Method Article

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

DOI:

10.3791/61433

⸱

August 11th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki dostępne do mechanicznej charakterystyki w mikro- i nanoskali eksplodowały w ciągu ostatnich kilku dekad. Od dalszego rozwoju skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego, po wynalezienie mikroskopii sił atomowych i postępy w obrazowaniu fluorescencyjnym, nastąpił znaczny postęp w technologiach umożliwiających badanie małych materiałów. Conpokal to portmanteau, który łączy mikroskopię konfokalną z mikroskopią sił atomowych (AFM), w której sonda "szturcha" powierzchnię. Chociaż każda technika jest niezwykle skuteczna w jakościowym i/lub ilościowym zbieraniu obrazów samodzielnie, Conpokal zapewnia możliwość testowania za pomocą mieszanego obrazowania fluorescencyjnego i charakterystyki mechanicznej. Zaprojektowany do niemal jednoczesnego obrazowania konfokalnego i sondowania sił atomowych, Conpokal ułatwia eksperymentowanie na żywych próbkach mikrobiologicznych. Dodatkowy wgląd w sparowane oprzyrządowanie zapewnia kolokalizację mierzonych właściwości mechanicznych (np. modułu sprężystości, przyczepności, chropowatości powierzchni) przez AFM ze składnikami subkomórkowymi lub aktywnością obserwowaną za pomocą mikroskopii konfokalnej. Praca ta zapewnia krok po kroku protokół działania skaningowej mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych, jednocześnie, w celu uzyskania tej samej komórki, tego samego regionu, obrazowania konfokalnego i charakterystyki mechanicznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia do mechanicznej oceny w mikro- lub nanoskali są często wykorzystywane do odkrywania cech deformacji na poziomie pojedynczej komórki lub mikroorganizmu, podczas gdy oddzielne narzędzia mikroskopowe o wysokiej rozdzielczości są używane do wizualizacji procesów subkomórkowych i cech strukturalnych. Conpokal to połączenie laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych (AFM) w jedną platformę instrumentalną. Technika Conpokal została po raz pierwszy zastosowana w niebiologicznym systemie polimerowym, w którym celem było określenie przyczepności, elastyczności i napięcia powierzchniowego twardych powierzchni stykających się z miękkimi powierzchniami. Obrazy konfokalne zapewniły wizualne odwzorowanie tego, jak polimer odkształca się, przylega i uwalnia z twardej sondy1,2. Od polimerów po próbki biologiczne, technika ta daje możliwość niemal jednoczesnego obrazowania konfokalnego żywych komórek lub mikroorganizmów i AFM.

Zmiany w elastyczności komórek są związane z patogenezą wielu chorób ludzkich3 w tym zaburzeń naczyniowych4, malaria5,6, anemia sierpowatokrwinkowa7, artretitis8, astma9, oraz rak6,10,11,12,13,14,15. Typowe techniki pomiaru mechaniki komórek obejmują użycie kulek magnetycznych16,17, pęseta optyczna18,19, aspiracja mikropipety8,20,21,22, oraz AFM11,23,24,25,26. Od czasu zastosowania AFM do żywych komórek, został on łatwo przystosowany do charakteryzowania topografii komórek27,28, a także właściwości mechanicznych11,24,29,30,31 z nanoskalową precyzją. AFM został dodatkowo zaadaptowany do mikroreologii32,33, frequency modulation34,35, and creep25,36,37 eksperymenty mające na celu zbadanie właściwości lepkosprężystych różnych linii komórkowych. Zastosowanie odpowiedniego modelu nanokontaktowego ma kluczowe znaczenie dla wyodrębnienia ilościowych wartości elastyczności z pomiarów siły wgniecenia wytworzonych przez AFM1,2. Badania AFM, które badają wpływ leków stosowanych w cytoszkieletzie na elastyczność komórek, wykazały, że moduł sprężystości jest silnie zaburzony38. Na podstawie pomiarów modułu sprężystości wielu badaczy wykazało, że komórki nowotworowe są bardziej miękkie niż ich nieprzekształcone odpowiedniki11,38,39. Zwiększona odkształcalność prawdopodobnie odgrywa znaczącą rolę w zdolności komórek nowotworowych do tworzenia przerzutów i infiltracji tkanek40. Takie zachowanie jest regulowane przez modyfikacje w organizacji komórek cytoszkieletu38,41,42. Oprócz raka, inną klasą chorób mechanicznych są choroby układu oddechowego. Na przykład zespół ostrego stresu oddechowego dotyka każdego roku coraz więcej ludzi. Wykazano, że gdy pacjenci są poddawani wentylacji mechanicznej, z wysokim stężeniem tlenu, ich stan może się pogorszyć43. W serii badań obserwujących makrofagi nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą AFM naukowcy odkryli, że dodanie środowiska bogatego w tlen zwiększyło sztywność komórek w wyniku tworzenia aktyny; Doskonałym przykładem wpływu, jaki AFM wywiera na nasze szczegółowe zrozumienie wpływu środowiska atmosferycznego na funkcję oddechową na poziomie komórkowym, a ostatecznie na leczenie i zdrowie człowieka44,45,46. Sztywność komórek nabłonka podczas migracji w kierunku rany można również ocenić za pomocą AFM i że występuje zmiana modułu sprężystości, aby zasygnalizować przyszłe rozprzestrzenianie się komórek47,48. Dlatego istnieje praktyczna potrzeba ilościowego pomiaru mechaniki komórek, aby zrozumieć, w jaki sposób chore komórki różnią się od zdrowych komórek i wchodzą z nimi w interakcje.

AFM jest również używany do badania właściwości adhezyjnych i struktury powierzchni. Mikroskop sił atomowych ma różne tryby zbierania informacji o próbce za pomocą mechaniki kontaktowej. W przypadku żywych próbek biologicznych dwa z głównych celów to uzyskanie ilościowych wartości właściwości mechanicznych (np. modułów sprężystości, sił adhezji), a także wysokości powierzchni mapy. Tryby te obejmują tryb gwintowania (znany również jako kontakt przerywany), który utrzymuje stałą amplitudę wspornika sporadycznie stykając się z powierzchnią próbki oraz tryb kontaktowy, który podnosi lub obniża wspornik, aby utrzymać stałe ugięcie49. Mapy przyczepności można zbierać za pomocą mapowania sił w systemie AFM. Wspornik wcina próbkę z określoną siłą, a następnie jest cofany. Siła opierająca się cofaniu jest mierzona przez detektor w celu wygenerowania wykresu siły-przemieszczenia. Siła adhezji to maksymalna siła mierzona podczas wciągania. Morfologia powierzchni zapewnia szczegółowy obraz próbki na poziomie mikro lub nano. Wspornik wykonuje skanowanie rastrowe w poprzek próbki w oparciu o wgłębienia i ugięcie uchwycone przez ruch wspornika w każdym pikselu, ujawniając cechy o rozmiarach mikro i nano. Za pomocą AFM można zmierzyć rozmiar małych obiektów, takich jak struktura peptydoglikanu 50, alignment łańcucha polimerowego51, flagella52, lamellipodia53 i filipodia54. Podczas gdy siła AFM tkwi w krzywych siła-przemieszczenie i nieoptycznych obrazach topologicznych, mikroskopia konfokalna oferuje szczegółowe obrazowanie próbek znakowanych fluorescencyjnie.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest dominującą techniką obrazowania żywych komórek, komórek stałych i tkanek55,56,57. CLSM jest stosowany w obrazowaniu biologicznym od 1955 roku, tj. od momentu jego powstania58,59. Podczas gdy zasada działania mikroskopów konfokalnych (tj. odrzucanie nieostrego światła przez otwór przez otwór) pozostała w dużej mierze taka sama, implementacja techniczna stała się bardzo zróżnicowana56,57,58,60. Obrazowanie konfokalne może być realizowane poprzez skanowanie wielopunktowe, jak w systemie obracającego się dysku61, skanowanie punktowe pojedynczej wiązki laserowej, jak w skanowaniu liniowym62, lub obrazowanie funkcji rozproszenia punktów z kolejnymi reprzypisacjami pikseli za pomocą detektora wieloelementowego57. Ostatnie osiągnięcia, które rozszerzają użyteczność obrazowania konfokalnego, obejmują możliwość skanowania laserowego, szybkie skanowanie rezonansowe i detektory o wysokiej czułości63,64,65. Przewagą wszystkich systemów konfokalnych nad mikroskopami szerokokątnymi jest możliwość wykonywania przekrojów optycznych w osi z większą szczegółowością, zwłaszcza w grubych próbkach. Mikroskopy szerokokątne wykorzystujące detekcję opartą na kamerze zbierają światło emitowane z płaszczyzny ogniskowej i jednocześnie światło emitowane z każdego miejsca na ścieżce oświetlenia. Zamykając otwór, kosztem zmniejszenia sygnału, można zwiększyć zarówno rozdzielczość osiową, jak i poprzeczną66. W CLSM obrazy są budowane piksel po pikselu poprzez zbieranie sygnału emisyjnego, gdy laser wzbudzający jest skanowany w polu widzenia x-y. Zebranie kilku płaszczyzn x-y wzdłuż osi z próbki może być następnie wykorzystane do zrekonstruowania 3-wymiarowej architektury próbki57,67. Mikroskopia konfokalna w połączeniu z wprowadzeniem białek fluorescencyjnych zrewolucjonizowała nasze rozumienie biologii komórki68. Na przykład stał się niezbędnym narzędziem w neurobiologii69. CLSM jest regularnie używany do obserwacji oczyszczonych tkanek oraz do uzyskiwania kompleksowych obrazów architektury mózgu i sieci neuronalnej zabarwionej immunologicznie70. Ta aplikacja zaowocowała nowymi spostrzeżeniami na temat kontaktów synaptycznych i komunikacji między neuronami i komórkami glejowymi w mózgu71. Od komórek mózgowych po pęcherzyki, protokoły barwienia fluorescencyjnego wspierają kontrolę i uchwycenie funkcji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu osiągnięcia postępów w technikach terapeutycznych72,73.

Chociaż są to imponujące i wszechstronne narzędzia indywidualnie, połączenie mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych (Conpokal) pozwala badaczom na unikalne skorelowanie topograficznych i mikromechanicznych właściwości komórek/tkanek z obserwacją różnych organelli komórkowych i ich odpowiedniej dynamiki. Sparowane oprzyrządowanie pozwala użytkownikom zasadniczo "zobaczyć" to, co sondują; Ogromna przewaga nad jedną techniką samą w sobie. W przypadku Conpokal mapowanie sił przez AFM jest nakładane na obrazy konfokalne w celu skorelowania sztywności komórek, adhezji lub morfologii ze strukturą cytoszkieletu w próbce, na przykład. Ogólnym celem metody Conpokal jest zapewnienie naukowcom platformy do badania żywych próbek w zwięzły i skuteczny sposób, dostarczając zarówno obrazu, jak i danych o właściwościach materiałów na jednej platformie. W tej pracy demonstrujemy działanie Conpokal, w tym prawidłowy wybór i przygotowanie próbki, konfigurację urządzenia, kalibrację wspornika i przedstawiamy wskazówki dotyczące skutecznego rozwiązywania problemów. Po protokole zapewniamy reprezentatywne wyniki, które obejmują udane mapowanie wysokości AFM bakterii i komórek, mapowanie modułu AFM bakterii i komórek oraz obrazowanie konfokalne komórek znakowanych wielokrotnie, poprzez konfokalne i AFM tej samej komórki. Kończymy omówieniem krytycznych etapów procedury Conpokal, zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów, ograniczeń techniki, znaczenia i perspektyw na przyszłość dla tej metody.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych, potraw

  1. Włącz źródła zasilania zarówno dla mikroskopu konfokalnego, jak i mikroskopu sił atomowych, a także wszelkich innych powiązanych instrumentów lub urządzeń używanych podczas Conpokal. Przed rozpoczęciem pomiarów należy odczekać wystarczająco dużo czasu, aby przyrządy zrównoważyły się termicznie i ustabilizowały. Zazwyczaj wystarcza 1 godzina.
  2. Przygotować jedną czystą, zatwierdzoną przez system, szklaną szalkę Petriego i napełnić do połowy, ale nie więcej niż w dwóch trzecich, solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub podobnym klarownym płynem. Ta czasza (określana jako "czasza kalibracyjna") jest oddzielona od czaszy na próbki i będzie używana do lokalizacji i kalibracji wspornika mikroskopu sił atomowych (AFM).
    UWAGA: Ważne jest, aby ciecz była klarowna i miała niską autofluorescencję, aby zapobiec wszelkim zakłóceniom widm fluorescencji. PBS jest zalecany, ponieważ naśladuje środowisko biologiczne.
  3. Przygotować eksperymentalne naczynia na próbki w taki sposób, aby związana z nimi ciecz wypełniła naczynie co najmniej do połowy. Jeśli próbka jest fluorescencyjna, upewnij się, że jest przykryta lub w ciemnym miejscu, dopóki nie będzie potrzebna. Wyczyść spód wszystkich szklanych naczyń za pomocą środka do czyszczenia soczewek i chusteczek do soczewek.
  4. Utwórz foldery przechowywania danych dla konfokalnego i AFM na dyskach twardych komputera.

2. Wybór komórek lub mikroorganizmów

  1. Aby stworzyć podstawowy roztwór bakteryjny, należy zaszczepić bakterie Streptococcus mutans, używając pętli inokulacyjnej, w 15 ml drożdży Todd Hewitt (THY) przez noc (dla fazy wykładniczej) w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Na 1 godzinę przed zakończeniem inkubacji przez noc pokryć naczynia z próbkami doświadczalnymi 1 ml roztworu poli-l-lizyny lub roztworem z poli-l-lizyną lub w ilości wystarczającej do przykrycia szklanej części naczynia ze szklanym dnem i pozostawić w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 1 godzinę. Po zastygnięciu odessać roztwór poli-l-lizyny i opłukać naczynia 3x PBS.
  3. Po 18 – 24 godzinach inkubacji bakteryjnej zaszczepić THY 1 ml zawiesiny bakteryjnej do uzyskania gęstości optycznej 0,6 – 0,7 (typowe wartości dla inokulacji to 3 ml THY z 1 ml zawiesiny bakteryjnej na szalkę). Dodać 1 ml roztworu nowych bakterii do każdego naczynia pokrytego poli-l-lizyną i inkubować przez 1 godzinę. W ciągu ostatnich 10 minut dodaj 1 ml zielonej fluorescencyjnej barwnika membranowego (stężenie 1 μM) do każdego naczynia.
  4. Opłucz każde naczynie 3x PBS. Delikatnie utrwal bakterie za pomocą około 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Opłucz każde naczynie 3x PBS po utrwaleniu.
  5. Przechowuj 293 komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) w ciekłym azocie. Przed galwanizacją przeprowadzić szybkie rozmrażanie w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  6. Dodać 1 ml roztworu macierzy błony podstawnej w pożywce do hodowli komórkowych do każdego naczynia na próbkę komórkową i inkubować (5% CO2) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Odessać roztwór i umyć naczynia pożywką do hodowli komórkowych. Umieścić na płytce wymaganą liczbę komórek HEK 293 (np. 100 000 komórek na szalkę o średnicy 35 mm) i dodać 2 ml pożywki do hodowli komórkowych. Następnie inkubować (5% CO2 ) komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
  7. Po 48 godzinach dodać 2 μl barwnika cytoszkieletu z mikrotubul fluorescencyjnych (stężenie 1x) do każdego naczynia na próbkę komórkową i inkubować przez 30 minut. Odessać roztwór zawierający barwnik, przemyć komórki 3x PBS i dodać 2 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  8. Dodać 1 μl barwnika błony plazmatycznej (stężenie 10 μM) do szalek na próbki i inkubować przez 30 minut. Przemyć roztwór zawierający barwnik 3x PBS i dodać 2 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  9. Przeciwbarwić jądro, dodając 1 μl roztworu barwnika kwasu nukleinowego (stężenie 10 μM) do szalek z próbkami i inkubować przez 30 minut. Przemyć roztwór zawierający barwnik 3x PBS i dodać 2 ml pożywki hodowlanej.

3. Procedura AFM

  1. Otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu sił atomowych (AFM), klikając ikonę oprogramowania na komputerze.
  2. Obróć lub włóż obiektyw pneumatyczny o małym powiększeniu (zalecane 10x lub 20x). Duża odległość robocza wynosząca 5 mm lub więcej jest korzystna podczas opuszczania końcówki i kalibracji.
  3. Zamontuj wybrany stolik na próbkę komórki, jeśli nie jest jeszcze zainstalowany. W przypadku żywych próbek należy użyć podgrzewacza do naczyń, aby utrzymać próbkę w żądanej temperaturze.
  4. Załadować czystą, zatwierdzoną przez system szalkę Petriego wypełnioną do połowy PBS (przygotowanym w kroku 1.2) lub podobnym przezroczystym płynem (naczynie kalibracyjne). Jeśli stolik na próbkę ma wbudowane zatrzaski, użyj ich, w przeciwnym razie użyj smaru próżniowego, aby ustabilizować próbkę.
  5. Wybierz odpowiedni wspornik AFM do żądanego zbierania danych i zainstaluj go, wykonując poniższe czynności.
    1. Za pomocą rękawiczek zamontuj chip AFM w pustaku szklanym, używając stage do montażu chipa AFM, pęsety i małego śrubokręta. Ostrożnie umieść chip AFM na pustaku szklanym i ustaw go tak, aby był wyśrodkowany. Wspornik oraz bardzo mała część chipa AFM powinny znajdować się w widocznej, nieprzezroczystej części bloku montażowego.
    2. Zabezpiecz chip śrubokrętem, dokręcając, aż wiór będzie ściśle przylegał do pustego szkła. Sprawdź, czy wspornik AFM jest prawidłowo ustawiony za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub ręcznej lunety. Dostosuj w razie potrzeby. Po prawidłowym ustawieniu umieść pustak szklany w głowicy AFM we właściwej orientacji i zablokuj go na miejscu.
      UWAGA: Orientacja chipa AFM w pustaku szklanym jest ważna, aby lasery systemowe celowały w tylną część wspornika i prawidłowo odbijały się od fotodetektora. Uważaj, aby nie dokręcić zbyt mocno podczas umieszczania, ponieważ ta procedura może spowodować pęknięcie chipa AFM, wspornika lub końcówki.
  6. Korzystając z opcji jasnego pola mikroskopu konfokalnego, zlokalizuj spód naczynia kalibracyjnego za pomocą pokrętła ostrości. Zwróć uwagę na tę wysokość z jako wartość, w której znajduje się dno naczynia w stosunku do obiektywu mikroskopu.
  7. Korzystając z panelu sterowania silnikiem systemu AFM na komputerze, który obsługuje silniki krokowe z, przesuń wspornik AFM od próbki w górę o 2000 μm.
  8. Używając obu rąk, delikatnie umieść głowicę AFM z chipem AFM na stoliku na próbkę, upewniając się, że każdy z pionowych punktów na głowicy AFM jest mocno osadzony w wyznaczonych rowkach na stoliku AFM. Gdy głowica AFM znajdzie się na miejscu, zobacz wzrokowo, jak blisko naczynia znajduje się uchwyt wspornikowy. Jeśli wydaje się, że jest zbyt blisko, tak że głowica AFM styka się lub nie przekracza 1 mm górnej części naczynia na próbkę, wycofaj ją za pomocą silników krokowych z przed opuszczeniem końcówki AFM w kierunku próbki.
  9. Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, powoli opuść chip AFM na dno szklanej naczynia za pomocą panelu sterowania silnika krokowego z w oprogramowaniu AFM. Zlokalizuj mikrometry ręczne, które kontrolują ruch x-y lub w płaszczyźnie głowicy AFM na platformie instrumentu. Dostosuj położenie wspornika AFM w polu view, korygując głowicę AFM, gdy wspornik pojawia się w view.
    1. Ponieważ położenie względem dna szalki jest w tej chwili nieznane, należy obniżyć z krokami 100 – 200 μm, aby uniknąć zderzenia końcówki AFM z szalką Petriego. Zazwyczaj końcówkę należy obniżyć o 800 – 2000 μm. Gdy końcówka jest opuszczana, obserwuj, czy w widoku oprogramowania mikroskopu pojawi się cień, który wskazuje, że końcówka AFM zbliża się do dna naczynia.
    2. Zmniejszaj przyrosty do 20 – 50 μm. Pamiętaj, aby dostosować tabele wyszukiwania (LUT) obrazu z kamery, gdy końcówka opuszcza się do naczynia, korzystając z panelu LUT w oprogramowaniu konfokalnym. Kontynuuj obniżanie końcówki AFM, wykonując małe kroki, aż będzie w większości ostra.
    3. Upewnij się, że końcówka jest wystarczająco ciemna, aby jej ogólny kształt był widoczny i wyśrodkowany w polu view. Upewnij się również, że końcówka jest rozmyta, co potwierdza, że nie napotkała jeszcze dna naczynia.
  10. Wyreguluj ostrość mikroskopu tak, aby końcówka była teraz ostra, pamiętając o odległości roboczej obiektywu. Przed przejściem do obiektywu o większym powiększeniu użyj narzędzia do pomiaru mikroskopu, aby zebrać szerokość i długość wspornika AFM, uzyskując dostęp do panelu narzędzi pomiarowych w oprogramowaniu konfokalnym. Zwróć uwagę na te pomiary.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie rozbijać obiektywu o dno naczynia na próbkę, co może również spowodować kontakt naczynia z końcówką AFM, potencjalnie ją uszkadzając.
  11. Jeśli jest obecny, wyjmij filtr światła laserowego i upewnij się, że laser AFM jest włączony, aby światło lasera stało się widoczne w optyce.
    1. Za pomocą pokręteł wyrównywania lasera przesuń go w pole view i w pobliże końcówki AFM. Gdy laser znajdzie się w tym miejscu, wymień filtr światła lasera.
    2. Za pomocą laserowych pokręteł wyrównujących umieść laser z tyłu miejsca, w którym znajduje się końcówka AFM na wsporniku. W tym momencie panel wyrównywania lasera powinien odczytywać sygnał sumy większy niż 0,0 V. Jeśli nie zostanie uzyskany żaden sygnał sumy, wyreguluj lusterko za pomocą ręcznie sterowanego pokrętła lusterka, aż na ekranie pojawi się sygnał sumy większy niż 0.0 V.
    3. Przesuwaj laser w małych ilościach we wszystkich kierunkach na wsporniku AFM, aż zostanie osiągnięty maksymalny sygnał sumy, ale pozycja znajduje się na końcówce AFM. Po ustawieniu pozycji lasera wyzeruj odchylenie pionowe i boczne za pomocą ręcznie sterowanych pokręteł odchylenia.
    4. Obserwuj panel wyrównywania lasera w oprogramowaniu AFM i za pomocą pokręteł odchylania pionowego i bocznego na głowicy AFM ustaw detektor tak, aby cel był wyśrodkowany (czerwona kropka w środku krzyża nitkowanego) i nie było odchylenia pionowego ani bocznego.
  12. Otwórz okno kalibracji w oprogramowaniu AFM. Wprowadź wszystkie informacje specyficzne dla eksperymentu. Przed kalibracją wyłącz źródło światła mikroskopu konfokalnego i zamknij obudowę AFM, jeśli ma to zastosowanie, aby dampWszelkie potencjalne dźwięki pochodzące ze światła w pomieszczeniu lub wibracje pomieszczenia. Następnie naciśnij przycisk kalibracji, aby automatycznie umożliwić systemowi kalibrację końcówki. Po zakończeniu kalibracji sztywność wspornika (N/m) i jego czułość (nm/V) zostaną podane w panelu kalibracyjnym. Zanotuj je do późniejszej analizy.
  13. Cofnąć wspornik AFM na co najmniej 2000 μm za pomocą silników krokowych. Zdejmij głowicę AFM ze sceny i wyjmij miskę kalibracyjną. Obróć do żądanego obiektywu lub wstaw go. Cofnij obiektyw o 10% odległości roboczej, jeśli system jest zaprogramowany tak, aby utrzymywać tę samą płaszczyznę ogniskową między obiektywami. Jeśli jest to obiektyw olejkowy, umieść jedną kroplę olejku immersyjnego na oku obiektywu.
    UWAGA: Chowanie obiektywu zmniejsza prawdopodobieństwo kontaktu obiektywu z naczyniem na próbkę podczas umieszczania.
  14. Aby bezpiecznie utrzymać naczynie na próbkę, użyj bawełnianego wacika, aby nałożyć małe krople smaru próżniowego wokół krawędzi pierścienia próbki w stoliku próbki lub użyj klipsów do próbek. Ostrożnie załaduj naczynie na próbkę do stolika na próbki.
  15. Po umieszczeniu próbki należy ją obrócić kilka razy, aby zapewnić dobre uszczelnienie naczynia z uchwytem próbki za pomocą smaru. Podnieś obiektyw na dno naczynia, aż olej po prostu przeniknie przez oko obiektywu.
  16. Za pomocą mikroskopu, bez głowicy AFM na stoliku, ustaw ostrość systemu obrazowania tak, aby próbka była ostra. Zwróć uwagę na tę wysokość z w celach informacyjnych.
  17. Ostrożnie umieść głowicę AFM na platformie.
  18. Korzystając z silników krokowych z, opuść końcówkę w kierunku próbki. Gdy końcówka AFM jest opuszczona, dostosuj tabele wyszukiwania (LUT) na obrazie w jasnym polu zgodnie z potrzebami. Opuść końcówkę, aż będzie prawie ostra. Korzystając z ręcznie obsługiwanych mikrometrów położenia końcówki AFM, przesuń głowicę AFM tak, aby końcówka AFM znajdowała się pośrodku lub wyśrodkowana z lewej strony w polu view.
    UWAGA: Ponieważ wysokość z AFM została odnotowana wcześniej w kroku 3.6, można podjąć większe kroki w celu obniżenia końcówki AFM, jednak na dno naczynia dodano smar i potencjalnie olej do obiektywu, więc ta wartość jest tylko orientacyjna. Zaleca się robienie kroków co 50 – 100 μm i zmniejszanie w miarę ustawiania ostrości końcówki
  19. Wyreguluj położenie lasera za pomocą ręcznych mikrometrów na głowicy AFM. W razie potrzeby wyzeruj ugięcia pionowe i boczne, regulując odpowiednie pokrętła i ponownie skalibruj wspornik AFM w naczyniu na próbkę.
    UWAGA: Jeśli wspornik został skalibrowany w ośrodku innym niż próbka, musi zostać ponownie skalibrowany w medium skanującym, aby uwzględnić potencjalną zmianę współczynnika załamania światła. Dodatkowo laser może dryfować z tyłu wspornika z powodu hałasu lub zmian temperatury. W przypadku kalibracji bezdotykowej należy ponownie wyregulować laser i ponownie skalibrować go w razie potrzeby oraz w naczyniu na próbkę nad szklanym podłożem. W przypadku korzystania z kalibracji kontaktowej należy ponownie skalibrować wnętrze naczynia kalibracyjnego za pomocą sample medium.
  20. Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy z mikroskopu konfokalnego, należy wymienić filtr tłumiący prąd na filtr, który blokuje całe światło lasera AFM. Ten filtr światła zapewnia brak zakłóceń powodowanych przez jasne światło lasera AFM.
  21. Korzystając z przycisku polecenia automatycznego zbliżania się, zwykle oznaczonego strzałką skierowaną w dół, opuść końcówkę na dno naczynia na próbkę. Ustaw rozmiar/obszar skanowania, rozdzielczość, wartość zadaną, długość z i czas piksela (lub użyj wartości skalibrowanych/propagowanych) na panelu sterowania obrazowaniem i rozpocznij skanowanie.
  22. Po zakończeniu skanowania podnieś chip AFM o 50 – 100 μm do góry, a następnie przejdź do nowej pozycji pomiarowej w naczyniu na próbkę. Po znalezieniu nowej lokalizacji podejdź do szyby i rozpocznij skanowanie ponownie, wykonując kroki 3.21 i 3.22.
  23. Wybierz opcję Autozapis lub ręcznie zapisz każdy wygenerowany plik z każdego pojedynczego skanu, klikając Zapisz.

4. Procedura konfokalna

  1. Otwórz oprogramowanie operacyjne konfokalne. Upewnij się, że wszystkie powiązane urządzenia peryferyjne, źródła światła i kontrolery są włączone i działają normalnie.
  2. Obróć lub włóż obiektyw o małym powiększeniu (10x lub 20x), aby view próbka. Upewnij się, że obiektyw znajduje się w bezpiecznej odległości roboczej od miejsca, w którym będzie znajdować się naczynie na próbkę i w razie potrzeby wycofaj obiektyw, aby uniknąć potencjalnej kolizji obiektywu z próbką. Za pomocą bawełnianego wacika natrzyj tłuszcz próżniowy wokół krawędzi pierścienia naczynia na próbkę. Jeśli używasz obiektywu olejkowego, umieść pojedynczą kroplę olejku immersyjnego na przedniej soczewce obiektywu
  3. Umieść żądaną próbkę w stoliku na próbkę. Zakręć próbkę kilka razy, aby upewnić się, że smar próżniowy wytworzył ścisłe połączenie z wkładką stolika na próbkę lub użyj klipsów do próbek. Jeśli używasz obiektywu olejowego, podnieś obiektyw do dna naczynia, aby olej po prostu spływał po szklanym dnie. Aby uniknąć nadmiernego wybielania, zminimalizuj oświetlenie otoczenia.
  4. Korzystając z trybów jasnego pola lub epifluorescencji za pomocą aparatu lub okularów, zlokalizuj próbkę i za pomocą pokrętła ostrości ustaw ostrość na obszarze zainteresowania zawierającym wiele komórek lub pojedynczą komórkę. Często pole widzenia w mikroskopie optycznym będzie większe niż okno skanowania x-y w systemie AFM (100 x 100 μm). Dokonaj regulacji pozycji AFM w konfokalnym polu view za pomocą panelu sterowania silnikiem w oprogramowaniu AFM, tak aby skan AFM i optyka konfokalna obrazowały te same cechy.
    UWAGA: W polu widzenia zazwyczaj znajduje się tylko kilka komórek, więc łatwiej jest określić, która komórka jest pożądana do sondowania. W miarę przeprowadzania AFM komórka staje się widoczna w oprogramowaniu AFM, a stamtąd użytkownik może wskazać określone obszary zainteresowania do zbadania.
  5. W razie potrzeby uchwyć obrazy w jasnym polu lub epifluorescencji za pomocą aparatu lub trybów CLSM w oparciu o etykietę próbki, pokrętła ostrości i przyciski przechwytywania w oprogramowaniu mikroskopu.
  6. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wybierz opcję lub otwórz panel, aby włączyć funkcje konfokalne (np. lasery i kolejne parametry). Ta opcja jest zwykle odnotowywana przez wartości długości fali linii laserowej.
  7. Wybierz linie laserowe odpowiednie dla barwników, które są używane do barwienia próbek. Włącz jedną lub wiele linii laserowych, aby wzbudzić i zobrazować te cechy w próbce.
  8. Ustaw wzmocnienie na wartość, która optymalizuje fluorescencję próbek, ale ogranicza ilość szumów. Typową wartością początkową jest zysk na poziomie 70.
  9. Dostosuj moc lasera, aby uniknąć nasyconych pikseli, ale zmaksymalizować zakres dynamiczny. Typowy zakres wyjściowy dla mocy lasera wynosi 1 – 3 %.
  10. Ustaw rozmiar otworka na 1 jednostkę Airy, aby zmaksymalizować rozdzielczość przekroju optycznego. Jeśli próbka jest przyciemniona, a moc lasera jest już wysoka, otwórz otwór, aby zwiększyć sygnał kosztem zmniejszenia rozdzielczości osi z.
  11. Ustaw czas przebywania pikseli (tj. szybkość skanowania). Zacznij od czasu przebywania 2 μs i w razie potrzeby dostosuj, aby odzwierciedlić jasność próbki. Wybierz rozmiar piksela/rozmiar skanowania dla wybranego obiektywu, pozwalając instrumentowi obliczyć go za pomocą przycisku opcji Nyquist i wybranej liczby pikseli na obrazie.
    UWAGA: Dłuższe czasy przebywania w grubszych próbkach mogą prowadzić do nadmiernego bielenia podczas zbierania stosów z.
  12. Wybierz opcję Skanuj w oprogramowaniu urządzenia i rozpocznij zbieranie danych.
    UWAGA: Jeśli urządzenie jest wyposażone w wiele laserów, każdy z nich może być optymalizowany niezależnie, a następnie uruchamiany jednocześnie w celu uzyskania obrazów wielofluorescencyjnych.
  13. Użyj pokrętła ostrości, aby przybliżać i pomniejszać oraz zlokalizować optymalne pole view w sample.
  14. Przechwyć obrazy za pomocą systemowego przycisku Przechwyć i zapisz wszystkie niezbędne formaty plików próbki w żądanej lokalizacji/folderze na dysku twardym komputera lub lokalnym zewnętrznym dysku twardym.
  15. Kontynuuj odpowiednią regulację wzmocnienia, mocy lasera, rozmiaru otworka, częstotliwości próbkowania i innych wartości, aby zoptymalizować obraz. Wskaźnik nasycenia pikseli można aktywować, aby sprawdzić, czy piksele są przesycone. Jeśli występuje to nadmierne nasycenie, wzmocnienie i moc lasera można ponownie dostosować, aby wyeliminować nasycone piksele. Użyj tablic LUT jako przewodnika, aby dokonać określonych regulacji.
  16. Jeśli to możliwe, użyj systemowej częstotliwości próbkowania Nyquist, która jest wyświetlana w oprogramowaniu jako panel lub przycisk, aby upewnić się, że obrazy są zbierane w maksymalnej możliwej do uzyskania rozdzielczości.
  17. Aktywuj narzędzie do zbierania stosu z lub objętości obrazu systemu konfokalnego. Korzystając z opcji od dołu do góry, z tylko jedną linią laserową, w szczególności linią laserową, która najwyraźniej oświetla element próbki, ustaw płaszczyznę początkową i końcową dla mierzonej objętości.
  18. Należy użyć sugerowanych odstępów między płaszczyznami w stosie z, który jest obliczany tak, aby spełniał kryteria próbkowania Nyquista w celu uzyskania najlepszej możliwej do uzyskania rozdzielczości osiowej zapewnianej przez instrument i użytą linię laserową.
  19. Gdy używanych jest wiele linii laserowych, do obliczenia odstępów należy użyć najkrótszej długości fali. Po zakończeniu pobierania zapisz plik w odpowiednim folderze.
  20. Alternatywnie, jeśli istnieje wiedza a priori na temat grubości próbki, zdefiniuj objętość, wybierając środkową płaszczyznę, tę, która wydaje się najjaśniejsza i najostrzejsza. W takiej sytuacji należy ustawić górną część próbki na połowę grubości powyżej środkowej płaszczyzny, a dolną na połowę grubości poniżej środkowej płaszczyzny.
  21. Po zakończeniu pobierania próbki w tym polu widzenia lub po wybieleniu próbki użyj zmotoryzowanego lub sterowanego ręcznie stolika, aby znaleźć inne interesujące miejsce na próbce i powtórzyć kroki pobierania obrazu.

5. Procedura czyszczenia

  1. Upewnij się, że wszystkie pliki danych, zarówno z CLSM, jak i AFM, są zapisane w odpowiednich lokalizacjach.
  2. Cofnij chip AFM za pomocą silników krokowych z co najmniej 2000 μm lub odległość, która została przebyta, aby dostać się do powierzchni próbki. Zdejmij głowicę AFM ze sceny i ostrożnie umieść ją w miejscu spoczynku.
  3. Cofnij obiektyw mikroskopu tak, aby znajdował się daleko od próbki. Jeżeli użyto obiektywu olejowego, obiektyw powinien być cofnięty na tyle daleko, aby nie było kontaktu między obiektywem a substratem próbki.
  4. Za pomocą rękawiczek wyjmij próbkę i usuń smar i olej, jeśli dotyczy, z dna naczynia na próbkę. Zdobądź nową, czystą, pustą szalkę Petriego i napełnij ją 70% roztworem etanolu w połowie do trzech czwartych. Umieść go w uchwycie na próbkę i wymień głowicę AFM, aby chip AFM mógł zanurzyć się w roztworze etanolu przez 5 minut.
  5. Podczas namaczania się układu AFM zaleca się rozpoczęcie kopiowania danych eksperymentu na zewnętrzny dysk twardy. Po zanurzeniu chipa AFM w roztworze etanolu na co najmniej 5 minut, zdejmij głowicę AFM i umieść ją w miejscu spoczynku.
  6. Za pomocą rękawic wyjmij uchwyt na chip AFM i umieść go w stacji montażowej. Ostrożnie usuń chip AFM za pomocą pęsety z gumowymi uchwytami. Umieść zużytą końcówkę z powrotem w miejscu, w którym przyszła, zorientowaną poza osią, aby wskazać, że została użyta. Na przyszłość zanotuj, która końcówka została użyta w eksperymencie.
  7. Wyjąć szalkę Petriego wypełnioną roztworem etanolu z układu i wyrzucić płyn wraz z naczyniem. Używając rękawiczek, środków do czyszczenia soczewek i chusteczek do soczewek, delikatnie usuń olej z obiektywu mikroskopu zgodnie ze standardowymi protokołami. Wyczyść uchwyt próbki, usuwając tłuszcz. Wszystkie odpady należy zutylizować zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego i zwrócić narzędzia do ich znanych lokalizacji.
  8. Zakończ zbieranie danych z komputera (komputerów) i zamknij je. Wyłącz wszystkie instrumenty, akcesoria, urządzenia peryferyjne lub inne urządzenia używane w eksperymencie.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika Conpokal jest schematycznie przedstawiona w Rysunek 1A, a obraz konfiguracji jest pokazany w Rysunek 1B. Aby dokładnie zlokalizować struktury biologiczne za pomocą mikroskopii konfokalnej z tymi samymi strukturami w AFM, kluczowe znaczenie ma wyrównanie obu systemów podczas instalacji. Wybierz renomowanych producentów konfokalnych i AFM, którzy są zaznajomieni ze swoimi wymaganiami przestrzennymi. Dodatkowo, pomyślne wdrożenie tej techniki opiera się na dobrych procedurach barwienia, unieruchomieniu struktury biologicznej i odpowiednim doborze końcówki AFM. Wysokość żywych komórek często stanowi wyzwanie dla obrazowania AFM. Skan AFM nad żywą komórką HEK jest pokazany na Rysunek 2A. Wysokość dla tej konkretnej komórki HEK wynosiła około 10 μm, co pokazał skan linii w kolorze zielonym (Rysunek 2B). Końcówka AFM z zerowym przesunięciem (końcówka znajduje się na samym końcu wspornika) lub z wysokością końcówki większą niż wysokość komórki (np. wysokość końcówki ≥ 10 μm) da obraz pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości. Przykład złego skanowania z powodu niewłaściwego wyboru końcówki AFM znajduje się w Rysunek 2C. Na tym obrazie czarne piksele pojawiły się na wierzchołku komórki, co wskazuje, że piezoelektryczny AFM jest poza zakresem ze względu na dużą wysokość komórki. Koniec wspornika AFM pojawił się na zdjęciu (zaokrąglony kwadrat) z powodu przesunięcia końcówki w połączeniu z niewystarczającą wysokością końcówki w porównaniu z wysokością komórki. Te artefakty na obrazie AFM wskazują, że do obrazowania komórki należy wybrać inną końcówkę AFM.

Efektywne znakowanie w barwieniu fluorescencyjnym wraz z odpowiednią sondą do obrazowania żywych komórek jest wymagane dla tej metody. Wykonaliśmy trójkolorowy obraz konfokalny pokazany na Rysunek 3A z barwieniem jądrowym (fluorescencyjnym niebieskim), barwnikiem mikrotubul (fluorescencyjnym zielonym) i lipofilowym barwnikiem błonowym (fluorescencyjnym czerwonym). Te sondy z żywymi komórkami zostały wybrane ze względu na ich ograniczone nakładanie się widma i kompatybilność ze standardowymi kostkami filtrującymi. Dołączyliśmy również obraz optyczny jasnego pola w Rysunek 3B.

Z AFM, analiza wgłębień końcówki wraz z modelem nanomechanicznym, tworzy mapę modułu powierzchni. Przykład mapy modułu zbudowanej przy użyciu dopasowania modelu Hertz i profilu parabolicznego (promień 8 nm) dla kształtu końcówki jest pokazany nałożony na rekonstrukcję 3D kształtu komórki w Rysunek 4A (który jest tymi samymi dwiema komórkami pokazanymi w Rysunek 3). Odpowiednia projekcja 3D stosu laserowego konfokalnego z jest pokazana na rysunku Rysunek 4B.

Metoda jest również odpowiednia dla mniejszych struktur biologicznych, w tym pojedynczych bakterii, których mikro i nanoskopowe cechy są trudne do rozpoznania przy użyciu mikroskopii świetlnej. Trwające badanie wykorzystuje technikę Conpokal do zbadania mechanizmów mechanicznych w ścianie komórkowej, które wpływają na oporność na antybiotyki u Streptococcus mutans.74 Manipulacja składnikami ściany komórkowej spowodowała zmiany w morfologii i oporności na antybiotyki. Conpokal ułatwia gromadzenie danych w roztworze (np. morfologii powierzchni, modułu sprężystości, siły adhezji i chropowatości powierzchni) na próbkach z tych samych komórek w celu powiązania właściwości mechanicznych z obecnością lub brakiem składników ściany komórkowej. Rysunek 5A,B zawiera skan AFM i mapę zmierzonego modułu bakterii Streptococcus mutans. Lepszą rozdzielczość w tej skali osiągnięto za pomocą AFM niż przy użyciu tradycyjnej mikroskopii konfokalnej.

Rysunek 6 zawiera konfokalny obraz kolonii Enterococcus faecalis zabarwiony zielonym fluorescencyjnym barwnikiem struktury komórkowej, który przyczepia się do ściany komórkowej. Rysunek 5 i Rysunek 6 pokazuje możliwość zastosowania techniki Conpokal do mikrobów oprócz komórek eukariotycznych.

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja Conpokal.
(A) Schemat techniki Conpokal. (B) Obraz konfiguracji przyrządu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikroskopia sił atomowych żywych komórek.
(A) Obraz AFM dwóch komórek HEK. (B) Profil wysokości (zielona linia w A) komórki HEK wskazujący, że wysokość komórki jest dość duża i wynosi 10 μm. (C) Słaby obraz AFM komórki astrocytów, w której piezoelektryczny AFM jest poza zakresem na wierzchołku komórki i istnieją dowody na odwrotne obrazowanie końca wspornika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Mikroskopia konfokalna i mikroskopia jasnego pola żywych komórek.
(A) Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna żywych komórek HEK wybarwionych barwnikiem jądrowym (fluorescencyjnie niebieski), barwnikiem mikrotubul (fluorescencyjnym zielonym) i lipofilowym barwnikiem błonowym (fluorescencyjnym czerwonym). (B) Odpowiedni obraz optyczny w jasnym polu. Podziałka skali wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie renderingów 3D AFM i mikroskopii konfokalnej żywych komórek HEK.
(A) Mapa modułu skonstruowana przy użyciu dopasowania modelu Hertz i profilu parabolicznego (promień 8 nm) dla kształtu końcówki nałożonej na rekonstrukcję 3D komórki z AFM. (B) Odpowiednia projekcja 3D laserowego stosu konfokalnego z barwieniem jądrowym (fluorescencyjnym niebieskim), barwnikiem mikrotubul (fluorescencyjnym zielonym) i lipofilowym barwnikiem błonowym (fluorescencyjnym czerwonym). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 5: AFM próbki bakterii.
(A) skan AFM i (B) zmierzona mapa modułu bakterii Streptococcus mutans. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Mikroskopia konfokalna próbki bakterii.
Obraz konfokalny kolonii Enterococcus faecalis z zielonym fluorescencyjnym barwnikiem błonowym. Podziałka skali wynosi 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conpokal to zaawansowana, skuteczna technika zbierania wysokiej jakości obrazów i właściwości mechanicznych in situ żywych biomateriałów w środowisku ciekłym. Możliwość zbierania wyjątkowych obrazów morfologicznych i topografii w połączeniu z właściwościami mechanicznymi żywych próbek wykracza poza typowe techniki mikroskopii elektronowej i świetlnej. Oddzielnie mikroskop konfokalny zapewnia jasne pole, epifluorescencję i konfokalne skanowanie laserowe w celu uzyskania wysokiej jakości, szczegółowych obrazów fluorescencyjnych próbek. AFM zapewnia charakterystykę mechaniczną, ale bez pomocniczej optyki nawigacja po próbce staje się trudna. Dzięki połączeniu tych dwóch systemów, użytkownik może zbierać zarówno obrazy, jak i właściwości mechaniczne dokładnie tej samej komórki podczas eksperymentu, co jest wielką zaletą w porównaniu z dwoma oddzielnymi instrumentami. Celem tego manuskryptu jest poinformowanie użytkowników o szerokich możliwościach połączonego systemu Conpokal dla przyszłości biologii, inżynierii i zdrowia. Protokół obejmuje przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych, naczyń, selekcję mikroorganizmów, procedurę AFM, procedurę konfokalną i oczyszczenie. Najważniejszymi krokami dla udanej sesji Conpokal na żywo w roztworze są unieruchomienie próbki, rozsądny wybór końcówki i wykonanie plamy na żywo. W części poświęconej dyskusji na temat tego manuskryptu omówione zostaną zalecenia dotyczące hodowli, wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i wytyczne operacyjne oraz przyszłe prace nad techniką Conpokal. Zalecenia dotyczące hodowli będą obejmować wskazówki dotyczące hodowli próbek, unieruchomienia i barwienia. Wskazówki i wytyczne dotyczące AFM, konfokalnego i Conpokal omówią wybór i kalibrację końcówek, rozdzielczość, ograniczenia i prawie jednoczesną obsługę. Przyszłe prace obejmują perspektywy i potencjał przyszłych ścieżek badawczych.

Protokół obejmuje hodowlę, sondowanie i obrazowanie zarówno żywych komórek, jak i utrwalonych próbek bakterii. Jednym z wyzwań występujących podczas przeprowadzania AFM w cieczy jest niedrożność ruchu wspornika spowodowana przeszkodą w próbce i oporem hydrodynamicznym. Jeżeli próbka nie jest dobrze przylegająca do podłoża, istnieje możliwość zanieczyszczenia wspornika przez odcinki próbki unoszące się w cieczy. W takim przypadku pomiary są zagrożone, ponieważ są przypuszczeniem o przyczepności elastycznej i właściwościach mikromechanicznych próbki. Komórki HEK nie były traktowane utrwalaczem, jednak S. mutans i E. faecalis wymagają dodatkowego unieruchomienia, podobnie jak inne komórki prokariotyczne. Wybrane bakterie wykazywały aktywny ruch, który utrudniał sondowanie komórek i obrazowanie, dlatego próbki były delikatnie, chemicznie utrwalane, aby promować unieruchomienie. Istnieją alternatywy dla utrwalania chemicznego, takie jak membrany filtracyjne, które fizycznie zatrzymują pojedyncze komórki w porach75.

Wybór końcówki jest również kluczowym elementem konfiguracji i obsługi AFM. Gdy poszukuje się właściwości mechanicznych opartych na odkształceniu biomateriału, należy wziąć pod uwagę sztywność wspornika i kompatybilność sztywności materiału, co jest zadaniem nietrywialnym. Głównym celem jest jak najlepsze dopasowanie sztywności materiału do sztywności wybranego wspornika. Jeśli wspornik jest znacznie bardziej miękki niż próbka, będzie podlegał zbyt dużemu ugięciu. Jeśli wspornik jest sztywniejszy niż próbka, detektor AFM może nie być w stanie uchwycić tak małych ugięć. Zaleca się, aby przy wyborze odpowiedniego wspornika AFM, dokonać wyboru na podstawie zastosowania eksperymentalnego. Aby zbierać szczegółowe obrazy w trybie przerywanego kontaktu, końcówki AFM w zakresie 0,1 - 0,3 N/m dla sztywności i promienia końcówki w zakresie 5 nm – 100 nm są skuteczne do obrazowania żywych komórek. Zalecane są małe stożkowe końcówki. Ostre końcówki zapewniają małą powierzchnię kontaktu i możliwość wciskania, co dodatkowo pomaga w zbieraniu drobnych szczegółów i cech w morfologii próbki76. Jednak ostre końcówki mogą być również problematyczne, ponieważ są podatne na przebijanie próbek, gdy ustawienia (np. wartość zadana, czas piksela, prędkość zbliżania) wymagają zbyt dużego wcięcia lub wgłębienie jest zbyt szybkie. Aby uniknąć efektów dużej prędkości odkształcania, miejscowego utwardzania odkształceń w pobliżu ostrej końcówki lub po prostu w celu kontrolowania obszaru styku i prędkości zbliżania, wiele osób decyduje się na użycie spektroskopii sił z końcówką koloidalną do pomiaru modułu sprężystości.

Do pomiaru modułów sprężystości żywych komórek zaleca się końcówki AFM w zakresie 0,01 - 1,0 N/m dla sztywności i promienia końcówki w zakresie 1 – 5 μm. Duże rozmiary końcówek, zazwyczaj koloidy szklane, zapewniają znaną powierzchnię kontaktu i jest mało prawdopodobne, aby przebiły ogniwo podczas kontaktu. Wsporniki prostokątne są preferowane w stosunku do trójkątnych, ponieważ podczas kalibracji metoda bezkontaktowa może być stosowana do geometrii prostokątnej w porównaniu z kalibracją kontaktową dla geometrii trójkątnych. Ponadto, ze względu na delikatną naturę końcówek AFM, zaleca się, aby operator używał pęsety z gumowymi końcówkami, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia delikatnego chipa AFM lub bloku montażowego. Inne parametry, o których należy pamiętać, to prędkość zbliżania się końcówki AFM i stopień wgłębienia w próbce. Dobrą wskazówką jest utrzymanie wgłębienia do około 10% grubości (lub wysokości) próbki i wybranie prędkości, która wyklucza potencjalny opór hydrodynamiczny doświadczany przez wspornik38.

Skomplikowane instrumenty eksperymentalne zazwyczaj są wyposażone w przeszkody, które wymagają rozwiązywania problemów w konfiguracji, kalibracji i obsłudze urządzenia. Uderzenie końcówki AFM lub wspornika w próbkę lub podłoże próbki jest częstym błędem popełnianym przez nowych użytkowników. Aby uniknąć tego problemu, protokół sugeruje cofnięcie wspornika o 2000 μm. Ten krok zapewnia, że końcówka nie będzie stykać się z dnem naczynia, jeśli poprzedni użytkownik zapomniał wycofać końcówkę podczas sprzątania po eksperymentach. Jednak odległość 2000 μm została wybrana dla wybranego uchwytu na talerz używanego w tym protokole. Może być konieczne wybranie innego zakresu, większego lub mniejszego, w zależności od używanego stylu uchwytu na naczynia. Podczas ustawiania lasera i detektora w protokole wspomina się o regulacji pokrętła lustra w celu maksymalizacji sygnału sumarycznego. Pokrętło regulacji lusterka może nie być dostępne we wszystkich AFM. Jeśli jednak jest obecny, jednym ze sposobów manipulowania instrumentem w celu rozwiązania problemu z sygnałem o niskiej sumie jest regulacja pokrętła lustra, używanego do uwzględnienia medium, w którym będzie się odbywać skanowanie; ciecz (np. woda, pożywka, PBS) lub powietrze. Ze względu na różnicę we współczynniku załamania światła dla światła przechodzącego przez powietrze i przez ciecz, może być konieczne wyregulowanie pokrętła lustra. Maksymalna czułość na zginanie wspornika AFM będzie znajdować się w miejscu końcówki AFM, dlatego światło laserowe, które przywraca pozycję gięcia poprzez umieszczenie na fotodiodzie, musi znajdować się w miejscu końcówki AFM. W zależności od wybranej końcówki AFM, suma wartości sygnału może wahać się od 0,3 do 3,0 V. Tylna powłoka na wsporniku AFM, taka jak Cr-Au lub Al, zwiększy sygnał sumy i czułość pomiaru.

Geometria końcówki jest istotna podczas kalibracji końcówki podczas pracy AFM. Zaobserwowano dobrą zgodność między kalibracją bezkontaktową a kalibracją kontaktową. Jeśli wybrany wspornik AFM nie jest prostokątny, konieczne będzie przeprowadzenie kalibracji styków. Należy pamiętać, że medium, w którym kalibrowana jest końcówka, musi być takie samo jak medium próbki. Jeśli te płyny różnią się, użytkownik musi przeprowadzić ponowną kalibrację. W przypadku używania końcówek AFM w cieczy, częstotliwość mierzona przez system powinna wynosić od jednej czwartej do jednej trzeciej częstotliwości rezonansu naturalnego oznaczonej przez producenta. Dobrym sposobem sprawdzenia, czy system prawidłowo skalibrował końcówkę, jest sprawdzenie wartości w wygenerowanym pliku szumu termicznego. Upewnij się, że ten plik jest zapisywany w odpowiednim folderze. Jeśli system ma problemy z kalibracją lub pojawią się nieprawdopodobne wartości, ponownie skalibruj lub nieznacznie dostosuj położenie lasera, a następnie ponownie skalibruj.

Inną przyczyną słabego sygnału sumy może być wyrównanie wspornika AFM. Gdy chip AFM jest zamontowany w pustaku szklanym, ważne jest, aby końcówka wspornika pozostała w małym oknie laserowym (gładka powierzchnia szkła). Jeśli chip jest zbyt daleko do przodu, kąt, pod którym wspornik naturalnie spoczywa, może powodować problem z odbiciem od wspornika, pomijając fotodetektor i powodując słaby sygnał sumy. Jeśli chip jest zbyt daleko z tyłu, laser nie będzie w stanie odbić się od tylnej części wspornika, powodując słaby sygnał sumy. Z tych powodów zamontowany chip AFM może wymagać regulacji. Ponadto inny problem, który można napotkać, występuje w przypadku wysokości próbki. Przyrząd AFM używany w tym protokole ma maksymalny zakres piezoelektryczny (wysokość) 15 μm. Jeśli użytkownik stwierdzi, że oprogramowanie nie jest w stanie zebrać danych o wysokości i map siły w określonym pikselu, pojawi się czarne pole wskazujące, że system jest poza zasięgiem (Rysunek 2C). Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest ustawienie wysokości piezoelektrycznej na niższą wartość, na przykład 2 lub 3 μm, tak aby większość zakresu 15 μm była zaangażowana w mapowanie przewidywanej wysokości komórki. Ta technika powinna, w większości eksperymentów związanych z komórkami lub bakteriami, rozwiązać problem związany z zakresem z.

Eksperymentatorzy, którzy wymagają rozszerzonego zakresu z dla wysokich próbek o wysokości większej niż 10 – 15 μm, mogą być zmuszeni do poszukiwania dodatkowego modułu na AFM. Producenci AFM mają tę opcję dostępną za dodatkową opłatą dla większości systemów. Rozszerzając zakres z, eksperymentator ma możliwość skanowania próbek, które są uważane za wysokie w skali mikro, z niewielkimi problemami dla wartości poza zakresem lub modyfikacji silnika piezoelektrycznego AFM. Chociaż moduły te kosztują dodatkowo, niektóre, w zależności od producenta, mogą oferować dodatkową wysokość, nawet do 100 μm w kierunku z. Konfokalna jest nadal możliwa w przypadku wyższych próbek, jeśli użytkownik ma dużą odległość roboczą, obiektyw o dużym powiększeniu lub jest skłonny użyć obiektywu pneumatycznego, być może 20x lub 40x. Zmniejszając powiększenie obiektywu mikroskopu, zwiększa się odległość robocza, zyskując odległość, aby zobaczyć wierzchołek wyższej próbki. Ta modyfikacja obiektywu o mniejszym powiększeniu poświęci rozdzielczość. W układzie Conpokal, o którym mowa w tym manuskrypcie, obiektyw TIRF (całkowita fluorescencja wewnętrznego odbicia) o powiększeniu 60x ma odległość roboczą wynoszącą blisko 100 μm poza szkiełko nakrywkowe naczynia na próbkę ze szklanym dnem.

W odniesieniu do mikroskopu konfokalnego, o którym mowa w tym manuskrypcie, omówiono kilka ważnych zastrzeżeń. System konfokalny użyty do produkcji rysunków w tym manuskrypcie wykorzystywał obiektyw olejny TIRF o powiększeniu 60x i aperturze numerycznej 1,49. Linie laserowe o długości fali wzbudzenia 405 nm, 488 nm i 561 nm wykorzystano do obrazowania żywych próbek komórek, pokazanych na rysunku 3 i rysunku 4. Granicę dyfrakcji mikroskopu konfokalnego można określić za pomocą równania rozdzielczości Abbego, rozdzielczość Abbego (x,y) = λ / 2NA, gdzie λ to długość fali wzbudzenia dla Alexa 488 przy 488 nm, a NA to apertura numeryczna kondensatora konfokalnego, która wynosi 0,3. W związku z tym określa się rozdzielczość osiową 272 nm. W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego brane są pod uwagę dwa przypadki w celu określenia rozdzielczości, w której otwór jest ustawiony na jedną jednostkę przewiewną (AU) i 0,5 AU. W tym drugim przypadku otwór jest zamykany w taki sposób, że następuje znaczna utrata światła, ale rozdzielczość wzrasta. Oprogramowanie konfokalne oblicza boczne natywne i osiowe rozdzielczości natywne odpowiednio przy 170 nm i 290 nm dla otworka przy 0,5 AU oraz 200 nm i 370 nm dla otworka przy 1 AU. Aberracje sferyczne wprowadzone w systemie można uwzględnić w procesie dekonwolucji w celu zwiększenia kontrastu i rozdzielczości obrazów mikroskopowych. Ze względu na ograniczenia dyfrakcyjne, które są nieodłącznie związane z mikroskopami konfokalnymi, konfokalny obraz kolonii bakterii na rysunku 6 nie ma rozdzielczości odpowiadającej szczegółom widocznym na skanie AFM bakterii na rysunku 5. AFM zapewnia dostęp do cech i szczegółów w nanoskali, które są trudne do uchwycenia za pomocą mikroskopu konfokalnego. Jednakże, w zależności od wymaganej rozdzielczości fluorescencji, ryc. 5 i ryc. 6 pokazują możliwość zastosowania techniki Conpokal do drobnoustrojów oprócz komórek eukariotycznych.

Zaletą korzystania z mikroskopu konfokalnego jest to, że operator może zbierać obrazy 3D określonych obszarów w próbce z wyostrzonymi szczegółami. Obrazy te korelują z AFM poprzez oglądanie powierzchni, która była badana za pomocą obrazu AFM i skanu konfokalnego tego samego obszaru. Ponieważ mikroskop jest odwrócony, obraz epifluorescencyjny zbiera informacje o świetle z przeciwnej strony próbki, która była badana. Otwór w systemie konfokalnym pomaga ograniczyć się do jednej płaszczyzny z pewnej odległości, jednocześnie odfiltrowując światło pochodzące z reszty próbki, a nawet z pomieszczenia. Zasadniczo, otwór otworkowy pomaga wyizolować światło powracające z pojedynczej płaszczyzny zainteresowania w próbce. Zazwyczaj ta płaszczyzna zainteresowania musi zawierać silne markery fluoroforowe, ponieważ w przypadku odwróconych układów konfokalnych wykrywanie pojedynczych cząsteczek byłoby ograniczone do mikroskopów konfokalnych o wyższej rozdzielczości. Oświetlenie epifluorescencyjne jest mniej pożądane ze względu na fakt, że w trybie obrazowania epifluorescencyjnego każde światło z próbki, które odbija się od obiektywu, jest zbierane i wykorzystywane do generowania obrazu, dlatego niemożliwe jest wyizolowanie pojedynczej płaszczyzny. Techniki konfokalne zapewniają bardziej izolowany obraz pojedynczej płaszczyzny badanego obiektu próbki ze względu na otwór77. Jeśli, na przykład, wierzchołek komórki eukariotycznej jest badany przez AFM, ta sama powierzchnia może być izolowana za pomocą konfokalnych możliwości skanowania laserowego mikroskopu, a nie w trybie obrazowania epifluorescencyjnego. Zaleca się monitorowanie stanu/kształtu komórek podczas pozyskiwania danych za pomocą obrazowania jednocześnie w trybie kontrastu interferencji różnicowej za pomocą detektora światła przechodzącego i linii laserowej 488 nm. Podczas przechwytywania stosu z próbki, w przypadku procedury opisanej powyżej, regulowane jest tylko wzmocnienie detektora. Każda zmiana morfologiczna w komórkach podczas pomiaru, która niekoniecznie jest widoczna w kanałach fluorescencyjnych, wskazuje, że do pomiaru wprowadzane są artefakty.

Idealne odstępy między płaszczyznami można uzyskać, postępując zgodnie z zaleceniami oprogramowania dotyczącymi najkrótszej długości fali stosowanej w technice obrazowania. Rozdzielczość natywną i stosunek sygnału do szumu w objętościach obrazu można skutecznie poprawić, stosując algorytmy dekonwolucyjne dostępne w module przetwarzania obrazu oprogramowania do akwizycji. Jednak wykonywanie mikroskopii fluorescencyjnej, wybór określonych barwników i barwników jest niezbędny, aby uniknąć wczesnego wybielania lub przesłuchów spowodowanych nakładającymi się widmami wzbudzenia/emisji. Czasami użytkownik może doświadczyć nieprawidłowego generowania światła konfokalnego. Jeśli użytkownik doświadcza braku emisji światła lub nieprawidłowo działających linii laserowych, jednym ze sposobów rozwiązania problemu jest zresetowanie systemu, zwykle przez ponowne uruchomienie oprogramowania operacyjnego. Jeśli problem będzie się powtarzał, detektor światła przechodzącego mógł nie przesunąć się na swoje miejsce w obrębie ścieżki optycznej mikroskopu świetlnego. Zresetowanie pozycji detektora nadajnika może pomóc w złagodzeniu problemów z gromadzeniem światła lub obrazowaniem laserowym.

Instrument Conpokal ma na celu zapewnienie użytkownikom możliwości zbierania informacji optycznych i opartych na siłach na temat żywych biomateriałów w środowisku ciekłym, jednocześnie i na tej samej komórce lub funkcji. Ta praca wyraźnie opisuje, jak przeprowadzać te eksperymenty w cieczy, która jest naturalnym domem dla wielu biomateriałów, chociaż eksperymenty na sucho mogą być nadal przeprowadzane przy użyciu oprzyrządowania. W przypadku próbek przygotowanych na szalkach Petriego wysokość szalki jest ograniczeniem. Ze względu na konfigurację pustaka szklanego, w którym znajduje się wspornik AFM, boczne ścianki naczyń muszą mieć mniej niż 10 mm wysokości; jeśli naczynie jest zbyt wysokie, przyrząd nie będzie w stanie opuścić końcówki AFM na powierzchnię próbki lub podłoża.

Chociaż istnieje ograniczenie dotyczące wielkości próby, nie ma ograniczeń co do możliwości urządzenia lub oprogramowania w odniesieniu do opóźnienia czasowego. Jednoczesna konfokalna i AFM jest możliwa przy zastosowaniu odpowiednich czynników. Ograniczenie, które przyczynia się do jego prawie jednoczesnej zdolności, odnosi się do szumu, który jest generowany podczas jednoczesnego wykonywania niektórych funkcji mikroskopii konfokalnej i funkcji mikroskopii sił atomowych. Drgania z silników, które poruszają obiektywem mikroskopu podczas zbierania stosu z, będą dodawane do sygnału z końcówki sondy AFM podczas jej ruchu. Hałas zostanie zwiększony przez obiektyw olejowy, ponieważ silniki poruszają się w górę i w dół w kierunku z, aby oświetlić kolejne płaszczyzny w próbce. W związku z tym zalecany protokół obejmuje sekwencyjne zbieranie skanów AFM i obrazów konfokalnych stosu z. Jednoczesne CLSM i AFM wymagałoby stacjonarnego obrazowania za pomocą konfokalu, jednak przy obecnej technice czas opóźnienia dla tych dwóch instrumentów może wynosić nawet kilkadziesiąt sekund. Rzeczywisty czas przejścia z operacji AFM na obrazowanie konfokalne wynosił około 2 – 4 minuty dla obrazów zebranych na rycinach 2A i 4B. Wartość ta została określona przez odjęcie dwóch okresów zbierania obrazów od całkowitego czasu 33 minut, który obejmuje czas rozpoczęcia i zakończenia skanowania AFM, przełączenia trybów instrumentu w celu aktywacji obrazowania konfokalnego oraz rozpoczęcia i zakończenia stosu obrazu konfokalnego.

Przyszłość projektu Conpokal ma na celu zbadanie nowych zależności między strukturą a funkcją, a także wnikliwe poznanie procesów zachodzących w pojedynczych komórkach. Na przykład eksperymentowanie z terapią farmakologiczną in situ na próbkach komórkowych lub bakteryjnych w celu określenia wpływu elastyczności komórek byłoby postępem w dziedzinie biomateriałów, biologii i biomechaniki. Terapia lecznicza do naczynia z próbką podczas obrazowania i sondowania dostarczyłaby wiedzy na temat tego, jak próbka reaguje na środki terapeutyczne w żywym i starannie kontrolowanym środowisku, w czasie. Włączenie nowego leku lub wyzwania środowiskowego poszerzyłoby wiedzę na temat tego, w jaki sposób lokalizacja cytoszkieletu lub organelli wpływa na lokomocję, topologię, sztywność itp. Kolejnym potencjalnym ulepszeniem Conpokal jest możliwość pełnej kontroli systemu nad środowiskiem. Obecny Conpokal wymieniony w tym protokole jest umieszczony w obudowie akustycznej zaprojektowanej w celu zmniejszenia hałasu z wnętrza laboratorium. Udoskonalenie tej obudowy zapewniłoby możliwość testowania w obrębie, być może, jednego lub kombinacji czynników, nie ograniczając się do takich jak sterylne środowisko, kontrolowana temperatura, a nawet zmienna grawitacja. W chwili obecnej metoda Conpokal zapewnia skuteczne i użyteczne podejście do charakteryzowania żywych, płynnych biomateriałów, ale przyszłość tej techniki tylko jeszcze bardziej rozwinie te możliwości.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potwierdzamy finansowanie NIH COBRE pod numerem P20GM130456. Dziękujemy brytyjskiej organizacji Light Microscopy Core, która jest wspierana przez Wiceprezydenta ds. Badań, za pomoc w tych pracach. Szczepy S. mutans i E. faecalis zostały dostarczone przez dr Natalię Korotkovą. Pierwsza wzmianka o grze słów, Conpokal, opisującej połączenie mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych, przypisuje się dr Bradowi Berronowi, inżynierowi chemicznemu i materiałowemu na Uniwersytecie Kentucky, w dyskusji z dr Marthą Grady (autorką korespondencyjną) w oczekiwaniu na przybycie prelegenta seminarium, dr Jonathana Phama. który dołączył do wydziału inżynierii chemicznej i materiałowej na Uniwersytecie Kentucky jesienią 2017 roku.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Obudowa akustycznaJPK-BrukerKomora akustycznasłużąca do łagodzenia hałasu
BioTracker 488 Zielony mikrotubula cytoszkieletBarwnik Millipore SigmaSCT142Służy do oznaczania mikrotubul w komórkach ssaków
CP-qp-CONT-BSG Końcówki AFMNanoAndMoreCP-qp-CONT-BSG-BKolodialne końcówki AFM dobre do pomiarów modułu na próbkach
biologicznychDil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))ThermoFischer ScientificD282Służy do znakowania błony plazmatycznej komórek ssaków
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy DulbeccoVWRVWRL0100-0500Składnik pożywki do hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoThermoFisher ScientificA1285601Służy do symulacji środowiska biologicznego
Surowica bydlęcapłodu Fischer Scientific45000-736Składnik pożywki do hodowli komórkowych
Fisher BioReagents Dodatki do pożywek mikrobiologicznych: EkstraktFischer ScientificBP1422-500Składnik pożywki do hodowli bakteryjnej
FluoroDish Cell Culture DishWorld Precision Instruments (WPI)FD35-100Naczynia ze szklanym dnem, których ścianki boczne są mniejsze niż 10 mm, niezbędne do pełnego funkcjonowania kwasu nukleinowego Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 barwienieThermoFischer Scientific62249Służy do oznaczania jądra komórek ssaków, dobry marker jądrowy dla żywych komórek
Ludzka nerka embrionalna 293 komórkiATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychCRL-1573Komórki ssaków użyte w protokole
MatrigelVWR47743-716Powłoka w naczyniu do hodowli komórkowych
Model: PFQNM-LC-A-CAL Końcówki AFMBrukerPFQNM-LC-A-CALKońcówki AFM, które dobrze sprawdzają się w przypadku próbek o dużej wysokości (takich jak komórki eukariotyczne)
NanoWizard 4aJPK-BrukerNanoWizard 4aAFM
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Nikon A1NikonA1 HD25używany do obrazowania jasnego pola, epi-fluorescencji i konfokalnej
PENICYLINA/STREPTOMYCYNAVWR16777-164Składnik pożywek
do hodowli komórkowychPetriDishHeaterJPK-BrukerPetriDishHeaterUtrzymuje żądaną temperaturę próbki na szalce Petriego
qp-BioAC-Cl Końcówki AFMNanosensoryqp-BioAC-Cl-10Trzy różne wsporniki AFM o różnej sztywności
Wymienna pęseta z końcówką z włókna węglowegoTed Pella Inc.5051Służy do ostrożnego umieszczania i wyjmowania delikatnych końcówek AFM w szklanym bloku montażowym
Todd Hewitt Broth BactoBD DIFCO Bacterius LtdBacto-249240Składnik pożywki bakteryjnej
Wankomycyna, BODIPY FL SprzężonyThermo Fisher ScientificV34850Służy do fluorescencyjnego znakowania ściany komórkowej bakterii
drożdżowy Mikroskop

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).">Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602(2017).">Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602(2017).
  3. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).">Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).">Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).">Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).">Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).">Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).">Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).">An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).">Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102(2013).">Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102(2013).
  12. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).">Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).">Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).">Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).">Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102(2001).">Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102(2001).
  17. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).">Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).">Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).">Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).">Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).">Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).">Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).">Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).">Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).">Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).">Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).">Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).">Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).">Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).">Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).">Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046(2014).">Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046(2014).
  33. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).">Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809(2011).">Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809(2011).
  35. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9(2015).">Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9(2015).
  36. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).">Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101(2010).">Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101(2010).
  38. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).">Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).">Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).">Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).">Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).">Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).">Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429(2014).">Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429(2014).
  45. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).">Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).">Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).">Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).">Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).">Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).">Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).">Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).">Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).">Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564(2014).">Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564(2014).
  55. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).">Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).">Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54(2015).">Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54(2015).
  58. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).">Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).">Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).">Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).">Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011(2006).">Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011(2006).
  63. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).">Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).">Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427(1996).">Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427(1996).
  66. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236(2010).">Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236(2010).
  67. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).">Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).">Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).">Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).">Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546(2011).">Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546(2011).
  72. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).">Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).">Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).">Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).">Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).">Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).">Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal MicroscopyAtomic Force MicroscopyConpokal TechniqueLive Cell ImagingMechanical CharacterizationFluorescence Co localizationAFM Cantilever CalibrationLaser Scanning ConfocalSubcellular Component AnalysisModulus Map Generation

Related Articles