Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji DNA zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia

DOI:

10.3791/61405

⸱

3 czerwca 2020

 , 
1Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 2Program in Ecology, University of Wyoming, 3EPSCoR-IDEA, University of Wyoming, 4Department of Botany, University of Wyoming

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody ładowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA mogą być podatne na zanieczyszczenie. Szczegółowo opisujemy nową metodę załadunku płytek 96-dołkowych, która zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między studniami. Nasza metoda pomoże innym badaczom wykorzystać skuteczność wysokoprzepustowych technik ekstrakcji DNA i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości znacząco przyczyniły się do postępu w naszym zrozumieniu relacji między społecznościami mikroorganizmów, charakterystyki gospodarzy i szerszych funkcji ekosystemu. Wraz z tym szybkim wzrostem zakresu i głębokości możliwości sekwencjonowania pojawiły się metody ekstrakcji, amplifikacji, analizy i interpretacji środowiskowego DNA z maksymalną wydajnością. Niestety, szybkie przeprowadzanie ekstrakcji DNA może odbywać się kosztem zwiększenia ryzyka zanieczyszczenia próbek. W szczególności ekstrakcje o wysokiej przepustowości, które opierają się na próbkach zawartych w 96-dołkowej płytce, oferują stosunkowo szybką metodę w porównaniu z ekstrakcjami jednoprobówkowymi, ale także zwiększają możliwości zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami, przy jednoczesnym zachowaniu korzyści płynących z wysokoprzepustowych technik ekstrakcji, opracowaliśmy nową metodę ładowania próbek środowiskowych do 96-dołkowych płytek. Użyliśmy przebijalnych folii uszczelniających PCR, aby pokryć każdą płytkę podczas ładowania próbek i najpierw dodaliśmy próbki do probówek PCR przed przeniesieniem ich do studzienek; Łącznie praktyki te zmniejszają ryzyko dryftu próbki i niezamierzonego podwójnego załadunku studni. Metoda opisana w tym artykule zapewnia naukowcom podejście do maksymalizacji dostępnych technik ekstrakcji o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego nieodłącznie związanego z płytkami 96-dołkowymi. Przedstawiamy szczegółowy opis krok po kroku, jak przejść od pobrania próbki do ekstrakcji DNA, jednocześnie minimalizując ryzyko niepożądanego zanieczyszczenia krzyżowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu społeczności mikroorganizmów zapewniają niezrównaną głębię sekwencjonowania, a co za tym idzie, bezprecedensowy wgląd w funkcjonowanie i różnorodność mikrobiomu Ziemi1. Wraz ze wzrostem możliwości multipleksowania coraz większej liczby próbek na jednym torze sekwencjonowania, ekstrakcja DNA z jednej probówki może stać się krokiem ograniczającym szybkość generowania danych ekologicznych. Jednak nowe metody wysokoprzepustowej ekstrakcji DNA dają nadzieję na przetwarzanie dużych ilości próbek środowiskowych z większą wydajnością niż było to wcześniej możliwe2. Metody te często polegają na użyciu płytek 96-dołkowych zamiast pojedynczych probówek, zwiększając w ten sposób możliwą liczbę ekstrakcji, które mogą odbywać się jednocześnie. W związku z tym praktyczność i wydajność wysokowydajnych metod ekstrakcji są oczywiste i zostały wdrożone do przetwarzania próbek środowiskowych od soil3,4 i plant tissues3,5 do ludzkiego kału class2.

Chociaż te metody mogą znacznie przyspieszyć proces przetwarzania próbek i ekstrakcji DNA, początkowy etap ładowania gleby i innych próbek ekologicznych do 96-dołkowych płytek jest podatny na zanieczyszczenie krzyżowe. Ten rodzaj zanieczyszczenia typu "od studni do studni" może wystąpić podczas ekstrakcji DNA6,7,8, a studnie są szczególnie wrażliwe w tym pierwszym etapie, zanim próbki zostaną zawieszone w roztworze buforowym. McPherson et al.9 demonstrują metodę ładowania gleb ryzosferowych do 96-dołkowych płytek za pomocą lejków i 8-dołkowych pokryw paskowych PCR, ale chociaż ich metoda jest bardziej kontrolowanym podejściem do ładowania płytek, nadal zapewnia wiele możliwości zanieczyszczenia sąsiednich studni podczas ładowania każdej próbki. Dodatkowo, otwarte studnie dają szansę rozproszonemu badaczowi na umieszczenie próbki w niewłaściwej studni lub dodanie próbki do studni, która została już załadowana. Ponadto różne typy próbek okazują się nieodpowiednie do ładowania tą metodą; Mokre próbki często przyklejają się do lejków, a suche próbki "przeskakują" między studzienkami z powodu elektryczności statycznej.

Aby zmniejszyć możliwości zanieczyszczenia między studniami w pierwszym etapie wysokoprzepustowej ekstrakcji DNA, opracowaliśmy nowe podejście do ładowania próbek gleby do 96-dołkowych płytek. Nasze metody zarówno chronią studzienki przed narażeniem na działanie środowiska, jak i zapobiegają przypadkowemu załadowaniu wielu próbek do jednej studzienki (podwójne ładowanie). Uważamy, że opisana poniżej metoda daje nadzieję na zmniejszenie potencjału zanieczyszczenia i jako taka zapewnia bardziej kontrolowany sposób ładowania 96-dołkowych płytek do późniejszej ekstrakcji DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stół laboratoryjny i przygotowanie narzędzi do załadunku płytki 96-dołkowej

  1. Przezroczysty blat przez zraszanie 70% etanolem. Wytrzyj i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed spryskaniem blatu 10% wybielaczem. Wytrzyj blat do sucha.
  2. Wysterylizuj mikroczerpak, szpatułkę i nożyczki chirurgiczne (zakrzywione), zanurzając je w 95% etanolu, a następnie wystawij na działanie płomienia. Zanurz każdy z nich w 10% wybielaczu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem.
    UWAGA: Narzędzia powinny być sterylizowane między każdą próbką.

2. Podpróbkowanie i przygotowanie próbki

  1. Wysterylizuj rękawice przy użyciu etanolu przed pobraniem podpróbek.
  2. Dokładnie homogenizować próbki gleby przed pobraniem podpróbek.
  3. Za pomocą wysterylizowanych narzędzi załaduj oznakowaną probówkę wirówkową o pojemności 2 ml próbką do około połowy wypełnionej.
  4. Powtarzać krok 2.2 do momentu, gdy wszystkie 95 próbek zostanie podpobranych do oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml. Studzienka 96powinna być używana jako ślepa próba ekstrakcyjna.
    UWAGA: Kroki 2.3 i 2.4 mają na celu zminimalizowanie wymaganej przestrzeni dyskowej i zapobieżenie nadmiernemu lub podwójnemu próbkowaniu.
  5. Przechowywać 2 ml probówek z podpróbkami na lodzie do czasu załadowania płytki.
  6. Etykieta 96 sterylnych probówek PCR z płaską nakrętką 200 μl A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Umieść te probówki w kolejności w 96-dołkowym stojaku.
  7. Przypisz identyfikator próbki do lokalizacji odwiertu (A1\u2012H12) i zapisz go.

3. Przygotowanie talerza

  1. Zdejmij gumową osłonę z płytki 96-dołkowej (Rysunek 1A–1C) i umieść ją w sterylnej plastikowej torbie (patrz tabela materiałów). Zamknij plastikową torbę, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  2. Przykryj 96-dołkową płytkę folią uszczelniającą (Rysunek 1D–1E); na przykład użyj wstępnie przyciętej przebijalnej folii uszczelniającej (patrz Tabela materiałów). Zapewnić uszczelnienie, zwijając gumową rolkę.
    UWAGA: Maty silikonowe do przekłuwania mogą potencjalnie stanowić opcję wielokrotnego użytku, pod warunkiem odpowiedniego czyszczenia między użyciami, ale testowane przez nas maty silikonowe łatwo pękają wzdłuż przekłuć i nie zapewniają równej ochrony żadnym następnym płytom.
  3. Umieść talerz w lodówce (4 °C), aby ostygł
    4. .

4. Transfer podpróbek

UWAGA: Zobacz krok 4.13, aby zapoznać się z modyfikacjami, gdy próbka gleby jest bardzo mała.

  1. Umieścić 24 z 2 ml podpróbek w bloku lodu do przechowywania w chłodni.
  2. Korzystając z nazwy próbki i arkusza lokalizacji studzienki, wybierz odpowiednią probówkę do PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl.
  3. Weź probówkę z podpróbką o pojemności 2 ml i wiruj przez ~5 s, aby zapewnić homogenizację.
  4. Używając narzędzi sterylizowanych płomieniem i wybielaczem, załaduj ~200 μL pierwszej próbki do odpowiedniej probówki PCR z płaską nakrętką (Rysunek 1F).
  5. Powtarzaj kroki 4.2\u20124.4, aż wszystkie 24 próbki zostaną załadowane. Następnie przejdź do kroku 4.6.
  6. Za pomocą papierowej chusteczki nasączonej wybielaczem wyczyść zewnętrzną część probówki do PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl.
  7. Odwróć probówkę i postukaj w ławkę, aby przesunąć próbkę na górę probówki. Za pomocą wybielonych i wysterylizowanych płomieniowo nożyczek przypnij spód probówki do PCR, aby utworzyć otwór, przez który próbka wpadnie do 96-dołkowej płytki (Rysunek 1G).
  8. Zlokalizuj właściwą studzienkę na 96-dołkowej płytce i przełóż rurkę w poprzek płytki z odciętym końcem skierowanym do góry, aż dotrze do tej studni. Lekko przechyl płytkę, aby ułatwić przebicie wstępnie przyciętej przebijalnej folii uszczelniającej, a tylko wtedy, gdy rurka znajduje się bezpośrednio nad właściwą studnią, ostrożnie odwróć ją tak, aby przycięta końcówka pasowała do studzienki. Za pomocą wysterylizowanych narzędzi postukaj w górną część probówki do PCR, aż cała ziemia spadnie z probówki do studzienki. Pozostaw probówkę w studni z zamkniętą pokrywą (Rysunek 1H–1J).
  9. Wyjmuj po jednej probówce PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl na raz i dodaj do niej 750 μl roztworu kulek (ryc. 1K). Wepchnij probówkę PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl do samego dołu do studzienki i zaznacz górę sharpie, aby wskazać, że ta studzienka została załadowana. Powtórzyć tę czynność dla każdej próbki.
  10. Po załadowaniu wszystkich 24 próbek i dodaniu roztworu kulek należy wyjąć probówki z podpróbkami o pojemności 2 ml i zastąpić je 24 probówkami bez próbek.
  11. Powtarzaj kroki 4.1\u20124.10, aż wszystkie 95 studzienek zostanie załadowanych próbką lub roztworem ślepej próby i kulek. Wyjmij probówki bez przepuszczania ich przez otwarte studzienki (Rysunek 1L).
  12. Ostrożnie usuń przebijalną folię i załóż gumową osłonę, aby chronić płytkę do momentu rozpoczęcia ekstrakcji (Rysunek 1M–1O).
  13. W przypadku bardzo małych ilości gleby, które są również drobnoziarniste, dodaj 750 μl roztworu kulek do probówki z próbką i użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby przenieść całą zawartość do odpowiedniego dołka. Umieść probówkę PCR w otworze, aby zapobiec podwójnemu ładowaniu.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wdrażania tej modyfikacji, ponieważ cząstki materii organicznej lub małe fragmenty skał większe niż otwór końcówki pipety mogą zatkać pipetę i utrudnić przenoszenie zawiesiny próbki.
  14. W razie potrzeby zamrozić w temperaturze -20 °C i przechowywać płytki wypełnione próbką i roztworem kulek do czasu planowanej ekstrakcji.

5. Porównanie metod ładowania płyt

UWAGA: Aby zweryfikować naszą nowatorską metodę ładowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA, podzieliliśmy pojedynczą 96-dołkową płytkę na trzy sekcje. Użyliśmy trzech różnych metod obciążania płyt, aby porównać możliwość niezamierzonego obciążenia gleby i zanieczyszczenia krzyżowego. Trzy metody, których użyliśmy, to metody opisane w McPherson et al.9, domyślnym protokole ładowania Qiagen10, oraz protokole, który opisujemy w tej publikacji.

  1. Ładowanie ziemi do płyty
    1. Przeciąć 96-dołkową płytkę na trzy czterokolumnowe bloki. Załaduj każdy blok za pomocą jednej z trzech metod wymienionych powyżej.
    2. Załaduj ziemię do każdej innej studzienki, tak aby próbka i puste studzienki były rozłożone naprzemiennie. Taki układ pozwala na maksymalne ryzyko niezamierzonego obciążenia próbki i zanieczyszczenia krzyżowego.
    3. Zamrozić 96-dołkową płytkę w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji DNA.
  2. Ekstrakcja DNA
    1. Ekstrakcja DNA zgodnie z protokołem ekstrakcji płytki 96-dołkowej producenta10.
    2. Przechowywać ekstrakty DNA w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.
  3. Kwantyfikacja DNA w ślepych studzienkach
    1. Rozmrozić ekstrakty DNA w temperaturze pokojowej, odwirować i odwirować za pomocą wirówki do płytek.
    2. Mierzyć i rejestrować stężenia DNA w ślepych studzienkach za pomocą spektrofotometru.
    3. Użyj ANVOA i testu post-hoc Tukey'a, aby przeanalizować różnice w średnim stężeniu DNA w ślepych studzienkach.
      UWAGA: Istotne różnice odnotowano przy α = 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta nowatorska metoda została z powodzeniem wykorzystana do załadowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA. Porównanie metod ładowania płytek wykazało, że nasza metoda ma najniższe stężenie DNA w ślepych studzienkach. Stężenie DNA w ślepych studzienkach było znacznie niższe niż metoda zaproponowana przez mojego McPhersona i wsp.9 (p < 0,05), chociaż stężenia DNA w naszej metodzie nie różniły się statystycznie od domyślnej metody Qiagen (Rysunek 2). Wszystkie trzy metody da...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta zmniejsza możliwość zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami podczas ładowania płytek do ekstrakcji próbek o wysokiej przepustowości i oferuje bardziej kontrolowane sposoby ładowania płytek 96-dołkowych poza istniejącymi strategiami ładowania płytek 9,10. Zanieczyszczenie między odwiertami może być bardziej rozpowszechnione w przypadku ekstrakcji płytkowej 96-dołkowej niż w przypadku ekstrakcji jednoprobówkowej, zwłaszcza w przypadku zautomatyzowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Microbial Ecology Collaborative z finansowaniem z nagrody NSF #EPS-1655726.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18 uncji WhirlPakNascoB01065
2 ml probówki wirówkoweFisherbrand05-408-129
200 µ L probówki do mikro-PCRThermo ScientificAB 2000
96-dołkowy zestaw do ekstrakcji DNA PowerSoilQiagen12955-4Użyliśmy zestawu do ekstrakcji gleby, ale każdy zestaw do formatu 96-dołkowego będzie działał.
Blok lodu do probówek wirówkowych 2 mlDowolnaDowolna Dowolna blok lodu wykonany na probówki 2 ml będzie działać
Blok lodu na 200 i mikro; L probówki micro-PCRDowolnaDowolnaDowolna dowolna blok lodu wykonana dla 200 i mikro; Rurki L będą działać
Micro scoopulaDowolnadowolna
wstępnie przycięta przebijalna folia uszczelniającaExcel ScientificXPS25
SzpatułkaDowolneDowolne
Nożyczki chirurgiczneDowolne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
  2. Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
  3. Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
  4. Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618(2019).
  5. Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
  6. Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186(2019).
  7. Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362(2019).
  8. Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
  9. McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932(2018).
  10. Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Za adunek p ytki 96 do kowejograniczanie zanieczyszcze krzy owychprzebijalna folia uszczelniaj catechnika przenoszenia pr bekprzygotowanie prob wek do PCRdodawanie roztworu kuleczekkontrola pustych do k wmetody bada mikrobiomuwydajno ekstrakcji DNA

Powiązane artykuły