Artykuł metodologiczny

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61403

⸱

7 października 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Streszczenie

Organoidy jąder dostarczają narzędzia do badania rozwoju jąder, spermatogenezy i endokrynologii in vitro. Opracowano kilka metod w celu stworzenia organoidów jąder. Wiele z tych metod opiera się na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w celu promowania składania tkanek de novo, jednak istnieją różnice między metodami pod względem morfologii biomimetycznej i funkcji tkanek. Co więcej, istnieje niewiele bezpośrednich porównań opublikowanych metod. W tym przypadku dokonuje się bezpośredniego porównania, badając różnice w protokołach generowania organoidów z dostarczonymi wynikami. Opisano cztery archetypowe metody generowania: (1) 2D ECM, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM free i (4) 3D ECM culture. Do oceny wytwarzania organoidów jąder wykorzystano trzy podstawowe punkty odniesienia. Są to samoorganizacja komórkowa, włączenie głównych typów komórek (Sertoli, Leydig, komórki rozrodcze i okołorurkowe) oraz odpowiednio podzielona architektura tkankowa. Spośród czterech badanych środowisk, hodowle 2D ECM i 3D wolne od ECM wygenerowały organoidy o wewnętrznej morfologii najbardziej zbliżonej do rodzimych jąder, w tym de novo podział komórek rurkowych i śródmiąższowych, rozwój struktur podobnych do kanalików i ustaloną długoterminową funkcję endokrynologiczną. We wszystkich badanych metodach wykorzystano niesortowane, pierwotne zawiesiny mysich komórek jąder i wykorzystano powszechnie dostępne zasoby hodowlane. Te techniki generowania organoidów jąder zapewniają wysoce dostępny i powtarzalny zestaw narzędzi dla inicjatyw badawczych dotyczących organogenezy i fizjologii jąder in vitro.

Wprowadzenie

Organoidy jąder to pionierska technika badania rozwoju jąder, spermatogenezy i fizjologii in vitro1,2,3,4. Zbadano kilka metod generowania organoidów; Obejmują one różnorodne systemy hodowli bez macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ECM, zarówno w orientacji dwuwymiarowej (2D), jak i trójwymiarowej (3D). Różne metody generowania mogą promować różne strategie składania komórek; Skutkuje to wysokim poziomem zmienności morfologicznej i funkcjonalnej między opublikowanymi modelami organoidów. Celem tego artykułu jest omówienie obecnego stanu modeli jąder in vitro i posłużenie jako szablon dla przyszłych badaczy podczas projektowania eksperymentów z organoidami jąder. W ramach niniejszego badania zdefiniowano i scharakteryzowano cztery różne archetypy systemu hodowlanego w procesie eksperymentalnym i wyniku biologicznym. Należą do nich: metody hodowli 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free i 3D ECM. Przedstawione w niniejszym dokumencie strategie mają być proste, dostępne i wysoce powtarzalne dla różnych laboratoriów i grup badawczych.

Historycznie dla jądra, nazwa "in vitro", była używana dla kilku różnych metod hodowli tkanek i komórek jąder. Należą do nich metody organotypowej hodowli tkanek/narządów (tj. hodowla eksplantatów)5, izolowana hodowla kanalików nasiennych6, hodowla komórek jądra7, oraz metody morfogenezy tkanek de novo (tj. konstrukty biologiczne i organoidy)1. Pierwsze badania nad spermatogenezą in vitro przeprowadzono około 100 lat temu, z hodowlą eksplantatów jąder królika w 1920 roku8, a później w 1937 roku z eksplantatami myszy9. W ramach tych wstępnych eksperymentów zaobserwowano, że spermatogonia w znacznym stopniu degeneruje się w pierwszym tygodniu hodowli, chociaż zidentyfikowano pewne komórki różnicujące się mejotycznie. Przypominając te historyczne doniesienia, hodowla eksplantatów jądra została ożywiona i zoptymalizowana w 2011 roku, aby stać się wykonalną techniką badania klasy testis10. Od 2011 r. hodowla eksplantatów wytworzyła plemniki kompetentne w płodności w wielu raportach11,12,13. Jednak ze względu na zależność hodowli eksplantatów od wcześniej istniejących natywnych kanalików jądrowych, te ostatnie postępy są dokładniej opisywane jako przykłady funkcji jąder i spermatogenezy "ex vivo", funkcji tkanek, która została utrzymana lub wznowiona po usunięciu z organizmu. Pomimo rozpowszechnienia w literaturze, długoterminowe utrzymanie i różnicowanie komórek rozrodczych w eksplantatach jąder jest trudne do odtworzenia14,15,16,17,18, zwłaszcza w ramach czasowych wystarczająco długich, aby w pełni zaobserwować spermatogenezę in vitro (~35 dni u myszy19 i 74 u ludzi20). Intrygujące jest zrozumienie, że wiele z tych samych wyzwań, których doświadczyliśmy 100 lat temu, jest nadal doświadczanych w spermatogenezie ex vivo.

W przeciwieństwie do metod ex vivo, organoidy jąder to de novo złożone mikrotkanki generowane całkowicie in vitro ze źródeł komórkowych (tj. pierwotnych komórek jąder). Organoidy jąder zapewniają kreatywną strategię pozwalającą obejść historyczną zależność tej dziedziny od wcześniej istniejących tkanek rodzimych i całkowicie podsumować biologię jąder in vitro. Istnieje wiele wymagań wspólnych dla większości modeli tkanek organoidowych; Obejmują one (1) morfologię lub architekturę tkanek in vivo-mimetycznych, (2) wiele głównych typów komórek reprezentowanej tkanki, (3) samoorganizację lub samoorganizację w ich generowaniu oraz (4) zdolność do symulowania pewnego poziomu funkcji i fizjologii reprezentowanej tkanki21,22,23,24. W przypadku jądra można to uchwycić w czterech głównych cechach rozpoznawczych: (1) włączenie głównych typów komórek jądra, zarodka, Sertoliego, Leydiga, komórek okołorurkowych i innych komórek śródmiąższowych, (2) składanie tkanek skierowanych na komórki, (3) odpowiednio podzielone typy komórek na oddzielne przedziały rurkowe (zarodek i Sertoli) i regiony śródmiąższowe (wszystkie inne typy komórek) oraz (4) pewien stopień funkcji tkanek (np. wydzielanie hormonów rozrodczych lub reakcje tkanek oraz utrzymanie i różnicowanie komórek rozrodczych). Biorąc pod uwagę historyczne wyzwania związane z utrzymaniem różnicowania komórek rozrodczych ex vivo i in vitro, rekapitulacja in vivo-mimetycznych architektur jąder (tj. struktur przypominających kanaliki nasienne) z dodatkowymi markerami sugerującymi symulację fizjologii jąder (np. funkcji hormonalnej), są priorytetowymi kamieniami milowymi w kierunku generowania organoidów, które pewnego dnia mogą utrzymać spermatogenezę in vitro.

Większość opublikowanych metod organoidów jąder korzysta z dostępnych na rynku ECM (np. kolagenu lub zastrzeżonych preparatów ECM)25,26,27 lub ECM pozyskiwane na zamówienie (np. decelularizowane hydrożele pochodzące z ECM z jądrami)28,29,30. Egzogenny ECM wspomaga tworzenie tkanek de novo poprzez zapewnienie rusztowania wspomagającego montaż do generowania tkanek. Metody ECM pozwoliły na imponujący poziom tworzenia tkanek, w tym pewną obecność komórek rozrodczych i morfologię mimetyczną tkanki25,28. Jednak ECM, z których korzystają, nie zawsze są powszechnie dostępne (tj. decelularizowane hydrożele pochodzące z ECM), a niektóre metody wymagają wyrafinowanych orientacji wysiewu żeli i komórek (np. 3-warstwowe gradienty ECM i druk 3D)25,31,32. Metody wolne od rusztowań (np. wiszące płytki hodowlane i nieprzyległe)33,34,35 również wygenerowały solidne i wysoce powtarzalne organoidy bez potrzeby stosowania żeli lub rusztowań ECM. Jednak morfologia tkanek tych organoidów wolnych od rusztowań jest często niepodobna do jąder in vivo, a większość tych doniesień zawiera biochemiczny dodatek ECM w celu promowania tworzenia tkanek33,34,36, lub alternatywnie, polegać na wirowaniu w celu wymuszonej agregacji i zagęszczenia komórek34, co czyni je mniej idealnymi do badania migracji kierowanej przez komórki i samoorganizacji.

Cztery metody generowania organoidów przedstawione w tym manuskrypcie obejmują zarówno zależne od ECM, jak i niezależne strategie, z których każda wykorzystuje proste rozsiewanie komórek, które umożliwia obserwację samoorganizacji organoidów sterowanych przez komórki. Wszystkie cztery techniki mogą być wykonywane z tych samych zawiesin komórkowych lub mogą wykorzystywać niestandardowe i wzbogacone o typ komórki populacje. Mocną stroną tych metod jest możliwość obserwacji samoorganizacji organoidów w czasie rzeczywistym oraz bezpośredniego porównania, w jaki sposób struktury jąder samoorganizują się w różnych mikrośrodowiskach kulturowych. Różnice fenotypowe między tymi czterema metodami hodowli powinny być brane pod uwagę pod kątem ich wpływu na pytanie badawcze lub temat badawczy badacza. Każda metoda pozwala na uzyskanie konstruktów biologicznych lub organoidów w ciągu 24 godzin lub krócej. Podsumowując, przedstawione tutaj metody zapewniają zestaw technik składania organoidów do badania składania organoidów jąder, rozwoju tkanek i fizjologii jąder in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Northwestern, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC.

1. Przygotowanie enzymatycznych roztworów dysocjacji tkanek

  1. Użyć dwóch różnych roztworów enzymatycznych (roztwór 1 i roztwór 2), oba wykonane przy użyciu roztworu pożywki do hodowli podstawowej (BM).
  2. W celu przygotowania BM dodać surowicę i penicylinę-streptomycynę do minimalnych niezbędnych stężeń do końcowych stężeń odpowiednio 10% i 1% (patrz Tabela materiałów dla określonych odczynników). Następnie sterylnie przefiltruj BM przez filtr 0,22 μm. Przed użyciem z komórkami należy wstępnie zrównoważyć sterylny BM do neutralnego pH, dozując go do naczynia hodowlanego i umieszczając w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę
    UWAGA: BM można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia, po czym należy przygotować świeży BM.
  3. Aby przygotować roztwory podstawowe kolagenazy I, należy najpierw rozpuścić 100 mg kolagenazy I w 1 ml sterylnego zarodka klasy H2O (końcowe stężenie 10% m/v), odwrócić lub zawirować do rozpuszczenia i przechowywać 20 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Podwielokrotności należy rozmrażać tylko raz.
  4. W celu przygotowania roztworów podstawowych dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) należy dodać 20 mg DNazy I do 1 ml sterylnego zarodka klasy H2O (stężenie końcowe 2% m/v), odwrócić lub zawirować do rozpuszczenia (nie wirować) i przechowywać 20 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Podwielokrotności należy rozmrażać tylko raz.
  5. W przypadku roztworów podstawowych hialuronidazy dodać 30 mg do 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; końcowe stężenie 3% hialuronidazy m/v w PBS zawierającym Ca++/Mg++), odwrócić lub zawirować do rozpuszczenia i przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Podwielokrotności można kilkakrotnie rozmrażać i ponownie zamrażać bez utraty aktywności enzymatycznej.
  6. Aby przygotować roztwór dysocjacyjny 1, dodaj 10 μl kolagenazy I i 10 μl DNazy I do 1 ml sterylnego, wstępnie zrównoważonego BM (końcowe stężenia: 1 mg/ml kolagenazy I i 5 μg/ml DNazy I). Delikatnie rozetrzeć pipetą, aby wymieszać roztwór, a następnie podgrzać do temperatury 37 °C przed użyciem z chusteczką.
    UWAGA: Roztwór 2 przygotowuje się przez dodanie 33 μl hialuronidazy (podgrzanej do 37 °C) na 1 ml roztworu 1 (do końcowego stężenia 1 mg/ml). Następuje to w połowie enzymatycznej dysocjacji tkanki jądra w kroku 2.5 poniżej.

2. Dysocjacja tkanki jądra

UWAGA: Wszystkie myszy były trzymane w klatkach z polipropylenu i zaopatrywane w jedzenie i wodę ad libitum. Zwierzęta były karmione napromieniowaną karmą, która nie zawierała fitoestrogenów. Młode myszy CD-1, 5 dni po porodzie (dpp), były wykorzystywane do wszystkich eksperymentów i znieczulane przed eutanazją i pobraniem tkanek, w komorze anestezjologicznej podłączonej do parownika izofluranu (2,5 l / min w O2). U myszy potwierdzono pełne znieczulenie poprzez brak odpowiedzi na nakłucie palca u nogi, po czym myszy zostały poddane eutanazji poprzez dekapitację.

  1. Znieczulij myszy w komorze izofluranowej, zapewnij znieczulenie za pomocą nakłucia palca u nogi, a następnie odetnij głowę myszy ostrymi nożycami. Umieść uśpioną mysz na wznak na macie preparacyjnej i wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Owiń skórę dolnej części brzucha kleszczami i otwórz brzuch nożyczkami.
  2. Zlokalizuj jądra w dolnej lewej i prawej pachwinowej części brzucha. Przeciąć ich połączenia z nasieniowodami i wszelką zakotwiczoną tkanką łączną, a następnie podnieś całe jądro (z nadal przyczepionymi najądrzami) ze zwierzęcia. Umieścić jądra na szalce Petriego o wstępnie zrównoważonym BM.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym i w sterylnym polu wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej na jednym końcu każdego jądra za pomocą małych nożyczek do mikrodysekcji lub delikatnie rozrywając za pomocą dwóch cienkich kleszczy.
    1. Następnie, trzymając jądro od przeciwnego końca nacięcia, delikatnie ściśnij jądro cienkimi kleszczami i pchnij delikatnym ruchem zamaszystym w kierunku otworu w tunice; spowoduje to uwolnienie tkanki jądra jako jednego spójnego kawałka.
  4. Pokrój jądra na mniejsze kawałki (≤ 2 mm3) i umieść je w 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) dysocjacji Roztwór 1.
    1. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. W przypadku więcej niż 10 jąder należy zwiększyć całkowitą objętość roztworu dysocjacyjnego o 1 ml, zapewniając co najmniej 1 ml roztworu dysocjacyjnego na 10 jąder (np. 2 ml na 20 jąder, 3 ml na 30 jąder itd.).
    3. Delikatnie rozcierać fragmenty jądra 50 razy (50x) w roztworze 1 za pomocą pipety P1000. Upewnij się, że kanaliki oddzielają się od siebie i od tkanki śródmiąższowej w tym miejscu. Jeśli pozostaną grudki, inkubować przez dodatkowe 5 minut i ponownie rozcierać (50x).
  5. Dodać 33 μl roztworu podstawowego hialuronidazy (wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C, od kroku 1.5) na 1 ml mieszaniny dysocjacyjnej roztwór 1 (zawierającej częściowo zdysocjowaną tkankę jądra i kanaliki). Po dodaniu hialuronidazy nazywa się to roztworem 2.
    1. Rozcierać (50x) za pomocą P1000 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Rozcierać (50x) za pomocą pipety P200.
    3. Upewnij się, że w tym momencie nie ma widocznych kanalików ani grudek komórek. Jeśli grudki utrzymują się, inkubować do 5 minut, z dalszym rozcieraniem za pomocą pipety P200 (50x).
  6. Ugasić enzymy dysocjacyjne, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do 10% całkowitej objętości roztworu 2. Kilkakrotnie rozcierać za pomocą pipety P200, aby upewnić się, że nie pozostały żadne grudki, a następnie przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  7. Odwirować komórki w stężeniu 100 x g przez 7 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym BM.
  8. Policz całkowite i żywotne stężenia komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze. Dodać 10 μl rozcieńczonej w stosunku 1:1 zawiesiny komórek: roztwór błękitu trypanowego do komory zliczania komórek hemocytometru (patrz tabela materiałów).
    1. Ponownie odwirować komórki przy 100 x g przez 7 minut i ponownie zawiesić w świeżym BM.
      UWAGA: Do obliczania stężenia i liczby komórek należy używać wyłącznie żywotnych komórek. Do wytwarzania organoidów należy używać wyłącznie zawiesin komórkowych o ≥ 80% żywotności.
    2. Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki do stężeń komórek zgodnie z opisem, aby podzielić 280 000 komórek na objętości użyte w protokole Szczegółowe kroki poniżej w sekcji 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 komórek/ml, 2D ECM – 0,56 x 106 komórek/ml, 3D ECM-Free – 4,66 x 106 komórek/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 komórek/ml.
      UWAGA: Wszystkie przedstawione tutaj eksperymenty z kulturami rozpoczynają się od 280 000 komórek wysianych na basenie. Liczby te są dopasowywane do reprezentatywnych danych w Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4.

3. Przygotowanie naczyń z hodowli organoidów i wysiewanie komórek

UWAGA: Aby zapewnić jednorodność ECM, przed eksperymentem należy wstępnie rozmrozić zamrożone porcje ECM przez noc. Podwielokrotności ECM należy zanurzyć w wiadrze z lodem w lodówce lub chłodni o temperaturze 4 °C, aby zagwarantować powolny, stopniowy wzrost temperatury. Wszystkie ECM stosuje się w końcowym rozcieńczeniu 1:1 w BM do hodowli. Rozmrożony ECM i rozcieńczony w stosunku 1:1 ECM należy przechowywać na lodzie do momentu bezpośrednio przed użyciem, w przeciwnym razie ECM może dojść do przedwczesnej polimeryzacji.

  1. W przypadku hodowli 2D bez ECM nie jest konieczne specjalne przygotowanie, zawiesiny jednokomórkowe (500 μL 0,56 x 106 komórek/ml w BM) należy umieścić bezpośrednio na szkiełkach 4-dołkowych i umieścić w inkubatorze do hodowli w temperaturze 35 °C.
    UWAGA: Komórki powinny przylegać do dna szalki hodowlanej w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli i mogą w tym samym czasie wykazywać małe skupiska komórek 3D.
  2. W przypadku hodowli 2D ECM należy dozować 100 μl zimnego, rozcieńczonego w stosunku 1:1 zewnątrzkomórkowego podłoża macierzystego do 4-dołkowego szkiełka samochodowego, upewniając się, że żel pokrywa całe dno naczynia.
    1. Umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 35 °C na co najmniej 30 minut, aby umożliwić polimeryzację ECM do postaci żelu.
    2. Dodaj zawiesinę komórek (500 μl 0,56 x 106 komórek/ml w BM) bezpośrednio na wierzchu żelu 2D po jego polimeryzacji.
      UWAGA: Komórki powinny grupować się razem, tworząc małe klastry 3D w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli.
  3. W przypadku hodowli 3D bez ECM, przed rozpoczęciem hodowli komórkowej należy przygotować wkładki do szalki Petriego 3D z agarozy.
    1. Najpierw autoklaw 1,5 g proszku agarozy w zlewce o pojemności 100 ml, a następnie dodaj 75 ml sterylnej, destylowanej wody i kuchenki mikrofalowej, aby uzyskać stopioną 2% agarozę do odlewania szalki Petriego 3D.
    2. W sterylnym obszarze roboczym dozuj stopioną agarozę do formy 3D na szalkę Petriego, aż menisk zrówna się z bokami formy.
    3. Pozwól agarozie ostygnąć i stężeć. Gdy forma stwardnieje, odwróć ją do góry nogami i delikatnie zginaj kilkakrotnie, aż szalka Petriego 3D z agarozy wypadnie z formy.
      UWAGA: W tym momencie można przygotować wiele agarozowych szalek Petriego 3D i przechowywać je w sterylnymH2Olub DPBS w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
    4. Przed hodowlą umieść agarozowe szalki Petriego 3D w 24-dołkowej naczyniu hodowlanym i przykryj je 1 ml BM. Pozostawić trójwymiarowe szalki Petriego w równowadze w BM przez co najmniej 30 minut w inkubatorze do hodowli w temperaturze 37 °C. Odrzucić BM i powtórzyć równoważenie jeszcze raz z 1 ml świeżego BM. Po zrównoważeniu 3D szalek Petriego w BM, będą one miały ten sam kolor co BM (tj. różowy).
    5. Aby przygotować się do wysiewu komórek, usuń cały BM ze studzienki i dozuj 200 μl świeżego BM wokół, ale nie wewnątrz środkowego wgłębienia szalki Petriego 3D. Zbierz również pozostały BM z wnętrza środkowego wgłębienia do wysiewu komórek wkładki mikrostudzienki.
    6. Dozować zawiesinę jednokomórkową (4,66 komórek/ml w 60 μl BM) do środkowego wgłębienia agarozowej szalki Petriego 3D. Delikatnie rozcieraj w górę iw dół, aby wymieszać komórki i zagwarantować zawiesinę pojedynczej komórki na początku hodowli.
    7. Umieścić w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 35 °C w celu przeprowadzenia hodowli. Następnego dnia usuń 200 μl BM z okolic wkładki mikrostudzienki i zastąp 1 ml świeżego BM. Spowoduje to przeniesienie poziomu cieczy powyżej płaszczyzny wkładki, zanurzając całą kulturę.
    8. Powoli i ostrożnie wyjmij/dodaj pożywkę z zewnątrz agarozowej szalki Petriego 3D. Organoidy powinny były zagęścić się przez noc, pozwalając im spocząć na dnie i umożliwiając zmiany pożywek pozostawienie organoidów w spokoju.
  4. W przypadku hodowli 3D ECM należy przygotować zawiesinę pojedynczej komórki, łącząc w równych częściach zawiesinę komórek w BM z zimnym, wstępnie rozmrożonym ECM (stężenie końcowe = 2,8 x 106 komórek/ml).
    1. Natychmiast dozuj mieszaninę komórka-ECM do 4-dołkowego szkiełka komorowego, upewniając się, że mieszanina pokrywa całe dno płytki.
    2. Umieścić szkiełka z komory w temperaturze 35 °C w inkubatorze i pozwolić na polimeryzację ich zawartości. Powinno to zająć co najmniej 30 minut. Po polimeryzacji dodać 500 μl BM na wierzch kultury.
      UWAGA: Komórki powinny się zgrupować, tworząc małe agregaty 3D w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli.

4. Utrzymanie organoidów

  1. Hodowla wszystkich typów modeli organoidów w temperaturze 35 °C. Dla wszystkich typów kultur co 2 dni wymieniaj połowę swoich pożywek na świeże BM. Aby upewnić się, że organoidy nie zostaną przypadkowo zebrane podczas wymiany pożywki, zawsze powoli pobieraj pożywkę z rogu szkiełka komory oraz z zewnętrznego punktu poza agarozowymi szalkami Petriego 3D. Wszystkie pożywki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu wykorzystania ich do późniejszych testów immunologicznych lub innych analiz (tj. oznaczania ilościowego wydzielanych hormonów rozrodczych lub cytokin).
  2. Po 7 dniach w hodowli należy zastosować BM zawierający hormon folikulotropowy (końcowe stężenie 20 mIU/ml) i ludzką gonadotropinę kosmówkową (końcowe stężenie 4,5 IU/ml). Dotyczy to wszystkich typów kultur organoidowych.
  3. Rutynowo obrazuj wszystkie kultury organoidów (tj. obrazowanie poklatkowe) w celu scharakteryzowania powstawania organoidów i ilościowego określenia wskaźników samoorganizacji, rozwoju i wzrostu w czasie.

5. Kolekcja organoidów

UWAGA: Wszystkie organoidy mogą być utrwalone za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS do dalszego znakowania immunologicznego i analiz histologicznych. Utrwalać na 2 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją lub przez noc w temperaturze 4 °C.

  1. W przypadku kultur 2D wolnych od ECM, najpierw przepłucz próbkę świeżym PBS, a następnie dodaj utrwalacz bezpośrednio na przylegające konstrukcje.
  2. W przypadku metod hodowli ECM (2D i 3D) należy przepłukać raz PBS, a następnie dodać utrwalacz bezpośrednio na wierzchu próbki organoidu ECM (aby połączyć żel ECM i organoidy razem) lub alternatywnie, delikatnie pipetować organoidy w górę i w dół, aby uwolnić je od otaczającego ECM, i przenieść do oddzielnej probówki w celu utrwalenia.
  3. W przypadku hodowli 3D bez ECM, delikatnie pipetuj organoidy w górę i w dół w środkowym wgłębieniu agarozowej szalki Petriego 3D; spowoduje to wypłukanie organoidów, ułatwiając ich łatwe pobranie za pomocą pipety. Następnie przenieś organoidy do osobnej probówki w celu utrwalenia.
  4. Przed przetworzeniem na parafinę należy osadzić wiele organoidów (≥ 20) w małej objętości (~ 30 μl) żelu do przetwarzania tkanek; pomaga to zorientować i skoncentrować organoidy na małym obszarze w blokach parafinowych, ułatwiając obserwację podczas cięcia i łatwiejszą identyfikację wizualną w obrębie skrawków parafiny.
    UWAGA: Organoidy mogą być trudne do zidentyfikowania po zatopieniu parafiny i podziale na mikrotomie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie organoidów uznawano za nieudane, jeśli komórki jąder nie uległy samoorganizacji w ciągu 72 h hodowli; jednak wszystkie przedstawione tutaj metody prowadzą do samoorganizacji w ciągu 24 h przy użyciu komórek mysich od osobników młodocianych (5 dpp). Niepowodzenie w generowaniu konstruktu biologicznego objawiało się utrzymywaniem stanu swobodnie zawieszonych komórek (kolumna 0 h na Rysunku 1) nawet po przedłużonej hodowli (72 h). W przypadku braku samoorganizacji tkanki, wszelkie w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wraz z ukończeniem tego protokołu generowania organoidów, użytkownik będzie miał do dyspozycji cztery różne techniki hodowli do składania konstruktów jąder i organoidów w środowiskach ECM lub wolnych od ECM. Co ważne, wszystkie cztery metody pozwalają badaczowi na nieinwazyjną obserwację samoorganizacji organoidów w czasie poprzez obrazowanie poklatkowe lub zapis wideo, a także na nieinwazyjne zbieranie kondycjonowanych pożywek do analizy wydzielanych hormonów i cytokin, bez naruszania tkanek podczas hodowli. We wszystki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 i 4UH3ES029073-03, oraz Thomas J. Watkin's Memorial Professorship.

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi W. Rothowi za pomoc w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W pracach wykorzystano ośrodek BioCryo Centrum NUANCE Uniwersytetu Northwestern, który otrzymał wsparcie z Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); program MRSEC (NSF DMR-1720139) w Centrum Badań Materiałowych; Międzynarodowy Instytut Nanotechnologii (IIN); i stanu Illinois, za pośrednictwem IIN. Wykorzystano również sprzęt CryoCluster, który otrzymał wsparcie z programu MRI (NSF DMR-1229693). Grafiki w Rysunek 1 zostały zaprojektowane przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 um Media Sterylne filtryMillipore Sigmascgpu05reDo sterylnych mediów filtracyjnych
3 i beta; Przeciwciało pierwszorzędowe HSDCosmo Bio CoK0607Marker komórek Leydiga, rozcieńczenie 1:500
AlexaFluor 568 α-MyszThermo Fisher ScientificA-21202Przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorescencją
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Baza pożywki
hodowlanej Kolagenaza IWorthington BioLS004197Do roztworu dysocjacyjnego 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, wolna od LDEVCorning354234Macierz zewnątrzkomórkowa używana do odlewania żeli hodowlanych 2D i 3D ECM
Countess Licznik komórek ThermoFisher ScientificC10227Automatyczny licznik komórek (maszyna do hemacytometru)
Szkiełka z komory do liczenia komórek CountessThermo Fisher ScientificC10228Szkiełko hemacytometryczne do użytku z automatycznym licznikiem Countess
Przeciwciało pierwszorzędowe DDX4Abcam138540Marker spermatogonii, rozcieńczenie 1:500
Deoksyrybonukleaza I (2,280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Do roztworu dysocjacyjnego 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Do odtwarzania hialuronidazy
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Do odtwarzania kolagenazy I i Dnazy I
Płodowej surowicy bydlęcejThermo Fisher Scientific16000044Do tłumienia roztworów dysowitacyjnych enzymów
Pęcherzyk hormon stymulującyAbcamab51888Do długotrwałej hodowli organoidów
Ludzka gonadotropina kosmówkowaMillipore SigmaC1063Do długotrwałej hodowli organoidów
Hialuronidaza z jąder bydlęcychMillipore SigmaH4272Do roztworu dysocjacyjnego 2
Test immunoenzymatyczny inhibiny BAnsh LabsAL-107Zestaw
ELISA inhibiny BKnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028Źródło surowicy do podłoża podstawowego
Mikrotkanki 3D Sferoidy mikropleśni Petriego (matryca 24-35, 5x7)Millipore SigmaZ764051Do produkcji organoidów 3D bez ECM
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-dołkowyThermo Fisher Scientific12-565-7Do hodowli 2D ECM bez ECM i 2D, 3D ECM
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15-140-122Antybiotyk dla pożywki
Richard-Allan Scientific; Histogel, Żel do przetwarzania próbekThermo Fisher ScientificHG-4000-012Do wspomagania zatapiania parafiny
Przeciwciało pierwotne SOX9Millipore SigmaAB5535Marker Sertoli, rozcieńczenie 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Hodowca)Teklad Global2920Karma dla myszy bez fitoestrogenów
Tedklad Global Mouse Chow (konserwacja)Teklad Global2916Pokarm dla myszy bez fitoestrogenów
Test immunoenzymatycznytestosteronu CalbiotechTE373SZestaw ELISA
testosteronu Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Do liczenia komórek
i przeciwciała pierwszorzędowego alfa SMAMillipore SigmaA2547Marker okołokanalikowy, rozcieńczenie 1:500
i beta; Przeciwciało pierwotne kateninyBD Biosciences610154Marker cytoplazmy Sertoliego, rozcieńczenie 1:100

Bibliografia

  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680(2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472(2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472(2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884(2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227(2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011(2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002(2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15(2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171(2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla w macierzy zewn trzkom rkowej2D bez macierzy zewn trzkom rkowej3D bez macierzy zewn trzkom rkowejsamoorganizacja kom rkowakom rki Sertolegokom rki Leydigakom rki zarodkowekom rki oko okanalikowearchitektura tkanki

Powiązane artykuły