Artykuł metodologiczny

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61421

⸱

29 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Life Sciences Division, National Research Council of Canada, 2Galenvs Sciences, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Streszczenie

opisano przebieg procesu PCR z multipleksem kropelkowym (mdPCR) i szczegółowy protokół do określania liczby rozmazów białych krwinek (WBC) na bazie epigenetycznej, wraz z urządzeniem do generowania kropel mikroprzepływowych z elastomeru termoplastycznego (TPE). Markery epigenetyczne są wykorzystywane do podtypowania WBC, co ma ważną wartość prognostyczną, w różnych chorobach. Osiąga się to poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA określonych regionów genomu bogatych w CG (loci CpG). W tym artykule DNA potraktowane wodorosiarczynem z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) jest zamknięte w kropelkach z odczynnikami mdPCR, w tym starterami i sondami fluorescencyjnymi do hydrolizy specyficznymi dla loci CpG, które korelują z subpopulacjami WBC. Podejście multipleksowe pozwala na badanie wielu loci CpG bez konieczności oddzielnych reakcji mdPCR, umożliwiając dokładniejsze parametryczne określenie subpopulacji WBC za pomocą analizy epigenetycznej miejsc metylacji. Ta precyzyjna kwantyfikacja może być rozszerzona na różne zastosowania i podkreśla korzyści dla diagnozy klinicznej i późniejszego rokowania.

Wprowadzenie

Analiza składu białych krwinek (WBC) jest jednym z najczęściej wymaganych badań laboratoryjnych w diagnostyce hematologicznej. Różnicowa liczba leukocytów służy jako wskaźnik dla spektrum chorób, w tym infekcji, stanów zapalnych, niedokrwistości i białaczki, i jest badana jako wczesny biomarker prognostyczny dla kilku innych schorzeń. Złoty standard w podtypowaniu WBC obejmuje barwienie immunologiczne i/lub cytometrię przepływową, które wymagają kosztownych, podatnych na niestabilność przeciwciał fluorescencyjnych i często w dużym stopniu zależą od biegłości operatora w przygotowywaniu próbek. Ponadto metoda ta ma zastosowanie wyłącznie do świeżych próbek krwi, tak aby próbki nie mogły zostać zamrożone w celu wysyłki lub późniejszej analizy.

Markery epigenetyczne pojawiły się ostatnio jako potężne narzędzia analityczne do badania zmienności fenotypowej. Następnie wykazano, że ludzkie populacje leukocytów mają wzorce metylacji DNA linii komórkowej, które pozwalają na precyzyjną charakterystykę podzbiorów WBC. Podtypowanie oparte na markerach epigenetycznych stanowi obiecującą alternatywę, która nie zależy od pobrania próbki świeżej krwi ani drogich przeciwciał i może być wykorzystana jako biomarker początku choroby i podatności1,2,3,4,5.

Przeprowadzono badania całego genomu w celu obszernego mapowania metylowanych, specyficznych regionów bogatych w CG w genomie (wyspy CpG) w podtypach leukocytów w celu zidentyfikowania potencjalnych markerów epigenetycznych specyficznych dla podtypów leukocytów. Z tego powodu protokoły PCR zostały opracowane dla metylowanych regionów genów, np. CD3Z i FOXP3, odpowiadających odpowiednio limfocytom T CD3 + i limfocytom T regulatorowym CD4 + CD25 + (T-Regs). Wiencke i wsp. wykazali użyteczność dupleksowej kropelkowej reakcji PCR do epigenetycznego podtypowania limfocytów T, uzyskując wyniki, które silnie korelują z analizą sortowania komórek aktywowanych przepływem (FACS)6. Ta ilościowa metoda analizy genetycznej opiera się na podziale matrycowych cząsteczek kwasu nukleinowego i odczynników PCR na tysiące dyskretnych, zdefiniowanych objętościowo kropelek o rozmiarach poniżej nanolitrów, zawierających zero, jedną lub więcej docelowych kopii kwasów nukleinowych, przy użyciu emulsji typu woda w oleju umożliwianej przez mikrofluidykę7,8. Amplifikację PCR przeprowadza się w każdej pojedynczej kropli i mierzy się intensywność fluorescencji w punkcie końcowym każdej kropli, co pozwala na bezwzględne określenie ilościowe celów obecnych w próbce. Stwierdzono, że PCR kropelkowy jest bardziej precyzyjny, dokładny i technicznie prostszy niż standardowy qPCR, co czyni go bardziej korzystną metodą opartą na metylacji DNA do klinicznej oceny limfocytów T. Chociaż szybko rozwijająca się metodologia podtypowania, brakuje multipleksowanej analizy epigenetycznej do jednoczesnego sondowania różnych metylowanych regionów CpG. Jest to konieczne do rutynowego zliczania leukocytów.

Tutaj, przedstawiono i zastosowano urządzenie mikroprzepływowe z termoplastycznym elastomerem (TPE) do specyficznego dla metylacji multipleksowego kropelkowego PCR (mdPCR). Technologia ta została wykorzystana do wyznaczenia określonych podtypów leukocytów, limfocytów T CD3 + i T-Regów CD4 + CD25 +, w oparciu o wzorce metylacji DNA linii komórkowej, tj. zmienność epigenetyczną regionów CpG CD3Z i FOXP3. Szczegółowy protokół ekstrakcji DNA, konwersji wodorosiarczynów i mdPCR jest opisany w połączeniu z metodą wytwarzania urządzenia do generowania kropel TPE. Reprezentatywne wyniki metody porównano z wynikami barwienia immunofluorescencyjnego, co podkreśla użyteczność proponowanego podejścia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w ramach niniejszego badania z wykorzystaniem próbek pochodzenia ludzkiego zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną NRC i wykonane zgodnie z zasadami NRC dotyczącymi udziału ludzi w badaniach, które są zgodne z obowiązującymi wytycznymi badawczymi oraz prawem prowincji Québec w Kanadzie.

1. Przygotowanie komórek

  1. Natychmiast rozmrozić zamrożone ludzkie monocyty i limfocyty z krwi obwodowej (PBMCs), umieszczając krioprobetkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 5 min.
  2. Dwa razy odwrócić krioprobetkę, aby delikatnie resuspendować komórki, a następnie za pomocą pipety 1 mL przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 mL.
  3. Do probówki 15 mL zawierającej PBMCs dodać 10 mL uprzednio ogrzanej (37 °C) pożywki wzrostowej uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (RPMI-1640 + 10% FBS).
  4. Odwirować zawiesinę komórkową w wirówce z koszem wahadłowym w temperaturze pokojowej z prędkością 330 x g przez 10 min, stosując szybką akcelerację i wysoki stopień hamowania.
  5. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zlać supernatant. Osad komórkowy resuspendować w 3 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) pH 7.2, zawierającej 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), delikatnie opukując ściankę probówki.
  6. Wymieszać komórki, odwracając probówkę z mocno dokręconą zakrętką.
  7. Przygotować dwie mikroprobówki 1.5 mL i za pomocą pipety nanieść do każdej z nich po 1.5 mL zawiesiny komórkowej; jedną z nich wykorzystać do późniejszego barwienia immunofluorescencyjnego, a drugą do ekstrakcji DNA.

2. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania

  1. Resuspendować komórki (z punktu 1.7) w 200 μL buforu PBS zawierającego 0,1% azotku sodu i 2% FBS, a następnie dostosować końcowe stężenie zawiesiny komórkowej do maksymalnie 2 x 107 komórek/ml
  2. Rozdziel zawiesinę komórkową poprzez pipetowanie 100 μL objętość do dwóch oddzielnych probówek mikrocentryfugowych o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodaj 20 μL objętość przeciwciała anty-Hu CD3/CD4 sprzężonego z fluoresceiną izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) oraz fikoerytrynę (PE) do jednej probówki oraz przeciwciała anty-Hu CD4/CD25 sprzężone z FITC i PE (patrz Tabela materiałów) do drugiej probówki, odpowiednio.
  4. Dodaj 1 kroplę niebieskiego fluorescencyjnego barwnika do żywych komórek (patrz Tabela materiałów) do każdej probówki.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przy użyciu rotatora do probówek przez 2 h. Chronić przed światłem.
  6. Wirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przy 330 x g przez 10 min, stosując szybkie przyspieszanie i wysoki stopień hamowania.
  7. Zlej nadpływ i ostrożnie resuspenduj osad komórkowy, stukując probówkę. Dodaj 1 ml PBS o pH 7,2 zawierającego 2 mM EDTA. Upewniając się, że nakrętka jest szczelnie zamknięta, wymieszaj komórki, dwukrotnie odwracając probówkę.
  8. Powtórz kroki 2.6 i 2.7 trzykrotnie.
  9. Resuspendować komórki w 20 μL buforu PBS o pH 7,2 zawierającego 2 mM EDTA.
  10. Pipeta 10 μL nanieść kroplę zawiesiny komórkowej na borokrzemienne szkiełko mikroskopowe i odczekać 2 min, aż komórki powoli osiądą na dnie kropli.
  11. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywką na preparacie, a następnie umieść preparat na stole mikroskopu odwróconego.
  12. Należy zarejestrować obrazy komórek dla każdego z fluoroforów w obu próbkach zawiesiny komórkowej, wykorzystując obiektyw 10x oraz kamerę EMCCD podłączoną do mikroskopu.
  13. Ręcznie policz komórki znakowane fluorescencyjnie (patrz Informacje uzupełniające dla danych surowych).
  14. Oblicz stosunek liczby komórek znakowanych przeciwciałami anty-Hu CD3 oraz anty-Hu CD4/CD25 do liczby komórek barwionych DAPI, aby uzyskać proporcje CD3+ Limfocyty T i CD4+ CD25+ Stosunek limfocytów T regulatorowych do całkowitej liczby leukocytów.

3. Ekstrakcja DNA i konwersja pirosiarczynowa

  1. Ekstrakcja DNA
    UWAGA: Wyizoluj DNA z PBMC przygotowanych w sekcji 1, używając zestawu do magnetycznej puryfikacji DNA (patrz Tabela materiałów) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez producenta.
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml zawiesić komórki w 100 µL buforu PBS i dodać 20 µL proteinazy K i 400 µL buforu do lizy/wiązania. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    2. Uchwycić kompleks DNA-kuleczki, umieszczając probówkę na statywie magnetycznym przez 1-2 min, a następnie ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz.
    3. Wyjmij probówkę zawierającą kompleks DNA-perełki z racka magnetycznego i resuspenduj perełki w 600 µL buforu do płukania nr 1 w celu usunięcia niespecyficznych wiązań.
    4. Ponownie umieść probówkę na statywie magnetycznym, a następnie ostrożnie odessaj i odrzuć nadsącz.
    5. Powtórz kroki 3.1.3 i 3.1.4 z 600 µL buforu do przemywania nr 2.
    6. Pozostaw probówkę otwartą do wyschnięcia przez 1 min.
    7. Wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego i eluej DNA, dozując 100 µL buforu elucyjnego, a następnie pipetowanie kompleksu DNA/beads w górę i w dół 20 razy.
    8. Ponownie umieść probówkę z eluowanym DNA na statywie magnetycznym i inkubuj przez 1–2 min, aby oddzielić kuleczki magnetyczne od eluowanego DNA.
    9. Przenieś eluat oczyszczonego DNA do nowej, czystej probówki.
    10. Oceń stężenie oczyszczonej próbki DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
  2. Konwersja pirosiarczynowa
    UWAGA: Przekształcenie pirosiarczynowe należy przeprowadzić na oczyszczonym DNA przy użyciu zestawu do analizy metylacji (patrz Tabela materiałów) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez producenta.
    1. To 20 µL do próbki DNA (200-500 ng) w probówce do PCR dodać 130 µL odczynnika do konwersji. Dobrze wymieszać i krótko wirować.
    2. Przenieś probówkę PCR do termocyklera i przeprowadź protokół cykliczny zgodnie z poniższymi ustawieniami: 98 °C przez 8 min; 54 °C przez 60 min, utrzymując temperaturę 4 °C.
    3. Dodaj 600 µL buforu wiążącego do kolumny do chromatografii jonowej (IC) umieszczonej w probówce zbiorczej.
    4. Należy dodać próbkę DNA do kolumny IC zawierającej bufor wiążący i wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę. Wirować przez 30 s przy maksymalnej prędkości. Zebrać i odrzucić filtrat.
    5. Do kolumny należy teraz dodać 100 µL buforu do płukania. Przeprowadzić wirowanie zgodnie z opisem w kroku 3.2.4 i odrzucić ciecz przepuszczoną.
    6. Dodaj 200 µl buforu do desulfonacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15–20 min. Odwiruj i odrzuć frakcję przepływową zgodnie z opisem w powyższych krokach.
    7. Dodaj 200 µL buforu do płukania (Wash Buffer) do kolumny. Wiruj z maksymalną prędkością przez 30 s i odrzuć przelew.
    8. Powtórz krok 3.2.7.
    9. Przenieś kolumnę do nowej probówki do zbierania o pojemności 1,5 ml i dodaj 100 µL wody jakości PCR na membranę kolumny. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 min, aby wyeluować DNA.
    10. Oceń stężenie próbki DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Należy przyjąć wartość 40 µg/mL dla absorbancji przy 260 nm = 1,0.
    11. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -70 °C do długotrwałego przechowywania.

4. Wykonanie urządzenia do generowania kropel

UWAGA: Urządzenie mikroprzepływowe użyte do generowania kropel (plik CAD dostępny w Informacjach Uzupełniających) zostało wykonane w środowisku czystym (klasa 1 000) z elastomeru termoplastycznego (patrz Tabela Materiałów) metodą tłoczenia na gorąco zgodnie z poniższym protokołem.

  1. Wytwarzanie formy z SU-8
    1. Przygotowanie formy z SU-8 na 6″ podłoże krzemowe z wykorzystaniem standardowej fotolitografii zgodnie z opisem poniżej.
    2. Oczyścić 6-calowy podłoże krzemowe za pomocą plazmy tlenowej przy mocy 500 W przez 10 s.
    3. Nanieść poprzez spin-coating resist SU-8 na wafelek krzemowy przy 900 obr./min przez 40 s, aby uzyskać całkowitą grubość filmu wynoszącą 100 µm.
    4. Umieść wafelek na płycie grzewczej i poddaj wstępnemu wypalaniu przez 15 min w temperaturze 65 °C, a następnie 2 h w temperaturze 95 °C.
    5. Naświetlać światłem UV o długości fali 365 nm (linia i rtęci) przez wysokorozdzielczą fotomaskę na przezroczystej folii, stosując dawkę naświetlania 1 000 mJ/cm²2.
    6. Umieść wafelek na płycie grzewczej i poddaj wygrzewaniu końcowemu (post-bake) przez 15 min w temperaturze 65 °C, a następnie 40 min w temperaturze 95 °C.
    7. Wywołać poprzez zanurzenie w octanie monometylopropilenoglikolu (PGMEA) na 5 min.
    8. Przepłukać PGMEA i izopropanolem, a następnie osuszyć strumieniem azotu.
    9. Umieść wafelek na płycie grzejnej i poddaj procesowi wygrzewania (hard-bake) przez 2 h w temperaturze 135 °C.
    10. Zasylanizuj wafer w desykatorze próżniowym zawierającym kroplę czynnika sylanizującego (trichloroperfluorooktylu silan) umieszczony na sąsiednim szkiełku przedmiotowym przez 2 h.
      UWAGA: Czynność tę wykonuje się w celu utworzenia monowarstwy silanów na powierzchni matrycy SU-8. Trichloro-perfluorooctylosilany należy zawsze obsługiwać w dygestorium i przechowywać z dala od źródeł wody.
  2. Replika z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. Przygotuj ciekłe prepolimery PDMS (patrz Tabela materiałów) w stosunku masowym 10:1 (baza elastomeru do utwardzacza) w plastikowym kubku.
    2. Umieść kubek w planetarnym mieszalniku próżniowym z odśrodkowaniem w celu wymieszania i odgazowania mieszaniny PDMS.
    3. Wlej mieszaninę PDMS do formy umieszczonej w specjalnym metalowym uchwycie zapobiegającym wyciekowi żywicy i utwardź w temperaturze 65 °C przez 2 h.
    4. Za pomocą pęsety ostrożnie odkleić formę z PDMS od matrycy SU-8.
  3. Forma epoksydowa
    UWAGA: Formę epoksydową wykonano z matrycy SU-8/krzem za pomocą pośredniego procesu replikacji z użyciem PDMS.
    1. Przygotuj żywicę epoksydową (patrz Tabela materiałów) stosując stosunek wagowy żywicy do utwardzacza 100/83.
    2. Odgazuj mieszaninę pod zmniejszonym ciśnieniem w suszarce próżniowej przez 30 min.
    3. Wylać żywicę na kopię z PDMS i utwardzić w temperaturze 80 °C przez 12 h.
    4. Usunąć utwardzoną formę epoksydową z repliki PDMS, umieścić ją na płycie grzewczej i poddać wygrzewaniu (hard-bake) przez 2 h w temperaturze 120 °C.
  4. urządzenie TPE
    1. Wytłocz granulat TPE (patrz Tabela materiałów) w 165 °C w arkuszach o grubości 2,0 mm i szerokości 7 cali oraz długości kilku metrów, a następnie przechowywać je w formie rolki do późniejszego użycia.
    2. Wytnij z rolki arkusz TPE o wymiarach 7 x 7 cali za pomocą nożyczek.
    3. Umieść arkusz TPE pomiędzy formą epoksydową a nieperiodyzowanym, silanizowanym waflem krzemowym (procedurę silanizacji wafla przedstawiono w kroku 4.1.10).
    4. Przeprowadź tłoczenie na gorąco w temperaturze 125 °C, przyłożoną siłę 10 kN oraz ciśnienie 10–2 mbar przez 10 min.
    5. Ostrożnie wyjmij formę w temperaturze pokojowej, używając natrysku z metanolu, aby oddzielić wytłoczony TPE od wafla krzemowego oraz formy epoksydowej.
    6. Wytnij kolejny arkusz TPE o wymiarach 7” x 7” i umieść go pomiędzy dwoma niepatternowanymi, silanizowanymi płytkami krzemowymi.
    7. Przeprowadzić tłoczenie na gorąco w temperaturze 140 °C, przyłożoną siłę 10 kN oraz ciśnienie 10–2 mbar przez 10 min w celu utworzenia płaskiej powierzchni do zamknięcia kanałów i uszczelnienia urządzenia.
    8. Ostrożnie wyjmij formę w temperaturze pokojowej, używając natrysku z metanolu, aby oddzielić wytłoczony TPE od dwóch wafli krzemowych.
    9. Każdy z tłoczonych arkuszy TPE należy dociąć do rozmiaru urządzenia za pomocą raklą.
    10. Wykonaj otwory dostępowe dla kanałów wlotowego i wylotowego w ustrukturyzowanym urządzeniu, używając 1 mm igły do biopsji z tłokiem.
    11. Zamknij kanały, umieszczając płaski element z TPE w bezpośrednim kontakcie z kanałami w temperaturze pokojowej.
    12. Opcjonalnie umieścić w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 2 h w celu promowania wiązania urządzenia.
    13. W otworach dostępowych należy zamocować jednorazowe rurki do cieczy (śr. wewn. 0,25 mm, śr. zewn. 0,8 mm). Połączenia należy uszczelnić klejem epoksydowym, aby zapewnić szczelność podczas manipulacji.

5. Generowanie kropel i PCR

UWAGA: Tabela 1 zawiera informacje na temat starterów prawych i lewych oraz podwójnie gaszonych sond hydrolitycznych dla genów C-LESS, CD3Z i Foxp3, które są niezbędne do multipleksowej amplifikacji zdemetylowanych celów genowych.

  1. Przygotować master mix zgodnie z opisem w Tabeli 2.
  2. Rozmrozić wszystkie składniki master mixu z wyjątkiem mieszaniny enzymów. Dokładnie wymieszać master mix poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie krótko odwirować.
  3. Dodać odpowiednią objętość (1 μL) DNA konwertowanego bisulfitowo (z sekcji 3.2) do master mixu w probówce PCR. Wymieszać reakcję poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie krótko odwirować.
  4. Podłączyć jednorazowe przewody płynowe (średnica wewnętrzna 0,25 mm, średnica zewnętrzna 1,6 mm) do dwóch precyzyjnych strzykawek szklanych (objętość 250 μL) za pomocą złącz PEEK.
  5. Napełnić jedną precyzyjną strzykawkę szklaną 250 μL oleju nośnego zawierającego 5% surfaktantu fluorowego.
  6. Napełnić drugą precyzyjną strzykawkę szklaną 50 µL oleju nośnego przed pobraniem 100 µL mieszaniny PCR, aby zapewnić dozowanie całej objętości próbki podczas emulgowania.
  7. Ustawić urządzenie mikrofluidyczne do generowania kropel na stole mikroskopu świetlnego w orientacji pionowej, wyposażonego w szybką kamerę, w celu obserwacji i rejestracji tworzenia się kropel w czasie rzeczywistym.
  8. Umieścić napełnione strzykawki w programowalnej pompie strzykawkowej i za pomocą złącza PEEK z odpowiednimi końcówkami (patrz Tabela Materiałów) połączyć przewody strzykawek z przewodami odpowiednich kanałów wlotowych urządzenia mikrofluidycznego.
  9. Umieścić przewód z wylotu generatora kropel wewnątrz probówki PCR o pojemności 0,5 mL.
  10. Ustawić szybkość przepływu pompy strzykawkowej na 2 µL/min i odczekać do ustabilizowania się rozmiaru kropel przed pobraniem powstałej emulsji.
  11. zebrać emulsję i przenieść 75 μL do probówki PCR o pojemności 0,2 mL w celu przeprowadzenia cyklicznej termostatyzacji.
  12. Upewnić się, że zawartość oleju w probówce PCR ściśle odpowiada objętości fazy rozproszonej, aby zapobiec koalescencji kropel podczas cykli termicznych.
  13. Umieścić probówkę PCR 0,2 mL w termocyklerze i przeprowadzić protokół cykliczny w następujący sposób: wstępne ogrzewanie w 95 °C przez 5 min, następnie 45 cykli denaturacji w 95 °C przez 15 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 30 s.
  14. Wykorzystać pozostałą emulsję do napełnienia borokrzemowej kapilary (głębokość 100 μm) o profilu prostokątnym w celu obrazowania kropel i oceny ich średnicy.
  15. Umieścić borokrzemową kapilarę wypełnioną emulsją na szkiełku przedmiotowym. Użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę EMCCD i obiektyw 10x, aby zarejestrować obrazy kropel w świetle przechodzącym.
  16. Zmierzyć średnicę kropel przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu zgodnie z poniższym opisem.
  17. Ustawić skalę znanej odległości w mikronach odpowiadającą liczbie pikseli na obrazie, wybierając przycisk „Analyze”, a następnie „Set Scale”.
  18. Przekształcić obraz na skalę szarości, wybierając przycisk „Image”, a następnie „Type”. W razie potrzeby dostosować jasność i kontrast. Ustawić ręczny próg w celu wyznaczenia i wypełnienia okręgów, wybierając przycisk „Image”, a następnie „Adjust Threshold”.
  19. Przeanalizować cząstki, wybierając przycisk „Analyze particles” i ustawiając kołowość w zakresie 0,75 – 1.
  20. Odczytać wynikową powierzchnię oraz średnicę zmierzonych kropel, które są automatycznie wyświetlane w oprogramowaniu.
  21. Obliczyć średnią średnicę kropel i przyjmując kształt sferyczny, oszacować objętość pojedynczej kropli, która zostanie wykorzystana do obliczenia bezwzględnego stężenia celu.
  22. Upewnić się, że krople są monodyspersyjne, analizując współczynnik zmienności (CV), definiowany jako stosunek odchylenia standardowego do wartości średniej (k = 1), dla średnicy kropel (< 3%).

6. Obrazowanie fluorescencyjne i analiza obrazu

  1. Obrazowanie fluorescencyjne
    1. Po amplifikacji przenieś emulsję PCR do kapilary borokrzemianowej (50 μm głębokość) z prostokątnym profilem w celu ułożenia kropli w ciasno upakowanej monowarstwie do obrazowania.
    2. Utrwalić wypełnione kapilary na szkiełku przedmiotowym i zabezpieczyć obie strony za pomocą Akrylowy klej UV. Nałóż źródło światła UV na klej UV, uważając, aby nie naświetlać emulsji, aby uniknąć odbarwienia próbki.
    3. Umieść szkiełko przedmiotowe na mikroskopie odwróconym wyposażonym w kamerę EMCCD oraz obiektyw 10x.
    4. Za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopowego wybrać Pozyskiwanie | Na żywo - Szybko Aby rozpocząć akwizycję obrazu z kamery w czasie rzeczywistym, należy zaobserwować próbkę i upewnić się, że w polu widzenia znajduje się cała szerokość kapilary.
    5. Ustaw lampę pola jasnego dla oświetlenia diaskopowego na 3,5 V.
    6. Ustaw szerokopasmową lampę fluorescencyjną LED do oświetlenia episkopowego na 20% intensywności.
    7. Ręcznie dostosuj ustawienia akwizycji dla wszystkich długości fal (Bright field, FAM, HEX i Cy5), wybierając Kalibracja | Konfiguracje optyczne polecenie w oprogramowaniu do obrazowania. Dla każdego fluoroforu odpowiadająca mu fluorescencja Kostrka filtra musi zostać przełączona ręcznie. Należy użyć kostki filtra dla obrazowania w jasnym polu, aby zachować tę samą drogę optyczną.
    8. Ręcznie dostosuj czas ekspozycji przed akwizycją obrazu, używając Pozyskiwanie danych | Ustawienia kamery polecenie dla każdego fluoroforu, zgodnie z podsumowaniem w Tabela 3Ustaw tryb odczytu EM gain na 17 MHz przy 16 bitach z mnożnikiem wzmocnienia wynoszącym 100 w „Ustawienia obrazowaniamenu oprogramowania.
    9. W oknie LUT oprogramowania ustaw skalę LUT w taki sposób, aby sygnał transmisji mieścił się w wyznaczonym zakresie. W tym doświadczeniu skalę ustawiono w przybliżeniu od 500 do 12 000.
    10. Zautomatyzuj akwizycję, korzystając z programu akwizycji wielopunktowej z opcjami skanowania XY oraz wielu długości fal, w takiej kolejności. Upewnij się, że stolik przesuwa się do pozycji początkowej ustawić pozycję, zarejestrować wszystkie różne długości fal, a następnie przejść do następnej pozycji.
    11. Najpierw należy skonfigurować skanowanie XY, dostosowując profil skanowania XY w menu skanowania XY w oprogramowaniu. W sekcji „Niestandardowa definicja wielu punktówwybrać pole definicji dużego obrazu i ustawić je na około 40,0 x 1,0 mm (długość wypełnienia emulsji). Zastosować 1% nakładki.
    12. Włącz funkcję ‘Użyj powierzchni ostrzeniaopcji i skonfiguruj krzywą powierzchni ostrości, regulując płaszczyznę ostrości w różnych punktach próbki za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu.
    13. Po drugie, skonfiguruj skanowanie wielodługościowe, wybierając zakładkę scan. Dodaj każdą z konfiguracji optycznych utworzonych w kroku 6.1.7 dla każdej długości fali.
    14. Wybierz opcję zamknięcia aktywnej migawki podczas przemieszczania stolika oraz podczas zmiany filtra, aby uniknąć blaknięcia próbki, a następnie uruchom akwizycję, naciskając przycisk „Rozpocznij uruchomienieprzycisk. Eksportuj każdą klatkę akwizycji do plików TIFF i rozdziel każdy kanał do osobnego pliku, korzystając z opcji „split multiple files” oraz stosując zapisane ustawienia LUT. Użyj opcji „point name and channel name”, aby łatwo odróżnić poszczególne pliki obrazów.
  2. Analiza obrazu
    1. Posortuj wszystkie pozyskane obrazy według filtrów światła przechodzącego (brightfield) i fluorescencyjnych, aby przesłać je do otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Należy użyć oprogramowania do analizy obrazu w celu stworzenia potoku przetwarzania, który umożliwi identyfikację wszystkich kropel na obrazach w jasnym polu, a następnie pomiar intensywności powiązanych z nimi kropel fluorescencyjnych.
    3. Do potoku przetwarzania danych prześlij obrazy TIFF w jasnym polu i fluorescencyjne, a następnie dodaj moduły „KonwersjaKoloruNaSkalęSzarości’, ‘IdentyfikacjaGłównychObiektów’, ‘Pomiar intensywności obiektu’, i ‘Eksportuj do arkusza kalkulacyjnegoWykorzystaj obrazy kropel w jasnym polu do identyfikacji obiektów, a następnie użyj tych obiektów jako maski do pomiaru intensywności obrazów fluorescencyjnych.
    4. Uruchom potok przetwarzania z wybranymi obrazami TIFF, aby wyekstrahować średnią intensywność fluorescencji z obrazów kropel fluorescencyjnych. Przeprowadź eksperyment w trzech powtórzeniach, przy czym każdy zestaw powinien składać się z około 5 000 kropel przeznaczonych do analizy.
    5. Zastosuj „zdefiniuj deszczalgorytm (http://definetherain.org.uk/) w celu zidentyfikowania pozytywnych i negatywnych skupisk kropel. Próbki pozytywne powinny znajdować się w obrębie 3 odchyleń standardowych od średniej. Pozwala to wyznaczyć próg intensywności kropel pozytywnych, który zostanie wykorzystany do zliczania.
    6. Ponownie należy użyć oprogramowania do analizy obrazu w celu wdrożenia nowej procedury, w której próg fluorescencji dla każdego genu docelowego zostanie ustawiony zgodnie z definicją z poprzedniego kroku.
    7. Prześlij obrazy w jasnym polu i obrazy fluorescencyjne do potoku przetwarzania. Dodaj moduły „KonwersjaKoloruNaSzarość’, ‘RescaleIntensity’, ‘Próg’, ‘IdentyfikacjaGłównychObiektów’, ‘PomiarWielkościIOkszytuObiektu’, ‘FiltrowanieObiektów’, i ‘Eksportuj do arkusza kalkulacyjnegoTwórz oddzielne moduły dla obrazów w świetle przechodzącym oraz dla każdego filtra fluorescencyjnego dla kropli.
    8. Zmień skalę intensywności obrazu na zakres od 0 do 1 dla każdej grupy obrazów fluorescencyjnych. Następnie ustaw próg, aby zidentyfikować i policzyć obiekty znajdujące się powyżej ustalonego progu. W razie potrzeby dodaj „PowiększanieLubPomniejszanieObiektówmoduł do zmniejszania obiektów w celu ułatwienia liczenia i identyfikacji kropli w obrazowaniu w jasnym polu.
    9. Identyfikuj obiekty wyłącznie w wybranym zakresie wielkości od 20 do 30 pikseli i przefiltruj policzone obiekty, aby zachować tylko te o konkretnej średnicy (np. kropelki w 75 µm zakres średnic) oraz okrągłą ekscentryczność sferyczną na poziomie 0,5 lub poniżej.
    10. Wyeksportuj wyniki do tabeli zawierającej całkowitą liczbę kropli z obrazów w jasnym polu oraz liczbę kropli dla wszystkich użytych kanałów fluorescencji: odpowiednio Cy5 dla genu C-LESS, HEX dla zmetylowanego genu CD3Z oraz FAM dla zmetylowanego genu FOXP3 (patrz Informacje uzupełniające (dla surowych danych eksperymentalnych uzyskanych dla przedstawionego testu mdPCR).
    11. Oblicz stosunek kropel negatywnych dla każdego genu docelowego i zastosuj rozkład Poissona, aby uzyskać odpowiednią liczbę kopii na kroplę (CPD), korzystając z Równania 1:
      figure-protocol-1
      gdzie x oznacza liczbę kropel zawierających 0, 1, 2 lub więcej cząsteczek, a λ reprezentuje wartość CPD.
    12. Oblicz bezwzględne stężenie docelowe, wyznaczając stosunek wartości CPD do objętości kropelki uzyskanej w kroku 5.20, zgodnie z równaniem 2:
      figure-protocol-2
      gdzie wartość (1-p) reprezentuje ułamek kropel negatywnych.
    13. Oblicz procent CD3+ Limfocyty T i CD4+ CD25+ limfocyty T regulatorowe (T-Regs), dzieląc odpowiednie wartości CPD dla zmetylowanych genów CD3Z oraz FOXP3 przez wartość CPD dla C-LESS – lub całkowitą liczbę komórek (patrz Informacje uzupełniające do obliczeń CPD na podstawie surowych danych).
    14. Porównaj te wartości procentowe z wartościami uzyskanymi w obrazowaniu immunofluorescencyjnym z zastosowaniem przeciwciał przeciwko CD3+ Limfocyty T i CD4+ CD25+ Liczenie limfocytów T-reg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Urządzenie mikroprzepływowego generatora kropel oparte na TPE zostało wykonane zgodnie z opisanym protokołem, zgodnie z Rysunkiem 1. W procesie fotolitografii wykorzystano maskę przezroczystą w celu otrzymania formy matki z krzemu (Si). Przeprowadzono litografię miękką, aby uzyskać odwrókną replikę formy matki Si z PDMS, która została następnie użyta do wykonania formy z epoksydu. Prekursor epoksydowy wylano na PDMS i utwardzono w celu sieciowania i stwardnienia. Forma ta, stanowiąca dokładn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół i metody eksperymentalne pozwalają na przeprowadzenie mdPCR we własnym zakresie przy użyciu wyprodukowanego generatora kropel TPE, termocyklera i mikroskopu fluorescencyjnego. Wyprodukowane urządzenie wykorzystujące miękkie połączenie TPE z TPE zapewnia hydrofobowe właściwości powierzchni, które są jednolite na wszystkich ściankach kanału, dzięki czemu końcowe urządzenie nie wymaga żadnej obróbki powierzchni w celu późniejszego wykorzystania jako generator kropel. Materiał ten jest rutynowo stosowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów do zgłoszenia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Rady ds. Badań Naukowych Kanady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bio-Rad, Mississauga, ONTFI0201probówka
RAN Biotechnologies, Beverly, MA008-FluoroSurfaktantFluoro-środek powierzchniowo czynny
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Wielka BrytaniaKamera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAMA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA22-8425-71
CellProfilerUżywany do analizy
Nikon, Japonia10x obiektyw
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAPCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)p/n 200-U1
Fisher, Kanada
Vitrocom, NJ, USA5015 i 5010 Rurkakapilarna borokrzemianowa
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, JaponiaLC-L1V5DEL Źródło
UV Dolomit3200063Jednorazowe rurki
Dolomit3200302Jednorazowe rurki
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NYPionowy mikroskop
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Austria
Zymo Research, Irvine, CAD5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, SzwajcariaSU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Niemcy
Obraz JSłuży do oceny średnicy
kropli Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USAŚwietlówka LED o szerokim spektrum
må l, SzwecjaElastomer termoplastyczny (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA13-400-518
Nikon, JaponiaUżywany do akwizycji
3M, St Paul, MNOlej
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAR37605Barwienie żywymi komórkami fluorescencyjnymi na niebiesko (DAPI)
IDEX Zdrowie & Science, Oak Harbor, WAP-881Złączki
Sigma-Aldrich, Oakville, ON806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USAARV 310
Ihc world, Maryland, USAIW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Niemcy
Sigma-Aldrich, Oakville, ON484431
Bio-Rad, Mississauga, ON1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NYodwrócony
Nikon, Japonia
LoctiteZobacz materiał AA 352
do PCREMCCDobrazu fluorescencyjnegoświatłapłynoweprzepływoweświetlny203603 Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC DE1010 Hexpol TPE, &obrazunośnikowyPEEK Mikroskop

Bibliografia

  1. Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
  2. Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
  3. Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
  4. Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
  5. Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  6. Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
  7. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  8. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  9. Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
  10. Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
  11. Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
  12. Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
  13. Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza metylacji DNAbiomarkery epigenetycznesubtypizacja bia ych krwinekmononuklearne kom rki krwi obwodowejkonwersja pirosiarczynowaurz dzenie do generowania kropelekobrazowanie fluorescencyjnekwantyfikacja loci CpG

Powiązane artykuły