Farmakologiczna walidacja hamowania preimpulsowego odpowiedzi na przestraszenie u larw danio pręgowanego przy użyciu komercyjnego zautomatyzowanego systemu i oprogramowania

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje dostępne na rynku zautomatyzowane systemy do farmakologicznej walidacji testu inhibicji przedimpulsowej (PPI) u larw danio pręgowanego.

Streszczenie

Chociaż istnieje mnóstwo komercyjnych i standardowych zautomatyzowanych systemów i oprogramowania do przeprowadzania testów hamowania przedimpulsowego (PPI) u gryzoni, według naszej najlepszej wiedzy, wszystkie testy PPI wykonywane u danio pręgowanego były do tej pory wykonywane przy użyciu niestandardowych systemów, które były dostępne tylko dla indywidualnych grup. W związku z tym pojawiły się wyzwania, szczególnie w odniesieniu do kwestii odtwarzalności i standaryzacji danych. W niniejszej pracy opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje dostępne na rynku zautomatyzowane systemy do farmakologicznej walidacji testu IPP u larw danio pręgowanego. Zgodnie z opublikowanymi wynikami, byliśmy w stanie powtórzyć wyniki apomorfiny, haloperidolu i ketaminy na odpowiedź PPI larw danio pręgowanego 6 dni po zapłodnieniu.

Wprowadzenie

Larwa danio pręgowanego (Danio rerio) jest odpowiednim kandydatem do modelowania chorób psychicznych, takich jak schizofrenia (sprawdzone przez Gawel et al.¹) ze względu na liczne zalety, które posiada. Obejmują one w pełni zsekwencjonowany genom z 70% homologią sekwencji do ludzkich ortologów², istnienie narzędzi genetycznych do przodu i do tyłu do manipulowania genomem i identyfikowania wkładu danego genu w rozwój lub chorobę³, oraz obecność głównych neuroprzekaźników człowiek/gryzoń w mózgu danio pręgowanego⁴. U danio pręgowanego występuje kilka domen neurofenotypowych, takich jak lęk, uczenie się i pamięć³. Przezroczystość optyczna i czułość na główne klasy leków neurotropowych sprawia, że jest to idealny kandydat do manipulacji farmakologicznych i badań przesiewowych leków fenotypowych^5,6.

Aby przeprowadzić wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków, automatyzacja i obecność solidnego endofenotypu jest bardzo ważna⁷. Na przykład, opracowano wiele technik automatycznego rejestrowania do pomiaru zachowania larw danio pręgowanego, takich jak thigmotaxis, reakcja na zaskoczenie, odpowiedź optokinetyczna, reakcja optomotoryczna, habituacja, chwytanie zdobyczy, zachowanie podczas snu/czuwania, zachowanie lokomotoryczne i kilka innych⁶. Podczas gdy niektóre laboratoria opracowują niestandardowe systemy do zautomatyzowanych pomiarów i analizy niektórych z tych zachowań, istnieją komercyjnie dostępne systemy obrazowania i oprogramowania^8,9,10,11. Hamowanie przedimpulsowe (PPI), forma bramkowania sensomotorycznego, w której reakcja na zaskoczenie jest zmniejszona, gdy słaby, niezaskakujący bodziec jest prezentowany na krótko przed bodźcem zaskakującym, została wykorzystana jako endofenotyp do badania schizofrenii w modelach zwierzęcych (recenzja przez^12,13). Ponadto akustyczna reakcja na zaskoczenie (ASR) i PPI odegrały użyteczną rolę w badaniu funkcji słuchu i słuchu w modelach zwierzęcych, w tym danio pręgowanego^14,15. Larwa danio pręgowanego wykazuje charakterystyczny start C w odpowiedzi na nieoczekiwany zaskakujący bodziec, który jest osłabiany przez słabszy bodziec zwany prepulsem. C-start od dawna jest opisywany jako zachowanie ucieczki kontrolowane przez odrębne populacje komórek nerwowych i został dokładnie scharakteryzowany u larw danio pręgowanego^15,16,17.

Istnieje mnóstwo komercyjnych i standardowych zautomatyzowanych systemów i oprogramowania do przeprowadzania testów PPI u gryzoni^18,19,20. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wszystkie testy PPI przeprowadzone do tej pory na danio pręgowanym zostały wykonane przy użyciu niestandardowych systemów, które są dostępne tylko dla poszczególnych grup^15,16,21,22. Stanowi to wyzwanie dla osiągnięcia odtwarzalności i powtarzalności danych w odniesieniu do standaryzacji²³.

Niedawno, znany sprzedawca w społeczności danio pręgowanego opracował zestaw z szybką kamerą i dodatkami do generatora PPI do przeprowadzania testu PPI na larwach danio pręgowanego²⁴. Kamera nagrywa z prędkością 1000 klatek na sekundę, co umożliwia rejestrowanie szybko działających zachowań, takich jak C-start, podczas gdy generator PPI pozwala na kontrolowane przez użytkownika dostarczanie różnych bodźców akustycznych w celu wywołania reakcji zaskoczenia²⁴. W tym miejscu łączymy wyżej wymieniony system z dostępnym na rynku kompleksowym pakietem oprogramowania przeznaczonym do automatycznej analizy złożonych zachowań¹¹, w celu wygenerowania protokołu do wykonywania testów odpowiedzi PPI u larw danio pręgowanego. Farmakologicznie weryfikujemy odpowiedź IPP za pomocą 1) apomorfiny, agonisty dopaminy, o którym wiadomo, że powoduje deficyty IPP; 2) haloperidol, antagonista dopaminy i lek przeciwpsychotyczny, o którym wiadomo, że zwiększa IPP i 3) ketamina, antagonista receptora NMDA, o którym wiadomo, że moduluje IPP.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez system nadzoru i aplikacji Norweskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (FOTS-18/106800-1).

1. Hodowla danio pręgowanego

1. Ustaw krycia dorosłych samców i samic danio pręgowanego (Danio rerio) typu dzikiego, utrzymywanych w standardowych warunkach²⁵ poprzedniego wieczoru. W tym przypadku stosowany jest szczep Tupfel długopłetwy (TL).
2. Usuń bariery następnego ranka i pozwól na kopulację podczas naturalnego tarła.
3. Zbierz jaja ze zbiorników godowych.
4. Usunąć niezapłodnione jaja i inne zanieczyszczenia, a następnie przenieść jaja na szalki Petriego (n = 60) i wychować w inkubatorze w temperaturze 28 °C w pożywce zarodkowej: 1,5 mM HEPES, pH 7,6, 17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgSO4 i 0,18 mM Ca(NO3)₂.
5. Odnawiać połowę pożywki zarodkowej i usuwać martwe larwy codziennie do 6 dpf.
   UWAGA: Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na pojedynczych larwach po 6 dniach od zapłodnienia (dpf).

2. Środki farmakologiczne i wstępne leczenie larw

1. Rozpuść apomorfinę i ketaminę w pożywce E3, aby uzyskać odpowiednio 500 μM i 10 mM roztworów podstawowych.
2. Rozpuścić haloperydol w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego. Końcowe stężenie zastosowanego DMSO wynosiło 0,1%.
3. Użyj 0,1% DMSO i medium E3 jako elementów sterujących pojazdem.
4. Należy stosować następujące końcowe stężenia leków: 10 mg/ml apomorfiny, 1 mM ketaminy i 20 μM haloperidolu¹⁶.
5. Wstępnie naświetl larwy grup apomorfiny i ketaminy przez 10 minut, a grupy kontrolne nośników haloperidolu i DMSO przez 20 minut¹⁶.

3. Konfiguracja przed testem zachowania

1. W dniu eksperymentu przenieś larwy i wszystkie istotne materiały do pomieszczenia doświadczalnego. Ustawić temperaturę w pomieszczeniu doświadczalnym na 27 ± 1 °C.
2. Upewnij się, że hałas tła w komorze testowej jest jak najniższy, najlepiej nie większy niż 45 dB poziom ciśnienia akustycznego (SPL).
   1. Zainstaluj mikrofon sonometru miernika decybeli (dB) w komorze testowej (otwór do instalacji jest już wywiercony przez producenta).
   2. Aby zredukować hałas tła w pomieszczeniu, zaizoluj komorę testową za pomocą specjalnie zbudowanej kabiny dźwiękowej (patrz Rysunek 1B, aby zapoznać się z konfiguracją).
3. Przygotować 96-dołkową płytkę do testu zahamowania przedimpulsowego.
   UWAGA: Kamera wideo ma rozdzielczość 2048 × 500 pikseli, co oznacza, że jednocześnie można obrazować maksymalnie 3 tory (33 dołki).
   1. Użyj specjalnie wykonanej płyty akrylowej o formacie 96 dołków, aby zredukować zakłócenia powodowane przez cienie.
      UWAGA: Wymiary tabliczki niestandardowej można znaleźć na następującej stronie internetowej: https://zenodo.org/record/3739378#.XooyLW5uKas
4. Za pomocą pipety transferowej przenieś 310 μl roztworu/pożywki ekspozycyjnej z jedną larwą do każdej studzienki.
5. Skalibruj i zmierz intensywność bodźca za pomocą pokrętła głośności wzmacniacza stereo i miernika decybeli.
6. Zarejestruj maksymalne natężenie dźwięku w sekcji "poziom odniesienia".

4. Parametry bodźca i akwizycja wideo

1. Włącz komputer, amplifier system i miernik dB (patrz Rysunek 1A, aby zapoznać się z ponadview konfiguracji).
2. Użyj pokrętła głośności, obracając je do minimum lub maksimum, aby wyregulować intensywność dźwięku.
   1. Za każdym razem sprawdzaj poziom dźwięku za pomocą miernika dB, pokrętło głośności jest regulowane. Jest to ważne przy określaniu maksymalnego i minimalnego natężenia dźwięku, które może być wytwarzane przez konfigurację.
      UWAGA: Miernik dB oblicza moc wyjściową RMS dB dla bodźca. System generuje dźwięk wewnątrz stałych elementów komory testowej, utrzymując płytę w stabilnej pozycji, jednocześnie wytwarzając wibracje w płaszczyźnie poziomej całego wspornika płyty.
      1. Ustaw pokrętło głośności na maksimum, zmierz natężenie dźwięku miernikiem dB i użyj tej wartości.
3. Na interfejsie generatora PPI zdefiniuj parametry: interwał między bodźcami reprezentowany jako opóźnienie; interwał międzypróbny reprezentowany jako czas delta akwizycji; czas trwania impulsu wstępnego itp.
   1. W przypadku prób z samym impulsem wstępnym upewnij się, że "Amplituda" lub Czas trwania bodźca dla parametrów Ostrzegawczego są ustawione na zero i odwrotnie dla prób z samym impulsem.
4. Aby wygenerować listę wersji próbnych, wybierz pozycję Dodaj > nadaj nazwę wersji próbnej. Na przykład "Impuls wstępny 50 dB samodzielnie".
   UWAGA: Można wygenerować tyle prób, ile chcesz, ale uważaj na to, jak długa jest lista, ponieważ może to spowodować awarię programu.
   1. Przeplatanie prób przedimpulsowych z próbami samego impulsu we wszystkich eksperymentach PPI przy użyciu kolejności pseudolosowej. W przypadku, gdy w eksperymencie prezentowanych jest wiele bodźców, stosuje się interwał międzypróbny (ITI) wynoszący 30 s.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano bodziec (impuls) przestraszenia 100 ms o częstotliwości 660 Hz i bodźce przedimpulsowe o długości 5 ms o częstotliwości 440 Hz. W przypadku eksperymentów PPI interwał między bodźcami (ISI) wynosił 100 ms.
5. Aby zapisać protokół, wybierz opcję Plik > Zapisz jako.
6. Dostosuj warunki oświetleniowe w komorze testowej w następujący sposób.
   1. Uruchom obliczenia pomiarowe USB, wybierz wyjście analogowe, a następnie przejdź do D/A OUT O (P13), aby wprowadzić zmiany w oświetleniu. Wartość zero oznacza brak światła, a zwiększenie wartości wyjścia cyfrowo-analogowego O zwiększa natężenie światła w pudełku. We wszystkich eksperymentach zastosowano natężenie światła 100.
7. Skonfiguruj kamerę
   1. Uruchom oprogramowanie i poczekaj, aż kamera się załaduje.
   2. Wybierz opcję Adjustments (Korekty) (znajdującą się po prawej stronie) i ustaw liczbę klatek na sekundę akwizycji na 1,000, a następnie kliknij Zastosuj, aby wprowadzić zmianę.
8. Zaaklimatyzować larwy w 100% oświetlonej światłem komorze testowej na 5 minut przed rozpoczęciem eksperymentów.
9. Aby rozpocząć eksperyment, wybierz menu Eksperyment w generatorze PPI, kliknij Uruchom i wybierz format studni (np. 33 dołki).
   1. Zawsze upewnij się, że oprogramowanie aparatu zostało uruchomione z odpowiednimi ustawieniami przed przeprowadzeniem eksperymentu.
   2. Uzyskaj 2-sekundowy film dla każdej próby.
   3. Upewnij się, że liczba klatek na sekundę pobierania jest ustawiona na 1 000.

5. Automatyczne śledzenie i analiza reakcji akustycznej na zaskoczenie i PPI

1. Konfiguracja protokołu.
   1. Uruchom oprogramowanie analityczne (patrz tabela materiałów). Wybierz Nowy z szablonu > Zastosuj wstępnie zdefiniowany szablon, a następnie przejdź przez inne menu (szczegóły poniżej).
      1. Wybierz jeden z plików wideo w obszarze Źródło wideo.
      2. Przeglądaj plik wideo. Ustaw temat jako szablon strefy > larw ryb > danio pręgowanego (brak szablonu). Określ liczbę aren w obszarze Areny.
      3. Określ liczbę tematów na arenę (ustawioną jako 1) w obszarze Tematy.
      4. Wybierz Wykrywanie punktu środkowego, punktu nosa i podstawy ogona w obszarze Śledzone obiekty (patrz Rysunek 2A,B).
         UWAGA: Jest to ważne do obliczenia kąta ciała odpowiedzi C-start (patrz Rysunek 2C).
      5. Kliknij Nazwa> zapisać jako. Używane jednostki to mm, s, deg odpowiednio dla odległości, czasu i obrotu.
         UWAGA: Pamiętaj, aby użyć tego samego urządzenia do kalibracji wagi.
   2. Wybierz ustawienie Areny.
      1. Kliknij Chwyć obraz tła.
      Postępuj zgodnie z
      2. instrukcjami w menu po prawej stronie (w razie wątpliwości skorzystaj z menu Pomoc).
      3. Wybierz narzędzie do rysowania okręgów, aby narysować areny.
   3. Wybierz Ustawienia kontroli próbnej > utwórz nową nazwę >.
   4. Wybierz Ustawienia wykrywania, wykonaj czynności opisane w menu po prawej stronie.
      1. Ustaw częstotliwość próbkowania na 25. Wybierz zaawansowane ustawienia wykrywania. W obszarze Metoda wybierz dynamiczne odejmowanie, zaawansowany model/dorosła ryba, a następnie ustaw Kolor obiektu w porównaniu z tłem jako Ciemniejszy i przesuń suwak, aby zdefiniować kontrast larwy.
      2. W obszarze Kontur obiektu wybierz najpierw erodę, a następnie rozszerz i zwiększ wartości erozji konturu i dylatacji, aż zwierzę zostanie całkowicie wykryte.
   5. Zapisz protokół i wykorzystaj go do późniejszych analiz pozyskanych filmów PPI.
2. Konfiguracja listy próbnej.
   1. Wybierz listę prób, zdefiniuj zmienne niezależne, takie jak identyfikator larw, leczenie, rodzaj bodźca itp. Wybierz ścieżkę filmów i zdefiniuj listę prób do nabycia partii.
3. Konfiguracja akwizycji.
   UWAGA: Jeśli została wygenerowana lista próbna, można przeprowadzić zbiorcze pobieranie filmów.
   1. Jeśli niektóre ścieżki zostaną utracone, użyj edytora ścieżek, aby dostosować śledzone obiekty.
   2. Wyklucz z analizy błędy śledzenia, które pozostają nierozwiązane po użyciu edytora ścieżek.
   3. Ustaw profil wygładzania ścieżki na 1 mm, aby zmniejszyć szum generowany przez dane. Można to dostosować w oparciu o aktywność tła larw.
4. Ustawienia analizy.
   1. Aby wybrać badania do analizy, wybierz pozycję Profile danych i zdefiniuj ścieżki na podstawie interesującej nas zmiennej niezależnej.
      UWAGA: Jeśli komponenty są ukryte, kliknij symbol oka w prawym górnym rogu, aby go wyświetlić.
      1. Filtruj części badań, które mają być analizowane (np. w oparciu o leczenie lub rodzaj grupy bodźców).
      2. Wybierz część ścieżek, które mają być analizowane (zagnieżdżanie). W tym badaniu dane zostały zagnieżdżone dla ścieżek między początkiem bodźca a 100 ms po wystąpieniu bodźca.
      3. Pamiętaj, aby połączyć wszystkie filtry i budki lęgowe liniami strzałek, aby zakończyć instrukcję.
   2. Zdefiniuj zmienne zależne do analizy, wybierz Profile analizy i określ zmienne będące przedmiotem zainteresowania (fokus na Treść w obszarze Zmienne zależne).
      UWAGA: Jeśli komponenty są ukryte, kliknij symbol oka w prawym górnym rogu, aby go wyświetlić.
      1. Kliknij dwukrotnie Kąt obiektu. Wybierz zgięcie bezwzględne. Przejdź przez ustawienia wersji próbnej i wybierz maksymalne, a następnie kliknij dodaj.
   3. Kliknij dwukrotnie stan kąta obiektu. Ustaw przedział uśredniania na 5 próbek. Ustaw próg kąta gięcia. Aby obliczyć statystyki dla gięcia, przejdź przez Statystykę próbną i wybierz opóźnienie, które ma być najpierw > dodania. Powtarzaj kroki, aż uzyskasz różne progi (zastosowano zakres 20–80°) i odpowiednio nazwij.
   4. Generowanie statystyk i wykresów.
      1. Wybierz wyniki > analizy > statystyk i wykresów, a następnie kliknij przycisk Oblicz.
      2. Upewnij się, że profile danych i analiz są ustawione na odpowiedni szablon, ponieważ w każdej sekcji można utworzyć kilka szablonów.
   5. Eksportuj statystyki próbne i grupowe jako pliki arkuszy kalkulacyjnych do przetwarzania i analizy.

6. Analiza danych

1. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego zawierający statystyki badania.
2. Wybierz kolumny: Kąt korpusu, Maksymalny stopień, Opóźnienie zgięcia (z różnych progów kąta bryły).
3. Każdą zmianę kąta nachylenia ciała ≥ 30° w ciągu 50 ms po wystąpieniu bodźca należy traktować jako pozytywną reakcję C-start (tj. reagowanie); osoby z kątem < ciała 30° nie reagują.
4. W sposób binarny przypisz 1 do reagującej larwy i 0 do larw nie reagujących na każdą płytkę.
   1. Policz całkowitą liczbę larw reagujących i niereagujących na każdą płytkę. Obliczyć liczbę odpowiadających (%) w każdym przypadku obliczoną jako (liczba larw reagujących/całkowita liczba larw) × 100. Wyklucz z analizy larwy, które reagują mniej niż 30% na bodziec zaskoczenia¹⁶.
      UWAGA: Każda intensywność bodźca, która jest w stanie wywołać reakcję C-start u co najmniej 70% larw, jest uważana za odpowiedni bodziec do zaskoczenia¹⁶.
5. Oblicz %PPI jako 100 × (procent reakcji na bodziec zaskoczenia − procent reakcji na bodziec przestraszenia + sekwencja przestraszenia)/ (procent reakcji na bodziec przestraszenia)16.

7. Analiza statystyczna

1. Przedstaw dane jako średnią ± odchylenie standardowe, S.D. (patrz tabela materiałów dla oprogramowania statystycznego).
2. Określ wpływ różnych intensywności prepulsów na odpowiedź larw za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya.
3. Zastosować dwukierunkową ANOVA, a następnie test post-hoc Holma-Sidaka w celu określenia wpływu leczenia farmakologicznego na % odpowiedzi PPI o różnej intensywności impulsów wstępnych.

Wyniki

Przeprowadzono trzy eksperymenty w celu sprawdzenia protokołu łączenia wielu systemów w celu analizy hamowania prepulsu reakcji akustycznego na przerażenie u larw danio pręgowanego. Po pierwsze, przetestowano zdolność do dokładnego dostarczania bodźców akustycznych i uchwycenia reakcji larw na bodziec zaskoczony. Następnie sprawdzono zdolność do tłumienia reakcji na zaskoczenie, gdy prezentowany jest bodziec prepulsacyjny. Na koniec ustalono zdolność do wykrywania farmakologicznej modulacji hamowania reakcji przedimpulsowej reakcji na przerażenie przez leki apomorfinę, haloperidol i ketaminę.

Reakcja larw danio pręgowanego na bodźce akustyczne zaskoczenia
Wcześniejsze prace wykazały, że larwy danio pręgowanego wykazują charakterystyczny C-start, gdy są prezentowane z zaskakującym bodźcem akustycznym¹⁶. Przetestowano zdolność do pobudzania i wychwytywania zachowania larw pod wpływem bodźców odstraszających. Zaobserwowano, że zarejestrowane larwy wykazują odpowiedź C-start (Rysunek 2). Bodziec o natężeniu 70 dB re (100 ms, 660 Hz, rysunek uzupełniający 1A) był wystarczająco silny, aby wywołać reakcję u ≥70% larw (Rysunek 3A). Wielokrotnie prezentowany 30 razy w odstępach międzypróbnych wynoszących 30 s, bodziec o natężeniu 70 dB nie powodował przyzwyczajenia larw (N = 3 powtórzenia; 16 larw/replikę), jak pokazano na Rysunek 3B.

Prepulse zmniejsza reakcję na bodźce akustyczne u larw danio pręgowanego
Mnóstwo dowodów pokazuje, że bodźce przedimpulsowe modulują reakcję larw na bodziec zaskoczenia^15,21,22,26. Zastosowano paradygmat dwupulsacyjny, w którym słaby bodziec zwany impulsem wstępnym poprzedzał bodziec wywołujący przerażenie zwany impulsem. Zastosowane bodźce przedimpulsowe były o 20, 17 lub 14 dB mniejsze niż bodziec impulsowy, który był ustawiony na 70 dB re. Impuls wstępny (5 ms, 440 Hz) był zawsze prezentowany 100 ms przed wystąpieniem impulsu (rysunek uzupełniający 1B). Każdy badany bodziec prepulsowy istotnie zmniejszał odpowiedź larw na impuls. W Rysunek 4 reakcja larw (w %) na bodźce akustyczne są pokazane dla 6 dpf TL w podłożu E3, N = 6 (16 larw/grupę). Odsetek larw reagujących na bodziec strachu (puls) wynosił 79,86 ± 9,772. Zgodnie z oczekiwaniami, gdy bodziec zaskoczenia był poprzedzony impulsem wstępnym o natężeniu 50, 53 lub 56 dB, odpowiedź larw zmniejszyła się odpowiednio do 40,87% ± 11,30%, 39,58% ± 7,345% i 29,17% ± 9,350%. Jednokierunkowa analiza Anova ujawniła statystyczną różnicę w wpływie bodźca na larwy (F (3, 48) = 57,23, P < 0,0001), przy czym test wielokrotnych porównań Tukeya ujawnił istotność statystyczną w grupach w 95% przedziale ufności.

Farmakologiczna modulacja hamowania przedimpulsowego
Wcześniejsze badania wykazały, że leki dopaminergiczne, apomorfina i haloperidol, a także lek glutaminergiczny ketamina, znacznie modulowały hamowanie przedimpulsowe u larw, podobnie jak u ich odpowiedników u ssaków i gryzoni¹⁶. Stężenia do walidacji konfiguracji zostały wybrane na podstawie tych badań. Interwał między bodźcami (ISI) dla wszystkich eksperymentów farmakologicznych wynosił 100 ms.

Wpływ apomorfiny na hamowanie przedimpulsowe
W Rycina 5, larwy wstępnie leczone 10 mg/ml apomorfiny przez 10 minut wykazywały ogólne zmniejszenie % PPI w porównaniu z larwami kontrolnymi E3 (dwukierunkowa ANOVA, non RM (czynniki: intensywność leczenia i prepulsu; leczenie: F (1, 34) = 16,21, p = 0,0003; intensywność przedimpulsu: F (2, 34) = 8,674, P = 0,0009, wykazało to nieistotną interakcję: F (2, 34) = 2,514, p = 0,0959). Aby bardziej szczegółowo zbadać różnice, test post-hoc Holma-Sidaka ujawnił znaczące różnice w reakcji na przerażenie między grupą kontrolną E3 a larwami leczonymi apomorfiną przy intensywności przedimpulsowej 53 (p = 0,0126) i 56 (p = 0,0044), ale nie przy 50 dB (p = 0,5813).

Wpływ haloperidolu na hamowanie przedimpulsowe
Rysunek 6 pokazuje ogólny wzrost %PPI u larw leczonych przez 20 minut haloperidolem 20 μM w porównaniu do larw w pożywce E3 (dwukierunkowa ANOVA, non RM (czynniki: intensywność leczenia i prepulsu; leczenie: F (1, 32) = 20,75, p < 0,0001; intensywność przedimpulsu: F (2, 32) = 3,147, p = 0,0565, bez istotnej interakcji: F (2, 32) = 0,7455, p = 0,4826). Korzystając z testu post-hoc Holma-Sidaka, obecność istotności statystycznej zaobserwowano tylko przy intensywności prepulsu 53 (p = 0,00489 i 56 (p = 0,0348), ale nie przy 50 dB (p = 0,067).

Wpływ ketaminy na hamowanie przedimpulsowe
Rysunek 7 pokazuje, że przy różnych intensywnościach bodźców prepulsowych, występowały różnice w reakcji na przerażenie między larwami kontrolnymi E3 a tymi wstępnie leczonymi przez 10 minut w 1,0 mM ketaminy (dwukierunkowa ANOVA, bez RM (czynniki: intensywność leczenia i prepulsu; leczenie: F (1, 35) = 25,46, p < 0,0001; intensywność przedimpulsu: F (2, 35) = 6,018, p = 0,0057, bez istotnej interakcji: F (2, 35) = 0,8450, p = 0,4381). Test post-hoc Holma-Sidaka wykazał istotność tylko przy intensywności preimpulsu 50 (p = 0,0039) i 53 (p = 0,0027), ale nie przy 56 dB (p = 0,0802).

Rysunek 1: Aparatura badawcza. (A) Przegląd konfiguracji sprzętu. (B) Wewnętrzna izolacja sprzętu ustawiającego w celu zminimalizowania szumów tła podczas eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza akustycznej reakcji larw danio pręgowanego na przestraszenie. (A) Charakterystyczny C-start wykazywany przez 6 larw danio pręgowanego przy 6 dpf. (B) Reprezentatywny obraz trzech śledzonych cech nałożonych na larwę o grubości 6 dpf: punkt środkowy (czerwony), punkt nosowy (cyjan) i podstawa ogona (fioletowy). (C) Reprezentatywny obraz bezwzględnego kąta zgięcia wyświetlanego przez larwy typu dzikiego 6-dpf TL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Określenie progu akustycznego przerażenia. (A) Intensywność bodźca wynosząca 70 dB (reprezentowana przez czerwone linie przerywane) jest w stanie wywołać reakcję C-start u >70% larw (N = 33; 6 dpf TL). (B) Larwy nie przyzwyczajają się do bodźca o natężeniu 70 dB podawanego 30 razy (próby) w odstępie między próbami wynoszącym 30 s (N = 3 powtórzenia; 16 larw/replikat). Dane są przedstawione jako średnia ± S.D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wywołany przed impulsem spadek odpowiedzi larw (%). Bodźce przedimpulsowe o natężeniu 20, 17 i 14 dB niższym niż 70 dB powodują zmniejszenie liczby larw TL typu dzikiego, które reagują na atak C-start. Wszystkie dane przedstawione jako średnia ± S.D., N = 5 (16 larw / grupa), ****p < 0,0001, istotnie różniące się od bodźca zaskoczenia przez test post-hoc Tukeya po jednokierunkowej ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Deficyty %PPI wywołane apomorfiną. Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± S.D., N = 4\u20125 (16 larw/grupę), statystycznie istotna różnica w teście post-hoc Holma-Sidaka po dwukierunkowej ANOVA. *p = 0,0126, grupa leczona E3 ctl/apomorfiną przy 53 dB; **p = 0,0044, grupa leczona E3 ctl/apomorfiną przy 56 dB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Zwiększenie %PPI wywołane przez haloperidol.Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± S.D., N = 4\u20125 (16 larw/grupę), statystycznie istotną różnicę w teście post-hoc Holma-Sidaka po dwukierunkowej Anovie. **p = 0,0048, grupa leczona DMSO ctl/apomorfiną przy 53 dB; *p = 0,0348, grupa leczona DMSO ctl/apomorfiną przy 56 dB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Zwiększenie %PPI wywołane przez ketaminę. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± S.D, N = 4\u20125 (16 larw/grupę), statystycznie istotna różnica w teście post-hoc Holma-Sidaka po dwukierunkowym Anova **p = 0,0039, grupa leczona E3 ctl/apomorfiną przy 50 dB, **p = 0,0027, grupa leczona E3 ctl/apomorfiną przy 53 dB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Reprezentatywny film przedstawiający larwy wykazujące C-start w odpowiedzi na akustyczny bodziec akustyczny o natężeniu 70 dB. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek uzupełniający 1: Reprezentatywne przykłady warunków generowanych bodźców przy użyciu generatora PPI. (A) próba samego bodźca, (B) próba hamowania przed impulsem (pre-puls + puls), (C) próba bez bodźca w celu zmierzenia progowego kąta zgięcia linii bazowej niestymulowanych larw. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Niezbędna jest walidacja każdego nowego systemu testów behawioralnych w celu ulepszenia i udoskonalenia protokołów badań neurobehawioralnych. W obecnym badaniu oceniono zdolność dwóch dostępnych na rynku systemów i oprogramowania do wywoływania akustycznej reakcji zaskoczenia u larw danio pręgowanego oraz do wykrywania i ilościowego określania wcześniej opisanej farmakologicznej modulacji takich zachowań.

Przeprowadzono szereg modyfikacji i rozwiązywania problemów w celu optymalizacji konfiguracji. Domyślne oprogramowanie do analizy odpowiedzi C-start polegało na tym, że analiza była automatycznie kontynuowana po uzyskaniu danych z każdego eksperymentu (22 próby/płytkę stanowiły eksperyment). Zmniejszyło to liczbę płyt, które można było przetworzyć w ciągu dnia, zmniejszając w ten sposób przepustowość (5 płyt dziennie). Aby uniknąć tego ograniczenia, zaistniała potrzeba oddzielenia oprogramowania analitycznego od procesu gromadzenia danych, co zwiększyło przepustowość do średnio 10 płytek dziennie. W związku z tym decyzja o zwróceniu się do niezależnego oprogramowania analitycznego do analizy na żywo okazała się skuteczna i bardziej efektywna. Aby uniknąć zakłóceń powodowanych przez cienie lub inne zanieczyszczenia, które wprowadzają szum do danych, zaleca się całkowite wypełnienie studzienek pożywką, usunięcie wszystkich pęcherzyków i unikanie cząstek pokarmu lub podobnych, które można pomylić z larwami, generując w ten sposób szum w danych. Po kalibracji bodźców dźwiękowych maksymalne natężenie osiągane przez system wzmacniacza uchwycone przez miernik dB wynosiło 85 dB re, podczas gdy początkowy szum tła w komorze testowej wynosił 60 dB re. Spowodowało to wąskie okno dB, w którym można było pracować. W związku z tym tak ważne było, aby hałas w tle był jak najmniejszy. Aby to osiągnąć, użyto materiału akustycznego parafon (patrz Tabela Materiałów) do zbudowania dodatkowej warstwy izolacji wokół komory testowej oraz dodatkowej warstwy izolacji za pomocą wiązki kabiny głosowej (patrz Tabela materiałów). Dzięki tym warstwom izolacji hałas tła wewnątrz komory testowej został skutecznie zredukowany z początkowych 60 dB do 45 dB re.

Obecnie jedną z zalet tej konfiguracji jest to, że wszystkie komponenty są dostępne na rynku i jako takie nie ograniczają się tylko do kilku laboratoriów. Osoby z ograniczoną wiedzą w języku kodowania mogą z niego korzystać, ponieważ protokół jest dość łatwy do zrozumienia i przestrzegania. Na przykład, dzięki zastosowaniu systemu PPI, możliwe było dostarczanie impulsów i preimpulsów w różnych odstępach czasu między bodźcami i między próbami, a także uchwycenie reakcji larw na takie bodźce. Po uchwyceniu tych zachowań można je sklasyfikować za pomocą oprogramowania analitycznego na osoby reagujące i niereagujące. Grupa respondentów została sklasyfikowana jako larwy, które wykazywały start C wynoszący 30° lub więcej przy opóźnieniu <50 ms. Ponadto odpowiedź PPI jest modulowana przez leki, które celują w sygnalizację dopaminergiczną i glutaminergiczną (przegląd Geyera i współpracowników²⁷). Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, apomorfina, nieselektywny agonista receptora dopaminy, zmniejszała hamowanie reakcji na zaskoczenie przed impulsem u larw danio pręgowanego, podczas gdy haloperidol, antagonista dopaminy, wzmacniał odpowiedź. Wykazano, że u larw danio pręgowanego ketamina moduluje PPI w różny sposób w zależności od czasu trwania ISI¹⁶. We wspomnianym badaniu PPI larw został zwiększony po 30 ms, ale stłumiony po 500 ms ISI po wstępnym leczeniu ketaminą. Chociaż w badaniu tym nie zastosowano zmiennego ISI, obserwacja, że ketamina zwiększa PPI przy ISI 100 ms, sprawia, że jest ono porównywalne z danymi z poprzedniego badania, gdy zastosowano ISI 30 ms. Badanie wykazało, że dzięki połączeniu tych dostępnych na rynku systemów możliwe jest przeprowadzenie testu IPP i wiarygodne wykrycie farmakologicznie wywołanych zmian w odpowiedzi PPI larw danio pręgowanego. Ograniczeniem systemu jest to, że cecha punktu nosa śledzona przez oprogramowanie analityczne zawsze pada na jedno z oczu larwy, tworząc w ten sposób kąt bazowy. Aby temu zaradzić, konieczne jest zawsze określenie podstawowego kąta zgięcia niestymulowanych larw, który okazał się wynosić ~30° dla larw użytych w tym badaniu. W ten sposób powstało podstawa do wyboru 30° jako progu tego, co uznano za pozytywną odpowiedź C-start u zaskoczonych larw. Jeżeli te punkty zostaną wzięte pod uwagę, powinno być możliwe przeprowadzenie testu IPP w dowolnym laboratorium posiadającym dostęp do sprzętu do konfiguracji. W tym artykule nie skupiono się na kategoryzacji kinematyki reakcji na zaskoczenie na krótkie opóźnienia i długie opóźnienia, jak opisano wcześniej¹⁶, ze względu na zakres zmienności opóźnienia. W związku z tym zastosowano tylko odpowiedzi C-start <50 ms po wystąpieniu^bodźca15.

Doniesiono, że różnice w szczepach wpływają na zachowanie danio pręgowanego w kilku testach 28,29,30,31, a także wpływają na wrażliwość słuchu³². W związku z tym konieczne jest określenie podstawowego kąta zgięcia każdego badanego szczepu. Ponieważ wrażliwość słuchu może być również różna, ważne jest, aby określić podstawowe reakcje na przerażenie, natężenie dźwięku najbardziej odpowiednie jako bodziec przedimpulsowy lub przestraszony dla każdego szczepu oraz czas trwania bodźca. ISI jest kolejnym parametrem, który powinien być dokładnie rozważony, ponieważ niektóre leki mogą zwiększać lub zmniejszać PPI w zależności od odstępu między początkiem bodźca poprzedzającego i zaskoczonego¹⁶. Oczekuje się, że laboratoria zainteresowane badaniem funkcji poznawczych, zaburzeń neuropsychiatrycznych i słuchu (funkcji słuchowych) uznają tę konfigurację i protokół PPI za przydatny w badaniach przesiewowych ich modeli farmakologicznych i/lub genetycznych. Protokół ten stanowi również podstawę do wysokoprzepustowego badania przesiewowego bibliotek złożonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Apomorfina	Sigma Aldrich	A4393	Agonista dopaminy
miernik dB	Instrumenty PCE	PCE-MSM 4	Do pomiaru intensywności bodźca
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Do rozpuszczania organicznych substancji rozpuszczonych
Wzmacniacz Dynavox		CS-PA1 MK	Do dostarczania bodźców akustycznych
EthoVision XT	Noldus, Holandia	EthoVision XT, wersja 14	Oprogramowanie do automatycznego śledzenia
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	Wersja 8	Oprogramowanie do analizy statystycznej
Haloperidol	Sigma Aldrich	H1512	Antagonista dopaminy
Ketamina	Sigma Aldrich	Y0000450	Antagonista receptora NMDA
Parofon materiały akustyczne	Paroc	8528308	Pomaga zredukować szumy tła w szafie testowej
t.akustik Vocal Booth Bundle	Thormann, Niemcy	458543	Pomaga zredukować szumy tła w szafce testowej
ZebraBox Revo z dodatkami PPI	ViewPoint, Francja	ZebraBox Revo z dodatkami PPI	Obejmuje sprzęt i oprogramowanie