Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61404

⸱

16 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Trójwymiarowe (3D) systemy komórkowe są istotnymi modelami do badania organogenezy. Zaproponowano metodę wytwarzania torbieli żółciowych opartą na hydrożelu i ich charakterystykę. Protokół ten odkrywa bariery w charakteryzacji 3D, dzięki prostej i niezawodnej metodzie oceny wydajności tworzenia torbieli, rozmiarów i testowania ich funkcjonalności.

Streszczenie

Cholangiocyty, komórki nabłonkowe, które tworzą drogi żółciowe w wątrobie, nadzorują tworzenie i modyfikację żółci. W ciągu ostatnich dwudziestu lat, w kontekście chorób wątroby, pojawiły się trójwymiarowe (3D) modele oparte na cholangiocytach, takie jak torbiele, sferoidy lub struktury przypominające rurki, aby naśladować topologię tkanek w organogenezie, modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Struktury te uzyskano głównie poprzez zatopienie cholangiocytów w hydrożelu. Głównym celem było zbadanie samoorganizacji poprzez zajęcie się polaryzacją nabłonka, właściwościami funkcjonalnymi i morfologicznymi. Jednak bardzo niewiele badań koncentruje się na skuteczności tworzenia torbieli. W takim przypadku wydajność jest często określana ilościowo na podstawie obrazów pojedynczej płaszczyzny. Testy funkcjonalne i analiza strukturalna są wykonywane bez reprezentowania potencjalnej niejednorodności rozmieszczenia torbieli wynikającej z niejednorodności polimeryzacji hydrożelowej i skutków ubocznych. W związku z tym analiza ilościowa, gdy jest wykonywana, nie może być wykorzystywana do porównywania jednego artykułu z drugim. Co więcej, metodologia ta nie pozwala na porównanie potencjału wzrostu 3D różnych matryc i typów komórek. Ponadto nie ma wzmianki o eksperymentalnym rozwiązywaniu problemów związanych z torbielami immunologicznymi. W tym artykule przedstawiamy wiarygodną i uniwersalną metodę wykazania, że początkowa dystrybucja komórek jest związana z niejednorodną pionową dystrybucją powstawania torbieli. Komórki cholangiocytów osadzone w hydrożelu są poddawane analizie stosów Z wzdłuż głębokości hydrożelu w ciągu 10 dni. Dzięki tej metodzie uzyskuje się solidną kinetykę skuteczności tworzenia torbieli i wzrostu. Przedstawiono również metody oceny polarności torbieli i funkcji wydzielniczej. Na koniec podano dodatkowe wskazówki dotyczące optymalizacji protokołów barwienia immunologicznego w celu ograniczenia zapadania się torbieli do obrazowania. Podejście to można zastosować do innych badań 3D nad hodowlami komórkowymi, otwierając w ten sposób możliwości porównania jednego systemu z drugim.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich trzech dekad dziedzina badań in vitro rozwinęła się w kierunku systemów hodowli 3D. Pojawiło się wiele protokołów hodowli komórek w 3D jako sferoid lub agregatów w obecności lub braku rusztowania/matrycy, w kropli, podczas mieszania, w urządzeniach mikroprzepływowych lub floating1. Zastosowanie metod hodowli 3D udowodniło swoje zalety w porównaniu z hodowlami dwuwymiarowymi (2D), szczególnie w przypadku komórek nabłonkowych, które wykazały samoorganizację w struktury 3D, zwane torbielami lub acini. W tym przypadku komórki tworzą monowarstwę otaczającą światło, w której komórki uzyskują pełny fenotyp nabłonka z ulepszonymi specyficznymi funkcjami fizjologicznymi2.

Liczne badania przyczyniły się do opracowania metod tworzenia tych organoidów nabłonkowych w naturalnych matrycach. Pozwoliło to na rekapitulację in vivo interakcji komórka-komórka i komórka-mikrośrodowisko, aby uzyskać ustalenie i stabilność fenotypu nabłonka3,4,5,6,7. Ostatnio, a w szczególności w celu opracowania organoidów nadających się do przeszczepu i rozszyfrowania wymagań mikrośrodowiska do orkiestracji programu nabłonkowego, opracowano syntetyczne hydrożele w celu zwiększenia tworzenia nabłonkowych acini8,9,10. Niestety, badania te opierają się na danych jakościowych lub prezentują metody obliczeń wykorzystujące wewnętrzne odniesienia, takie jak stosunek torbieli do nietorbieli w płaszczyźnie 2D8,9,10. Wyklucza to jakiekolwiek porównanie różnych badań pod względem skuteczności, stabilności lub charakterystyki morfologicznej i fizjologicznej organoidów nabłonkowych.

Mikrokapsułkowanie komórek nabłonka w koralikach za pomocą urządzeń mikroprzepływowych pozwoliło na uzyskanie bardziej realistycznych wyników ilościowych i porównawczych. Korzystając z tej technologii, organoidy z różnych typów komórek zostały utworzone i zróżnicowane na podstawie morfologii między różnymi strukturami komórkowymi 3D11,12. Jednak technologia ta nie jest łatwa w obsłudze i wymaga użycia czystych pomieszczeń do produkcji urządzeń mikroprzepływowych. Technologia ta została opracowana dla kilku rodzajów hydrożeli, ale wymaga dostosowania technicznego do zastosowania do innych hydrożeli, co ogranicza jej wszechstronność. Dlatego większość badań mających na celu opracowanie organoidów nabłonkowych opiera się na osadzaniu komórek nabłonkowych w masie hydrożelowej. W tych metodach często pomija się wysoką niejednorodność struktury żelu i rozmieszczenia komórek w całej kulturze 3D. W związku z tym większość analiz odnosi się do pojedynczych obrazów 2D, które tylko w przybliżeniu reprezentują rozkład różnych obiektów komórkowych w całej objętości 3D.

Choroby wpływające na drogi żółciowe, takie jak rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, między innymi, są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności. Z wyjątkiem przeszczepu wątroby, nie ma skutecznych metod leczenia tych schorzeń13. Wysiłki mające na celu zbadanie powstawania dróg żółciowych, przyczyn choroby i progresji pozwolą na opracowanie nowych terapii14.

Organotypowe modele dróg żółciowych torbieli, sferoidów lub struktur rurkowatych wykorzystujących normalne lub pochodzące od pacjenta, zróżnicowane lub pochodzące od progenitorów linie komórek cholangiocytów zostały opracowane15,16,17,18,19,20. Różne badania podsumowały polarność cholangiocytów, ekspresję markerów cholangiocytów, obecność rzęsek, zdolność wydzielniczą i reabsorpcyjną cholangiocytów oraz tworzenie i niedrożność światła; Wszystkie z nich reprezentują ważne cechy fenotypu, morfologii i funkcji cholangiocytów15,17,19. Inni donosili o utrzymywaniu się organoidów dróg żółciowych pochodzących od pacjentów przez długi okres czasu20. Niedawno badaliśmy rolę sygnałów biochemicznych i biofizycznych w organogenezie torbieli dróg żółciowych21. Co ważne, badano patogenezę atrezji dróg żółciowych w sferoidach i rurkach żółciowych7,22. Ponadto kluczowe cechy pierwotnego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych, takie jak starzenie się cholangiocytów, wydzielanie cytokin prozapalnych, a także rekrutacja makrofagów, zostały z powodzeniem zbadane za pomocą sferoidów żółciowych15,20. Jednak nadal potrzebne są powtarzalne modele ilościowe 3D in vitro, które fizjologicznie modulują fenotyp cholangiocytów, fizjologię i mikrośrodowisko, na które można odpowiedzieć tymi pytaniami. Co więcej, tylko kilka publikacji podało skuteczność tworzenia torbieli21,23. Jest to ważny punkt do ustalenia, szczególnie podczas badania organogenezy, przyczyny choroby i korelacji odpowiedzi na leki z funkcją cholangiocytów i polaryzacją. Ponadto, ze względu na różnice w stosowanych rusztowaniach/matrycach w zależności od protokołu, trudno jest porównywać systemy. Aby rozwiązać te problemy, proponujemy ilościową, wiarygodną i uniwersalną metodę generowania torbieli żółciowych naśladujących tworzenie światła, polaryzację cholangiocytów i funkcję wydzielniczą cholangiocytów. Co ważne, przedstawiamy systematyczną analizę przeprowadzoną wzdłuż osi Z w poprzek żelu 3D podczas oceny w czasie, skuteczności tworzenia torbieli, rozmiaru, żywotności, polaryzacji i funkcjonalności. Ponadto użyliśmy naturalnego hydrożelu i normalnych cholangiocytów szczura (NRC), jako przykładu dla protokołu, ale inne naturalne lub syntetyczne hydrożele, a także komórki nabłonkowe mogą być używane do tworzenia struktur torbielowatych 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generowanie cyst

UWAGA: Niniejszy protokół można przeprowadzić z dowolnym rodzajem hydrożelu, o ile proces żelowania umożliwia zatopienie komórek.

  1. Powlekanie hydrożelem
    UWAGA: Prawidłowe powlekanie szkiełka komorowego hydrożelem jest krytycznym etapem pozwalającym uniknąć tworzenia się dwuwymiarowych (2D) warstw komórek na dnie dołka, co mogłoby zakłócić późniejsze obrazowanie cyst i upośledzić obliczenie wydajności tworzenia cyst.
    1. Aby zapewnić homogeniczność roztworu żelu, rozmrozić hydrożel w temperaturze 4 °C przez noc (O/N).
    2. Wychłodzić końcówki pipet w lodzie lub przez noc (O/N) w temperaturze -20 °C oraz 8-dołkowe szkiełko komorowe w temperaturze -20 °C przez noc (O/N).
    3. Umieścić hydrożel i 8-dołkowe szkiełko komorowe w pojemniku z lodem.
    4. W probówce stożkowej 15 mL przygotować roztwór zawierający 40% hydrożelu (V/V) w zimnej pełnej pożywce NRC (patrz Tabela materiałów) i umieścić probówkę w lodzie.
    5. Aby powlec szkiełko komorowe, używając zimnych końcówek pipet, nanieść 50 μL roztworu hydrożelu na środek każdego dołka i rozprowadzić go po całej powierzchni za pomocą końcówki pipety, trzymając szkiełko komorowe w lodzie (Rysunek 1A).
      UWAGA: Rozprowadzić roztwór hydrożelu tak równomiernie, jak to możliwe, unikając pęcherzyków powietrza.
    6. Aby spolimeryzować hydrożel, inkubować szkiełko komorowe przez co najmniej 15 min w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2.
  2. Przygotowanie komórek
    1. Podgrzać pełną pożywkę NRC, roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) oraz trypsynę z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (trypsyna-EDTA) w łaźni wodnej rozgrzanej do 37 °C.
    2. Podczas polimeryzacji hydrożelu upewnić się, że komórki NRC osiągnęły 70% konfluencji w kolbie T-25 cm2 powlekanej kolagenem21. Przemyć komórki raz podgrzanym 1x PBS.
    3. Inkubować komórki NRC z 5 mL podgrzanego 1x PBS (dla kolby T-25 cm2) przez 20 min w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
      UWAGA: Ten etap, który skraca czas inkubacji z trypsyną-EDTA, jest kluczowy dla zachowania właściwości samorganizujących się komórek.
    4. Odlać PBS, dodać 1 mL trypsyny-EDTA i inkubować przez 5-10 min w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
    5. Zneutralizować za pomocą 4 mL podgrzanej pełnej pożywki NRC. Zebrać i przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15 mL, a następnie wirować przy 150 x g przez 4 min.
    6. Odlać pożywkę i resuspendować osad komórkowy w 5 mL podgrzanej pożywki.
    7. Używając sitka komórkowego o oczkach 40 μm, przefiltrować roztwór komórek do probówki stożkowej 50 mL i policzyć komórki.
      UWAGA: Przepuszczenie komórek przez sitko jest krytycznym etapem dla powtarzalności wyników ilościowych, t.j. aby uzyskać niemal identyczną wielkość osadzanych agregatów komórkowych.
  3. Osadzanie zawiesiny komórkowej w roztworze hydrożelu
    1. Przygotować roztwór 1 600 µL 80% hydrożelu (V/V) w zimnej pełnej pożywce NRC (probówka 1); przechowywać w lodzie. Rozcieńczyć 5 x 105 komórek/mL w 1 600 µL zimnej pełnej pożywki NRC (probówka 2) i przechowywać w lodzie.
      UWAGA: Ten etap musi zostać wykonany szybko, aby uniknąć polimeryzacji hydrożelu podczas mieszania go z zawiesiną komórkową oraz aby zachować żywotność komórek.
    2. Aby przygotować roztwór do wysiewu komórek o stężeniu 2,5 x 105 komórek/mL w 40% hydrożelu (V/V), zmieszać zawartość probówki 1 i probówki 2. Dodać 400 μL roztworu komórek do każdego dołka powleczonego hydrożelem szkiełka komorowego, unikając pęcherzyków powietrza (Rysunek 1B).
    3. Przechowywać szkiełko komorowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu wymiany pożywki.
    4. Po 2 dniach hodowli usunąć 250 μL pożywki z narożnika każdego dołka, uważając, aby nie odessać hydrożelu. Następnie powoli dodać 250 μL pożywki hodowlanej. Wymieniać pożywkę co 2 dni.
      UWAGA: Ogranicz do minimum przemieszczanie szkiełka komorowego, szczególnie podczas inicjacji tworzenia cyst.

2. Ilościowe oznaczenie cyst

  1. Obrazowanie torbieli
    UWAGA: Tę sekcję należy przeprowadzić szybko, aby nie pogorszyć żywotności komórek, jeśli mikroskop nie jest wyposażony w komorę grzewczą do kontroli poziomu CO2.2 oraz temperaturę. Aby zapewnić spójną kwantyfikację, reprezentatywną dla rozkładu cyst w całej objętości hydrożelu, cysty obrazuje się za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej i obrazowania seryjnego (stosy Z) z zastosowaniem predefiniowanych parametrów w różnych punktach czasowych.
    1. Wykonaj stos Z (Z-stack) wzdłuż głębokości hydrożelu dla każdego punktu czasowego (Rysunek 1C, D). W tym przykładzie serie obrazów Z (Z-stacki) są pobierane w dniach 1, 2, 4, 7 i 10.
      UWAGA: Należy sprawdzić, czy początkowy rozkład komórek w hydrożelu jest jednorodny, aby zapewnić możliwość zastosowania tej metody.
      1. Za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu, wybierz powiększenie obiektywu 10x w oknie panelu ręcznego sterowania obrotową głowicą (Rysunek 2B(1)).
      2. Włącz lampę białego światła i wybierz opcję obrazowania w polu jasnym.
      3. Włącz kamerę, wybierając „Odtwórzprzycisk „” w podmenu paska narzędzi. Skupić ostrość na polu z cystami i ustawić czas ekspozycji (Rycina 2B(2)). Otwórz Folder automatycznego przechwytywania okno automatycznego zapisywania obrazów (Rycina 2B(3)).
      4. Otwórz okno przechwytywania serii Z i zdefiniuj za pomocą śruby Z płaszczyzny górną i dolną stosu Z (te same współrzędne XY, ale różne wartości Z). Dostosuj skok Z w zależności od obiektywu oraz poziomu rozdzielczości, a następnie naciśnij przycisk „Uruchom terazw celu rozpoczęcia akwizycji (Rycina 2B(4)).
        UWAGA: W tym przykładzie cysty są rozprzestrzenione na grubości hydrożelu wynoszącej 520 µmPozyskano 26 obrazów wzdłuż głębokości hydrożelu za pomocą 20 µm Interwał kroku Z. W zależności od celu badania, krok Z należy dostosować tak, aby nie pominąć żadnej cysty oraz zapewnić wykrycie pojedynczych komórek i agregatów.
      5. Wykonaj co najmniej 3 niezachodzące na siebie stosy Z (Z-stacks) na każdą studzienkę.
        UWAGA: Takie pobieranie próbek jest konieczne w sytuacjach, gdy – jak w tym przykładzie – torbiele występują w większej liczbie w głębi żelu niż na jego krawędziach, co wynika z heterogeniczności polimeryzacji hydrożelu.
      6. Aby uzyskać reprezentatywny zestaw danych, należy powtórzyć krok 2.1.1.5. łącznie dla 3 dołków.
        UWAGA: Heterogeniczność rozkładu cyst zależy od rodzaju hydrożelu, jego polimeryzacji oraz linii komórkowej. Przyjmując trzy serie obrazów Z (Z-stacks) na dołek i trzy dołki na eksperyment, w celu charakterystyki tworzenia się i wzrostu cyst w każdym punkcie czasowym, obrazuje się minimum 200 cyst w obrębie dziewięciu serii Z-stacks.
  2. Przetwarzanie obrazów
    UWAGA: W hydrożelu NRC mogą występować jako pojedyncze komórki, cysty lub agregaty. Cysty rozpoznaje się po obecności okrągłej i cienkiej, kontrastującej otoczki komórkowej zamykającej światło, natomiast agregaty komórkowe mają nieregularny kształt i nie posiadają światła. Agregaty i pojedyncze komórki mają gęsty i kontrastowy wygląd (Rysunek 3B(4)).
    1. Otwórz oprogramowanie Fiji, otwórz stos Z (Z-stack), przejdź do menu Fiji i kliknij Plik | Otwórz (Rysunek uzupełniający 1). Wybierz stos Z (Z-stack) do analizy. W razie potrzeby wybierz „Wirtualny stosopcja „ i kliknij „Tak” do otwierania (Rysunek 3A(1)).
    2. Powielić stos za pomocą Obraz | Duplikuj. Kliknij pole „Duplikuj stos” i kliknij „Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.” (Rycina uzupełniająca 2).
      UWAGA: W tym przykładzie stosy Z (Z-stacks) znajdują się w formacie plików .nd2 zakodowanych w 16 bitach.
    3. Utwórz projekcję minimalnej intensywności z zduplikowanego stosu. Przejdź do Obraz menu | Stosy | Projekt ZWybierz typ projekcji „Minimalna intensywność” i kliknij „Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.” (Rycina 3A(2)) (Rysunek uzupełniający 3).
    4. Odejmij tło z projekcji. Przejdź do Menu procesu | Odjęcie tłaWpisz 500,0 pikseli w polu promienia toczącej się kuli (rolling ball radius) i kliknij „jasne tłoaby zapewnić większy kontrast torbieli względem tła (Rysunek 3A(3)) (Rysunek uzupełniający 4).
      UWAGA: Promień tocznej kuli (rolling ball radius) definiuje rozmiar obszaru, w obrębie którego wykonywane jest odejmowanie tła. Parametr ten należy ustawić zgodnie z rozmiarem największego obiektu, który ma zostać zidentyfikowany.
    5. Jeśli wymagane jest wzmocnienie kontrastu, przejdź do Menu obrazu | Regulacja | Jasność/Kontrast | Auto | ZastosujProgram Fiji automatycznie zoptymalizuje jasność i kontrast. W (Rycina 3A(3)), dolne i górne wartości szarości ustawiono odpowiednio na 49702 i 65452 (Rysunek uzupełniający 5).
      UWAGA: Jeśli projekcja nie została skalibrowana, przejdź do Menu analizy | Ustaw skalę i wpisz odpowiednią kalibrację µm/pixestosunek l (Rysunek uzupełniający 6).
  3. Liczenie cyst i pomiary wielkości cyst
    1. Aby zmierzyć przybliżoną średnicę torbieli, należy wybrać Liniowy narzędzie w menu Fiji i narysować linię w poprzek średnicy każdej torbieli na końcowej projekcji (Rysunek 3B(4)). Dodaj nowy obszar zainteresowania (ROI) utworzony dla każdej torbieli do menedżera ROI: naciśnij przycisk „tskrót klawiszowy umożliwiający szybsze liczenie i otwieranie menedżera ROI. Kliknij „Pokaż Wszystkieaby zobaczyć policzone cysty (Rycina uzupełniająca 7)
    2. Należy upewnić się, że żadna torbiel nie została pominięta podczas liczenia, nakładając zestaw zdefiniowanych obszarów zainteresowania (ROI) z projekcji na stos obrazów Z (Z-stack). W tym celu należy kliknąć w okno stosu Z aby go wybrać. W oknie ROI Manager kliknij „Pokaż wszystko” i przesuń kursor wzdłuż stosu Z (Z-stack), aby sprawdzić obraz po obrazie, czy wszystkie cysty zostały policzone (Rycina uzupełniająca 8).
    3. Po przeliczeniu nowych cyst i dodaniu obszarów zainteresowania (ROI) w kroku 2.3.1., należy wybrać zestaw ROI i zapisać go w oknie ROI Manager, klikając Więcej | Zapisz (Rycina uzupełniająca 9).
    4. Zaznacz wszystkie obszary zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI (ROI Manager) i kliknij „Pomiar” w ROI Manager, aby uzyskać rozmiar każdej torbieli. Otworzy to nowe okno pomiarów o nazwie „Wynikinumerując każdą torbiel i podając jej szacowany rozmiar. Następnie zapisz w formacie .csv, klikając w „Wynikiokno oraz przez menu: Plik | Zapisz jako (Rysunek uzupełniający 10).
      UWAGA: Można utworzyć makro do półautomatycznego przetwarzania stosów obrazów, szacowania liczby i wielkości cyst na podstawie projekcji oraz przechowywania danych w celu przyspieszenia procedury liczenia. Aby to zrobić, należy wybrać narzędzie „Rejestruj” w menu paska, klikając Wtyczki | Makra | Nagrywaj.
  4. Ilościowe określenie wydajności tworzenia cyst
    1. Policz liczbę cyst w dniu Y, Wzór na równowagę statyczną Σ(cysty w dniu Y); obraz równania matematycznego do celów edukacyjnych. na projekcji (Y=1, 2, 4, 7 lub 10).
    2. Aby obliczyć wydajność tworzenia cyst dla 1000 komórek w dniu Y, należy podzielić liczbę cyst policzonych w tym punkcie czasowym przez liczbę komórek wysianych w dniu 0, wyznaczoną na podstawie objętości hydrożelu, a następnie pomnożyć wynik przez 1000 (Rysunek 3C, Rycina 4).
      Równanie wydajności tworzenia cyst; obliczanie liczby cyst na komórki w czasie w badaniu biologicznym.

3. Żywotność komórek

  1. Przygotować roztwór zapasowy diacetanu fluoresceiny (FDA) o stężeniu 5 mg/mL, rozpuszczając 5 mg FDA w 1 mL acetonu, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować roztwór zapasowy jodku propidyny (PI) o stężeniu 2 mg/mL w wodzie dejonizowanej (dH2O) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować pożywkę NRC bez płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  4. Aby przygotować roztwór barwiący FDA/PI, dodać 4 μL roztworu zapasowego FDA (stężenie końcowe 8 µg/mL) oraz 25 μL roztworu zapasowego PI (stężenie końcowe 20 µg/mL) do 2,5 mL pożywki NRC bez FCS.
  5. Usunąć pożywkę z szkiełka komorowego, dodać 250 μL roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować przez 4-5 min w ciemności w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2. Ostrożnie odpipetować roztwór barwiący i przepłukać raz 250 μL 1x PBS.
  6. Ostrożnie dodać 250 μL pełnej pożywki NRC do każdej studzienki i wykonać zdjęcia przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami Texas red oraz izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Żywe komórki będą zielone, a martwe czerwone (Rycina 5A).
    UWAGA: W celu kwantyfikacji żywych i martwych komórek, po wykonaniu kroku 2 należy wykonać serie obrazów Z-stack w całej objętości hydrożelu i dostosować metodę przetwarzania obrazów dla fluorescencji.

4. Aktywność wydzielnicza

UWAGA: Aktywność wydzielnicza przez błonę apikalną cholangiocytów jest oceniana na podstawie wydzielania fluoresceiny do światła naczynia. Jej swoistość można ocenić, przeprowadzając ten sam test z użyciem Verapamilu, inhibitora transporterów wielolekoopornych (MDR)24.

  1. Aby przygotować roztwór barwiący Hoechst 33258 o stężeniu 5 µg/mL, dodać 0,83 μL roztworu zapasowego Hoechst (stężenie zapasowe 15 mg/mL w dH2O) do 2,5 mL pożywki NRC bez FCS.
  2. Dodać 250 μL roztworu Hoechst do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15 min.
  3. Usunąć roztwór Hoechst i dodać 250 µL roztworu FDA (stężenie końcowe 8 µg/mL) do każdego dołka. Inkubować przez 4-5 min w 37 °C, 5% CO2.
    UWAGA: Natychmiast po wystawieniu komórek na działanie roztworu barwiącego FDA, przydatne może być monitorowanie kinetyki sekrecji fluoresceiny w celu skalibrowania czasu potrzebnego na sekrecję przez cysty. W tym celu należy wykonywać zdjęcia co 1 min przez 1 h za pomocą obrazowania time-lapse. W tym przykładzie czas potrzebny do zaobserwowania sekretyngnych cyst NRC w hydrożelu wynosi około 15-20 min.
  4. Wykonać zdjęcia za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego 5 min po wypłukaniu pożywką bez FCS. Użyć filtrów dla 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oraz FITC, aby uwidocznić znakowanie jąder oraz akumulację fluoresceiny w świetle (Rycina 6A). Aby określić liczbę sekretyngnych cyst, należy wykonać serie obrazów Z-stack zgodnie z krokiem 2 i dostosować etapy przetwarzania obrazów do obrazów fluorescencyjnych.
    UWAGA: W przypadku testu z Verapamilem, poprzedzić powyższy proces (kroki 4.3. do 4.4.) inkubacją z Verapamilem zgodnie z następującymi warunkami:
  5. Przygotować roztwór zapasowy 10 mM Verapamilu w dimetylosulfoksydzie (DMSO). Aby przygotować roztwór roboczy 10 µM, zmieszać 2,5 μL roztworu zapasowego Verapamilu z 2,5 mL pożywki hodowlanej bez FCS.
  6. Aby ocenić, czy fluorescencja w świetle wynika z sekrecji MDR, należy użyć innego preparatu, dodać 250 µL roboczego roztworu Verapamilu do każdego dołka i inkubować przez 20 min w 37° C, 5% CO2
  7. Usunąć roztwór i dodać 250 µL roztworu FDA (stężenie końcowe 8 µg/mL) do każdego dołka. Inkubować przez 4-5 min w ciemności w 37 °C, 5% CO2. Następnie wypłukać 250 μL 1x PBS przed obrazowaniem (Rycina 6B, C).

5. Ocena polarności nabłonka za pomocą immunofluorescencji

  1. Aby przygotować roztwór utrwalający, zmieszaj 4% formaldehyd z 5% sacharozą w 1x PBS, pH 7.4 i inkubuj w kąpieli wodnej wstępnie podgrzanej do 37 °C.
  2. Aby utrwalić komórki, ostrożnie odpipetuj pożywkę hodowlaną z dołka, nie uszkadzając matrycy. Powoli dodaj 400 µL roztworu utrwalającego przy ściankach dołków. Inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Zawsze pozostawiaj 25 µL cieczy nad matrycą, aby zapobiec jej uszkodzeniu.
  3. Ostrożnie usuń roztwór utrwalający i przemyj 3x 400 μL 1x PBS w temperaturze RT.
  4. Odpipetuj PBS, dodaj 400 µL roztworu permeabilizującego (0,5% Triton X-100 w 1x PBS) i inkubuj przez 10 min w RT.
  5. Ostrożnie usuń roztwór permeabilizujący, a następnie wykonaj 3 szybkie przemycia 400 μL 1x PBS oraz długi etap płukania przez 30 min w RT.
    UWAGA: Na tym etapie preparat można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 dni. W takim przypadku szczelnie zamknij preparat folią parafinową, aby zapobiec odparowywaniu i wysychaniu matrycy.
  6. Usuń PBS, dodaj 400 µL roztworu blokującego zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 10% surowicy koziej w 1x PBS i inkubuj przez 60 min w RT.
    OSTROŻNIE: Stężenia BSA wyższe niż 0,1% spowodują retrakcję światła i dalszy zapad torbieli (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki) (Rycina 7A).
  7. Odpipetuj roztwór blokujący, przemyj raz 400 µL PBS/0,05% Tween 20 i odlej płyn.
  8. Dodaj 150 µL roztworu przeciwciał, np. przeciwciała przeciwko E-kadherynie rozcieńczonego 1:400 oraz faloidyny 568 (stężenie końcowe 16,2 nM) w 1x PBS i inkubuj przez 90 min w RT.
    UWAGA: To rozcieńczenie E-kadheryny jest takie samo, jak stosowane w standardowym protokole immunofluorescencji 2D.
  9. Przemyj próbkę 400 µL PBS/0,05% Tween 20 3x; za każdym razem inkubując próbkę przez 10 min w RT.
  10. Dodaj 150 µL przeciwciała wtórnego (kozie anty-królicze IgG Alexa Fluor Plus 647), rozcieńczonego 1:500 w 1x PBS i inkubuj przez 60 min w RT.
  11. Przemyj 3x 400 µL PBS/0,05% Tween 20, za każdym razem inkubując próbkę przez 10 min w RT.
  12. Przemyj 3x 400 µL 1x PBS, za każdym razem inkubując próbkę przez 10 min w RT.
  13. Odlej PBS z ostatniego przemycia i przygotuj szkiełko komorowe do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej, wybierając jedną z dwóch poniższych opcji.
    1. Dodaj 400 μL 1x PBS i 50 μL DAPI na dołek. Próbki można badać przez dno dołka bez konieczności montowania z deactivate szkiełkiem nakrywnym (Rycina 7B).
    2. Dodaj 100 µL na dołek odczynnika zapobiegającego blaknięciu (antifade) zawierającego DAPI i pozostaw szkiełko do wyschnięcia przez noc (O/N) w RT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tworzenie i charakterystyka cyst
Trójwymiarowe systemy hodowli komórkowej stanowią istotne narzędzie w badaniach nad organogenezą i modelowaniem chorób25. Niestety większość tych metod ma charakter jakościowy lub opiera się na wewnętrznej kwantyfikacji przeprowadzanej w jednej płaszczyźnie poprzez porównanie liczby cyst do liczby struktur niebędących cystami, w zmiennych i często nieokreślonych objętościach, co uniemożliwia porównanie wydajności tworzenia cyst pomiędzy różnymi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W celu zbadania organogenezy i utrzymania struktur komórkowych 3D modelowano różne tkanki, wykorzystując różne pochodzenie komórkowe, ale także różne rodzaje matryc zewnątrzkomórkowych, w tym syntetyczne hydrożele 8,9,10,21. Jednak ze względu na brak analizy ilościowej 3D, która pozwala na porównania metod pod względem tworzenia lub funkcjonalności organoidów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Nicholasowi LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Stany Zjednoczone), który uprzejmie dostarczył linię komórkową NRC.

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe zarówno od programu iLite RHU (grant ANR-16-RHUS-0005), jak i DHU Hepatinov.

Dziękujemy Isabelle Garcin i Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay za wsparcie w zakresie obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 &mikro; l- Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000020
100 & mikro; l - Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000046
1000 & micro; l - Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000062
1X PBSThermo Fisher Scientific14190-094
200 µ l - Pipeta Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000054
3,3′,5-triiodo-L-tyroniny sól sodowaSigma-AldrichT5516NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 3,4 &mikro; g/ml
Kwas octowyVWR20104-2980,02N końcowy
Końcówki do pipet barierowych aerozolowych 10 i mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific 2707439
Końcówki do pipet barierowych w aerozolu 1000 i mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707404
Końcówki do pipet barierowych w aerozolu 200 i mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific 2707430
Antybiotykowy roztwór przeciwmikotyczny (100X)Sigma-AldrichA5955NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie Ekstrakt
przysadki bydlęcejThermo Fisher Scientific13028-014NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 30 &mikro; g / ml
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA21531:1000 rozcieńczenie
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (100X)Thermo Fisher Scientific11905-031NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie
Kolagen o wysokim stężeniu, ogon szczuraThermo Fisher Scientific35424950 &mikro; g/ml stężenie końcowe
DeksametazonSigma-AldrichD4902NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 0,393 &mikro; g / mL
DMEM F12Thermo Fisher Scientific21331-020NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1X
E-kadheryna Królik anty-Człowiek, Szczur, PoliklonalnyThermo Fisher ScientificPA5-32178Rozcieńczenie 1:400
Mikroskop odwrócony Eclipse TE300ObrazowanieNikon
EtanoloaminaSigma-AldrichE9508NRC kompletny średni finał stężenie = 0,32 mM
Płodowa surowica cielęcaThermo Fisher Scientific10270-106NRC complete medium stężenie końcowe = 5:100 rozcieńczenie
Fluoroshield z DAPI (Podłoże montażowe)Sigma-AldrichF6057
Formaldehyd 16% (W/V)Thermo Fisher Scientific289064% (W/V)
Kozia surowicaThermo Fisher Scientific16210-0641:10 rozcieńczenie
Aparat Hamamatsu (Aparat cyfrowy C11440 ORCA - flash 4.OLT)Hamamatsuobrazowanie
Hoechst 33258Sigma-AldrichB11555 µ g / ml stężenie końcowe
IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowany krzyżowo kozi anty-królik, Alexa Fluor Plus 647Thermo Fisher ScientificA32733rozcieńczenie 1:500
ImageJ wersja 2.0.0-rc-69/1.52nOprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym
Insulina-Transferyna-Selen (100X)Thermo Fisher Scientific51300-044NRC pełne stężenie końcowe = rozcieńczenie
1:100L-Glutamina (100X)Thermo Fisher Scientific25030-024NRC kompletne stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie
Matrigel GFR (stężenie podstawowe 9,7 mg/mL)Thermo Fisher Scientific3562314:10 rozcieńczenie
NIS Elements wersja oprogramowania 4.50.00Akwizycja i wyświetlanie obrazówNikon
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-035NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 1:100 rozcieńczenie
Obiektywny Plan Fluor 10X/0,30 Ph1 DL (∞/1,2 WD 15,2)Nikon
Prolong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciuThermo Fisher ScientificP36931
Jodek propidyny (PI)Sigma-AldrichP417020 &mikro; g/ml stężenie końcowe
Rodamina PhalloidynaThermo Fisher ScientificR41516,2 nM stężenie końcowe
Zestaw Sir-Actin / VerapamilSpirochromeSC00110 µ M stężenie końcowe
Inhibitor trypsyny sojowejThermo Fisher Scientific17075-029NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 50 &mikro; g / ml
Sterylne sitko komórkowe 40 i mikro; m (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific22363547
Sterylne pipety 10 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811E
Sterylne pipety 5 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811D
Sterylne probówki 1,5 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific11926955
Sterylne probówki 15 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific7200886
Sterylne probówki 50 ml (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific553913
SacharozaSigma-AldrichS03895:100 rozcieńczenie
Kolba do hodowli tkankowych 25cm2 (Falcon)Thermo Fisher Scientific353108
Triton X-100Sigma-AldrichT87875:1000 rozcieńczenie
Trypsyna-EDTA (0,05%) czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25300-0541X
Tween-20Sigma-AldrichP13795:10000 rozcieńczenie
Witamina (100X)Thermo Fisher Scientific11120-037NRC pełne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie
μ-Slajd 8 Well ibiTreat, IbidiClinisciences80826
z

Bibliografia

  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67(2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013(2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70(2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544(2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla cholangiocytówzatapianie w hydrożeluanaliza Z-stackwydajność tworzenia cystocena polarności cystocena funkcji wydzielniczejoptymalizacja immunobarwieniabarwienie żywe/martwewydzielanie flurorescyny
Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.