Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Podsumowanie

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Streszczenie

opisano przebieg procesu PCR z multipleksem kropelkowym (mdPCR) i szczegółowy protokół do określania liczby rozmazów białych krwinek (WBC) na bazie epigenetycznej, wraz z urządzeniem do generowania kropel mikroprzepływowych z elastomeru termoplastycznego (TPE). Markery epigenetyczne są wykorzystywane do podtypowania WBC, co ma ważną wartość prognostyczną, w różnych chorobach. Osiąga się to poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA określonych regionów genomu bogatych w CG (loci CpG). W tym artykule DNA potraktowane wodorosiarczynem z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) jest zamknięte w kropelkach z odczynnikami mdPCR, w tym starterami i sondami fluorescencyjnymi do hydrolizy specyficznymi dla loci CpG, które korelują z subpopulacjami WBC. Podejście multipleksowe pozwala na badanie wielu loci CpG bez konieczności oddzielnych reakcji mdPCR, umożliwiając dokładniejsze parametryczne określenie subpopulacji WBC za pomocą analizy epigenetycznej miejsc metylacji. Ta precyzyjna kwantyfikacja może być rozszerzona na różne zastosowania i podkreśla korzyści dla diagnozy klinicznej i późniejszego rokowania.

Wprowadzenie

Analiza składu białych krwinek (WBC) jest jednym z najczęściej wymaganych badań laboratoryjnych w diagnostyce hematologicznej. Różnicowa liczba leukocytów służy jako wskaźnik dla spektrum chorób, w tym infekcji, stanów zapalnych, niedokrwistości i białaczki, i jest badana jako wczesny biomarker prognostyczny dla kilku innych schorzeń. Złoty standard w podtypowaniu WBC obejmuje barwienie immunologiczne i/lub cytometrię przepływową, które wymagają kosztownych, podatnych na niestabilność przeciwciał fluorescencyjnych i często w dużym stopniu zależą od biegłości operatora w przygotowywaniu próbek. Ponadto metoda ta ma zastosowanie wyłącznie do świeżych próbek krwi, tak aby próbki nie mogły zostać zamrożone w celu wysyłki lub późniejszej analizy.

Markery epigenetyczne pojawiły się ostatnio jako potężne narzędzia analityczne do badania zmienności fenotypowej. Następnie wykazano, że ludzkie populacje leukocytów mają wzorce metylacji DNA linii komórkowej, które pozwalają na precyzyjną charakterystykę podzbiorów WBC. Podtypowanie oparte na markerach epigenetycznych stanowi obiecującą alternatywę, która nie zależy od pobrania próbki świeżej krwi ani drogich przeciwciał i może być wykorzystana jako biomarker początku choroby i podatności^1,2,3,4,5.

Przeprowadzono badania całego genomu w celu obszernego mapowania metylowanych, specyficznych regionów bogatych w CG w genomie (wyspy CpG) w podtypach leukocytów w celu zidentyfikowania potencjalnych markerów epigenetycznych specyficznych dla podtypów leukocytów. Z tego powodu protokoły PCR zostały opracowane dla metylowanych regionów genów, np. CD3Z i FOXP3, odpowiadających odpowiednio limfocytom T CD3 ⁺ i limfocytom T regulatorowym CD4 ⁺ CD25 ⁺ (T-Regs). Wiencke i wsp. wykazali użyteczność dupleksowej kropelkowej reakcji PCR do epigenetycznego podtypowania limfocytów T, uzyskując wyniki, które silnie korelują z analizą sortowania komórek aktywowanych przepływem (FACS)⁶. Ta ilościowa metoda analizy genetycznej opiera się na podziale matrycowych cząsteczek kwasu nukleinowego i odczynników PCR na tysiące dyskretnych, zdefiniowanych objętościowo kropelek o rozmiarach poniżej nanolitrów, zawierających zero, jedną lub więcej docelowych kopii kwasów nukleinowych, przy użyciu emulsji typu woda w oleju umożliwianej przez mikrofluidykę^7,8. Amplifikację PCR przeprowadza się w każdej pojedynczej kropli i mierzy się intensywność fluorescencji w punkcie końcowym każdej kropli, co pozwala na bezwzględne określenie ilościowe celów obecnych w próbce. Stwierdzono, że PCR kropelkowy jest bardziej precyzyjny, dokładny i technicznie prostszy niż standardowy qPCR, co czyni go bardziej korzystną metodą opartą na metylacji DNA do klinicznej oceny limfocytów T. Chociaż szybko rozwijająca się metodologia podtypowania, brakuje multipleksowanej analizy epigenetycznej do jednoczesnego sondowania różnych metylowanych regionów CpG. Jest to konieczne do rutynowego zliczania leukocytów.

Tutaj, przedstawiono i zastosowano urządzenie mikroprzepływowe z termoplastycznym elastomerem (TPE) do specyficznego dla metylacji multipleksowego kropelkowego PCR (mdPCR). Technologia ta została wykorzystana do wyznaczenia określonych podtypów leukocytów, limfocytów T CD3 ⁺ i T-Regów CD4 ⁺ CD25 ⁺, w oparciu o wzorce metylacji DNA linii komórkowej, tj. zmienność epigenetyczną regionów CpG CD3Z i FOXP3. Szczegółowy protokół ekstrakcji DNA, konwersji wodorosiarczynów i mdPCR jest opisany w połączeniu z metodą wytwarzania urządzenia do generowania kropel TPE. Reprezentatywne wyniki metody porównano z wynikami barwienia immunofluorescencyjnego, co podkreśla użyteczność proponowanego podejścia.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w tym badaniu na próbkach ludzkich zostały zatwierdzone przez Radę Etyki NRC i zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami NRC dotyczącymi ludzi, które są zgodne z obowiązującymi wytycznymi badawczymi i są zgodne z prawem w Québecu, Kanada.

1. Przygotowanie komórek

1. Zamrożone ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) należy natychmiast rozmrozić, umieszczając kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.
2. Odwróć kriowial dwukrotnie, aby delikatnie zawiesić komórki i za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
3. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki wzrostowej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (RPMI-1640 + 10% FBS) do 15 ml probówki zawierającej PBMC.
4. Odwirować zawiesinę komórek w wirówce z odchylanym wiadrem w temperaturze pokojowej z prędkością 330 x g przez 10 minut z gwałtownym przyspieszeniem i hamulcem na wysokim poziomie.
5. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zdekantować supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,2, zawierającego 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), stukając w bok probówek.
6. Wymieszaj komórki, odwracając probówkę ze szczelnie zamkniętą nakrętką.
7. Przygotować dwie mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i za pomocą pipety podać 1,5 ml zawiesiny komórek w każdej probówce, z których jedna jest używana do późniejszego barwienia immunofluorescencyjnego, a druga do ekstrakcji DNA.

2. Protokół barwienia i obrazowania immunofluorescencyjnego

1. Zawiesić komórki (od 1,7) w 200 μl buforu PBS zawierającego 0,1% azydku sodu i 2% FBS i dostosować końcowe stężenie zawiesiny komórkowej do maksymalnie 2 x 10⁷ komórek/ml.
2. Podzielić zawiesinę komórek, pipetując objętość 100 μl do dwóch oddzielnych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.
3. Dodać 20 μl objętości anty-Hu CD3/CD4 sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i fikoerytryną (PE) do jednej probówki i anty-Hu CD4/CD25 sprzężonego z FITC i PE (patrz tabela materiałów) odpowiednio do drugiej probówki.
4. Dodaj 1 kroplę niebieskiego fluorescencyjnego barwnika z żywych komórek (patrz tabela materiałów) do każdej probówki.
5. Inkubować w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora probówkowego przez 2 godziny. Chronić przed światłem.
6. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przy 330 x g przez 10 minut z gwałtownym przyspieszeniem i hamulcem na wysokich obrotach.
7. Zdekantować supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy, stukając w rurkę. Dodać 1 ml PBS o pH 7,2 zawierającym 2 mM EDTA. Upewniając się, że nakrętka jest szczelnie zamknięta, wymieszaj komórki, odwracając probówkę 2x.
8. Powtórz kroki 2.6 i 2.7 trzy razy.
9. Zawieś komórki w 20 μl PBS pH 7,2 zawierającym 2 mM EDTA.
10. Odpipetować 10 μl kropli zawiesiny komórek na borokrzemianowe szkiełko mikroskopowe i odczekać 2 minuty, aż komórki powoli opadną na dno kropli.
11. Ostrożnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego.
12. Rejestruj obrazy komórek za pomocą obiektywu 10x i kamery EMCCD podłączonej do mikroskopu dla każdej z fluoroforów dla obu próbek zawiesiny komórek.
13. Ręcznie policz komórki znakowane fluorescencyjnie (patrz Informacje uzupełniające dla nieprzetworzonych danych).
14. Weź stosunek komórek znakowanych anty-Hu CD3 i anty-Hu CD4 / CD25 do komórek barwionych DAPI, aby uzyskać proporcje limfocytów T CD3 ⁺ i T-Regów CD4 ⁺ CD25 ⁺ do całkowitej leukocytów.

3. Ekstrakcja DNA i konwersja wodorosiarczynu

1. Ekstrakcja DNA
   UWAGA: Ekstrahować DNA z PBMC przygotowanych w sekcji 1 za pomocą zestawu do magnetycznego oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez producenta.
   1. W probówce o pojemności 1,5 ml zawiesić komórki w 100 μl PBS i dodać 20 μl proteinazy K i 400 μl buforu do lizy/wiązania. Wymieszać pipetując pipetowanie góra-dół 10x, a następnie przeprowadzić inkubację w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Uchwyć kompleks kulek DNA, umieszczając probówkę na stojaku magnetycznym na 1-2 minuty, a następnie ostrożnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
   3. Wyjmij probówkę zawierającą kompleks kulek DNA ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 600 μl buforu do płukania #1, aby zmyć wszelkie niespecyficzne wiązania.
   4. Umieść probówkę ponownie na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
   5. Powtórz kroki 3.1.3 i 3.1.4 z 600 μl buforu do przemywania #2.
   6. Pozostaw probówkę otwartą do wyschnięcia na powietrzu na 1 minutę.
   7. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i eluuj DNA, dozując 100 μl buforu elucyjnego i pipetując kompleks DNA/kulki w górę iw dół 20x.
   8. Umieść probówkę zawierającą wymyte DNA ponownie na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 1-2 minuty, aby oddzielić kulki magnetyczne od wymytego DNA.
   9. Przenieś eluowany oczyszczony roztwór DNA do nowej czystej probówki.
   10. Ocenić stężenie oczyszczonej próbki DNA, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru.
2. Konwersja wodorosiarczynu
   UWAGA: Przeprowadź konwersję wodorosiarczynu na oczyszczonym DNA za pomocą zestawu do metylacji (patrz Tabela materiałów) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez producenta.
   1. Do 20 μl próbki DNA (200-500 ng) w probówce PCR dodać 130 μl odczynnika konwersyjnego. Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj.
   2. Przenieść probówkę PCR do termocyklera i wykonać protokół cykliczny w następujący sposób: 98 °C przez 8 minut; 54 °C przez 60 minut i utrzymać w temperaturze 4 °C.
   3. Dodać 600 μl buforu wiążącego do kolumny do chromatografii jonowej (IC) umieszczonej w probówce zbiorczej.
   4. Dodać próbkę DNA do kolumny IC zawierającej bufor wiążący i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Wirować przez 30 s z pełną prędkością. Wyrzuć zebrany przepływ.
   5. Do kolumny dodaj teraz 100 μl buforu do płukania. Przeprowadzić odwirowanie zgodnie z opisem w kroku 3.2.4 i odrzucić przepływ.
   6. Dodać 200 μl buforu odsiarczającego i przeprowadzić inkubację w temperaturze pokojowej przez 15-20 min. Odwirować i odrzucić przepływ, jak opisano w krokach powyżej.
   7. Dodać 200 μl buforu do przemywania do kolumny. Wirować z pełną prędkością przez 30 s i odrzucić przepływ.
   8. Powtórz krok 3.2.7.
   9. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl wody klasy PCR na membranę kolumny. Wirować z pełną prędkością przez 1 minutę, aby wymyć DNA.
   10. Ocenić stężenie próbki DNA przekształconej w wodorosiarczyn, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
       UWAGA: Użyj wartości 40 μg/ml dla absorbancji przy 260 nm = 1,0.
   11. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -70 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

4. Produkcja urządzeń do generowania kropelek

UWAGA: Urządzenie mikroprzepływowe używane do generowania kropel (plik CAD znajduje się w Informacjach Uzupełniających) zostało wyprodukowane w czystym pomieszczeniu (klasa 1,000) w elastomerze termoplastycznym (zobacz Tabelę Materiałów) przy użyciu tłoczenia na gorąco wygenerowanego przez następujący protokół.

1. Produkcja form SU-8
   1. Przygotuj formę SU-8 na 6-calowej płytce krzemowej przy użyciu standardowej fotolitografii, jak opisano poniżej.
   2. Wyczyść 6-calową płytkę krzemową za pomocą plazmy tlenowej o mocy 500 W przez 10 s.
   3. Powłoka spinowa SU-8 opiera się na płytce krzemowej z prędkością 900 obr./min przez 40 s, aby uzyskać całkowitą grubość warstwy 100 μm.
   4. Umieść wafel na gorącym talerzu i piecz przez 15 minut w temperaturze 65 °C, a następnie 2 godziny w temperaturze 95 °C.
   5. Wystaw na działanie światła UV o długości fali 365 nm (Hg i-line) przez przezroczystą fotomaskę o wysokiej rozdzielczości, stosując dawkę ekspozycji 1 000 mJ/^cm2.
   6. Umieść wafel na gorącym talerzu i piecz przez 15 minut w temperaturze 65 °C, a następnie 40 minut w temperaturze 95 °C.
   7. Wywoływać przez zanurzenie w octanie eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na 5 minut.
   8. Spłukać PGMEA i izopropanolem i osuszyć strumieniem gazowego azotu.
   9. Ułóż wafel na gorącym talerzu i piecz na twardo przez 2 godziny w temperaturze 135 °C.
   10. Sylizanizować płytkę w eksykatorze próżniowym zawierającym kroplę środka silanizującego (tricholoro perfluorooktylosilan) umieszczoną na sąsiednim szklanym szkiełku mikroskopowym przez 2 godziny
       UWAGA: Ma to na celu sprawienie, aby silany tworzyły monowarstwę na powierzchni mastera SU-8. Tricholoro perfluorooktylosilan należy zawsze obchodzić się z wyciągiem i trzymać z dala od źródeł wody.
2. Replika polidimetylosiloksanu (PDMS)
   1. Przygotować płynne prepolimery PDMS (patrz Tabela materiałów) w stosunku 10:1 w/w bazy elastomerowej do utwardzacza w plastikowym kubku.
   2. Umieść kubek w planetarnym odśrodkowym mikserze próżniowym, aby wymieszać i odgazować mieszaninę PDMS.
   3. Wlej mieszaninę PDMS na formę umieszczoną w niestandardowym metalowym uchwycie, który zapobiega wyciekaniu żywicy i utwardź się w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
   4. Za pomocą pęsety ostrożnie oderwij formę PDMS od mastera SU-8.
3. Forma epoksydowa
   UWAGA: Forma epoksydowa została wytworzona z wzorca SU-8/krzemu przy użyciu pośredniego procesu replikacji z PDMS.
   1. Przygotuj żywicę epoksydową (patrz tabela materiałów) przy użyciu stosunku 100/83 w/w żywicy/utwardzacza.
   2. Odgazować mieszaninę pod zmniejszonym ciśnieniem w suszarce próżniowej przez 30 minut.
   3. Replikę PDMS zalać żywicą i utwardzić w temperaturze 80 °C przez 12 godzin.
   4. Wyjmij utwardzoną formę epoksydową z repliki PDMS, umieść na płycie grzejnej i piecz na twardo przez 2 godziny w temperaturze 120 °C.
4. Urządzenie TPE
   1. Wytłaczaj granulki TPE (patrz tabela materiałów) w temperaturze 165 °C w arkuszach o grubości 2,0 mm i szerokości 7 cali o długości kilku metrów i przechowuj je jako rolkę do wykorzystania w przyszłości.
   2. Wytnij arkusz TPE z rolki za pomocą nożyczek na kwadrat o średnicy 7 cali.
   3. Umieść arkusz TPE między formą epoksydową a niewzorzystą silanizowaną płytką krzemową (patrz krok 4.1.10, aby zapoznać się z procedurą silanizacji wafli).
   4. Wytłaczanie na gorąco należy wykonywać w temperaturze 125 °C, przy przyłożonej sile 10 kN i ciśnieniu 10^–2 mbar przez 10 minut.
   5. Ostrożnie wyjmować z formy w temperaturze pokojowej za pomocą sprayu metanolowego, aby oddzielić wytłaczany TPE od płytki krzemowej i formy epoksydowej.
   6. Wytnij kolejny 7-calowy kwadratowy arkusz TPE i umieść go między dwoma niewzorzystymi silanizowanymi waflami krzemowymi.
   7. Wytłaczanie na gorąco należy wykonać w temperaturze 140 °C, przy przyłożonej sile 10 kN i ciśnieniu 10^–2 mbar przez 10 minut, aby utworzyć płaską powierzchnię do zamknięcia kanałów i uszczelnienia urządzenia.
   8. Ostrożnie rozformować w temperaturze pokojowej za pomocą sprayu metanolowego, aby oddzielić wytłaczany TPE od dwóch płytek krzemowych.
   9. Przytnij każdy z wytłoczonych arkuszy TPE do rozmiaru urządzenia za pomocą rakla.
   10. Przebić otwory dostępowe do kanałów wlotowych i wylotowych w urządzeniu strukturalnym za pomocą igły do biopsji o średnicy 1 mm z tłokiem.
   11. Owiń kanały, umieszczając płaskie urządzenie TPE w bezpośrednim kontakcie z kanałami w temperaturze pokojowej.
   12. Opcjonalnie wstaw do piekarnika w temperaturze 70 °C na 2 godziny, aby ułatwić klejenie urządzenia.
   13. Zamontuj otwory dostępowe za pomocą jednorazowej rurki płynowej (średnica wewnętrzna 0.25 mm, średnica zewnętrzna 0.8 mm). Uszczelnij połączenia za pomocą kleju epoksydowego, aby zapewnić szczelną manipulację.

5. Wytwarzanie kropelek i PCR

UWAGA: Tabela 1 przedstawia informacje o starterach do przodu i do tyłu wraz z podwójnie hartowanymi sondami hydrolizy dla genów C-LESS, CD3Z i Foxp3, które są wymagane do multipleksowej amplifikacji celów demetylowanych genów.

1. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w tabeli 2.
2. Rozmrozić wszystkie składniki mieszanki wzorcowej z wyjątkiem mieszaniny enzymatycznej. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną, pipetując góra-dół i krótko odwiruj.
3. Dodać odpowiednią objętość (1 μl) DNA przekształconego w wodorosiarczyn (z sekcji 3.2) do mieszanki wzorcowej w probówce do PCR. Wymieszać reakcję, pipetując góra-dół i krótko odwirować.
4. Podłącz jednorazowy przewód płynowy (średnica wewnętrzna 0,25 mm, średnica zewnętrzna 1,6 mm) do dwóch precyzyjnych szklanych strzykawek (objętość 250 μl) za pomocą złączek PEEK.
5. Napełnij jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 250 μl oleju nośnikowego zawierającego 5% fluoro-surfaktantu.
6. Przed załadowaniem 100 μl mieszanki PCR należy wstępnie napełnić kolejną precyzyjną szklaną strzykawkę 50 μl oleju nośnikowego, aby zapewnić dozowanie całej objętości próbki podczas emulgacji.
7. Ustaw kropelkowe urządzenie mikroprzepływowe na stoliku pionowego mikroskopu świetlnego wyposażonego w szybką kamerę, aby obserwować i rejestrować tworzenie się kropel w czasie rzeczywistym.
8. Umieścić ampułkostrzykawki na programowalnej pompie strzykawkowej i za pomocą złączki PEEK ze złączkami (patrz Tabela materiałów) podłączyć rurki strzykawek do przewodów odpowiednich kanałów wlotowych kropelkowego urządzenia mikroprzepływowego.
9. Umieść rurkę z wylotu generatora kropel w probówce PCR o pojemności 0.5 ml.
10. Dostosować natężenie przepływu pompy strzykawkowej do 2 μl/min i pozwolić, aby wielkość kropli ustabilizowała się przed zebraniem powstałej emulsji.
11. Zebrać emulsję i przenieść 75 μl do probówki PCR o pojemności 0,2 ml w celu przeprowadzenia cykli termicznych.
12. Upewnij się, że zawartość oleju w probówce PCR ściśle odpowiada objętości fazy rozproszonej, aby zapobiec koalescencji kropelek podczas cykli termicznych.
13. Umieścić probówkę PCR o pojemności 0,2 ml w termocyklerze i wykonać protokół cykliczny w następujący sposób: podgrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie 45 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60 °C przez 30 s.
14. Pozostałą emulsję należy wypełnić borokrzemianową rurką kapilarną (głębokość 100 μm) o profilu prostokątnym w celu zobrazowania kropel i oceny średnicy kropli.
15. Umieść probówkę borokrzemianową wypełnioną emulsją na szkiełku mikroskopowym. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w kamerę EMCCD i obiektyw 10x, aby zarejestrować obrazy kropel w jasnym polu.
16. Zmierz średnicę kropli za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jak opisano poniżej.
17. Ustaw skalę znanej odległości w mikronach odpowiadającą liczbie pikseli na obrazie, wybierając przycisk "Analizuj", a następnie "Ustaw skalę".
18. Przekonwertuj obraz na skalę szarości, wybierając przycisk "Obraz", a następnie "Tekst". W razie potrzeby dostosuj jasność i kontrast. Ustaw ręczny próg, aby wyznaczyć i wypełnić okręgi, wybierając przycisk "Obraz", a następnie "Dostosuj próg".
19. Przeanalizuj cząstki, wybierając przycisk "Analizuj cząstki" i ustawiając okrągłość na 0,75 – 1.
20. Uzyskaj wynikową powierzchnię i średnicę mierzonych kropel, która jest automatycznie wyświetlana w oprogramowaniu.
21. Obliczyć średnią średnicę kropli i przyjmując kroplę sferyczną, oszacuj objętość podziału, która zostanie wykorzystana do obliczenia bezwzględnego stężenia docelowego.
22. Upewnij się, że kropelki są monodyspersyjne, analizując współczynnik zmienności (CV), który przyjmuje się jako stosunek odchyleń standardowych do wartości średnich (k = 1) dla średnicy kropli (< 3%).

6. Obrazowanie fluorescencyjne i analiza obrazu

1. Obrazowanie fluorescencyjne
   1. Po amplifikacji przenieść emulsję PCR do borokrzemianowej rurki kapilarnej (głębokość 50 μm) o profilu prostokątnym w celu ułożenia kropelek w gęsto upakowaną monowarstwę do obrazowania.
   2. Zamocuj wypełnione kapilary na szkiełku mikroskopowym i uszczelnij obie strony za pomocą kleju akrylowego UV. Nałóż źródło światła UV na klej UV, uważając, aby nie oświetlić emulsji, aby uniknąć wybielenia próbki.
   3. Załaduj szklane szkiełko do odwróconego mikroskopu wyposażonego w kamerę EMCCD i obiektyw 10x.
   4. Korzystając z oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, wybierz opcję Acquire (Pobieranie) | Na żywo — szybkie rozpoczęcie akwizycji z kamery w czasie rzeczywistym, obserwacja próbki i upewnienie się, że uchwycona została szerokość kapilary.
   5. Ustaw lampę jasnego pola do oświetlenia diaskopowego na 3.5 V.
   6. Ustaw świetlówkę LED o szerokim spektrum działania do oświetlenia episkopowego na 20% intensywności.
   7. Dostosuj ustawienie przechwytywania dla wszystkich długości fal (jasne pole, FAM, HEX i Cy5) ręcznie, wybierając opcję Kalibracja | Konfiguracje optyczne w oprogramowaniu do obrazowania. Dla każdego fluoroforu należy ręcznie przełączyć odpowiednią kostkę filtra fluorescencyjnego. Aby zachować tę samą ścieżkę optyczną, należy użyć kostki filtrującej do obrazowania w jasnym polu.
   8. Ręczne dostosowywanie czasu ekspozycji przed akwizycją obrazu za pomocą opcji Acquire | Ustawienia kamery dla każdego fluoroforu, jak podsumowano w Tabeli 3. Ustaw tryb odczytu EM gain 17 MHz na 16-bit z mnożnikiem wzmocnienia 100 w menu "Ustawienia przechwytywania" oprogramowania.
   9. W oknie LUT oprogramowania ustaw skalę LUT tak, aby sygnał transmisji mieścił się w ustawionym zakresie. W tym eksperymencie skala została ustalona w przybliżeniu od 500 do 12 000.
   10. Zautomatyzuj przechwytywanie za pomocą programu do akwizycji wielopunktowej, korzystając zarówno ze skanowania XY, jak i wielu opcji długości fali w określonej kolejności. Upewnij się, że stolik przesunie się do pozycji początkowej, uchwyć wszystkie różne długości fal, a następnie przejdź do następnej pozycji.
   11. Najpierw skonfiguruj skanowanie XY, dostosowując profil skanowania XY w menu skanowania XY oprogramowania. W polu "Niestandardowa definicja wielopunktowa" wybierz pole definicji dużego obrazu i ustaw ją na około 40,0 x 1,0 mm (długość wypełnienia emulsją). Użyj 1% nakładania się.
   12. Włącz opcję "Użyj powierzchni ostrości" i ustaw krzywą powierzchni ostrości, dostosowując płaszczyznę ostrości w różnych punktach próbki za pomocą pokrętła ostrości na mikroskopie.
   13. Po drugie, skonfiguruj skanowanie na wiele długości fali, wybierając kartę skanowania. Dodaj każdą z konfiguracji optycznych utworzonych w kroku 6.1.7 dla każdej długości fali.
   14. Kliknij opcję, aby zamknąć aktywną migawkę podczas ruchu stolika i podczas wymiany filtra, aby uniknąć wybielania próbki i uruchom akwizycję, naciskając przycisk "Start Run". Eksportuj każdą klatkę akwizycji do plików tiff i podziel każdy kanał na oddzielny plik, korzystając z opcji podziału wielu plików i stosując zapisane ustawienia LUT. Użyj opcji nazwy punktu i nazwy kanału, aby łatwo rozróżnić każdy plik obrazu.
2. Analiza obrazu
   1. Posortuj wszystkie uzyskane obrazy według filtrów jasnego pola i fluorescencji, aby przesłać je do oprogramowania do analizy obrazów typu open source.
   2. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby utworzyć potok w celu zidentyfikowania wszystkich kropel za pomocą obrazów w jasnym polu, a następnie zmierz intensywność powiązanych kropel fluorescencyjnych.
   3. Aby potokować przesyłać obrazy tiff w jasnym polu i fluorescencji, a następnie dodaj moduły "ColorToGray", "IdentifyPrimaryObjects", "MeasureObjectIntensity" i "ExportToSpreadsheet". Użyj obrazów kropel w jasnym polu do identyfikacji obiektów, a następnie użyj obiektów jako maski do pomiaru intensywności obrazów fluorescencyjnych.
   4. Uruchom potok z wybranymi obrazami tiff, aby wyodrębnić średnią intensywność fluorescencji obrazów kropelek fluorescencji. Przeprowadź eksperyment w trzech egzemplarzach, przy czym każdy zestaw składa się z ~ 5 000 kropel do analizy.
   5. Zastosować algorytm "definetherain" (http://definetherain.org.uk/) w celu zidentyfikowania dodatnich i ujemnych klastrów kropel. Wartości dodatnie powinny mieścić się w zakresie 3 odchyleń standardowych od średniej. Określa to progi intensywności dodatnich kropel, które mają być używane do liczenia.
   6. Ponownie użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zaimplementować nowy potok, w którym próg fluorescencji dla każdego docelowego genu jest ustawiany zgodnie z definicją w poprzednim kroku.
   7. Przesyłanie obrazów jasnego pola i fluorescencji do potoku. Dodaj moduły "ColorToGray", "RescaleIntensity", "Threshold", "IdentifyPrimaryObjects", "MeasureObjectSizeShape", "FilterObjects" i "ExportToSpreadsheet". Twórz unikalne moduły dla obrazów w jasnym polu i każdy filtr fluorescencyjny dla kropel.
   8. Przeskaluj skalę intensywności obrazu od 0 do 1 dla każdej grupy obrazów fluorescencyjnych. Następnie ustaw próg, aby zidentyfikować i policzyć obiekty powyżej ustalonego progu. W razie potrzeby dodaj moduł "ExpandOrShrinkObjects", aby zmniejszyć obiekty, aby ułatwić liczenie i identyfikację kropel w jasnym polu.
   9. Identyfikuj tylko obiekty o wybranym rozmiarze 20-30 pikseli i filtruj zliczane obiekty, aby zachować tylko te obiekty, o określonej średnicy (tj. kropelkach w zakresie średnic 75 μm) i okrągłej mimośrodzie sferycznej 0,5 i mniejszej.
   10. Wyeksportuj wyniki do tabeli, która zawiera całkowitą liczbę kropel z obrazów w jasnym polu, a także liczbę kropelek we wszystkich użytych kanałach fluorescencyjnych, a mianowicie Cy5 dla genu C-LESS, HEX dla metylowanego genu CD3Z i FAM dla metylowanego genu FOXP3 (patrz Informacje uzupełniające dla surowych danych eksperymentalnych uzyskanych dla prezentowanego testu mdPCR).
   11. Oblicz stosunek ujemnych kropel dla każdego docelowego genu i zastosuj rozkład Poissona, aby uzyskać odpowiednie kopie na kroplę (CPD), korzystając z równania 1:
       
       gdzie x oznacza liczbę kropel zawierających 0, 1, 2 lub więcej cząsteczek, a λ oznacza wartość CPD.
   12. Obliczyć bezwzględne stężenie docelowe, biorąc pod uwagę stosunek wartości CPD do objętości kropli uzyskanej w kroku 5.20 za pomocą równania 2:
       
       gdzie wartość (1-p) reprezentuje ułamek ujemnych kropel.
   13. Obliczyć procent limfocytów T CD3 ⁺ i T-Regów CD4 ⁺ CD25 ⁺, dzieląc odpowiednie wartości CPD metylowanych genów CD3Z i FOXP3 przez wartość C-LESS – lub całkowitą komórkę – CPD (patrz Informacje dodatkowe dotyczące obliczeń CPD na podstawie surowych danych).
   14. Porównaj te wartości procentowe z tymi uzyskanymi z obrazowania immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciał do zliczania limfocytów T CD3 ⁺ i T-Reg CD4 ⁺ CD25 ⁺.

Wyniki

Generator kropel mikroprzepływowych oparty na TPE został wyprodukowany przy użyciu opisanego protokołu, jak pokazano w Rysunek 1. Maska przezroczystości została użyta w fotolitografii w celu uzyskania wzorca krzemu (Si). Przeprowadzono miękką litografię w celu uzyskania odwróconej repliki PDMS wzorca Si, która została następnie wykorzystana do wytworzenia formy epoksydowej. Prekursor epoksydowy wylano na PDMS i utwardzono w celu usieciowania i stwardnienia. Ta forma, reprezentująca dokładną ...

Dyskusja

Przedstawiony protokół i metody eksperymentalne pozwalają na przeprowadzenie mdPCR we własnym zakresie przy użyciu wyprodukowanego generatora kropel TPE, termocyklera i mikroskopu fluorescencyjnego. Wyprodukowane urządzenie wykorzystujące miękkie połączenie TPE z TPE zapewnia hydrofobowe właściwości powierzchni, które są jednolite na wszystkich ściankach kanału, dzięki czemu końcowe urządzenie nie wymaga żadnej obróbki powierzchni w celu późniejszego wykorzystania jako generator kropel. Materiał ten jest rutynowo stosowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	probówka
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfaktant	Fluoro-środek powierzchniowo czynny
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Wielka Brytania		Kamera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Używany do analizy
Nikon, Japonia		10x obiektyw
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Kanada
Vitrocom, NJ, USA	5015 i 5010 Rurka		kapilarna borokrzemianowa
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japonia	LC-L1V5	DEL Źródło
UV Dolomit	3200063	Jednorazowe rurki
Dolomit	3200302	Jednorazowe rurki
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Pionowy mikroskop
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Szwajcaria		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Niemcy
Obraz J		Służy do oceny średnicy
kropli Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		Świetlówka LED o szerokim spektrum
må l, Szwecja		Elastomer termoplastyczny (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japonia		Używany do akwizycji
3M, St Paul, MN		Olej
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Barwienie żywymi komórkami fluorescencyjnymi na niebiesko (DAPI)
IDEX Zdrowie & Science, Oak Harbor, WA	P-881	Złączki
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Niemcy
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY			odwrócony
Nikon, Japonia
Loctite	Zobacz materiał AA 352