Zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji DNA zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia

Summary

Obecne metody ładowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA mogą być podatne na zanieczyszczenie. Szczegółowo opisujemy nową metodę załadunku płytek 96-dołkowych, która zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między studniami. Nasza metoda pomoże innym badaczom wykorzystać skuteczność wysokoprzepustowych technik ekstrakcji DNA i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Abstract

Techniki sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości znacząco przyczyniły się do postępu w naszym zrozumieniu relacji między społecznościami mikroorganizmów, charakterystyki gospodarzy i szerszych funkcji ekosystemu. Wraz z tym szybkim wzrostem zakresu i głębokości możliwości sekwencjonowania pojawiły się metody ekstrakcji, amplifikacji, analizy i interpretacji środowiskowego DNA z maksymalną wydajnością. Niestety, szybkie przeprowadzanie ekstrakcji DNA może odbywać się kosztem zwiększenia ryzyka zanieczyszczenia próbek. W szczególności ekstrakcje o wysokiej przepustowości, które opierają się na próbkach zawartych w 96-dołkowej płytce, oferują stosunkowo szybką metodę w porównaniu z ekstrakcjami jednoprobówkowymi, ale także zwiększają możliwości zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami, przy jednoczesnym zachowaniu korzyści płynących z wysokoprzepustowych technik ekstrakcji, opracowaliśmy nową metodę ładowania próbek środowiskowych do 96-dołkowych płytek. Użyliśmy przebijalnych folii uszczelniających PCR, aby pokryć każdą płytkę podczas ładowania próbek i najpierw dodaliśmy próbki do probówek PCR przed przeniesieniem ich do studzienek; Łącznie praktyki te zmniejszają ryzyko dryftu próbki i niezamierzonego podwójnego załadunku studni. Metoda opisana w tym artykule zapewnia naukowcom podejście do maksymalizacji dostępnych technik ekstrakcji o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego nieodłącznie związanego z płytkami 96-dołkowymi. Przedstawiamy szczegółowy opis krok po kroku, jak przejść od pobrania próbki do ekstrakcji DNA, jednocześnie minimalizując ryzyko niepożądanego zanieczyszczenia krzyżowego.

Introduction

Ostatnie postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu społeczności mikroorganizmów zapewniają niezrównaną głębię sekwencjonowania, a co za tym idzie, bezprecedensowy wgląd w funkcjonowanie i różnorodność mikrobiomu Ziemi¹. Wraz ze wzrostem możliwości multipleksowania coraz większej liczby próbek na jednym torze sekwencjonowania, ekstrakcja DNA z jednej probówki może stać się krokiem ograniczającym szybkość generowania danych ekologicznych. Jednak nowe metody wysokoprzepustowej ekstrakcji DNA dają nadzieję na przetwarzanie dużych ilości próbek środowiskowych z większą wydajnością niż było to wcześniej możliwe². Metody te....

Protocol

1. Stół laboratoryjny i przygotowanie narzędzi do załadunku płytki 96-dołkowej

1. Przezroczysty blat przez zraszanie 70% etanolem. Wytrzyj i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed spryskaniem blatu 10% wybielaczem. Wytrzyj blat do sucha.
2. Wysterylizuj mikroczerpak, szpatułkę i nożyczki chirurgiczne (zakrzywione), zanurzając je w 95% etanolu, a następnie wystawij na działanie płomienia. Zanurz każdy z nich w 10% wybielaczu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem.
   UWAGA: Narzędzia powinny być sterylizowane między każdą próbką.

2. Podpróbkowanie i przygotowanie próbki

1. Wysterylizuj rę....

Results

Ta nowatorska metoda została z powodzeniem wykorzystana do załadowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA. Porównanie metod ładowania płytek wykazało, że nasza metoda ma najniższe stężenie DNA w ślepych studzienkach. Stężenie DNA w ślepych studzienkach było znacznie niższe niż metoda zaproponowana przez mojego McPhersona i wsp.⁹ (p < 0,05), chociaż stężenia DNA w naszej metodzie nie różniły się statystycznie od domyślnej metody Qiagen (Rysunek 2). Wszystkie trzy metody da.......

Discussion

Metoda ta zmniejsza możliwość zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami podczas ładowania płytek do ekstrakcji próbek o wysokiej przepustowości i oferuje bardziej kontrolowane sposoby ładowania płytek 96-dołkowych poza istniejącymi strategiami ładowania płytek ^9,10. Zanieczyszczenie między odwiertami może być bardziej rozpowszechnione w przypadku ekstrakcji płytkowej 96-dołkowej niż w przypadku ekstrakcji jednoprobówkowej, zwłaszcza w przypadku zautomatyzowan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 uncji WhirlPak	Nasco	B01065
2 ml probówki wirówkowe	Fisherbrand	05-408-129
200 µ L probówki do mikro-PCR	Thermo Scientific	AB 2000
96-dołkowy zestaw do ekstrakcji DNA PowerSoil	Qiagen	12955-4	Użyliśmy zestawu do ekstrakcji gleby, ale każdy zestaw do formatu 96-dołkowego będzie działał.
Blok lodu do probówek wirówkowych 2 ml	Dowolna		Dowolna Dowolna blok lodu wykonany na probówki 2 ml będzie działać
Blok lodu na 200 i mikro; L probówki micro-PCR	Dowolna	Dowolna	Dowolna dowolna blok lodu wykonana dla 200 i mikro; Rurki L będą działać
Micro scoopula	Dowolna	dowolna
wstępnie przycięta przebijalna folia uszczelniająca	Excel Scientific	XPS25
Szpatułka	Dowolne	Dowolne
Nożyczki chirurgiczne	Dowolne