Method Article

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

DOI:

10.3791/61434

⸱

October 31st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsy są funkcjonalnymi elementami neuronów, a ich defekty lub straty leżą u podstaw wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurologicznych. Badania obrazowe są szeroko stosowane do badania ich funkcji i plastyczności w stanach fizjologicznych i patologicznych. Ze względu na ich rozmiar i strukturę, badania lokalizacyjne białek wymagają technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W tym protokole opisujemy procedurę badania w neuronach pierwotnych kolokalizacji białek docelowych z markerami synaptycznymi na poziomie superrozdzielczości przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM). SIM to technika oświetlenia światłem wzorzystym, która podwaja rozdzielczość przestrzenną mikroskopii szerokokątnej, osiągając szczegółowość około 100 nm. Protokół wskazuje wymagane kontrole i ustawienia dla solidnych badań kolokalizacyjnych oraz przegląd metod statystycznych do prawidłowej analizy danych obrazowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozumienie i pogląd na synapsę ogromnie się zmieniły od czasu jej pierwszego opisu przez Fostera i Sherringtona w 1897 roku1. Od tego czasu nasza wiedza na temat komunikacji neuronalnej i procesów molekularnych, które za nią stoją, wzrosła wykładniczo2. Stało się jasne, że synapsy można traktować jako system dwukompartmentowy: przedział presynaptyczny zawierający pęcherzyki do uwalniania neuroprzekaźników i przedział postsynaptyczny z receptorami3. Ten uproszczony pogląd w ciągu ostatnich dwudziestu lat przekształcił się w złożoną sieć białek niezbędnych do transdukcji wiązania nadajnika w sygnalizację4.

Korzyści w zrozumieniu są częściowo spowodowane technikami super-rozdzielczości, które pokonały limit dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, aby lepiej dopasować wymiary synaps5,6,7,8,9,10. Ze względu na granicę dyfrakcji mikroskop optyczny nie może osiągnąć rozdzielczości powyżej 200 nm poprzecznie11,12. Aby obejść ten limit, stworzono techniki superrozdzielczości, wykorzystujące różne podejścia i osiągające różne rozdzielczości graniczne subdyfrakcyjne: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) i STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM podwaja rozdzielczość przestrzenną laserowych systemów mikroskopii szerokokątnej poprzez wstawienie siatki dyfrakcyjnej do ścieżki wiązki wzbudzenia15. Ruchoma siatka załamuje wiązki laserowe, tworząc znany wzór oświetlenia, zwykle paski. Ten celowo ustrukturyzowany wzór światła jest nakładany na nieznany rozkład przestrzenny barwnika fluorescencyjnego (próbki). Pręgi interferencyjne utworzone przez te dwa wzory kodują drobne szczegóły, których nie dałoby się inaczej odróżnić za pomocą normalnej mikroskopii szerokokątnej. Ostateczny obraz superrozdzielczy uzyskuje się przez połączenie i dekodowanie metodami matematycznymi kilku surowych obrazów tej samej próbki uzyskanych przez translacje i obroty siatki dyfrakcyjnej. Rozdzielczość obrazów superrozdzielczych osiąga 100 nm w kierunku bocznym i 500 nm w kierunku osiowym dla 2D-SIM15 lub 100 nm w kierunku bocznym i 250 nm w kierunku osiowym dla 3D-SIM16.

Nowe zrozumienie synapsy jest jeszcze ważniejsze w świetle wielu zaburzeń neurologicznych, w których dysfunkcja synaps odgrywa główną rolę w powstaniu i progresji17,18. Choroba Alzheimera, zespół Downa, choroba Parkinsona, choroby prionowe, padaczka, zaburzenia ze spektrum autyzmu i zespół łamliwego chromosomu X zostały powiązane z nieprawidłowościami w składzie, morfologii i funkcji synaptyków19,20,21,22.

Niedawno, używając zestawu przeciwciał specyficznych dla SUMO, użyliśmy SIM, aby pokazać kolokalizację białek SUMO w pierwotnych neuronach hipokampa z pre- i postsynaptycznymi markerami synaptofizyną i PSD95 na poziomie superrozdzielczości23. Umożliwiło nam to potwierdzenie dowodów z mikroskopii biochemicznej i konfokalnej na lokalizację SUMO w neuronach.

Tutaj opisujemy protokół do badania lokalizacji białek w pierwotnych neuronach hipokampa myszy. Jednocześnie protokół ten może być dostosowany do różnych typów pierwotnych kultur neuronalnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultury pierwotne

  1. Hodowla pierwotnych neuronów hipokampa myszy w komorowych szkiełkach nakrywkowych (takich jak Ibidi μ-Slide 8 Well lub Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), które spełniają obiektywne wymagania dotyczące grubości szkiełka nakrywkowego #1,5 (0,17 mm).
  2. Szkiełka nakrywkowe z komorą pokryć 100 μl poli-L-lizyny (100 μg/ml).
  3. Następnego dnia należy dwukrotnie przemyć szkiełka nakrywkowe w komorze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. Aby uzyskać pierwotne neurony myszy, wyizoluj hipokampy od P1-P4 pups23.
  5. Umieść wypreparowane hipokampy w 10 ml pożywki preparacyjnej (Tabela 1) i pozwól im odłożyć je na dno probówki.
  6. Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie wyjmij pożywkę do wypreparowania, pozostawiając hipokamp nienaruszony na dnie probówki.
  7. Dodać 10 ml pożywki 1 (Tabela 1) do hipokampa i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie wyjmij pożywkę 1, pozostawiając hipokampy nienaruszone na dnie probówki.
  9. Dodać 10 ml pożywki 2 (Tabela 1) i pozostawić (zakrytą) probówkę wirówkową poziomo pod okapem na 45 minut.
  10. Pozostaw probówkę wirówkową pionowo, aby tkanka mogła osiąść na dnie probówki.
  11. Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie wyjmij pożywkę 2, pozostawiając hipokampy nienaruszone na dnie probówki wirówkowej.
  12. Dodać 2 ml pożywki 3 (Tabela 1).
  13. Za pomocą pipety p1000 z końcówką z filtrem mechanicznie oddzielić komórki od tkanki.
  14. Przenieść supernatant, w którym znajdują się izolowane neurony, do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  15. Odwirować zawiesinę komórkową przez 2 minuty przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  16. Po odwirowaniu komórki znajdują się na dnie probówki wirówkowej. Za pomocą sterylnej pipety wyrzucić supernatant.
  17. Ponownie zawieś komórki w 1 ml pożywki 4.
  18. Użyj filtra 70 μm, aby wyeliminować niezdysocjowane komórki.
  19. Policz żywe komórki w komorze Bürkera, dodając 1 μl 0,4 % roztworu błękitu trypanowego do 19 μl zawiesiny komórek.
  20. Płytki komórkowe w ilości 70 000 komórek/dołek w objętości 200 μl na studzienkę.
  21. Pozostawić komórki na przyczepienie się na 2 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  22. Wyjąć szkiełka nakrywkowe z komorą z inkubatora i ostrożnie zastąpić podłoże 200 μl pożywki hodowlanej.
  23. Pozostawić szkiełka nakrywkowe z komorą w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
  24. Zastąp jedną trzecią pożywki świeżymi pożywkami hodowlanymi co 5-7 dni.
  25. Poczekaj, aż pierwotne neurony hipokampa osiągną pełną dojrzałość (12-14 dni po posiewie), aby przeprowadzić badania kolokalizacji.

2. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Pobrać szkiełka nakrywkowe z komorą z inkubatora.
  2. Usuń nośnik.
  3. Szybko umyj studzienki 200 μl PBS.
  4. Dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS (200 μl/studzienkę) do neuronów, aby szybko je naprawić.
  5. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usuń roztwór PFA.
  7. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie PBS z 0,2% Triton X-100 (200 μL/dołek).
  8. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  9. Usunąć roztwór i inkubować próbki z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (200 μl/basenik) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby biernie pokryć wszystkie wolne powierzchnie wiążące płytki białkiem nieistotnym do analizy. Bufor blokujący oparty na BSA bez Triton X-100 redukuje tło przeciwciał bardziej efektywnie niż ten sam bufor z 0,2% Triton X-100.
  10. Usuń roztwór.
  11. Dodać wybrane przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze PBS zawierającym 1% BSA i 0,2% Triton X-100 (120-200 μl/basenik, w zależności od rozcieńczenia przeciwciała i dostępności). Inkubować próbki przez 2 godziny.
    1. Jako kontrolę ujemną nie dodawaj żadnego przeciwciała pierwszorzędowego do jednej z studzienek. W tym samym czasie można stosować wiele przeciwciał różnych gatunków przeciwko różnym celom. Użyj przeciwciała przeciwko MAP2 (markerowi neuronalnemu) wyhodowanemu u kurczaka, przeciwciała przeciwko PSD95 lub synaptofizynie wyhodowanej u myszy oraz przeciwciała przeciwko docelowemu białku wyhodowanemu u królika. Pozwala to na trójkolorowe analizy karty SIM.
  12. Szybko umyj studzienki trzykrotnie PBS (200 μl/studzienkę).
  13. Dodaj przeciwciała drugorzędowe (można użyć przeciwciał drugorzędowych dyLight i Alexa) rozcieńczone w roztworze PBS zawierającym 1% BSA i 0,2% Triton X-100 (200 μL/basenik). Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  14. Szybko umyj studzienki trzykrotnie PBS (200 μl/studzienkę).
  15. Dodać barwnik Hoechst o stężeniu 1 μg/ml rozcieńczony w PBS (200 μl/basenik) do barwienia jąder. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Szybko umyj studzienki dwukrotnie za pomocą PBS.
  17. Zamontuj komórki za pomocą uchwytu kompatybilnego z kartą SIM. Użyj 10 μl/dołek ProLong Glass Antifade Mountant.
  18. Przykryj i zabezpiecz ogniwa szkłem nakrywkowym (np. okrągłym szkłem nakrywkowym o średnicy 8 mm). Można również użyć kwadratowych.
  19. Szkiełka nakrywkowe z komorą należy przechowywać w temperaturze pokojowej i odczekać co najmniej 48 godzin przed uzyskaniem obrazów. Diamond Glass wymaga co najmniej dwóch dni utwardzania przed przejęciami w super rozdzielczości.

3. Kontrola swoistości przeciwciał

UWAGA: Użyj dwóch strategii, aby zapewnić swoistość przeciwciał. Pierwsza strategia polega na użyciu co najmniej dwóch różnych przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu substratowi. Drugą strategią jest neutralizacja przeciwciał poprzez inkubację z oczyszczonym celem białkowym lub epitopem używanym do podniesienia przeciwciała.

  1. Inkubować wybrane przeciwciało z pięciokrotnym nadmiarem rekombinowanego celu lub epitopu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 1% BSA w PBS.
  2. Po inkubacji użyć zneutralizowanego przeciwciała o zwykłym stężeniu do barwienia, jak opisano powyżej z ppkt 2.11.

4. Kalibracja mikroskopu

UWAGA: Rutynowo używamy systemu mikroskopu super-rozdzielczego N-SIM wyprodukowanego przez firmę Nikon do badań super-rozdzielczości. Jednak kilka innych firm również oferuje w swoich katalogach mikroskopy superrozdzielcze. Chociaż opisano konkretne wskazania dla systemu N-SIM firmy Nikon, poniższe instrukcje można uogólnić na inne systemy. Przed akwizycją obrazów SIM system wymaga odpowiedniej kalibracji za pomocą koralików fluorescencyjnych o określonym rozmiarze poniżej rozdzielczości. Przykładem są mikrosfery TetraSpeck. Koraliki te są barwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, aby umożliwić kalibrację różnych laserów za pomocą jednej próbki.

  1. W łaźni wodnej sonikować około 1,8 x 108 fluorescencyjnych mikrosfer przez 10 minut. System N-SIM firmy Nikon wymaga do kalibracji próbki rzadko zaludnionych wielokolorowych koralików. Może się to różnić w przypadku innych systemów, które wymagają gęstej pojedynczej warstwy koralików fluorescencyjnych o rozmiarze poniżej rozdzielczości. Dostosuj odpowiednio liczbę cząstek fluorescencyjnych.
  2. Rozcieńczyć mikrosfery fluorescencyjne w stosunku 1:500 w wodzie podwójnie destylowanej.
  3. Poddaj sonifikację po raz drugi przez dodatkowe 10 minut.
  4. Odpipetować 15 μl rozcieńczonych kulek do studzienki w komorze na szkiełku nakrywkowym.
  5. Pozostaw roztwór do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 10 μl roztworu montażowego i umieścić na wierzchu szkiełko nakrywkowe o grubości 8 mm.
  7. Odczekaj co najmniej 48 godzin, aby umożliwić prawidłowe utwardzenie.
  8. Włącz mikroskop i lasery.
  9. Pozwól systemowi się rozgrzać, aby osiągnąć równowagę termiczną wszystkich elementów mikroskopu. System mikroskopu superrozdzielczego N-SIM wymaga co najmniej 3 godzin.
  10. Wybierz obiektyw 100x.
  11. Rozpocznij kalibrację od wyrównania laserów do środka bloku siatki dyfrakcyjnej. W systemie N-SIM pokrętło mikrometryczne oraz dedykowana kamera umożliwiają wyśrodkowanie wiązki światła do celu.
  12. Włóż szkiełko nakrywkowe z komorą do mikroskopu w celu view. Ustawić system na grubość szkiełka nakrywkowego w komorze poprzez regulację kołnierza korekcyjnego obiektywu. Oprogramowanie NIS, autorskie oprogramowanie dostarczane z systemami mikroskopu N-SIM Super-Resolution Microscope, posiada automatyczną funkcję regulacji kołnierzy korekcyjnych.
  13. Dostosuj ostrość bloku siatki dla każdego kanału, aby zapewnić skupione, strukturalne oświetlenie wzoru na próbce. Oprogramowanie NIS zapewnia automatyczną funkcję dla tego zadania.
  14. Następnie uzyskaj surowe obrazy 3D-SIM wielokolorowych mikrosfer. Zrekonstruuj surowe obrazy, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości, korzystając z oprogramowania mikroskopowego lub platformy oprogramowania typu open source do analizy obrazów biologicznych ImageJ24 i wtyczki fairSIM25.
  15. Oblicz, dla każdej wydzielonej długości fali, transformację Fouriera obrazu superrozdzielczego uzyskanego w 4.14. Jeśli przekształcony obraz nie uzyska prawidłowego wzoru przypominającego kwiat, należy wznowić kalibrację od wersji 4.11, ponieważ nie osiągnięto superrozdzielczości.
  16. Na obrazie o wysokiej rozdzielczości wybierz pojedynczą mikrosferę i oblicz jej profil intensywności dla każdego kanału, aby zmierzyć osiągniętą rozdzielczość. Powinien być teraz bliski 100 nm w boku.
  17. Następnie wykonaj rejestrację kanału, nakładając wielokanałową akwizycję mikrosfer. Celem jest kolimacja wszystkich sygnałów kanału poprzecznie i osiowo. Wyeliminuje to aberracje chromatyczne spowodowane niewspółosiowością różnych kanałów i pomoże w analizie kolokalizacji.
  18. Potwierdź jakość kalibracji za pomocą funkcji "Etapy fazy oświetlenia" i "Skupienie wzoru oświetlenia" w SIMcheck26, zestawie wtyczek do aplikacji open source ImageJ. W tym celu należy przygotować komorowe szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać gęstą pojedynczą warstwę mikrosfer TetraSpeck i uzyskać obraz 3D-SIM próbki. Przeanalizuj obraz w obrazie ImageJ i, jeśli zostaną wykryte aberracje, uruchom ponownie kalibrację mikroskopu od kroku 4.11.

5. Akwizycja

  1. Rozpocznij analizę próbki za pomocą obiektywu 40x w trybie konfokalnym lub szerokokątnym. Pozwala to na nawigację do próbki, zachowując dobre szczegóły i duże pole widzenia.
  2. Użyj sygnału przeciwciała MAP2, aby zidentyfikować obszar reprezentujący procesy neuronalne.
  3. Uzyskaj obrazy próbki w trybie konfokalnym, aby określić jakość barwienia. Słaba jakość konfokalna będzie odzwierciedlać się w niskiej jakości karty SIM, co będzie wymagało wyrzucenia próbek.
  4. Jeśli obszar i jakość obrazów są zadowalające, przełącz obiektyw na 100x.
  5. Nałóż olej na obiektyw 100x.
  6. Uzyskaj obraz szerokokątny lub konfokalny, który zostanie później wykorzystany do oceny jakości obrazu o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1A,B).
  7. Przełącz na tryb 3D-SIM.
  8. Korzystając z okien dialogowych do ustawiania parametrów akwizycji, wybierz najwyższe dostępne ustawienie głębi bitowej, aby zmaksymalizować informacje o kolorach. Zazwyczaj standardowym wyborem jest wersja 16-bitowa. Ponadto, aby poprawić stosunek sygnału do szumu, wybierz wartość niskiej częstotliwości do akwizycji, na przykład 1 MHz.
  9. Korzystając z okien histogramu, ustaw moc laserów, aby uzyskać liniową odpowiedź sygnału. Aby uniknąć utraty informacji, ogranicz nasycone piksele na obrazach. System N-SIM wykorzystuje kamerę Andor iXon3. Podczas pracy w trybie 16-bitowym wybierz docelową intensywność 16 000, aby zapewnić liniową reakcję kamery. Alternatywnie wybierz zakres od 30 000 do 45 000, aby zmaksymalizować dynamiczny zakres akwizycji.
  10. Ustaw moc lasera w zakresie od 0,1% do 50% podczas obrazowania próbek i czasy ekspozycji od 50 ms do 2 s. Moce lasera powyżej 50% mogą powodować szybkie fotowybielanie używanych fluoroforów.
  11. Rozpocznij pobieranie obrazów w trybie 3D-SIM.
  12. Użyj SIMcheck, pakietu bezpłatnych wtyczek do ImageJ, aby ocenić jakość pozyskiwania surowych obrazów.
  13. Jeśli SIMCheck nie wykryje żadnych artefaktów ani problemów z jakością, uzyskaj co najmniej 10 obrazów z 4 replik technicznych, aby umożliwić analizę statystyczną.

6. Postprodukcja: rekonstrukcja obrazu

UWAGA: Obrazy pozyskane za pomocą karty 3D-SIM to surowe obrazy, które muszą zostać przetworzone, aby uzyskać zrekonstruowane obrazy o wysokiej rozdzielczości. Nieprawidłowa rekonstrukcja surowych obrazów może prowadzić do powstania artefaktów, które wpłynęłyby na analizę próbek. Dużą uwagę należy zatem zwrócić na odpowiedni dobór parametrów rekonstrukcji.

  1. Przetwarzaj surowe obrazy za pomocą oprogramowania do analizy rekonstrukcji mikroskopu, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1C). Alternatywnie użyj bezpłatnej wtyczki ImageJ fairSIM, aby zrekonstruować surowe obrazy.
  2. Oblicz transformację Fouriera obrazów o wysokiej rozdzielczości za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji mikroskopu lub wtyczki ImageJ SIMCheck. Dobry, zrekonstruowany obraz powinien zwracać, dla każdego kanału, obraz przypominający kwiat. Jeśli zrekonstruowane obrazy nie odtworzą kształtu przypominającego kwiat, uruchom ponownie od obrazów RAW i zrekonstruuj je, modyfikując parametry rekonstrukcji, takie jak filtrowanie Wienera, apodyzacja i tłumienie zerowego rzędu27. W oprogramowaniu sieciowej usługi informacyjnej, korzystając z podglądu, aby monitorować, jak zmiana parametrów wpływa na ostateczny rozdzielczość obrazu, zmodyfikuj parametry i) Kontrast modulacji oświetlenia, ii) Tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości i iii) Tłumienie nieostrości.
  3. Następnie przeanalizuj zrekonstruowany obraz, aby bezstronnie wykryć artefakty za pomocą NanoJ-SQUIRREL28, wtyczki opartej na ImageJ do oceny jakości obrazów o wysokiej rozdzielczości.
  4. Jeśli NanoJ-SQUIRREL wykryje artefakty, uruchom ponownie od surowych obrazów i zrekonstruuj je, modyfikując parametry rekonstrukcji, takie jak filtrowanie Wienera, apodyzacja i tłumienie zerowego rzędu. W oprogramowaniu sieciowej usługi informacyjnej, korzystając z podglądu, aby monitorować, jak zmiana parametrów wpływa na ostateczną rozdzielczość obrazu, zmodyfikuj parametry Kontrast modulacji oświetlenia, Tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości i Tłumienie nieostrości.
  5. Użyj obrazów o wysokiej rozdzielczości, aby obliczyć profil kolokalizacji i/lub współczynniki Pearsona i Mandera.

7. Kolokacja z analizą profilu

UWAGA: Jako pierwszy krok do zbadania kolokalizacji między markerami synaptycznymi a interesującym białkiem, weź obraz o wysokiej rozdzielczości i przeanalizuj pojedynczy locus w celu określenia nakładania się sygnałów.

  1. Zidentyfikuj pojedyncze miejsce na obrazie o wysokiej rozdzielczości.
  2. Uzyskaj profile intensywności sygnałów fluorescencyjnych miejsca zainteresowania.
  3. Eksportuj dane.
  4. Użyj GraphPad Prism lub podobnego oprogramowania analitycznego, aby znormalizować wszystkie piki sygnału i uzyskać porównywalne intensywności sygnału dla każdego kanału, a ostatecznym celem jest określenie kolokalizacji specyficznej dla locus.

8. Kwantyfikacja współczynników Pearsona i Mandera

UWAGA: Jeśli analiza profilu sugerowała kolokalizację pojedynczego miejsca, bardziej ogólną analizę całego obrazu można przeprowadzić, obliczając współczynniki Pearsona i Mandera29,30.

  1. Użyj wtyczki ImageJ JACoP31, aby określić dwa parametry kolokalizacji: Pearsona i Mandera.

9. Analiza statystyczna

  1. Użyj GraphPad Prism lub podobnego oprogramowania do analizy i tworzenia wykresów, aby przetworzyć dane zebrane za pomocą JACoP.
  2. Użyj co najmniej 40 obrazów karty SIM dla każdego analizowanego warunku, aby uzyskać wykresy i uzyskać trafność statystyczną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj standardowy przebieg pracy do badania kolokalizacji białek neuronalnych. Najpierw skalibrowaliśmy mikroskop, a następnie przeprowadziliśmy analizę SIM próbek. Do kalibracji systemu użyliśmy mikrosfer fluorescencyjnych o średnicy 0,1 μm. Po uzyskaniu superrozdzielczych obrazów 3D-SIM koralików, leżące u ich podstaw dane obrazu są przekształcane metodą Fouriera w celu ponownej konwersji ich do przestrzennej reprezentacji częstotliwości. W Rysunek 2A, wyraźny wzór kwiatu jest...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyjaśnienie struktury i składu synapsy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów fizjologicznych i patologicznych, które regulują pamięć i poznanie. Podczas gdy w normalnym stanie synapsy są budulcem pamięci, leżą również u podstaw złożonych zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera32. Opisany tutaj protokół służy do badania kolokalizacji białek neuronalnych za pomocą techniki mikroskopii superrozdzielczej zwanej SIM. Wykorzystując określony wzór oświetlenia, SIM może osiągnąć r...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Edoardo Micottiemu za konstruktywną krytykę manuskryptu. Badanie to było wspierane przez BrightFocus A2019296F, przez Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), przez Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN), przez Innowacyjną Sieć Szkoleniową "Maria Skłodowska-Curie" (JK) oraz przez Fondazione Telethon TCP15011, Alzheimer's Association AARG-17-505136 (LF).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,4% roztwór błękitu trypanowego Thermo Fisher Scientific15250061Chemiczny
70 & mikro; Filtr M Corning352350Equiment
AlexaThermo Fisher Naukoweprzeciwciało
przeciwprzeciwciałowe SENP1Santa Cruzsc-271360Przeciwciało
B27 SuplementLife Technologies17504044Chemiczna
albumina surowicy bydlęcej Merck5470Chemical
CaCl2Merck Life Science21115
Szkiełka nakrywkowe z komorąIbidi80826Equiment
DyLightThermo FisherScientific-Antibody
FBS (Hyklon)GIBCOSH3007002 (CHA1111L)Serum
Mikrosfery modyfikowane karboksylanem FluoSpheres, 0,1 μ m, żółty– zielony fluorescencyjnyThermo Fisher ScientificF8803Ekwipunek
GlukozaMerck Life ScienceG8769Chemiczny
GlutamaxGIBCO35050061Chemiczny
HEPESMerck Life ScienceH3537Chemiczny
L-Cysteina Merck Nauki przyrodnicze C6852-25gChemiczne
MAP2MerckAB15452Przeciwciało
MEM Life Technologies21575022Medium
MgClMerck Life ScienceM8266Chemical
NaOHVWR International1 091 371 000Chemical
NeurobasalA Life Technologies10888022Medium
N-SIM Super Resolution MicroscopeNikon-Instrument
PapainMerck Life Science& nbsp;P-3125Chemiczny
paraformaldehyd Thermo Fisher Scientific28908
Chemical Pen/Strep 10xLife Technologies15140122Chemiczna
sól fizjologiczna buforowana fosforanami Gibco10010023Chemical
Poly-L lizynaSigmaP2636Chemical
ProLong Diamond Glass Antiblade MountantThermo Fisher ScientificP36970Chemical
PSD95 Przeciwciało NeuroMabK28/43
Okrągła szklanka nakrywkowaThermo12052712Ekwipunek
SUMO1Abcamab32058Przeciwciało
Synaptofizyna MerckS5768 przeciwciało
Triton X-100 MerckT8787Chemiczny
inhibitor trypsyny Merck Nauki przyrodnicze T9003-500MGChemiczny
chemiczną

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
  4. Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
  5. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).
  8. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644(2020).
  9. Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133(2019).
  10. Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
  11. Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361(2009).
  12. Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
  13. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290(2016).
  14. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  15. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  16. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  17. Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
  18. Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
  19. Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
  20. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
  21. Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
  22. Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803(2013).
  23. Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980(2016).
  26. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).
  27. Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
  28. Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
  30. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
  31. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  32. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  33. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  34. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  35. Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
  36. Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
  37. Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
  38. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Super Resolution ImagingProtein Co LocalizationSynaptic MarkersPrimary NeuronsStructured Illumination MicroscopySIM ImagingConfocal MicroscopyMAP2 AntibodySynaptophysin PSD 95Image Analysis

Related Articles