Method Article

Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

DOI:

10.3791/61404

⸱

May 16th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) systemy komórkowe są istotnymi modelami do badania organogenezy. Zaproponowano metodę wytwarzania torbieli żółciowych opartą na hydrożelu i ich charakterystykę. Protokół ten odkrywa bariery w charakteryzacji 3D, dzięki prostej i niezawodnej metodzie oceny wydajności tworzenia torbieli, rozmiarów i testowania ich funkcjonalności.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cholangiocyty, komórki nabłonkowe, które tworzą drogi żółciowe w wątrobie, nadzorują tworzenie i modyfikację żółci. W ciągu ostatnich dwudziestu lat, w kontekście chorób wątroby, pojawiły się trójwymiarowe (3D) modele oparte na cholangiocytach, takie jak torbiele, sferoidy lub struktury przypominające rurki, aby naśladować topologię tkanek w organogenezie, modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Struktury te uzyskano głównie poprzez zatopienie cholangiocytów w hydrożelu. Głównym celem było zbadanie samoorganizacji poprzez zajęcie się polaryzacją nabłonka, właściwościami funkcjonalnymi i morfologicznymi. Jednak bardzo niewiele badań koncentruje się na skuteczności tworzenia torbieli. W takim przypadku wydajność jest często określana ilościowo na podstawie obrazów pojedynczej płaszczyzny. Testy funkcjonalne i analiza strukturalna są wykonywane bez reprezentowania potencjalnej niejednorodności rozmieszczenia torbieli wynikającej z niejednorodności polimeryzacji hydrożelowej i skutków ubocznych. W związku z tym analiza ilościowa, gdy jest wykonywana, nie może być wykorzystywana do porównywania jednego artykułu z drugim. Co więcej, metodologia ta nie pozwala na porównanie potencjału wzrostu 3D różnych matryc i typów komórek. Ponadto nie ma wzmianki o eksperymentalnym rozwiązywaniu problemów związanych z torbielami immunologicznymi. W tym artykule przedstawiamy wiarygodną i uniwersalną metodę wykazania, że początkowa dystrybucja komórek jest związana z niejednorodną pionową dystrybucją powstawania torbieli. Komórki cholangiocytów osadzone w hydrożelu są poddawane analizie stosów Z wzdłuż głębokości hydrożelu w ciągu 10 dni. Dzięki tej metodzie uzyskuje się solidną kinetykę skuteczności tworzenia torbieli i wzrostu. Przedstawiono również metody oceny polarności torbieli i funkcji wydzielniczej. Na koniec podano dodatkowe wskazówki dotyczące optymalizacji protokołów barwienia immunologicznego w celu ograniczenia zapadania się torbieli do obrazowania. Podejście to można zastosować do innych badań 3D nad hodowlami komórkowymi, otwierając w ten sposób możliwości porównania jednego systemu z drugim.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich trzech dekad dziedzina badań in vitro rozwinęła się w kierunku systemów hodowli 3D. Pojawiło się wiele protokołów hodowli komórek w 3D jako sferoid lub agregatów w obecności lub braku rusztowania/matrycy, w kropli, podczas mieszania, w urządzeniach mikroprzepływowych lub floating1. Zastosowanie metod hodowli 3D udowodniło swoje zalety w porównaniu z hodowlami dwuwymiarowymi (2D), szczególnie w przypadku komórek nabłonkowych, które wykazały samoorganizację w struktury 3D, zwane torbielami lub acini. W tym przypadku komórki tworzą monowarstwę otaczającą światło, w której komórki uzyskują pełny fenotyp nabłonka z ulepszonymi specyficznymi funkcjami fizjologicznymi2.

Liczne badania przyczyniły się do opracowania metod tworzenia tych organoidów nabłonkowych w naturalnych matrycach. Pozwoliło to na rekapitulację in vivo interakcji komórka-komórka i komórka-mikrośrodowisko, aby uzyskać ustalenie i stabilność fenotypu nabłonka3,4,5,6,7. Ostatnio, a w szczególności w celu opracowania organoidów nadających się do przeszczepu i rozszyfrowania wymagań mikrośrodowiska do orkiestracji programu nabłonkowego, opracowano syntetyczne hydrożele w celu zwiększenia tworzenia nabłonkowych acini8,9,10. Niestety, badania te opierają się na danych jakościowych lub prezentują metody obliczeń wykorzystujące wewnętrzne odniesienia, takie jak stosunek torbieli do nietorbieli w płaszczyźnie 2D8,9,10. Wyklucza to jakiekolwiek porównanie różnych badań pod względem skuteczności, stabilności lub charakterystyki morfologicznej i fizjologicznej organoidów nabłonkowych.

Mikrokapsułkowanie komórek nabłonka w koralikach za pomocą urządzeń mikroprzepływowych pozwoliło na uzyskanie bardziej realistycznych wyników ilościowych i porównawczych. Korzystając z tej technologii, organoidy z różnych typów komórek zostały utworzone i zróżnicowane na podstawie morfologii między różnymi strukturami komórkowymi 3D11,12. Jednak technologia ta nie jest łatwa w obsłudze i wymaga użycia czystych pomieszczeń do produkcji urządzeń mikroprzepływowych. Technologia ta została opracowana dla kilku rodzajów hydrożeli, ale wymaga dostosowania technicznego do zastosowania do innych hydrożeli, co ogranicza jej wszechstronność. Dlatego większość badań mających na celu opracowanie organoidów nabłonkowych opiera się na osadzaniu komórek nabłonkowych w masie hydrożelowej. W tych metodach często pomija się wysoką niejednorodność struktury żelu i rozmieszczenia komórek w całej kulturze 3D. W związku z tym większość analiz odnosi się do pojedynczych obrazów 2D, które tylko w przybliżeniu reprezentują rozkład różnych obiektów komórkowych w całej objętości 3D.

Choroby wpływające na drogi żółciowe, takie jak rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, między innymi, są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności. Z wyjątkiem przeszczepu wątroby, nie ma skutecznych metod leczenia tych schorzeń13. Wysiłki mające na celu zbadanie powstawania dróg żółciowych, przyczyn choroby i progresji pozwolą na opracowanie nowych terapii14.

Organotypowe modele dróg żółciowych torbieli, sferoidów lub struktur rurkowatych wykorzystujących normalne lub pochodzące od pacjenta, zróżnicowane lub pochodzące od progenitorów linie komórek cholangiocytów zostały opracowane15,16,17,18,19,20. Różne badania podsumowały polarność cholangiocytów, ekspresję markerów cholangiocytów, obecność rzęsek, zdolność wydzielniczą i reabsorpcyjną cholangiocytów oraz tworzenie i niedrożność światła; Wszystkie z nich reprezentują ważne cechy fenotypu, morfologii i funkcji cholangiocytów15,17,19. Inni donosili o utrzymywaniu się organoidów dróg żółciowych pochodzących od pacjentów przez długi okres czasu20. Niedawno badaliśmy rolę sygnałów biochemicznych i biofizycznych w organogenezie torbieli dróg żółciowych21. Co ważne, badano patogenezę atrezji dróg żółciowych w sferoidach i rurkach żółciowych7,22. Ponadto kluczowe cechy pierwotnego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych, takie jak starzenie się cholangiocytów, wydzielanie cytokin prozapalnych, a także rekrutacja makrofagów, zostały z powodzeniem zbadane za pomocą sferoidów żółciowych15,20. Jednak nadal potrzebne są powtarzalne modele ilościowe 3D in vitro, które fizjologicznie modulują fenotyp cholangiocytów, fizjologię i mikrośrodowisko, na które można odpowiedzieć tymi pytaniami. Co więcej, tylko kilka publikacji podało skuteczność tworzenia torbieli21,23. Jest to ważny punkt do ustalenia, szczególnie podczas badania organogenezy, przyczyny choroby i korelacji odpowiedzi na leki z funkcją cholangiocytów i polaryzacją. Ponadto, ze względu na różnice w stosowanych rusztowaniach/matrycach w zależności od protokołu, trudno jest porównywać systemy. Aby rozwiązać te problemy, proponujemy ilościową, wiarygodną i uniwersalną metodę generowania torbieli żółciowych naśladujących tworzenie światła, polaryzację cholangiocytów i funkcję wydzielniczą cholangiocytów. Co ważne, przedstawiamy systematyczną analizę przeprowadzoną wzdłuż osi Z w poprzek żelu 3D podczas oceny w czasie, skuteczności tworzenia torbieli, rozmiaru, żywotności, polaryzacji i funkcjonalności. Ponadto użyliśmy naturalnego hydrożelu i normalnych cholangiocytów szczura (NRC), jako przykładu dla protokołu, ale inne naturalne lub syntetyczne hydrożele, a także komórki nabłonkowe mogą być używane do tworzenia struktur torbielowatych 3D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Powstawanie torbieli

UWAGA: Ten protokół może być wykonany z dowolnym rodzajem hydrożelu, jeśli żelowanie pozwala na osadzanie komórek.

  1. Powłoka hydrożelowa
    UWAGA: Właściwa powłoka hydrożelowa szkiełka komory jest krytycznym krokiem, aby uniknąć tworzenia się warstw komórek 2D na dnie studzienki, które mogą zakłócać późniejsze obrazowanie torbieli i pogarszać obliczanie wydajności tworzenia torbieli.
    1. Aby zapewnić jednorodność roztworu żelu, należy rozmrozić hydrożel w temperaturze 4 °C przez noc (O/N).
    2. Wstępnie schłodzić końcówki pipet na lodzie lub O/N w temperaturze -20 °C i szkiełku z 8 dołkami w temperaturze -20 °C O/N.
    3. Umieść hydrożel i szkiełko z 8-dołkową komorą na wiaderku wypełnionym lodem.
    4. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml przygotować roztwór zawierający 40% hydrożelu (V/V) w zimnym kompletnym podłożu NRC (patrz tabela materiałów) i umieścić probówkę na lodzie.
    5. Aby pokryć szkiełko komory, używając zimnych końcówek pipet, dodaj 50 μl roztworu hydrożelu na środek każdej studzienki i rozprowadź na całej powierzchni za pomocą końcówki pipety, trzymając szkiełko komory na lodzie (Rysunek 1A).
      UWAGA: Rozprowadź roztwór hydrożelu tak równomiernie, jak to możliwe, unikając pęcherzyków.
    6. W celu polimeryzacji hydrożelu należy inkubować szkiełko komorowe przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Przygotowanie komórek
    1. Rozgrzać kompletną pożywkę NRC, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (trypsyna-EDTA) w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 37 °C.
    2. Podczas polimeryzacji hydrożelu upewnij się, że NRC są wyhodowane do 70% konfluencji w kolbie pokrytej kolagenem T-25 cm221. Umyj komórki raz podgrzanym 1x PBS.  
    3. Inkubować NRC z 5 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS (dla kolby T-25 cm2) przez 20 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Ten krok, który skraca czas inkubacji z trypsyną-EDTA, odgrywa zasadniczą rolę w zachowaniu samoorganizujących się właściwości komórek.
    4. Wyrzucić PBS, dodać 1 ml trypsyny-EDTA i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    5. Zneutralizować za pomocą 4 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki NRC. Zebrać i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 150 x g przez 4 minuty.
    6. Odrzucić pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml podgrzanego podłoża.
    7. Używając sitka do komórek o wielkości 40 μm, przefiltruj roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i policz komórki.
      UWAGA: Przepuszczenie komórek przez sitko jest krytycznym krokiem, aby wyniki ilościowe były powtarzalne, tj. aby uzyskać prawie podobną wielkość agregatów komórkowych do osadzenia.
  3. Osadzanie zawiesiny komórkowej w roztworze hydrożelu
    1. Przygotować roztwór 1 600 μl 80% hydrożelu (V/V) w zimnym, kompletnym pożywce NRC (probówka 1); przechowywać w lodzie. Rozcieńczyć 5 x 105 komórek/ml w 1 600 μl zimnej, kompletnej pożywki NRC (probówka 2) i przechowywać w lodzie.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko, aby uniknąć polimeryzacji hydrożelu podczas mieszania go z zawiesiną komórkową i utrzymać żywotność komórki.
    2. Aby przygotować roztwór do wysiewu komórek 2,5 x 105 komórek/ml w 40% hydrożelu (V/V), wymieszaj probówkę 1 i probówkę 2. Dodać 400 μl roztworu komórkowego do każdej studzienki szkiełka komorowego pokrytego hydrożelem, unikając pęcherzyków (Rysunek 1B).
    3. Przechowywać szkiełko komory w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu wymiany podłoża.
    4. Po 2 dniach w hodowli usuń 250 μl pożywki z rogu każdej studzienki, uważając, aby nie odpipetować hydrożelu. Następnie powoli dodawać 250 μl pożywki hodowlanej. Zmieniaj podłoże co 2 dni.
      UWAGA: Zminimalizuj ruch szkiełka komory, szczególnie podczas inicjacji torbieli.

2. Kwantyfikacja torbieli

  1. Obrazowanie torbieli
    UWAGA: Ten rozdział należy wykonać szybko, aby nie zagrozić żywotności komórek, jeśli mikroskop nie jest wyposażony w komorę grzewczą do kontrolowania CO2 i temperatury. W celu zapewnienia spójnej kwantyfikacji, reprezentatywnej dla rozmieszczenia torbieli w pełnej objętości hydrożelu, torbiele są obrazowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym i obrazowania seryjnego (stosy Z), z predefiniowanymi parametrami w różnych punktach czasowych.
    1. Weź stos Z wzdłuż głębokości hydrożelu dla każdego punktu czasowego ( Rysunek 1C, D). W tym przykładzie stosy Z są wykonywane w dniach 1, 2, 4, 7 i 10,
      UWAGA: Sprawdź, czy początkowy rozkład komórek w hydrożelu jest równomierny, aby zapewnić możliwość zastosowania tej metody.
      1. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu, wybierz 10-krotne powiększenie obiektywu w okienku ręcznej końcówki nosa (Rysunek 2B(1)).
      2. Włącz białą lampę i wybierz opcję obrazowania w jasnym polu.
      3. Włącz kamerę, wybierając przycisk "Odtwórz" w podmenu paska. Skoncentruj się na polu torbieli i ustaw czas ekspozycji (Rysunek 2B(2)). Otwórz okno Auto Capture Folder w celu automatycznego zapisywania obrazów (Rysunek 2B(3)).
      4. Otwórz okno przechwytywania serii Z i zdefiniuj śrubą Z górną i dolną płaszczyznę stosu Z (te same współrzędne XY, ale różne ekranowane Z). Dostosuj krok Z w zależności od celu, poziomu rozdzielczości i naciśnij przycisk "Uruchom teraz", aby uruchomić akwizycję (Rysunek 2B(4)).
        UWAGA: W tym przykładzie torbiele są rozmieszczone na grubości hydrożelu 520 μm. 26 obrazów jest uzyskiwanych wzdłuż głębokości hydrożelu w odstępie 20 μm Z-step. W zależności od celu, krok Z powinien być dostosowany tak, aby nie przegapić żadnej torbieli i zapewnić wykrywanie pojedynczych komórek i agregatów.
      5. Weź co najmniej 3 nienakładające się na siebie stosy Z na dołek.
        UWAGA: Pobieranie próbek jest konieczne, gdy, tak jak w tym przykładzie, torbiele są liczniejsze w głębi żelu niż na krawędziach ze względu na niejednorodności polimeryzacji hydrożelu.
      6. Aby uzyskać reprezentatywny zbiór danych, powtórz krok 2.1.1.5. dla łącznie 3 studzienek.
        UWAGA: Niejednorodny rozkład torbieli zależy od rodzaju hydrożelu, jego polimeryzacji i linii komórkowej. Biorąc pod uwagę trzy stosy Z na studzienkę i trzy studzienki na eksperyment, co najmniej 200 torbieli jest obrazowanych na dziewięciu stosach Z, aby scharakteryzować powstawanie torbieli i wzrost torbieli w każdym punkcie czasowym.
  2. Przetwarzanie obrazu
    UWAGA: W hydrożelu NRC mogą występować w postaci pojedynczych komórek, torbieli lub agregatów. Torbiele identyfikuje się po obecności okrągłej i cienkiej kontrastowej powłoki komórkowej otaczającej światło, podczas gdy agregaty komórkowe mają nieregularny kształt i nie mają światła. Agregacje i pojedyncze komórki mają gęsty i kontrastowy wygląd (Rysunek 3B(4)).
    1. Otwórz oprogramowanie Fiji, otwórz stos Z i przejdź do menu Fidżi, a następnie kliknij Plik | Otwórz (Rysunek uzupełniający 1). Wybierz stos Z do analizy. W razie potrzeby wybierz opcję "Wirtualny stos" i kliknij "Tak", aby otworzyć (Rysunek 3A(1)).
    2. Zduplikuj stos za pomocą obrazu | Duplikat. Kliknij pole "Zduplikowany stos" i kliknij "OK" (Rysunek uzupełniający 2).
      UWAGA: W tym przykładzie stosy Z są w formacie pliku .nd2 zakodowanym w 16 bitach.
    3. Utwórz projekcję o minimalnej intensywności ze zduplikowanego stosu. Przejdź do menu Obraz | Stosy | Projekt Z. Wybierz typ projekcji "Min Intensity" i kliknij "OK" (Rysunek 3A(2)) (Rysunek uzupełniający 3).
    4. Odejmij tło od projekcji. Przejdź do menu Proces | Odejmij tło. Wpisz 500,0 pikseli promienia toczącej się kuli i kliknij "jasne tło", aby renderować torbiele bardziej kontrastowe niż tło (Rysunek 3A(3)) (Rysunek uzupełniający 4).
      UWAGA: Promień toczącej się kuli określa rozmiar obszaru, na którym wykonywane jest odejmowanie tła. Ten parametr musi być ustawiony na rozmiar największego obiektu do zidentyfikowania.
    5. Jeśli potrzebna jest poprawa kontrastu, przejdź do menu Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast | Automatyczny | Złóż wniosek. Fidżi automatycznie zoptymalizuje jasność i kontrast. W (Rysunek 3A(3)), dolne i górne wartości szarości zostały ustawione odpowiednio na 49702 i 65452 (Rysunek uzupełniający 5).
      UWAGA: Jeśli projekcja nie jest skalibrowana, przejdź do menu Analizuj | Ustaw skalę i wpisz odpowiednią kalibrację stosunku μm/piksel (rysunek uzupełniający 6).
  3. Liczenie torbieli i pomiary wielkości torbieli
    1. Aby zmierzyć przybliżoną średnicę torbieli, wybierz narzędzie Linia prosta w menu Fidżi i narysuj linię w poprzek średnicy każdej torbieli na końcowym rzucie (Rysunek 3B(4)). Dodaj nowy obszar zainteresowania (ROI) utworzony dla każdej torbieli do menedżera ROI: naciśnij skrót "t" na klawiaturze, aby przyspieszyć liczenie i otwieranie menedżera ROI. Kliknij "Pokaż wszystko", aby zobaczyć zliczone torbiele (rysunek uzupełniający 7)
    2. Sprawdź, czy nie pozostała żadna torbiel bez liczenia, nakładając ustawione ROI z projekcji na stos Z. Aby to zrobić, kliknij okno Z-stack, aby je wybrać. W Menedżerze ROI kliknij "Pokaż wszystko" i przesuń kursor wzdłuż stosu Z, aby sprawdzić, czy obraz na obrazie został policzony (rysunek uzupełniający 8).
    3. Po zliczeniu nowych torbieli i dodaniu ROI w kroku 2.3.1 wybierz zestaw ROI i zapisz go w oknie Menedżer ROI, klikając Więcej | Zapisz (Rysunek uzupełniający 9).
    4. Wybierz wszystkie ROI w Menedżerze ROI i kliknij "Zmierz" w Menedżerze ROI, aby uzyskać rozmiar każdej torbieli. Spowoduje to otwarcie nowego okna pomiarów o nazwie "Wyniki" numerującego każdą torbiel i jej szacowany rozmiar. Następnie zapisz w .csv formacie, klikając w okno "Wyniki" i poprzez menu: Plik | Zapisz jako (Rysunek uzupełniający 10).
      UWAGA: Można utworzyć makro w celu półautomatycznego przetwarzania stosów, szacowania liczby/rozmiarów torbieli na podstawie projekcji i przechowywania danych w celu szybszej procedury liczenia. Aby to zrobić, wybierz narzędzie "Nagraj" w menu paska, klikając Wtyczki | Makra | Rekord.
  4. Kwantyfikacja skuteczności tworzenia torbieli
    1. Policz liczbę torbieli w dniu Y, figure-protocol-1 na projekcji (Y=1, 2, 4, 7 lub 10).
    2. Aby obliczyć skuteczność tworzenia torbieli dla 1000 komórek w dniu Y, podziel liczbę torbieli zliczonych w tym punkcie czasu przez liczbę komórek wysianych w dniu 0 wywnioskowaną z objętości hydrożelu i pomnóż przez 1000 (Rysunek 3C, Rysunek 4).
      figure-protocol-2

3. Żywotność komórek

  1. Przygotować roztwór podstawowy dioctanu fluoresceiny (FDA) o stężeniu 5 mg/ml rozpuszczając 5 mg FDA w 1 ml acetonu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować roztwór podstawowy jodku propidyny (PI) o stężeniu 2 mg/ml w wodzie dejonizowanej (dH2O) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować pożywkę NRC bez płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  4. Aby przygotować roztwór barwiący FDA/PI, dodaj 4 μl roztworu podstawowego FDA (stężenie końcowe 8 μg/ml) i 25 μl roztworu podstawowego PI (stężenie końcowe 20 μg/ml) do 2,5 ml pożywki NRC bez FCS.
  5. Usunąć pożywkę ze szkiełka komorowego, dodać 250 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować 4-5 minut w ciemności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Ostrożnie odpipetować roztwór barwiący i przemyć raz 250 μl 1x PBS.
  6. Ostrożnie dodaj 250 μl kompletnej pożywki NRC do każdej studzienki i zrób zdjęcia za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami czerwieni teksańskiej i izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Żywe komórki będą zielone, a martwe komórki będą czerwone (Rysunek 5A).
    UWAGA: Aby określić ilościowo żywe/martwe komórki, należy pobrać stosy Z w objętości hydrożelu zgodnie z krokiem 2 i dostosować metodę przetwarzania obrazu do fluorescencji.

4. Aktywność wydzielania

UWAGA: Aktywność wydzielania przez błonę wierzchołkową cholangiocytów jest oceniana na podstawie wydzielania fluoresceiny w świetle. Jego swoistość można ocenić, wykonując ten sam test z werapamilem, inhibitorem transportera wielolekoopornego (MDR)24.

  1. Aby przygotować roztwór barwiący Hoechst 33258 o stężeniu 5 μg/ml, należy dodać 0,83 μl roztworu podstawowego Hoechst (15 mg/ml stężenia podstawowego w dH2O) do 2,5 ml pożywki NRC bez FCS.
  2. Dodać 250 μl roztworu Hoechsta do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15 minut.
  3. Usunąć roztwór Hoechsta i dodać 250 μl roztworu FDA (8 μg/ml stężenia końcowego) do każdej studzienki. Inkubować 4-5 min w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Gdy tylko komórki zostaną wystawione na działanie roztworu barwiącego FDA, monitorowanie kinetyki wydzielania fluoresceiny może być przydatne w celu skalibrowania czasu potrzebnego do wydzielania torbieli. W tym celu rób zdjęcia co minutę przez 1 godzinę za pomocą obrazowania poklatkowego. W tym przykładzie czas potrzebny na zaobserwowanie torbieli wydzielających NRC w hydrożelu wynosi około 15-20 minut.
  4. Wykonaj zdjęcia za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego 5 minut po spłukaniu pożywką bez FCS. Użyj filtrów 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i FITC, aby ujawnić znakowanie jąder i akumulację fluoresceiny w świetle (Rysunek 6A). Aby określić ilościowo liczbę torbieli wydzielających, weź stosy Z, jak w kroku 2 i dostosuj etapy przetwarzania obrazu do obrazów fluorescencyjnych.
    UWAGA: W teście Werapamilu należy poprzedzić poprzedni proces (kroki od 4.3 do 4.4.) inkubacją z Werapamilem, zgodnie z następującymi warunkami:
  5. Przygotować roztwór podstawowy 10 mM werapamilu w dimetylosulfotlenku (DMSO). Aby przygotować 10 μM roztworu roboczego, zmieszaj 2,5 μl roztworu podstawowego Verapamil z 2,5 ml pożywki hodowlanej bez FCS.
  6. Aby ocenić, czy fluorescencja w świetle wynika z wydzielania MDR, weź kolejny szkiełko i dodaj 250 μl roztworu roboczego Werapamilu do każdej studzienki i inkubuj 20 minut w temperaturze 37 ° C, 5% CO2
  7. Usuń roztwór i dodaj 250 μl roztworu FDA (8 μg/ml stężenia końcowego) do każdej studzienki. Inkubować 4-5 minut w ciemności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Następnie przemyj 250 μl 1x PBS przed obrazowaniem (Rysunek 6B, C).

5. Ocena polaryzacji nabłonka za pomocą immunofluorescencji

  1. Aby przygotować roztwór utrwalający, zmieszać 4% formaldehydu z 5% sacharozą w 1x PBS, pH 7,4 i inkubować w łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C.
  2. Aby utrwalić komórki, delikatnie odpipetuj pożywkę hodowlaną ze studzienki, nie uszkadzając matrycy. Powoli dodawać 400 μl roztworu utrwalającego na bok studzienek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Zawsze pozostawiaj 25 μl płynu nad matrycą, aby zapobiec jej uszkodzeniu.
  3. Delikatnie usunąć roztwór utrwalający i przemyć 3x 400 μl 1x PBS o temperaturze (RT).
  4. Odpipetować PBS, dodać 400 μl roztworu permeabilacyjnego (0,5% Triton X-100 w 1x PBS) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Delikatnie usunąć roztwór permeabilizacyjny, a następnie wykonać 3 szybkie płukania 400 μl 1x PBS i długi etap mycia trwający 30 minut w RT.
    UWAGA: Na tym etapie szkiełko można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 dni. W takim przypadku należy uszczelnić szkiełko folią parafinową, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu matrycy.
  6. Usunąć PBS, dodać 400 μl roztworu blokującego zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 10% surowicy koziej w 1x PBS i inkubować przez 60 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Stężenia BSA wyższe niż 0,1% spowodują cofnięcie światła i dalsze zapadnięcie się torbieli (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki) (Rysunek 7A).
  7. Odpipetować roztwór blokujący i przemyć raz 400 μl PBS/0,05% Tween 20 i wyrzucić.
  8. Dodać 150 μl roztworu przeciwciała, np. przeciwciała E-kadheryny rozcieńczonego w stosunku 1:400 i falloidyny 568 (stężenie końcowe 16,2 nM) w 1x PBS i inkubować przez 90 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: To rozcieńczenie E-kadheryny jest takie samo, jak w standardowym protokole immunofluorescencji 2D.
  9. Przemyć próbkę 400 μl PBS/0,05% Tween 20,3x; za każdym razem inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać 150 μl przeciwciała drugorzędowego (koziego przeciwciała anty-króliczego IgG Alexa Fluor Plus 647), rozcieńczonego w stosunku 1:500 w 1x PBS i inkubować 60 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Przemyć 3x 400 μl PBS/0,05% Tween 20, za każdym razem inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Przemyć 3x 400 μL 1x PBS, za każdym razem inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Wyrzuć PBS z ostatniego płukania i przygotuj szkiełko komory do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej, postępując zgodnie z jedną z dwóch poniższych opcji.
    1. Dodaj 400 μl 1x PBS i 50 μL DAPI na studzienkę. Próbki mogą być badane przez dno studni bez konieczności montażu za pomocą szkiełka nakrywkowego (Rysunek 7B).
    2. Dodać 100 μl do dołka odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI i pozostawić szkiełko do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powstawanie i charakterystyka torbieli
Systemy hodowli komórkowych 3D są ważnym narzędziem do badania organogenezy i modelowania chorób25. Niestety, większość z tych metod ma charakter jakościowy lub wykorzystuje wewnętrzną kwantyfikację przeprowadzaną na jednej płaszczyźnie, porównując liczbę torbieli z nietorbielami, w zmiennych i często nieokreślonych objętościach, uniemożliwiając jakiekolwiek porównanie pod względem skuteczności tworzenia torbieli między różnymi badaniami<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu zbadania organogenezy i utrzymania struktur komórkowych 3D modelowano różne tkanki, wykorzystując różne pochodzenie komórkowe, ale także różne rodzaje matryc zewnątrzkomórkowych, w tym syntetyczne hydrożele 8,9,10,21. Jednak ze względu na brak analizy ilościowej 3D, która pozwala na porównania metod pod względem tworzenia lub funkcjonalności organoidów ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Nicholasowi LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Stany Zjednoczone), który uprzejmie dostarczył linię komórkową NRC.

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe zarówno od programu iLite RHU (grant ANR-16-RHUS-0005), jak i DHU Hepatinov.

Dziękujemy Isabelle Garcin i Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay za wsparcie w zakresie obrazowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 &mikro; l- Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000020
100 & mikro; l - Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000046
1000 & micro; l - Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000062
1X PBSThermo Fisher Scientific14190-094
200 µ l - Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000054
3,3′,5-triiodo-L-tyroniny sól sodowaSigma-AldrichT5516NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 3,4 &mikro; g/ml
Kwas octowyVWR20104-2980,02N końcowy
Końcówki do pipet barierowych aerozolowych 10 i mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific 2707439
Końcówki do pipet barierowych w aerozolu 1000 i mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707404
Końcówki do pipet barierowych w aerozolu 200 i mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific 2707430
Antybiotykowy roztwór przeciwmikotyczny (100X)Sigma-AldrichA5955NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie Ekstrakt
przysadki bydlęcejThermo Fisher Scientific13028-014NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 30 &mikro; g / ml
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA21531:1000 rozcieńczenie
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (100X)Thermo Fisher Scientific11905-031NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie
Kolagen o wysokim stężeniu, ogon szczuraThermo Fisher Scientific35424950 &mikro; g/ml stężenie końcowe
DeksametazonSigma-AldrichD4902NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 0,393 &mikro; g / mL
DMEM F12Thermo Fisher Scientific21331-020NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1X
E-kadheryna Królik anty-Człowiek, Szczur, PoliklonalnyThermo Fisher ScientificPA5-32178Rozcieńczenie 1:400
Mikroskop odwrócony Eclipse TE300ObrazowanieNikon
EtanoloaminaSigma-AldrichE9508NRC kompletny średni finał stężenie = 0,32 mM
Płodowa surowica cielęcaThermo Fisher Scientific10270-106NRC complete medium stężenie końcowe = 5:100 rozcieńczenie
Fluoroshield z DAPI (Podłoże montażowe)Sigma-AldrichF6057
Formaldehyd 16% (W/V)Thermo Fisher Scientific289064% (W/V)
Kozia surowicaThermo Fisher Scientific16210-0641:10 rozcieńczenie
Aparat Hamamatsu (Aparat cyfrowy C11440 ORCA - flash 4.OLT)Hamamatsuobrazowanie
Hoechst 33258Sigma-AldrichB11555 µ g / ml stężenie końcowe
IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowany krzyżowo kozi anty-królik, Alexa Fluor Plus 647Thermo Fisher ScientificA32733rozcieńczenie 1:500
ImageJ wersja 2.0.0-rc-69/1.52nOprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym
Insulina-Transferyna-Selen (100X)Thermo Fisher Scientific51300-044NRC pełne stężenie końcowe = rozcieńczenie
1:100L-Glutamina (100X)Thermo Fisher Scientific25030-024NRC kompletne stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie
Matrigel GFR (stężenie podstawowe 9,7 mg/mL)Thermo Fisher Scientific3562314:10 rozcieńczenie
NIS Elements wersja oprogramowania 4.50.00Akwizycja i wyświetlanie obrazówNikon
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-035NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 1:100 rozcieńczenie
Obiektywny Plan Fluor 10X/0,30 Ph1 DL (∞/1,2 WD 15,2)Nikon
Prolong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciuThermo Fisher ScientificP36931
Jodek propidyny (PI)Sigma-AldrichP417020 &mikro; g/ml stężenie końcowe
Rodamina PhalloidynaThermo Fisher ScientificR41516,2 nM stężenie końcowe
Zestaw Sir-Actin / VerapamilSpirochromeSC00110 µ M stężenie końcowe
Inhibitor trypsyny sojowejThermo Fisher Scientific17075-029NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 50 &mikro; g / ml
Sterylne sitko komórkowe 40 i mikro; m (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific22363547
Sterylne pipety 10 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811E
Sterylne pipety 5 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811D
Sterylne probówki 1,5 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific11926955
Sterylne probówki 15 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific7200886
Sterylne probówki 50 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific553913
SacharozaSigma-AldrichS03895:100 rozcieńczenie
Kolba do hodowli tkankowych 25cm2 (Falcon)Thermo Fisher Scientific353108
Triton X-100Sigma-AldrichT87875:1000 rozcieńczenie
Trypsyna-EDTA (0,05%) czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25300-0541X
Tween-20Sigma-AldrichP13795:10000 rozcieńczenie
Witamina (100X)Thermo Fisher Scientific11120-037NRC pełne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie
μ-Slajd 8 Well ibiTreat, IbidiClinisciences80826
z

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67(2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013(2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70(2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544(2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biliary Epithelial CystsCholangiocyte CultureHydrogel EmbeddingZ stack AnalysisCyst Formation EfficiencyCyst Polarity AssessmentSecretory Function EvaluationImmunostaining OptimizationLive Dead StainingFluorescein Secretion

Related Articles