i TNP-ATP. Podświetlono grupy fluorescencyjne. (B) Widma absorbancji i emisji fluorescencji ANAP i TNP-ATP. Pokrywanie się emisji ANAP z absorbancją TNP-ATP jest niezbędne do wystąpienia FRET. Adaptowano z Puljung et al. (opublikowano na licencji Creative Commons Attribution, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu fluorescencji komórkowej; konfiguracja mikroskopii; analiza wykresu fluorescencji; wyniki spektroskopii.
Rycina 2: Pomiar wiązania nukleotydów w odsłoniętych błonach plazmatycznych. (A) Schemat przygotowania odsłoniętych błon plazmatycznych z komórek adherentnych eksprymujących fluorescencyjne białko błonowe. Podano instrukcje dla komórek hodowanych na szkiełkach podstawkowych powlekanych poli-L-lizyną lub niepowlekanych. (B) Konfiguracja eksperymentalna do pomiaru wiązania nukleotydów w odsłoniętych błonach. (C) Obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne całkowicie odsłoniętej błony plazmatycznej pochodzącej z komórki eksprymującej kanały KATP znakowane pomarańczowym białkiem fluorescencyjnym (OFP). Gwiazdka oznacza położenie błony, która jest niemal niewidoczna na obrazie w polu jasnym. OFP wzbudzano szerokopasmową diodą LED 565 nm poprzez filtr pasmowy 531/40 nm i dichroik krawędziowy 562 nm, a emitowane światło zbierano poprzez filtr pasmowy 593/40 nm. (D) Obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne częściowo odsłoniętego fragmentu błony pochodzącej z komórki eksprymującej kanały KATP znakowane pomarańczowym białkiem fluorescencyjnym (OFP). (E) Przebieg czasowy wymiany roztworu uzyskany przy użyciu konfiguracji opisanej w B. Pokazano pięć powtórzeń technicznych. Mikroobjętościowy system perfuzyjny napełniono 50 μM tetrametylorodaminy-5-maleimidu (TMRM). Kąpiel perfumowano wodą z prędkością ~0,5 mL/min. Dane z przebiegów czasowych wymywania w górę (rosnąca fluorescencja) i wymywania w dół (malejąca fluorescencja) dopasowano do pojedynczego wykładniczego zaniku postaci F = A*exp(-x/τ) + y0. Stała czasowa (τ) dla wymywania w górę wynosiła ~0,6 s. Stała czasowa dla wymywania w dół wynosiła ~1,0 s. TMRM wzbudzano szerokopasmową diodą LED 565 nm poprzez filtr pasmowy 540/25 nm i dichroik krawędziowy 565 nm, a emitowane światło zbierano poprzez filtr pasmowy 605/55 nm. (F) Porównanie natężenia fluorescencji roztworu TMRM 50 μM podanego przy użyciu mikroobjętościowego systemu perfuzyjnego (jak w B) oraz statycznej kąpieli zawierającej 50 μM TMRM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza fluorescencji; schemat, pomiary widma, analiza ROI, układ optyczny, wykresy dopasowania danych.
Rycina 3: Odejmowanie tła i korekcja wybielania. (A) Obraz spektralny (informacja przestrzenna w wymiarze y, długość fali w wymiarze x) odsłoniętej błony plazmatycznej komórki wykazującej ekspresję kanałów KATP znakowanych ANAP. Zastosowano 5 μM TNP-ATP przy użyciu układu opisanego na Rycynie 2B. Pomarańczowa ramka oznacza obszar zainteresowania (ROI), odpowiadający odsłoniętej błonie. Szara ramka oznacza obszar tła użyty do korekcji widma. (B) Widma emisji uzyskane z uśrednionych wartości dla poszczególnych długości fal z obszarów ROI i tła z punktu A. (C) Widmo uzyskane poprzez odjęcie uśrednionego widma tła od uśrednionego widma ROI z punktu B. Okno o szerokości 5 nm wokół piku ANAP, użyte do wyznaczenia średniej intensywności, przedstawiono jako szary obszar zacieniony. (D) Widma pozyskane z sześciu kolejnych 10-s ekspozycji odsłoniętej błony plazmatycznej komórki wykazującej ekspresję kanałów KATP znakowanych ANAP. Zwróć uwagę na spadek fluorescencji wynikający z fotowybielania. Wstawka przedstawia dopasowanie znormalizowanej fluorescencji szczytowej do pojedynczej funkcji wykładniczej o formie F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A). Symbole we wstawce są oznaczone kolorami odpowiadającymi widmom. (E) Te same widma co w punkcie D, skorygowane o fotowybielanie. Wstawka przedstawia znormalizowaną fluorescencję szczytową z punktu D jako puste kółka, a skorygowaną fluorescencję szczytową jako kółka wypełnione. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat metody patch-clamp; widma fluorescencji; efekty stężenia ATP; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 4: Jednoczesne pomiary wiązania nukleotydów i prądów kanałowych z wykorzystaniem fluorometrii patch-clamp (PCF). (A) Schemat przedstawiający układ eksperymentalny do pomiaru wiązania nukleotydów i prądów jonowych. (B) Przykładowe prądy (lewo) i widma (prawo) zarejestrowane z płata błony wyciętego z komórki wykazującej ekspresję kanałów KATP znakowanych ANAP. Prądy rejestrowano przy potencjale trzymania -60 mV, z digitalizacją 20 kHz i filtrowaniem 5 kHz. Szary zacieniowany obszar odpowiada zakresowi długości fali, z którego wyznaczono intensywność ANAP. Adaptowano z Usher et al. (opublikowano na licencji Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (C) Widmo zarejestrowane z płata błony wyciętego z komórki wykazującej ekspresję kanałów KATP znakowanych ANAP, wystawionej na działanie 1 mM TNP-ATP. Należy zwrócić uwagę na ujemny pik odpowiadający zakresowi długości fali, w którym obserwuje się fluorescencję TNP-ATP. Szary zacieniowany obszar oznacza zakres długości fali użyty do ilościowego oznaczenia fluorescencji ANAP, analogicznie jak w B. Adaptowano z Usher et al. (opublikowano na licencji Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (D) Obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne pipety patch wystawionej na działanie 1 mM TNP-ATP. Gwiazdka oznacza końcówkę pipety. (E) Obraz spektralny tej samej pipety patch w 1 mM TNP-ATP. Gwiazdka oznacza pozycję pipety. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Widma fluorescencji; wpływ stężeń TNP-ATP; analiza emisji; wykres; nm vs intensywność.
Rysunek 5: Wiązanie TNP-ATP do kanałów KATP znakowanych ANAP. (A) Obrazy spektralne odsłoniętej błony plazmatycznej z komórki wykazującej ekspresję kanałów KATP znakowanych ANAP w nieobecności TNP-ATP lub w obecności 50 μM lub 1 mM TNP-ATP. Intensywności przedstawiono w formie mapy ciepła. (B) Widma uśrednione dla każdej długości fali z obrazów w A, wykazujące gaszenie fluorescencji ANAP przez TNP-ATP. Zacieniowane obszary reprezentują dwa różne filtry pasmowe, które można wykorzystać do pomiaru gaszenia ANAP w przypadku braku spektrometru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywa dawka-odpowiedź, F/Fmax względem [TNP-ATP], wykres przedstawiający analizę danych dla badania wiązania ligandu.
Rysunek 6: Gaszenie fluorescencji kanałów KATP znakowanych ANAP przez TNP-ATP w membranach typu unroofed oraz w PCF. Nałożenie danych z pracy Usher et al. (opublikowano na licencji Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. Dane dopasowano do równania Hilla: F / Fmax = Emax + (1 – Emax) / (1+10(EC50 – [TNP-ATP])*h). F to zmierzona fluorescencja, Fmax to maksymalna fluorescencja w obecności nukleotydu, Emax to maksymalne gaszenie przy nasycających stężeniach nukleotydu, a h to współczynnik nachylenia Hilla. EC50 (stężenie nukleotydu, przy którym gaszenie wynosi połowę wartości maksymalnej) oraz [TNP-ATP] są wartościami logarytmicznymi. Membrany unroofed: EC50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, Emax = 0,93. PCF: EC50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, Emax = 1,00. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opracowaliśmy metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych w czasie rzeczywistym z nienaruszonymi białkami błonowymi. Nasza metoda opiera się na kilku innych uznanych technikach, w tym znakowaniu białek za pomocą ANAP przy użyciu tłumienia kodonu bursztynowego stop12, odsłaniania komórek14 i fluorometrii zaciskowej napięcia / PCF 19,20,21,22,23,24,25. Synteza tych podejść pozwala na pomiar wiązań nukleotydów z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Rzeczywiście, w naszej poprzedniej pracy byliśmy w stanie rozróżnić różne miejsca wiązania na tym samym kompleksie białkowym przy użyciu tego podejścia10,11. Co ważne, technika ta może być bezpośrednio zastosowana do niewielkich ilości białka w środowisku komórkowym w warunkach zachowania funkcji białka. Zastosowanie naszej metody wiązania w połączeniu z bezpośrednim, elektrofizjologicznym odczytem prądów kanałów jonowych pozwala nam uzyskać bogaty wgląd w molekularne podstawy bramkowania kanału11.

Ponieważ spektrometry są niestandardowym sprzętem laboratoryjnym, intensywność ANAP może być również monitorowana we względnej izolacji za pomocą filtrów pasmowo-przepustowych. Rysunek 5B przedstawia właściwości spektralne dwóch takich filtrów. Filtr pasmowo-przepustowy 470/10 nm skutecznie odsiewa sygnał fluorescencji od TNP-ATP i dobrze pokrywa się ze szczytową fluorescencją ANAP. Jednak szczytowa przepuszczalność tego filtra wynosi tylko około 50%, co może utrudnić uzyskanie dobrych sygnałów z membran (lub w wyciętych łatach membranowych pod cęgami napięciowymi). Inną opcją jest filtr pasmowo-przepustowy 460/60 nm. W porównaniu z filtrem 470/10 nm filtr 460/60 nm i stopa piku emisji TNP-ATP pokrywają się nieco bardziej. Jednak pasmo 460/60 nm ma przepuszczalność 90-95% w szerokim zakresie piku ANAP, co powinno zwiększyć sygnał emisji fluorescencji.

ANAP jest wrażliwym na środowisko fluoroforem 12,26,27. Emisja szczytowa i wydajność kwantowa różnią się w zależności od miejsca włączenia do białka będącego przedmiotem zainteresowania i mogą się zmieniać, gdy białko zmienia konformację. Takie zmiany byłyby natychmiast widoczne na podstawie widm emisyjnych, ale nie byłyby tak oczywiste, gdy intensywność ANAP jest mierzona za pomocą filtrów. W każdym przypadku wymagane są odpowiednie kontrole w celu wykazania, że sygnał fluorescencji nie zmienia się z powodu zmian w środowisku lokalnym wokół ANAP po związaniu nukleotydów. Eksperymenty kontrolne z nieznakowanymi nukleotydami mogą pomóc w sprawdzeniu, czy wszelkie zmiany intensywności ANAP są wynikiem FRET między nukleotydami ANAP i TNP. Nukleotydy TNP mogą wiązać się niespecyficznie z błonami pochodzącymi z komórek nietransfekowanych (albo z błoną plazmatyczną, albo z natywnymi białkami błonowymi)10. Określamy ilościowo wiązanie jako zmniejszenie fluorescencji dawcy, ponieważ sygnał ten jest specyficzny dla znakowanego kanału. Zalecamy jednak przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów kontrolnych dla każdej pary agonista/receptor, na przykład mutacji miejsca wiązania nukleotydu, jeśli jest znane, w celu sprawdzenia, czy zmiana fluorescencji donora jest rzeczywiście wynikiem bezpośredniego wiązania z znakowanym receptorem11. Na koniec zaleca się pracę z konstruktami, które oprócz znacznika ANAP zawierają znacznik białka fluorescencyjnego. Pomaga to odróżnić znakowaną fluorescencję receptora od tła/autofluorescencji. Fluorescencję tła można odróżnić od ANAP na podstawie piku i kształtu widm emisyjnych10, ale takie oznaczenia mogą być bardzo trudne, gdy używane są tylko zestawy filtrów. Dodatkowo, komórki i niezadaszone błony eksprymujące receptory fluorescencyjne można zidentyfikować za pomocą znacznika białka fluorescencyjnego bez konieczności wzbudzania ANAP i ryzyka nadmiernego fotowybielania.

W wielu naszych zapisach PCF zaobserwowaliśmy silny ujemny pik w naszych widmach przy wysokich stężeniach TNP-ATP (Figura 4C). Ten ujemny szczyt jest artefaktem naszego protokołu odejmowania tła. Rysunek 4D przedstawia obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne pipety punktowej wystawionej na działanie 1 mM TNP-ATP. Widoczny jest cień na końcówce pipety, wynikający z wykluczenia TNP-ATP z objętości ścianek pipety, który jest najbardziej widoczny w płaszczyźnie ostrości. Obraz widmowy na rysunku 4E pokazuje ciemne pasmo, odpowiadające temu cieniowi. Gdy obszar powyżej lub poniżej tego ciemnego pasma jest używany do odejmowania tła, tworzy ujemny szczyt. Co ważne, pik ten wystąpił w zakresie długości fal odpowiadającym emisji TNP-ATP i nie wpłynął na nasze pomiary wygaszania ANAP.

Głównym ograniczeniem naszych eksperymentów było uzyskanie odpowiedniej ekspresji błony plazmatycznej konstruktów znakowanych ANAP do pomiaru fluorescencji. Ogólnie rzecz biorąc, łatwiej było uzyskać wysokiej jakości widma z membran niezadaszonych niż z PCF, ze względu na ich większy rozmiar i naszą zdolność do szybkiego skanowania całej czaszy z membranami bez dachu, w przeciwieństwie do PCF, gdzie łaty można uzyskać tylko pojedynczo. W naszych eksperymentach dane z membran bez dachu i eksperymentów z PCF były podobne, ale nie równoważne (Figura 6)11. Nie ma jednak a priori powodu, dla którego miałoby to być uniwersalne spostrzeżenie, ponieważ białka w pipecie z plastrem mogą być w innym stanie funkcjonalnym niż te w błonach bez dachu.

W tym przypadku podjęto próby maksymalizacji ekspresji naszych konstruktów znakowanych ANAP, w szczególności obniżając temperaturę hodowli komórkowej do 33 °C 10,11,16. Z naszego doświadczenia wynika, że próba zidentyfikowania miejsc w białku, w których ANAP byłby konserwatywną substytucją, nie zawsze skutkowała konstruktami o dobrej ekspresji. Odnieśliśmy większy sukces w systematycznym skanowaniu całych regionów białkowych w poszukiwaniu miejsc inkorporacji ANAP i badaniach przesiewowych kandydatów na ekspresję powierzchniową10. System znakowania ANAP działa również w oocytach Xenopus laevis, co pozwala na wycinanie znacznie większych płatów błony, zwiększając w ten sposób sygnał do szumu 26,27,28.

Podczas gdy oczekuje się, że większe poziomy ekspresji spowodują jaśniejsze sygnały, minimalna liczba kanałów wymagana do pomiaru fluorescencji zależy od kilku czynników, w tym jasności fluoroforu, stopnia fotowybielania, intensywności światła wzbudzającego i płaszczyzny ostrości. Teoretycznie szacunki można by dokonać poprzez skorelowanie intensywności fluorescencji i prądu kanału, jak wykazano wcześniej 28,29. Jednak wiarygodność takich szacunków wymaga pewnej wiedzy na temat przewodności pojedynczego kanału i otwartego prawdopodobieństwa kanału. Oprócz czynników wymienionych powyżej, na sygnał fluorescencyjny będą miały również wpływ kanały związane z pęcherzykami lub odcinkami błony plazmatycznej przyklejonymi do szkła pipety, które nie są pod napięciem clamp.

Metoda ta jest łatwo przystosowana do badania innych kanałów jonowych wrażliwych na nukleotydy. CFTR jest strukturalnie podobny do dodatkowej podjednostki receptora sulfonylomocznika KATP 30,31. Podobnie jak KATP, CFTR bramkowanie jest kontrolowane przez wiązanie nukleotydów, co czyni go oczywistym przyszłym celem naszej metody7. Purynergiczne receptory P2X to kanały jonowe bramkowane zewnątrzkomórkowym ATP9. TNP-ATP działa jako antagonista receptorów P2X32,33. Dlatego nie będzie przydatny do badania aktywacji P2X, chociaż może być stosowany w testach konkurencji z agonistami P2X. Alternatywnie, do badania aktywacji można zastosować inne fluorescencyjne pochodne ATP o wystarczającym nakładaniu się widma z emisją ANAP. Alexa-647-ATP jest fluorescencyjnym agonistą receptora P2X34. Obliczone R0 między Alexa-647 a ANAP wynosi ~85 A, co oznacza, że bezpośrednie wiązanie z P2X powinno spowodować znaczne wygaszenie ANAP wbudowanego w kanał. Jednak tak długie R0 spowoduje również wygaszanie z Alexa-647-ATP związane z sąsiednimi podjednostkami i zwiększa prawdopodobieństwo, że niespecyficzne wiązanie nukleotydów spowoduje FRET. Ponieważ miejsce wiązania liganda w receptorach P2X jest zewnątrzkomórkowe, pomiary wiązania byłyby wykonywane na nienaruszonych komórkach, w zacisku napięciowym całej komórki lub w łatach błonowych na zewnątrz. Nasza metoda może być również rozszerzona o badanie wiązania i aktywacji elektrogennych i nieelektrogenicznych transporterów i pomp, które zależą od ATP w swoim cyklu reakcji, a także receptorów P2Y sprzężonych z białkiem G. Wreszcie, mimo że opracowaliśmy tę metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), to samo podejście można zastosować do badania wiązania z praktycznie każdym receptorem, dla którego zidentyfikowano odpowiedni, fluorescencyjny ligand.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Raulowi Terronowi Exposito za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały sfinansowane przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BB/R002517/1; MCP i FMA) oraz Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba poddana hodowli tkankowej T75StarLabCC7682-4875
0,1% w/v poli-L-lizynaSigma-AldrichP8920
30 mm szkiełka szklane z pokrywką borokrzemianowąVWR631-0174
35 mm sterylne naczynia bez obróbkiCytoOneCC7672-3340
35 mm szklana pokrywa dolna naczynieWPIFD35-PDL-100
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)Gibco31966021
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco10500-064
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122
TrypLE select (tryozyna)Gibco12563-011Odczynnik Trypsyna/EDTA
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Gibco14040-091
UltraPure woda destylowanaInvitrogen10977-035
HEK293T komórkiATTCCRL-3216Stosowany między przejściami 5-30
ANAP-TFAAsisChemASIS-0014Rozpuszczony w 30 mM NaOH do końcowego stężenia 1 mM
plazmid ekspresji pANAPAddgenePlasmid #48696Koduje parę syntetaz tRNA/tRNA do ekspresji białka
peRF1-E55D znakowanego ANAPChin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Wielka Brytania)Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728Koduje dominująco-ujemny eukariotyczny czynnik uwalniania rybosomów
TransIT-LT1Odczynnik do transfekcjiMirus BioMIR 2300
Grubościenne kapilary ze szkła borokrzemianowegoAparat HarvardaGC150F-15
Tetrametylorodamino-5-maleimidSigma-Aldrich94506
TNP-ATPJena BioscienceNU-221LDostarczany na 10 mM w wodzie
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TE2000-UNikon
60x zanurzenie w wodzie (1.4 NA)GłowicaMRD07602
385/490/565/625 nm
Czterokanałowy sterownik LEDThorLabsDC4100
390/18 nm filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowegoThorLabsMF390-18Do wzbudzenia ANAP
Długoprzepustowy filtr emisyjny 400 nmThorLabsFEL0400Do obrazowania widm ANAP
416 nm krawędziowy dichroicznyThorLabsMD416Do obrazowania widm ANAP
Filtr pasmowo-przepustowy 460/60 nmThorLabsMF460-60Sugerowany filtr szerokopasmowo-przepustowy do obrazowania fluorescencji ANAP (rysunek 4B)
Filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 470/10 nmThorLabsFB470-10Sugerowany filtr wąskopasmowo-przepustowy do obrazowania fluorescencji ANAP (rysunek 4B)
Filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 531/40BrightlineFF01-531/40-25Do wzbudzenia białka fluorescencyjnego pomarańczowego (OFP)
Filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 540/25 nmChromaD540/25XDo wzbudzenia tetrametylorodamino-5-maleimidu (TMRM)
562 nm krawędzi dichroicznejSemrockFF562-Di03Do obrazowania fluorescencji OFP
565 nm krawędzi dichroicznejChroma565DCDo obrazowania TMRM fluorescencja
593/40 nm filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowyBrightlineFF01-387/11-25Do obrazowania fluorescencji OFP
605/55 nm pasmowo przepustowe filtr emisyjnyChromaD605/55MDo obrazowania fluorescencji TMRM
Spektrometr obrazowania IsoPlane-160Princeton InstrumentsKamera 400BR_eXcelon IsoPlane-160
PIXISPrinceton InstrumentsPIXIS: 400BR_eXcelon
Wzmacniacz Axopatch 200BUrządzenia molekularneDigitizer Axopatch 200B-2
Digidata 1440AUrządzenia molekularneDigidata 1440A
Sonics& Sonics & MateriałyVC-50Do zdejmowania dachu
Cyfrowa pompa perystaltyczna REGLOIsmatecISM 832Do perfuzji kąpielowej
System perfuzji mikroobjętościowejALA Instrumenty naukoweALA μ Flow-8Do perfuzji TNP-ATP
pClamp 10.6.2molekularneRejestracja i analiza prądów
Lightfield 5.20.1507Princeton InstrumentsOprogramowanie do akwizycji obrazów i widm
MatlabMathworksDo analizy danych
Python 3.8.1Python Software FoundationDo analizy danych
Lipopolyplex LED o dużej mocy Nikon LED4D245 Urządzenia

Bibliografia

  1. Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  4. Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
  5. Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
  6. Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
  7. Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
  8. Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
  9. Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
  10. Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103(2019).
  11. Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775(2020).
  12. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  13. Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
  14. Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
  15. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  16. Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562(2015).
  17. Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
  18. Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
  19. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  20. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  21. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7(2003).
  22. Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
  23. Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
  24. Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
  25. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  26. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  27. Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
  28. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
  29. Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
  30. Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
  31. Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
  32. Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876(2017).
  33. Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
  34. Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza FRETznakowanie ANAPTNP ATPmembrany bez dachufluorometria patch-clampkanały KATPobrazowanie spektralnewiązanie w czasie rzeczywistym
Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.