Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
opisano przebieg procesu PCR z multipleksem kropelkowym (mdPCR) i szczegółowy protokół do określania liczby rozmazów białych krwinek (WBC) na bazie epigenetycznej, wraz z urządzeniem do generowania kropel mikroprzepływowych z elastomeru termoplastycznego (TPE). Markery epigenetyczne są wykorzystywane do podtypowania WBC, co ma ważną wartość prognostyczną, w różnych chorobach. Osiąga się to poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA określonych regionów genomu bogatych w CG (loci CpG). W tym artykule DNA potraktowane wodorosiarczynem z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) jest zamknięte w kropelkach z odczynnikami mdPCR, w tym starterami i sondami fluorescencyjnymi do hydrolizy specyficznymi dla loci CpG, które korelują z subpopulacjami WBC. Podejście multipleksowe pozwala na badanie wielu loci CpG bez konieczności oddzielnych reakcji mdPCR, umożliwiając dokładniejsze parametryczne określenie subpopulacji WBC za pomocą analizy epigenetycznej miejsc metylacji. Ta precyzyjna kwantyfikacja może być rozszerzona na różne zastosowania i podkreśla korzyści dla diagnozy klinicznej i późniejszego rokowania.
Wprowadzenie
Analiza składu białych krwinek (WBC) jest jednym z najczęściej wymaganych badań laboratoryjnych w diagnostyce hematologicznej. Różnicowa liczba leukocytów służy jako wskaźnik dla spektrum chorób, w tym infekcji, stanów zapalnych, niedokrwistości i białaczki, i jest badana jako wczesny biomarker prognostyczny dla kilku innych schorzeń. Złoty standard w podtypowaniu WBC obejmuje barwienie immunologiczne i/lub cytometrię przepływową, które wymagają kosztownych, podatnych na niestabilność przeciwciał fluorescencyjnych i często w dużym stopniu zależą od biegłości operatora w przygotowywaniu próbek. Ponadto metoda ta ma zastosowanie wyłącznie do świeżych próbek krwi, tak aby próbki nie mogły zostać zamrożone w celu wysyłki lub późniejszej analizy.
Markery epigenetyczne pojawiły się ostatnio jako potężne narzędzia analityczne do badania zmienności fenotypowej. Następnie wykazano, że ludzkie populacje leukocytów mają wzorce metylacji DNA linii komórkowej, które pozwalają na precyzyjną charakterystykę podzbiorów WBC. Podtypowanie oparte na markerach epigenetycznych stanowi obiecującą alternatywę, która nie zależy od pobrania próbki świeżej krwi ani drogich przeciwciał i może być wykorzystana jako biomarker początku choroby i podatności1,2,3,4,5.
Przeprowadzono badania całego genomu w celu obszernego mapowania metylowanych, specyficznych regionów bogatych w CG w genomie (wyspy CpG) w podtypach leukocytów w celu zidentyfikowania potencjalnych markerów epigenetycznych specyficznych dla podtypów leukocytów. Z tego powodu protokoły PCR zostały opracowane dla metylowanych regionów genów, np. CD3Z i FOXP3, odpowiadających odpowiednio limfocytom T CD3 + i limfocytom T regulatorowym CD4 + CD25 + (T-Regs). Wiencke i wsp. wykazali użyteczność dupleksowej kropelkowej reakcji PCR do epigenetycznego podtypowania limfocytów T, uzyskując wyniki, które silnie korelują z analizą sortowania komórek aktywowanych przepływem (FACS)6. Ta ilościowa metoda analizy genetycznej opiera się na podziale matrycowych cząsteczek kwasu nukleinowego i odczynników PCR na tysiące dyskretnych, zdefiniowanych objętościowo kropelek o rozmiarach poniżej nanolitrów, zawierających zero, jedną lub więcej docelowych kopii kwasów nukleinowych, przy użyciu emulsji typu woda w oleju umożliwianej przez mikrofluidykę7,8. Amplifikację PCR przeprowadza się w każdej pojedynczej kropli i mierzy się intensywność fluorescencji w punkcie końcowym każdej kropli, co pozwala na bezwzględne określenie ilościowe celów obecnych w próbce. Stwierdzono, że PCR kropelkowy jest bardziej precyzyjny, dokładny i technicznie prostszy niż standardowy qPCR, co czyni go bardziej korzystną metodą opartą na metylacji DNA do klinicznej oceny limfocytów T. Chociaż szybko rozwijająca się metodologia podtypowania, brakuje multipleksowanej analizy epigenetycznej do jednoczesnego sondowania różnych metylowanych regionów CpG. Jest to konieczne do rutynowego zliczania leukocytów.
Tutaj, przedstawiono i zastosowano urządzenie mikroprzepływowe z termoplastycznym elastomerem (TPE) do specyficznego dla metylacji multipleksowego kropelkowego PCR (mdPCR). Technologia ta została wykorzystana do wyznaczenia określonych podtypów leukocytów, limfocytów T CD3 + i T-Regów CD4 + CD25 +, w oparciu o wzorce metylacji DNA linii komórkowej, tj. zmienność epigenetyczną regionów CpG CD3Z i FOXP3. Szczegółowy protokół ekstrakcji DNA, konwersji wodorosiarczynów i mdPCR jest opisany w połączeniu z metodą wytwarzania urządzenia do generowania kropel TPE. Reprezentatywne wyniki metody porównano z wynikami barwienia immunofluorescencyjnego, co podkreśla użyteczność proponowanego podejścia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w ramach niniejszego badania z wykorzystaniem próbek ludzkich zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną NRC i wykonane zgodnie z polityką NRC dotyczącą osób uczestniczących w badaniach, która jest zgodna z obowiązującymi wytycznymi badawczymi oraz prawem prowincji Québec w Kanadzie.
1. Przygotowanie komórek
- Zamrożone ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) należy rozmrozić bezzwłocznie, umieszczając krioprobetkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 min.
- Krioprobetkę należy odwrócić dwukrotnie, aby delikatnie resuspendować komórki, a następnie za pomocą pipety 1 mL przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mL.
- Do probówki 15 mL zawierającej PBMCs należy dodać 10 mL uprzednio ogrzanej (37 °C) pożywki wzrostowej uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (RPMI-1640 + 10% FBS).
- Zawiesinę komórkową należy odwirować w wirówce z koszykiem wahadłowym w temperaturze pokojowej z prędkością 330 x g przez 10 min, stosując szybkie przyspieszanie oraz wysoki stopień hamowania.
- Po zakończeniu wirowania należy ostrożnie odlać nadsącz. Osad komórkowy należy resuspendować w 3 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o pH 7.2, zawierającej 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), delikatnie opukując ścianki probówek.
- Komórki należy wymieszać, odwracając probówkę z mocno zakręconą zakrętką.
- Należy przygotować dwie mikroprobówki o pojemności 1.5 mL i za pomocą pipety odnieść do każdej z nich po 1.5 mL zawiesiny komórkowej; jedna z nich posłuży do późniejszego barwienia immunofluorescencyjnego, a druga do ekstrakcji DNA.
2. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania
- Resuspendować komórki (z punktu 1.7) w 200 μL buforu PBS zawierającego 0,1% azotku sodu i 2% FBS, a następnie dostosować końcowe stężenie zawiesiny komórkowej do maksymalnie 2 x 107 komórek/mL.
- Podzielić zawiesinę komórkową, pipetując objętość 100 μL do dwóch oddzielnych mikroprobówek o pojemności 1,5 mL.
- Do jednej probówki dodać 20 μL przeciwciał anty-Hu CD3/CD4 sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i fykoerytryną (PE), a do drugiej probówki odpowiednio przeciwciał anty-Hu CD4/CD25 sprzężonych z FITC i PE (patrz Tabela materiałów).
- Do każdej probówki dodać 1 kroplę niebieskiego fluorescencyjnego barwnika do żywych komórek (patrz Tabela materiałów).
- Inkubować w temperaturze pokojowej przy użyciu rotatora do probówek przez 2 h. Chronić przed światłem.
- Wirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przy 330 x g przez 10 min z szybkim przyspieszeniem i wysokim hamowaniem.
- Odlać nadsącz i ostrożnie resuspendować osad komórkowy poprzez opukiwanie probówki. Dodać 1 mL PBS pH 7,2 zawierającego 2 mM EDTA. Upewniając się, że zakrętka jest szczelnie zamknięta, wymieszać komórki, odwracając probówkę 2 razy.
- Powtórzyć kroki 2.6 i 2.7 trzykrotnie.
- Resuspendować komórki w 20 μL PBS pH 7,2 zawierającego 2 mM EDTA.
- Nanieść pipetą 10 μL zawiesiny komórkowej na borokrzemowe szkiełko przedmiotowe i odczekać 2 min, aż komórki powoli osiądą na dnie kropli.
- Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na szkiełko przedmiotowe i umieścić je na stoliku mikroskopu odwróconego.
- Przechwycić obrazy komórek dla każdego z fluoroforów w obu próbkach zawiesiny komórkowej, używając obiektywu 10x oraz kamery EMCCD podłączonej do mikroskopu.
- Ręcznie policzyć komórki znakowane fluorescencyjnie (patrz Informacje uzupełniające w celu uzyskania danych surowych).
- Obliczyć stosunek liczby komórek znakowanych anty-Hu CD3 oraz anty-Hu CD4/CD25 do liczby komórek barwionych DAPI, aby uzyskać proporcje limfocytów T CD3+ oraz T-Regs CD4+ CD25+ w stosunku do całkowitej liczby leukocytów.
3. Ekstrakcja DNA i konwersja pirosulfitowa
- Ekstrakcja DNA
UWAGA: Wyizoluj DNA z PBMC przygotowanych w sekcji 1, korzystając z zestawu do magnetycznej puryfikacji DNA (patrz Tabela materiałów) zgodnie z procedurami podanymi przez producenta.- W probówce o pojemności 1,5 ml zawiesić komórki w 100 µL buforu PBS i dodać 20 µL proteinazy K i 400 µL buforu do lizy i wiązania. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Przyłap kompleks DNA-koraliki, umieszczając probówkę na statywie magnetycznym na 1–2 min, a następnie ostrożnie odessaj i usuń nadsącz.
- Wyjmij probówkę zawierającą kompleks DNA-perełki z racka magnetycznego i resuspenduj perełki w 600 µL buforu piorącego nr 1 w celu usunięcia niespecyficznych wiązań.
- Ponownie umieść probówkę na statywie magnetycznym, a następnie ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz.
- Powtórz kroki 3.1.3 i 3.1.4 z 600 µL buforu do płukania nr 2.
- Pozostawić probówkę otwartą do wyschnięcia przez 1 min.
- Wyjmij probówkę z racka magnetycznego i elue DNA, dodając 100 µL buforu elucyjnego i pipetowania kompleksu DNA/beads góra-dół 20 razy.
- Probtkę zawierającą eluat DNA należy ponownie umieścić na statywie magnetycznym i inkubować przez 1–2 min w celu oddzielenia kulek magnetycznych od eluatowanego DNA.
- Przenieś eluat z oczyszczonym DNA do nowej, czystej probówki.
- Oznacz stężenie oczyszczonej próbki DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
- Konwersja pirosiarczynowa
UWAGA: Konwersję pirosiarczynową należy przeprowadzić na oczyszczonym DNA przy użyciu zestawu do analizy metylacji (patrz Tabela materiałów) zgodnie z procedurami podanymi przez producenta.- Do 20 µL do próbki DNA (200–500 ng) w probówce do PCR dodać 130 µL odczynnika do konwersji. Dokładnie wymieszać i krótko odwirować.
- Przenieś probówkę PCR do termocyklera i przeprowadź protokół cykliczny zgodnie z poniższymi parametrami: 98 °C przez 8 min; 54 °C przez 60 min, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
- Dodaj 600 µL buforu wiążącego do kolumny do chromatografii jonowej (IC) umieszczonej w probówce zbiorczej.
- Przenieś próbkę DNA do kolumny IC zawierającej bufor wiążący i wymieszaj, kilkukrotnie odwracając probówkę. Wiruj przez 30 s z maksymalną prędkością. Odrzuć zebrany filtrat.
- Do kolumny należy teraz dodać 100 µL buforu płuczącego. Przeprowadzić wirowanie zgodnie z opisem w kroku 3.2.4 i odrzucić frakcję przepływową.
- Dodaj 200 µl buforu do desulfonacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15–20 min. Odwiruj i odlej frakcję przepływową zgodnie z opisem w powyższych krokach.
- Dodaj 200 µL Buforu Płuczącego do kolumny. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 s, a następnie odrzucić frakcję przepływową.
- Powtórz krok 3.2.7.
- Przenieś zawartość kolumny do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodaj 100 µL wody klasy PCR na membranę kolumny. Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 min, aby eluować DNA.
- Oznacz stężenie próbki DNA poddanego konwersji bisulfitowej, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
UWAGA: Należy przyjąć wartość 40 µg/mL dla absorbancji przy 260 nm = 1,0. - Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -70 °C do długoterminowego przechowywania.
4. Fabrykacja urządzenia do generowania kropel
UWAGA: Urządzenie mikrofluidyczne wykorzystane do generowania kropelek (plik CAD dostępny w Informacjach Uzupełniających) zostało wykonane w warunkach pomieszczenia czystego (klasa 1000) z elastomeru termoplastycznego (patrz Tabela Materiałów) przy użyciu metody tłoczenia na gorąco zgodnie z poniższym protokołem.
- Wytwarzanie formy z SU-8
- Przygotować formę z SU-8 na 6-calowym waflu krzemowym, stosując standardową fotolitografię zgodnie z poniższym opisem.
- Oczyścić 6-calowy wafelek krzemowy w plazmie tlenowej przy 500 W przez 10 s.
- Nanieść za pomocą spin-coatingu rezyst SU-8 na wafelek krzemowy przy 900 rpm przez 40 s, aby uzyskać całkowitą grubość filmu 100 µm.
- Umieścić wafelek na płycie grzejnej i przeprowadzić wstępne wypiekanie (pre-bake) przez 15 min w 65 °C, a następnie przez 2 h w 95 °C.
- Naświetlić światłem UV o długości fali 365 nm (linia i rtęci) przez wysokorozdzielczą fotomaskę transparentną, stosując dawkę naświetlania 1 000 mJ/cm2.
- Umieścić wafelek na płycie grzejnej i przeprowadzić wypiekanie wtórne (post-bake) przez 15 min w 65 °C, a następnie przez 40 min w 95 °C.
- Wywołać poprzez zanurzenie w octanie monometylu eteru glikolu propylenowego (PGMEA) na 5 min.
- Przepłukać PGMEA oraz izopropanolem i osuszyć strumieniem azotu.
- Umieścić wafelek na płycie grzejnej i przeprowadzić utwardzanie termiczne (hard-bake) przez 2 h w 135 °C.
- Przeprowadzić silanizację wafla w deskrykatorze próżniowym zawierającym kroplę środka silanizującego (trichloroperfluorooktylosilanu) umieszczonego na sąsiednim szkiełku przedmiotowym przez 2 h.
UWAGA: Zabieg ten ma na celu utworzenie monowarstwy silanów na powierzchni matrycy z SU-8. Trichloroperfluorooktylosilanem należy zawsze operować w dygestorium i przechowywać go z dala od źródeł wody.
- Replika z polidimetylosiloksanu (PDMS)
- Przygotować ciekłe prepolimery PDMS (patrz Tabela materiałów) w stosunku masowym 10:1 bazy elastomeru do czynnika sieciującego w plastikowym kubku.
- Umieścić kubek w planetarnym odśrodkowym mieszadle próżniowym w celu wymieszania i odpowietrzenia mieszaniny PDMS.
- Wylać mieszaninę PDMS na formę umieszczoną w specjalnym metalowym uchwycie zapobiegającym wyciekom żywicy i utwardzać w 65 °C przez 2 h.
- Za pomocą pęsety ostrożnie oddzielić formę z PDMS od matrycy z SU-8.
- Forma epoksydowa
UWAGA: Formę epoksydową wykonano z matrycy SU-8/krzem przy użyciu pośredniego procesu replikacji z PDMS.- Przygotować żywicę epoksydową (patrz Tabela materiałów), stosując stosunek masowy żywicy do utwardzacza 100/83.
- Odpowietrzyć mieszaninę pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej suszarce grąbowej przez 30 min.
- Wylać żywicę na replikę z PDMS i utwardzać w 80 °C przez 12 h.
- Zdjąć utwardzoną formę epoksydową z repliki z PDMS, umieścić na płycie grzejnej i przeprowadzić utwardzanie termiczne (hard-bake) przez 2 h w 120 °C.
- Urządzenie z TPE
- Wytłoczyć granulat TPE (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 165 °C w arkusze o grubości 2,0 mm i szerokości 7 cali o długości kilku metrów i przechowywać je w rolce do późniejszego użycia.
- Wyciąć z rolki arkusz TPE o wymiarach 7 cali kwadratowych za pomocą nożyczek.
- Umieścić arkusz TPE pomiędzy formą epoksydową a niesztukturowanym, silanizowanym waflkiem krzemowym (procedurę silanizacji wafla opisano w punkcie 4.1.10).
- Przeprowadzić tłoczenie na gorąco (hot-embossing) w temperaturze 125 °C, przy przyłożonej sile 10 kN i ciśnieniu 10–2 mbar przez 10 min.
- Ostrożnie wyjąć z formy w temperaturze pokojowej, używając natrysku z metanolu, aby oddzielić wytłoczony TPE od wafla krzemowego i formy epoksydowej.
- Wyciąć kolejny arkusz TPE o wymiarach 7 cali kwadratowych i umieścić go pomiędzy dwoma niesztukturowanymi, silanizowanymi waflkami krzemowymi.
- Przeprowadzić tłoczenie na gorąco w temperaturze 140 °C, przy przyłożonej sile 10 kN i ciśnieniu 10–2 mbar przez 10 min, aby utworzyć płaską powierzchnię do zamknięcia kanałów i uszczelnienia urządzenia.
- Ostrożnie wyjąć z formy w temperaturze pokojowej, używając natrysku z metanolu, aby oddzielić wytłoczony TPE od dwóch waflków krzemowych.
- Przyciąć każdy z wytłoczonych arkuszy TPE do rozmiaru urządzenia za pomocą noża do poziomowania (doctor blade).
- Wykonać otwory dostępowe dla kanałów wlotowych i wylotowych w ustrukturowanym urządzeniu, używając igły do biopsji o średnicy 1 mm z tłokiem.
- Zamknąć kanały, przykładając płaski element z TPE w bezpośredni kontakt z kanałami w temperaturze pokojowej.
- Opcjonalnie umieścić w piecu w 70 °C przez 2 h, aby wzmocnić wiązanie elementów urządzenia.
- Wyposażyć otwory dostępowe w jednorazowe rurki fluidyczne (średnica wewnętrzna 0,25 mm, zewnętrzna 0,8 mm). Uszczelnić połączenia za pomocą kleju epoksydowego, aby zapewnić szczelność podczas manipulacji.
5. Generowanie kropelek i PCR
UWAGA: Tabela 1 zawiera informacje na temat starterów forward i reverse oraz dwukrotnie wygaszonych sond hydrolitycznych dla genów C-LESS, CD3Z i Foxp3, które są wymagane do multipleksowej amplifikacji zdemetylowanych celów genowych.
- Przygotować master mix zgodnie z opisem w Tabeli 2.
- Odmrozić wszystkie składniki master mixu z wyjątkiem mieszaniny enzymów. Dokładnie wymieszać master mix poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie krótko odwirować.
- Do master mixu w probówce do PCR dodać odpowiednią objętość (1 μL) DNA przekonwertowanego metodą konwersji bisulfitowej (z sekcji 3.2). Wymieszać reakcję poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie krótko odwirować.
- Połączyć jednorazowe przewody płynowe (średnica wewnętrzna 0,25 mm, średnica zewnętrzna 1,6 mm) z dwiema precyzyjnymi strzykawkami szklanymi (objętość 250 μL) za pomocą złączy PEEK.
- Napełnić jedną precyzyjną strzykawkę szklaną 250 μL oleju nośnego zawierającego 5% fluorosurfaktantu.
- Napełnić drugą precyzyjną strzykawkę szklaną 50 µL oleju nośnego przed pobraniem 100 µL mieszaniny PCR, aby zapewnić dozowanie całej objętości próbki podczas emulgowania.
- Ustawić mikroprzepływowe urządzenie do generowania kropel na stoliku pionowego mikroskopu świetlnego wyposażonego w szybką kamerę, aby obserwować i rejestrować tworzenie się kropel w czasie rzeczywistym.
- Umieścić napełnione strzykawki w programowalnej pompie strzykawkowej i za pomocą złączy PEEK z adapterami (patrz Tabela materiałów) połączyć przewody strzykawek z przewodami odpowiednich kanałów wlotowych mikroprzepływowego urządzenia do generowania kropel.
- Umieścić przewód z wylotu generatora kropel wewnątrz probówki do PCR o pojemności 0,5 mL.
- Ustawić szybkość przepływu pompy strzykawkowej na 2 µL/min i odczekać do stabilizacji wielkości kropel przed zebraniem powstałej emulsji.
- Zebrać emulsję i przenieść 75 μL do probówki do PCR o pojemności 0,2 mL w celu przeprowadzenia cyklicznej termostatacji.
- Upewnić się, że zawartość oleju w probówce do PCR ściśle odpowiada objętości fazy rozproszonej, aby zapobiec koalescencji kropel podczas cyklicznej termostatacji.
- Umieścić probówkę do PCR o pojemności 0,2 mL w termocyklerze i przeprowadzić protokół cykliczny w następujący sposób: wstępne podgrzewanie w 95 °C przez 5 min, następnie 45 cykli denaturacji w 95 °C przez 15 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 30 s.
- Wykorzystać pozostałą emulsję do napełnienia kapilary borokrzemianowej (głębokość 100 μm) o profilu prostokątnym w celu obrazowania kropel i oceny ich średnicy.
- Umieścić rurkę borokrzemianową wypełnioną emulsją na szkiełku przedmiotowym. Użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę EMCCD i obiektyw 10x, aby zarejestrować obrazy kropel w polu jasnym.
- Zmierzyć średnicę kropel za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, zgodnie z poniższym opisem.
- Ustawić skalę znanej odległości w mikronach odpowiadającą liczbie pikseli na obrazie, wybierając przycisk „Analyze”, a następnie „Set Scale”.
- Konwertować obraz na skalę szarości, wybierając przycisk „Image”, a następnie „Type”. W razie potrzeby dostosować jasność i kontrast. Ustawić ręczny próg w celu wyznaczenia i wypełnienia okręgów, wybierając przycisk „Image”, a następnie „Adjust Threshold”.
- Przeanalizować cząstki, wybierając przycisk „Analyze particles” i ustawiając kołowość w zakresie 0,75 – 1.
- Odczytać wynikową powierzchnię i średnicę zmierzonych kropel, które są automatycznie wyświetlane w oprogramowaniu.
- Obliczyć średnią średnicę kropel i przyjmując, że kropla jest sferyczna, oszacować objętość partycji, która zostanie wykorzystana do obliczenia bezwzględnego stężenia celu.
- Upewnić się, że krople są monodyspersyjne poprzez analizę współczynnika zmienności (CV), który jest definiowany jako stosunek odchyleń standardowych do wartości średnich (k = 1), dla średnicy kropel (< 3%).
6. Obrazowanie fluorescencyjne i analiza obrazu
- Obrazowanie fluorescencyjne
- Po amplifikacji przenieść emulsję PCR do borokrzemowej kapilary (głębokość 50 μm) o przekroju prostokątnym, aby ułożyć krople w gęsto upakowanej monowarstwie do obrazowania.
- Przymocować wypełnione kapilary do szkiełka przedmiotowego i uszczelnić obie strony za pomocą akrylowego kleju UV. Nałożyć źródło światła UV na klej UV, uważając, aby nie naświetlać emulsji, co mogłoby doprowadzić do blaknięcia próbki.
- Umieścić szkiełko na mikroskopie odwróconym wyposażonym w kamerę EMCCD i obiektyw 10x.
- W oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego wybrać opcję Acquire | Live - Fast, aby rozpocząć akwizycję obrazu w czasie rzeczywistym, zaobserwować próbkę i upewnić się, że uchwycono pełną szerokość kapilary.
- Ustawić lampę pola jasnego do oświetlenia diaskopowego na 3,5 V.
- Ustawić szerokopasmową lampę fluorescencyjną LED do oświetlenia episkopowego na 20% intensywności.
- Ręcznie dostosować ustawienia akwizycji dla wszystkich długości fal (pole jasne, FAM, HEX i Cy5), wybierając polecenie Calibration | Optical Configurations w oprogramowaniu do obrazowania. Dla każdego fluoroforu należy ręcznie przełączyć odpowiednią kostkę filtrów fluorescencyjnych. Do obrazowania w polu jasnym należy użyć kostki filtrów w celu zachowania tej samej drogi optycznej.
- Przed akwizycją obrazu ręcznie dostosować czas ekspozycji dla każdego fluoroforu za pomocą polecenia Acquire | Camera Settings, zgodnie z podsumowaniem w tabeli 3. W menu „Capture Settings” oprogramowania ustawić tryb odczytu EM gain 17 MHz w 16 bitach z mnożnikiem wzmocnienia (gain multiplier) wynoszącym 100.
- W oknie LUT oprogramowania ustawić skalę LUT tak, aby sygnał transmisji mieścił się w wyznaczonym zakresie. W tym eksperymencie skala została ustawiona w przybliżeniu od 500 do 12 000.
- Zautomatyzować akwizycję za pomocą programu do akwizycji wielopunktowej, korzystając z opcji skanowania XY oraz wielu długości fal w tej konkretnej kolejności. Upewnić się, że stolik przesuwa się do pozycji początkowej, rejestruje wszystkie różne długości fal, a następnie przechodzi do następnej pozycji.
- Najpierw skonfigurować skanowanie XY, dostosowując profil skanowania XY w menu skanowania XY oprogramowania. W sekcji „Custom Multipoint Definition” wybrać duże pole definicji obrazu i ustawić je na około 40,0 x 1,0 mm (długość wypełnienia emulsji). Zastosować 1% zakładki (overlap).
- Włączyć opcję „Use Focus Surface” i ustawić krzywą powierzchni ostrości, regulując płaszczyznę ostrości w różnych punktach próbki za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu.
- Następnie skonfigurować skanowanie wielu długości fal, wybierając zakładkę skanowania. Dodać każdą z konfiguracji optycznych utworzonych w kroku 6.1.7 dla każdej długości fali.
- Kliknąć opcję zamykania aktywnej migawki podczas ruchu stolika i zmiany filtra, aby zapobiec blaknięciu próbki, a następnie uruchomić akwizycję, naciskając przycisk „Start Run”. Eksportować każdą klatkę akwizycji do plików tiff i podzielić każdy kanał na osobny plik, korzystając z opcji dzielenia wielu plików i stosując zapisane ustawienia LUT. Użyć opcji nazwy punktu i nazwy kanału, aby łatwo rozróżnić poszczególne pliki obrazów.
- Analiza obrazu
- Posortować wszystkie pozyskane obrazy według filtrów pola jasnego i fluorescencyjnych, a następnie przesłać je do otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazu.
- Użyć oprogramowania do analizy obrazu w celu stworzenia potoku (pipeline), aby zidentyfikować wszystkie krople na obrazach w polu jasnym, a następnie zmierzyć intensywność powiązanych z nimi kropli fluorescencyjnych.
- Aby stworzyć potok, przesłać obrazy tiff w polu jasnym i fluorescencyjne, a następnie dodać moduły „ColorToGray”, „IdentifyPrimaryObjects”, „MeasureObjectIntensity” oraz „ExportToSpreadsheet”. Użyć obrazów kropli w polu jasnym do identyfikacji obiektów, a następnie wykorzystać te obiekty jako maskę do pomiaru intensywności obrazów fluorescencyjnych.
- Uruchomić potok z wybranymi obrazami tiff, aby wyodrębnić średnią intensywność fluorescencji z obrazów kropli fluorescencyjnych. Przeprowadzić eksperyment w trzech powtórzeniach, przy czym każdy zestaw powinien składać się z ok. 5 000 kropli do analizy.
- Zastosować algorytm „definetherain” (http://definetherain.org.uk/), aby zidentyfikować klastry kropli pozytywnych i negatywnych. Obiekty pozytywne powinny mieścić się w granicach 3 odchyleń standardowych od średniej. Pozwala to wyznaczyć próg intensywności kropli pozytywnych, który zostanie użyty do zliczania.
- Ponownie użyć oprogramowania do analizy obrazu, aby wdrożyć nowy potok, w którym próg fluorescencji dla każdego genu docelowego jest ustawiony zgodnie z definicją z poprzedniego kroku.
- Przesłać obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne do potoku. Dodać moduły „ColorToGray”, „RescaleIntensity”, „Threshold”, „IdentifyPrimaryObjects”, „MeasureObjectSizeShape”, „FilterObjects” oraz „ExportToSpreadsheet”. Utworzyć oddzielne moduły dla obrazów w polu jasnym oraz dla każdego filtra fluorescencyjnego dla kropli.
- Przeskalować intensywność obrazu w zakresie od 0 do 1 dla każdej grupy obrazów fluorescencyjnych. Następnie ustawić próg, aby zidentyfikować i policzyć obiekty powyżej ustalonego progu. Jeśli to konieczne, dodać moduł „ExpandOrShrinkObjects”, aby zmniejszyć obiekty i ułatwić zliczanie oraz identyfikację kropli w polu jasnym.
- Identyfikować wyłącznie obiekty o rozmiarze w zakresie 20–30 pikseli i odfiltrować zliczone obiekty, aby zachować tylko te o konkretnej średnicy (tj. krople o średnicy w zakresie 75 µm) i okrągłej ekscentryczności sferycznej wynoszącej 0,5 lub mniej.
- Eksportować wyniki do tabeli zawierającej całkowitą liczbę kropli z obrazów w polu jasnym, a także liczbę kropli dla wszystkich użytych kanałów fluorescencyjnych: Cy5 dla genu C-LESS, HEX dla zmetylowanego genu CD3Z oraz FAM dla zmetylowanego genu FOXP3 (patrz Informacje uzupełniające w celu uzyskania surowych danych eksperymentalnych otrzymanych dla przedstawionego testu mdPCR).
- Obliczyć stosunek kropli negatywnych dla każdego genu docelowego i zastosować rozkład Poissona, aby uzyskać odpowiednią liczbę kopii na kroplę (CPD), korzystając z równania 1:
gdzie x reprezentuje liczbę kropli zawierających 0, 1, 2 lub więcej cząsteczek, a λ reprezentuje wartość CPD. - Obliczyć bezwzględne stężenie celu, wyznaczając stosunek wartości CPD do objętości kropli uzyskanej w kroku 5.20 za pomocą równania 2:
gdzie wartość (1-p) reprezentuje frakcję kropli negatywnych. - Obliczyć procent limfocytów T CD3+ oraz limfocytów T-Reg CD4+ CD25+, dzieląc odpowiednie wartości CPD zmetylowanych genów CD3Z i FOXP3 przez wartość CPD genu C-LESS – lub całkowitą liczbę komórek (patrz Informacje uzupełniające w celu uzyskania obliczeń CPD z surowych danych).
- Porównać te wartości procentowe z wartościami uzyskanymi z obrazowania immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciał do zliczania limfocytów T CD3+ oraz limfocytów T-Reg CD4+ CD25+.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Urządzenie mikrofluidyczne do generowania kropel oparte na TPE zostało wykonane zgodnie z opisanym protokołem, jak pokazano na Rysunku 1. W procesie fotolitografii zastosowano maskę przezroczystą w celu otrzymania formy matki z krzemu (Si). Przeprowadzono litografię miękką, aby uzyskać odwróconą replikę formy matki Si z PDMS, która posłużyła następnie do wykonania formy z epoksydu. Prekursor epoksydowy wylano na PDMS i utwardzono w celu sieciowania i stwardnienia. Forma ta, będąca dokładną r...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony protokół i metody eksperymentalne pozwalają na przeprowadzenie mdPCR we własnym zakresie przy użyciu wyprodukowanego generatora kropel TPE, termocyklera i mikroskopu fluorescencyjnego. Wyprodukowane urządzenie wykorzystujące miękkie połączenie TPE z TPE zapewnia hydrofobowe właściwości powierzchni, które są jednolite na wszystkich ściankach kanału, dzięki czemu końcowe urządzenie nie wymaga żadnej obróbki powierzchni w celu późniejszego wykorzystania jako generator kropel. Materiał ten jest rutynowo stosowa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma żadnych konfliktów do zgłoszenia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Rady ds. Badań Naukowych Kanady.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | probówka | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfaktant | Fluoro-środek powierzchniowo czynny | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, Wielka Brytania | Kamera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Używany do analizy | ||
| Nikon, Japonia | 10x obiektyw | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Kanada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 i 5010 Rurka | kapilarna borokrzemianowa | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japonia | LC-L1V5 | DEL Źródło | |
| UV Dolomit | 3200063 | Jednorazowe rurki | |
| Dolomit | 3200302 | Jednorazowe rurki | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Pionowy mikroskop | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schä rding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Szwajcaria | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Niemcy | |||
| Obraz J | Służy do oceny średnicy | ||
| kropli Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Świetlówka LED o szerokim spektrum | ||
| må l, Szwecja | Elastomer termoplastyczny (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japonia | Używany do akwizycji | ||
| 3M, St Paul, MN | Olej | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Barwienie żywymi komórkami fluorescencyjnymi na niebiesko (DAPI) | |
| IDEX Zdrowie & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | Złączki | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Niemcy | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | odwrócony | ||
| Nikon, Japonia | |||
| Loctite | Zobacz materiał AA 352 |
Bibliografia
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
