Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Summary

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Abstract

Organoidy jąder dostarczają narzędzia do badania rozwoju jąder, spermatogenezy i endokrynologii in vitro. Opracowano kilka metod w celu stworzenia organoidów jąder. Wiele z tych metod opiera się na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w celu promowania składania tkanek de novo, jednak istnieją różnice między metodami pod względem morfologii biomimetycznej i funkcji tkanek. Co więcej, istnieje niewiele bezpośrednich porównań opublikowanych metod. W tym przypadku dokonuje się bezpośredniego porównania, badając różnice w protokołach generowania organoidów z dostarczonymi wynikami. Opisano cztery archetypowe metody generowania: (1) 2D ECM, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM free i (4) 3D ECM culture. Do oceny wytwarzania organoidów jąder wykorzystano trzy podstawowe punkty odniesienia. Są to samoorganizacja komórkowa, włączenie głównych typów komórek (Sertoli, Leydig, komórki rozrodcze i okołorurkowe) oraz odpowiednio podzielona architektura tkankowa. Spośród czterech badanych środowisk, hodowle 2D ECM i 3D wolne od ECM wygenerowały organoidy o wewnętrznej morfologii najbardziej zbliżonej do rodzimych jąder, w tym de novo podział komórek rurkowych i śródmiąższowych, rozwój struktur podobnych do kanalików i ustaloną długoterminową funkcję endokrynologiczną. We wszystkich badanych metodach wykorzystano niesortowane, pierwotne zawiesiny mysich komórek jąder i wykorzystano powszechnie dostępne zasoby hodowlane. Te techniki generowania organoidów jąder zapewniają wysoce dostępny i powtarzalny zestaw narzędzi dla inicjatyw badawczych dotyczących organogenezy i fizjologii jąder in vitro.

Introduction

Organoidy jąder to pionierska technika badania rozwoju jąder, spermatogenezy i fizjologii in vitro^1,2,3,4. Zbadano kilka metod generowania organoidów; Obejmują one różnorodne systemy hodowli bez macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ECM, zarówno w orientacji dwuwymiarowej (2D), jak i trójwymiarowej (3D). Różne metody generowania mogą promować różne strategie składania komórek; Skutkuje to wysokim poziomem zmienności morfologicznej i funkcjonalnej między opublikowanymi modelami organoidów. Celem tego artykułu jest omówienie obecnego stanu model....

Protocol

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Northwestern, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC.

1. Przygotowanie enzymatycznych roztworów dysocjacji tkanek

1. Użyć dwóch różnych roztworów enzymatycznych (roztwór 1 i roztwór 2), oba wykonane przy użyciu roztworu pożywki do hodowli podstawowej (BM).
2. W celu przygotowania BM dodać surowicę i penicylinę-streptomycynę do minimalnych niezbędnych stężeń do końcowych stężeń odpowiednio 10% i 1% (patrz Tabela materiałów dla okre....

Results

Generowanie organoidów było uważane za nieudane, jeśli komórki jąder nie ulegały samoorganizacji w ciągu 72 godzin hodowli, jednak wszystkie przedstawione tutaj metody składają się w ciągu 24 godzin przy użyciu młodocianych (5 dpp) komórek mysich. Niepowodzenie generacji konstruktów biologicznych przedstawione jako kontynuacja swobodnie zawieszonych komórek (kolumna 0 h w Rysunek 1) nawet po przedłużonej hodowli (72 godziny). W przypadku braku samoorganizacji tkankowej, wszelkie pozorne skupiska komór.......

Discussion

Wraz z ukończeniem tego protokołu generowania organoidów, użytkownik będzie miał do dyspozycji cztery różne techniki hodowli do składania konstruktów jąder i organoidów w środowiskach ECM lub wolnych od ECM. Co ważne, wszystkie cztery metody pozwalają badaczowi na nieinwazyjną obserwację samoorganizacji organoidów w czasie poprzez obrazowanie poklatkowe lub zapis wideo, a także na nieinwazyjne zbieranie kondycjonowanych pożywek do analizy wydzielanych hormonów i cytokin, bez naruszania tkanek podczas hodowli. We wszystki.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 um Media Sterylne filtry	Millipore Sigma	scgpu05re	Do sterylnych mediów filtracyjnych
3 i beta; Przeciwciało pierwszorzędowe HSD	Cosmo Bio Co	K0607	Marker komórek Leydiga, rozcieńczenie 1:500
AlexaFluor 568 α-Mysz	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie
AlexaFluor 568 α-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	Przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorescencją
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Baza pożywki
hodowlanej Kolagenaza I	Worthington Bio	LS004197	Do roztworu dysocjacyjnego 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, wolna od LDEV	Corning	354234	Macierz zewnątrzkomórkowa używana do odlewania żeli hodowlanych 2D i 3D ECM
Countess Licznik komórek Thermo	Fisher Scientific	C10227	Automatyczny licznik komórek (maszyna do hemacytometru)
Szkiełka z komory do liczenia komórek Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228	Szkiełko hemacytometryczne do użytku z automatycznym licznikiem Countess
Przeciwciało pierwszorzędowe DDX4	Abcam	138540	Marker spermatogonii, rozcieńczenie 1:500
Deoksyrybonukleaza I (2,280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	Do roztworu dysocjacyjnego 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	Do odtwarzania hialuronidazy
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	Do odtwarzania kolagenazy I i Dnazy I
Płodowej surowicy bydlęcej	Thermo Fisher Scientific	16000044	Do tłumienia roztworów dysowitacyjnych enzymów
Pęcherzyk hormon stymulujący	Abcam	ab51888	Do długotrwałej hodowli organoidów
Ludzka gonadotropina kosmówkowa	Millipore Sigma	C1063	Do długotrwałej hodowli organoidów
Hialuronidaza z jąder bydlęcych	Millipore Sigma	H4272	Do roztworu dysocjacyjnego 2
Test immunoenzymatyczny inhibiny B	Ansh Labs	AL-107	Zestaw
ELISA inhibiny BKnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Źródło surowicy do podłoża podstawowego
Mikrotkanki 3D Sferoidy mikropleśni Petriego (matryca 24-35, 5x7)	Millipore Sigma	Z764051	Do produkcji organoidów 3D bez ECM
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-dołkowy	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	Do hodowli 2D ECM bez ECM i 2D, 3D ECM
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Antybiotyk dla pożywki
Richard-Allan Scientific; Histogel, Żel do przetwarzania próbek	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	Do wspomagania zatapiania parafiny
Przeciwciało pierwotne SOX9	Millipore Sigma	AB5535	Marker Sertoli, rozcieńczenie 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Hodowca)	Teklad Global	2920	Karma dla myszy bez fitoestrogenów
Tedklad Global Mouse Chow (konserwacja)	Teklad Global	2916	Pokarm dla myszy bez fitoestrogenów
Test immunoenzymatyczny	testosteronu Calbiotech	TE373S	Zestaw ELISA
testosteronu Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Do liczenia komórek
i przeciwciała pierwszorzędowego alfa SMA	Millipore Sigma	A2547	Marker okołokanalikowy, rozcieńczenie 1:500
i beta; Przeciwciało pierwotne kateniny	BD Biosciences	610154	Marker cytoplazmy Sertoliego, rozcieńczenie 1:100