Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

Ten protokół opisuje metodę hodowli pierwotnych neuronów hipokampa z embrionalnego mózgu myszy. Ekspresja głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na zewnątrzkomórkowej powierzchni hodowanych neuronów jest następnie oceniana za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Abstract

Coraz więcej dowodów potwierdza hipotezę, że interakcje neuro-immunologiczne wpływają na funkcjonowanie układu nerwowego zarówno w warunkach homeostatycznych, jak i patologicznych. Dobrze zbadaną funkcją głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHCI) jest prezentacja peptydów pochodzenia komórkowego dla adaptacyjnego układu odpornościowego, szczególnie w odpowiedzi na infekcję. Niedawno wykazano, że ekspresja cząsteczek MHCI na neuronach może modulować zależne od aktywności zmiany w połączeniach synaptycznych podczas normalnego rozwoju i zaburzeń neurologicznych. Znaczenie tych funkcji dla zdrowia mózgu potwierdza potrzebę czułego testu, który łatwo wykrywa ekspresję MHCI na neuronach. W tym miejscu opisano metodę pierwotnej hodowli mysich neuronów hipokampa, a następnie oceny ekspresji MHCI za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Mysi hipokamp jest mikropreparowany od prenatalnych szczeniąt myszy w 18 dniu embrionalnym. Tkanka jest dysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki przy użyciu technik enzymatycznych i mechanicznych, a następnie hodowana w pożywce wolnej od surowicy, która ogranicza wzrost komórek nieneuronalnych. Po 7 dniach in vitro ekspresja MHCI jest stymulowana przez farmakologiczne traktowanie hodowanych komórek interferonem beta. Cząsteczki MHCI są znakowane in situ fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem, a następnie komórki są nieenzymatycznie dysocjowane w zawiesinę pojedynczej komórki. Aby potwierdzić tożsamość neuronalną, komórki są utrwalane paraformaldehydem, permeabilizowane i znakowane fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem, które rozpoznaje neuronalny antygen jądrowy NeuN. Ekspresja MHCI jest następnie oznaczana ilościowo na neuronach za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Hodowle neuronów mogą być łatwo manipulowane przez modyfikacje genetyczne lub interwencje farmakologiczne w celu przetestowania określonych hipotez. Z niewielkimi modyfikacjami, metody te mogą być stosowane do hodowli innych populacji neuronów lub do oceny ekspresji innych białek będących przedmiotem zainteresowania.

Introduction

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) był kiedyś uważany za pozbawiony nadzoru immunologicznego, określany jako "immune privileged¹." Teraz jest jasne, że ten przywilej nie jest równoznaczny z absolutnym brakiem składników immunologicznych, ale raczej z wyspecjalizowaną regulacją, która działa w celu ograniczenia uszkodzeń związanych z immunopatologią¹. W rzeczywistości komunikacja między OUN a układem odpornościowym to ciągła rozmowa, która jest niezbędna do zdrowego rozwoju mózgu i odpowiedzi na infekcje^2,3.

Główne cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHCI) są poligenicznymi i polimorficznymi białkami transbłonowymi, najbardziej znanymi ze swojej funkcji w prezentowaniu antygenowych peptydów limfocytom T CD8⁺ podczas infekcji⁴. Klasyczne kompleksy MHCI składają się z transbłonowego łańcucha α i zewnątrzkomórkowego łańcucha lekkiego, zwanego β2-mikroglobuliną. Łańcuch α zawiera polimorficzny rowek, który wiąże peptyd antygenowy do prezentacji⁵. Właściwa ekspresja MHCI na błonie zewnątrzkomórkowej wymaga skoordynowanego działania molekularnych białek opiekuńczych w retikulum endoplazmatycznym, aby zapewnić prawidłowe fałdowanie łańcucha α i β2-mikroglobuliny wraz z obciążeniem ligandu peptydowego o wysokim powinowactwie⁵. Dopiero po złożeniu kompleksów MHCI są one eksportowane z retikulum endoplazmatycznego do błony plazmatycznej⁶. Po zaangażowaniu pokrewnego receptora limfocytów T z kompleksem MHCI obciążonym peptydami, limfocyty T CD8 ⁺ pośredniczą w zabijaniu komórek poprzez uwalnianie ziarnistości litycznych zawierających perforynę i granzymy lub poprzez indukowanie apoptozy poprzez wiązanie receptora Fas na błonie komórki docelowej⁷. Dodatkowo limfocyty T CD8 ⁺ wytwarzają cytokiny, takie jak interferon gamma (IFNγ) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), które mogą aktywować mechanizmy przeciwwirusowe w zakażonych komórkach bez skutków cytopatycznych^8,9. W przypadku wielu wirusów neurotropowych limfocyty T CD8 ⁺ są niezbędne do usunięcia infekcji z CNS^10,11,12.

Wcześniej sądzono, że neurony wyrażają MHCI tylko w warunkach uszkodzenia, infekcji wirusowej lub stymulacji cytokin in vitro. Ostatnio badania zidentyfikowały rolę neuronalnej ekspresji MHCI w przebudowie synaps i plastyczności^13,14. Chociaż dokładne mechanizmy leżące u podstaw regulacji synaps nie są dobrze poznane, dane wskazują, że poziom ekspresji MHCI jest regulowany przez aktywność synaptyczną^15,16. Jedna z hipotez zakłada, że neurony presynaptycznie wyrażają sparowany receptor podobny do immunoglobuliny B (PirB), który wiąże MHCI transynaptycznie^13,17. Ta interakcja inicjuje kaskadę sygnalizacyjną PirB, która przeciwstawia się szlakom zaangażowanym w przebudowę synaptyczną, wzmacniając w ten sposób i stabilizując połączenie synaptyczne^17,18,19. W przypadku braku aktywności neuronalnej, ekspresja MHCI jest zmniejszona¹⁴, a utrata MHCI powoduje wadliwą eliminację synaps i niezorganizowaną organizację obwodów synaptycznych^20,21.

Opisany tutaj test, który został zaadaptowany z Chevalier et al.⁹, wykorzystuje analizę cytometryczną przepływową do ilościowej oceny zewnątrzkomórkowej ekspresji białka MHCI w pierwotnych hodowlach mysich neuronów hipokampa. Protokół ten ilustruje początkowe techniki mikropreparowania tkanki hipokampa od embrionalnych szczeniąt myszy. Następnie szczegółowo opisano procesy enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji tkanki w zawiesinę pojedynczej komórki oraz metody utrzymywania kultur in vitro. Ponieważ neurony nie dzielą się, po znalezieniu się w hodowli muszą być posiane w naczyniu o gęstości odpowiedniej dla ich eksperymentalnego punktu końcowego. Następnie przedstawiono etapy indukcji ekspresji MHCI za pomocą interferonu beta (IFNβ), znakowania immunologicznego MHCI i markera jąder neuronalnych NeuN oraz analizy komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Na koniec opisano procedury oceny danych cytometrii przepływowej w celu identyfikacji neuronów MHCI-dodatnich i ilościowego określenia poziomu ekspresji MHCI. W tym protokole odnotowuje się również niewielkie korekty, które można wprowadzić w celu hodowli neuronów korowych oprócz lub zamiast neuronów hipokampa. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu przetestowania określonych hipotez przy użyciu wariacji genetycznych lub leczenia farmakologicznego.

Protocol

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health oraz zgodnie z Międzynarodowymi Wytycznymi dla Badań Biomedycznych z udziałem Zwierząt. Protokół został zatwierdzony przez University of North Carolina at Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protokół #19-020).

1. Przygotowanie do kultury

UWAGA: Te procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonej do hodowli tkankowej. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z nośnikami i rozwiązaniami.

1. Sterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne przez autoklawowanie w samozamykających się workach sterylizacyjnych.
2. Przygotuj zapasy robocze poli-D-lizyny do obróbki 12-dołkowych naczyń hodowlanych.
   1. Rozpuścić poli-D-lizynę w 1x buforze boranowym do stężenia 100 μg/ml (10x zagęszczony). Przechowywać około 1 ml porcji w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
   2. Rozcieńczyć 10x skoncentrowaną poli-D-lizynę w dPBS do 10 μg/ml (1x) i wysterylizować filtrem.
   3. Traktuj 12-dołkowe płytki hodowlane 0,5 ml na zagłębienie 1x poli-D-lizyny w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc do użycia następnego dnia. Upewnij się, że objętość poli-D-lizyny jest wystarczająca, aby w pełni pokryć dno obszaru hodowli.
   4. Tuż przed użyciem usuń poli-D-lizynę z płytki hodowlanej, spłucz 3x w sterylnej wodzie i trzymaj w sterylnej wodzie, aż będą gotowe do płytki komórek. Usuń wszelkie ślady cieczy poprzez dokładne zasysanie przed posiewem komórek.
3. Przygotuj pożywkę wzrostu neuronów i bufor FACS. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pożywka Neuron Growth Media może być przechowywana przez około 2 tygodnie; Bufor FACS może być przechowywany przez około 4 tygodnie.

2. Preparowanie embrionalnego hipokampa

UWAGA: Ta procedura może być wykonana na stole, ponieważ wymaga użycia mikroskopu stereoskopowego do usunięcia opon mózgowych i mikrodysekcji hipokampa. Przestrzegaj ścisłej techniki aseptycznej, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie.

1. Poddać eutanazji samicę myszy C57BL/6J w 18. dniu embrionalnym w komorze CO₂ w ciąży w ciąży w czasie.
2. Spryskaj skórę brzucha i sierść 70% EtOH, a następnie uszczypnij skórę kleszczami tkankowymi i wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi. Naciąć otrzewną, aby odsłonić wnętrzności i macicę.
3. Chwyć macicę za pomocą standardowych kleszczy, wyjmij z jamy i odetnij połączenie z mezometrium cienkimi nożyczkami. Przenieść macicę z zarodkami do sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm umieszczonego na lodzie.
4. Za pomocą cienkich nożyczek i cienkich kleszczy ostrożnie przetnij macicę i usuń woreczki embrionalne, aby uwolnić zarodki. Przenieść zarodki do nowego sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego dPBS umieszczonego na lodzie.
5. Odetnij głowy embrionalnym młodem za pomocą cienkich nożyczek i przenieś głowy do nowego sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego pożywkę Hibernate-E, umieszczonej na lodzie.
6. Aby usunąć mózg, przytrzymaj głowę parą cienkich kleszczy w jednej ręce. Używając zakrzywionych kleszczy Dumont #7 w drugiej ręce, włóż końcówkę kleszczy u podstawy czaszki i ściśnij kość i leżącą nad nią skórę przesuwającą się do przodu wzdłuż linii środkowej, nie przebijając mózgu.
7. Za pomocą zakrzywionych kleszczy rozsuń skórę i czaszkę, aby odsłonić mózg. Zamiataj zakrzywione kleszcze pod mózgiem od odsłoniętej opuszki węchowej do móżdżku, aby wyjąć mózg z czaszki. Przenieś mózg do nowego sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego pożywkę Hibernate-E, umieszczonej na lodzie. Powtórz te czynności dla każdego mózgu.
   UWAGA: Wszystkie mózgi można zebrać w jednym naczyniu hodowlanym, chyba że jest to konieczne do oddzielnych celów specyficznych dla eksperymentu.
8. Pod mikroskopem stereoskopowym, pracując z jednym mózgiem na raz i dwiema parami sterylnych kleszczy Dumont #5, uszczypnij opuszki węchowe i odciągnij opony mózgowe. Dokładne usunięcie opon mózgowych jest konieczne, aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli innymi komórkami i umożliwić dalszą sekcję.
9. Po prawidłowym usunięciu opon mózgowych górna strona kory otwiera się bocznie, co odsłania hipokamp. Za pomocą kleszczyków Dumont #5 uszczypnij hipokamp z dala od przyczepionej kory i ostrożnie przenieś izolowany hipokamp do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki Hibernate-E na lodzie.
10. Powtórz sekcję dla obu półkul mózgowych dla każdego embrionalnego szczeniaka myszy i połącz wszystkie hipokampy w jedną stożkową rurkę o pojemności 15 ml, chyba że jest to potrzebne osobno do celów specyficznych dla eksperymentu.
    1. Aby wyhodować neurony korowe, kora może być oddzielona od podkory i przetwarzana identycznie jak neurony hipokampa.
       UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Przechowuj mózgi lub wypreparowane hipokampy w pożywce Hibernate-E uzupełnionej witaminą B27 (2%) w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca, chociaż dłuższe opóźnienie może zagrozić liczbie żywotnych komórek.

3. Dysocjacja i hodowla neuronów hipokampa

UWAGA: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonej do hodowli tkankowej.

1. Przygotować 0,5 ml roztworu dysocjacji papainy na zarodek do dysocjacji hipokampa. Objętość potrzebnego roztworu dysocjacyjnego będzie się różnić w zależności od liczby preparowanych mózgów embrionalnych.
   UWAGA: Do hodowli neuronów korowych przygotuj 1,0 ml roztworu papainy na zarodek.
   1. Rozpuścić 20 μl zawiesiny papainy na 1 ml pożywki Hibernate E, wirując przez około 3 minuty.
   2. Po rozpuszczeniu papainy dodać 1 μl DNazy I na 1 ml roztworu. Nie należy mieszać roztworu po dodaniu DNazy I, ponieważ może to spowodować dezaktywację enzymu.
2. Odwirować 15 ml stożkowej probówki zawierającej tkankę hipokampa (krok 2.10) przy 1 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i dodać roztwór papainy. Ponownie zawieś tkankę, odwracając kilka razy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, odwracając w celu ponownego zawieszenia tkanki co 10 minut.
   1. W przypadku hodowli neuronów korowych przenieś całą korę do nowego sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, ostrożnie odessaj pożywkę z płytki i zmiel tkankę cienkimi nożyczkami lub żyletką. Dodać roztwór papainy do szalki hodowlanej i przenieść tkankę korową z roztworem papainy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia. Inkubować roztwór tkanek i enzymów w temperaturze 37 °C przez 30 minut, mieszając co 10 minut.
3. Podczas 30-minutowej inkubacji przygotuj 3 szklane pipety Pasteura polerowane ogniowo: 1 całkowicie otwartą, 1 półotwartą i 1 ćwiartkę otwartą.
4. Po 30 minutowej inkubacji odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą strawione tkanki mózgowe w stężeniu 125 x g przez 10 minut. Usunąć roztwór enzymu i zastąpić równą objętością świeżej pożywki Hibernate E.
5. Za pomocą całkowicie otwartej pipety Pasteura rozcierać tkankę 10 razy. Pozwól tkance osiąść na 2 minuty, a następnie przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj równą objętość pożywki Hibernate E z powrotem do tkanki.
6. Za pomocą półotwartej pipety Pasteura rozcieraj tkankę 10x. Pozwól tkance osiąść na 2 minuty, a następnie przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, co w poprzednim kroku. Dodaj równą objętość pożywki Hibernate E z powrotem do tkanki.
7. Używając ćwiartki otwartej pipety Pasteura, rozcieraj tkankę 10x. Pozwól tkance osiąść na 2 minuty, a następnie ponownie przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do tego samego stożkowego 50 ml, jak w poprzednich krokach. Wyrzuć pozostałą tkankę, która nie uległa dysocjacji.
8. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą supernatant z zawiesiny komórek o sile 125 x g przez 5 minut. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, umyj płytki pokryte poli-D-lizyną sterylną wodą i usuń wszelkie ślady płynu przez dokładne zasysanie podczas wirowania.
9. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 ml pożywki Neuron Growth Media. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
   1. W przypadku hodowli neuronów korowych dodaj co najmniej 10 ml pożywki do wzrostu neuronów, aby uzyskać mniej gęste komórki i dokładniejsze liczenie.
10. Rozcieńczyć komórki za pomocą pożywki Neuron Growth Media, aby uzyskać końcową gęstość posiewu 5 x 10⁵ żywych komórek na ml i dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Utrzymuj neurony w temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
    UWAGA: Zazwyczaj hipokampy z 1 embrionalnego mózgu myszy, tj. 2 hipokampy, dają około 1 x 10⁶ żywotnych komórek. Liczba ta jest podawana wyłącznie do celów planowania eksperymentu i nie powinna być traktowana jako substytut do liczenia komórek dla każdej hodowli.
11. Zmień pożywkę wzrostową dzień po hodowli, usuwając połowę objętości pożywki z każdej studzienki, tj. 0,5 ml, i dodaj równą objętość świeżej pożywki z boku dołka, aby uniknąć zakłócenia pracy hodowanych komórek. Dokonuj połówkowej wymiany pożywki dwa razy w tygodniu przez cały okres życia kultury.

4. Ocena ekspresji MHCI za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przygotować leczenie, rozcieńczając interferon beta (IFNβ) lub równą objętość rozcieńczalnika w pożywce Neuron Growth Media. Ponieważ zmiana pożywki będzie zmianą o połowę objętości, należy przygotować pożywkę zabiegową z 2x skoncentrowanym IFNβ. tj. aby potraktować 3 dołki 12-dołkowej płytki 100 U/ml IFNβ, przygotuj 1,5 ml z 200 U/ml IFNβ lub równą objętość IFNβ lub równą objętość IFNβ dla kontroli poddanych działaniu pożywki.
2. Usuń 0,5 ml z każdej studzienki neuronów i dodaj 0,5 ml pożywki do wzrostu neuronów z IFNβ lub bez niego do każdej studzienki. Inkubować w normalnych warunkach wzrostu (37 °C, 5% CO_{2 )} przez 6-72 h, w zależności od warunków eksperymentalnych i optymalizacji sygnału.
3. Po upływie czasu leczenia usuń wszystkie pożywki hodowlane i delikatnie umyj je w zimnym podłożu neurobazalnym, w którym brakuje suplementów (B27, L-glutamina, Pen-Strep).
4. Dodać 0,5 ml niesuplementowanego zimnego podłoża neurobazalnego zawierającego 1 μg/ml bloku Fc i 1 μg/ml fluorescencyjnego sprzężonego przeciwciała anty-MHCI do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 45 minut.
5. Usunąć pożywkę zawierającą przeciwciała i ostrożnie umyć raz w zimnym dPBS. Dodaj 0,5 ml bezenzymatycznego buforu dysocjacji komórek o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i mieszaj, aby usunąć komórki. Obserwuj dysocjację za pomocą mikroskopu odwróconych kultur tkankowych.
6. Po odłączeniu komórek od naczynia hodowlanego dodaj 0,5 ml buforu FACS do każdej studzienki, rozdziel komórki, aby rozproszyć grudki i przenieś całkowitą objętość każdej studzienki do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
7. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS i przenieść całkowitą objętość każdej probówki do indywidualnych studzienek 96-dołkowej płytki dennej w kształcie litery U.
8. Dodać 100 μl odczynnika utrwalającego do każdej studzienki. Kilkakrotnie rozcierać, aby uniknąć zbrylania się komórek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
9. Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl buforu FACS.
10. Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl odczynnika permeabilizacyjnego zawierającego fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało anty-NeuN (rozcieńczenie 1:100) do każdej studzienki. Dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, kołysząc przez 20 minut.
11. Po inkubacji odwirować przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu FACS. Powtórz 2 razy.
12. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 100 μl 2% paraformaldehydu rozcieńczonego w buforze FACS. Dobrze wymieszaj, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu, gdy będzie gotowe do odczytu na cytometrze przepływowym. Przeczytaj próbki tak szybko, jak to możliwe, w ciągu 1 tygodnia.

5. Kwantyfikacja i ocena danych

1. Zmierz kontrolki kompensacji dla każdego barwnika fluorescencyjnego i skoryguj wszelkie nakładanie się widma. Idealna kontrola kompensacji obejmuje hodowane neurony, które są niebarwione, barwione tylko anty-MHCI i barwione tylko anty-NeuN.
2. Jeśli to możliwe, zarejestruj 100 000 zdarzeń dla każdej próbki (co najmniej 10 000) i zapisz jako pliki FCS.
3. Aby przeanalizować dane, używając odpowiedniego oprogramowania do analizy, ustaw bramki sekwencyjne, jak pokazano na Rysunek 1A-C, aby wybrać neurony NeuN-dodatnie.
   1. Wykres SSC-A (log) vs FSC-A (liniowy). Narysuj bramkę na populacji komórkowej (P1), aby wyeliminować zanieczyszczenia komórkowe z analizy.
   2. W populacji komórkowej P1 wykreśl FSC-H (liniowy) vs FSC-A (liniowy). Narysuj bramkę na populacji pojedynczej komórki.
   3. W populacji pojedynczej komórki wykreśl SSC-A (log) vs NeuN (log). Narysuj bramkę w populacji NeuN-dodatniej, używając jako przewodnika niebarwionych komórek lub komórek barwionych tylko MHCI.
   4. Wykreśl histogram fluorescencji MHCI ze zdarzeniami komórkowymi znormalizowanymi do trybu na osi y. Używając niebarwionych neuronów lub neuronów barwionych tylko NeuN jako przewodnika, narysuj poziomą bramkę, aby określić ilościowo procent neuronów dodatnich dla MHCI.
   5. Wyeksportuj procent komórek dodatnich dla MHCI, a także medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla MHCI w populacji NeuN-dodatniej w celu oceny statystycznej i rysunku graficznego.

Results

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, tkanka hipokampa została wycięta od prenatalnych szczeniąt myszy w 18 dniu embrionalnym. Tkanka została zdysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki przy użyciu metod enzymatycznych i mechanicznych, a następnie wyhodowana na 12-dołkowych płytkach, które zostały wstępnie potraktowane poli-D-lizyną. Po 7 dniach in vitro komórki traktowano 100 U/ml IFNβ lub pożywką tylko przez 72 godziny, co stymulowało ekspresję MHCI. Neurony wybarwiono in situ pod kątem MHCI, a następnie nieenzymatycznie zdysocjowano w zawiesinę pojedynczej komórki. Neurony zostały utrwalone i przepuszczalne, a następnie wybarwione wewnątrzkomórkowo w poszukiwaniu markera jąder neuronalnych NeuN. Próbki oceniano za pomocą cytometrii przepływowej, a dane analizowano za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Neurony zostały zidentyfikowane poprzez sekwencyjne bramkowanie wszystkich zdarzeń w celu wykluczenia szczątków komórkowych i dubletów (Rysunek 1A,B). Neurony zostały ostatecznie zidentyfikowane przez NeuN-pozytywność (Figura 1C). Komórki NeuN ⁺ poddano dalszej analizie pod kątem dodatniości MHCI, wykreślając komórki na histogramie z liczbą komórek znormalizowanych do trybu na osi y i fluorescencji MHCI na osi x. Bramka MHCI⁺ została narysowana w punkcie, w którym dodatnie i ujemne piki się rozchodzą (Rysunek 1D). Na tej podstawie odsetek neuronów dodatnich pod kątem barwienia MHCI (Rysunek 1E) i mediana intensywności fluorescencji (MFI; Rysunek 1F) zostały obliczone. Wyniki pokazują, że leczenie IFNβ znacznie zwiększyło odsetek neuronów dodatnich pod kątem zewnątrzkomórkowego barwienia MHCI, a także poziom ekspresji, jak wskazuje MFI. Analizę statystyczną i reprezentację graficzną przeprowadzono przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania statystycznego.

Rysunek 1: Reprezentatywna strategia bramkowania i kwantyfikacja MHCI.
Pierwotne neurony hipokampa traktowano 100 U/ml IFNβ lub tylko pożywką. Po 72 godzinach neurony wybarwiono zewnątrzkomórkowo sprzężonym z Pacific Blue MHCI (1 μg/mL H2-K^b), a następnie znakowano wewnątrzkomórkowo NeuN sprzężonym z PE (rozcieńczenie 1:100). Fluorescencję komórkową oceniano za pomocą cytometrii przepływowej, a dane analizowano. (A) Łączna liczba zdarzeń została wykreślona jako SSC-A (log) vs FSC-A (liniowa), a komórki (P1) zostały bramkowane, aby wykluczyć szczątki. (B) W populacji P1 komórki wykreślono jako FSC-H (liniowe) vs FSC-A (liniowe), aby zabramować populację pojedynczych komórek. (C) W populacji pojedynczych komórek komórki wykreślono SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). Komórki NeuN⁺ bramkowano w celu identyfikacji neuronów. (D) W populacji neuronów komórki wykreślono na histogramie z MHCI-PacBlu na osi x, a liczbę komórek znormalizowano do trybu na osi y. Narysowano bramę poziomą, aby określić ilościowo procent neuronów dodatnich pod kątem barwienia MHCI. (E) Kwantyfikacja procentowego MHCI⁺ komórek NeuN⁺ tylko w pożywkach i neuronach traktowanych IFNβ. (F) Kwantyfikacja mediany intensywności fluorescencji (MFI) MHCI na komórkach NeuN⁺ w neuronach pośrednich (czarnych) i traktowanych IFNβ (czerwonych). Istotność statystyczną obliczono za pomocą niesparowanego testu t. **, P < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. .

Pożywka do wzrostu neuronów (50 ml)
Odczynnik	Stężenie końcowe	Koncentracja zapasów	Na 50 ml
Suplement witaminy B27	2 proc	W 100%	Pojemność 1,0 ml
L-glutamina	2 mM	200 mM	Pojemność 0,5 ml
Penicylina-Streptomycyna	100 U/ml	10 000 U/ml	Pojemność 0,5 ml
Podłoże nerwowo-podstawne			Pojemność 48,0 ml
Bufor FACS (500 ml)
Odczynnik	Stężenie końcowe	Koncentracja zapasów	Na 500 ml
Surowica bydlęca płodu	2 proc	W 100%	Pojemność 10 ml
Edta	1 mM	500 mM	Pojemność 1 ml
dPBS (pałeczka dPBS			Pojemność 489 ml
Rozwiązanie dysocjacji papainy
Odczynnik	Stężenie końcowe	Koncentracja zapasów	Na 1 ml
Zawiesina papainy	20 j./ml	1000 U/ml	Pojemność 0,020 ml
DNaza I	2,5 U/ml	2500 U/ml	Pojemność 0,001 ml
Hibernate-E			Pojemność 1,0 ml
Uwaga: Ilość potrzebnego roztworu dysocjacji papainy będzie się różnić w zależności od liczby embrionalnych mózgów poddawanych sekcji. Przygotuj 0,5 ml na mózg w przypadku neuronów hipokampa lub 1,0 ml na mózg w przypadku neuronów korowych.
Uwaga: Przygotuj roztwór dysocjacyjny, wirując zawiesinę papainy w Hibernate-E przez około 3 minuty. Po dokładnym rozpuszczeniu papainy dodać DNazę I. Nie wirować DNazy I.

Tabela 1: Media i rozwiązania.

Discussion

Protokół ten opisuje sekcję i hodowlę pierwotnych neuronów hipokampa od prenatalnych szczeniąt myszy w 18 dniu embrionalnym. Wykorzystanie pierwotnych neuronów wyhodowanych od gryzoni jest jedną z najbardziej podstawowych metodologii opracowanych we współczesnej neurobiologii²². Chociaż unieśmiertelnione linie komórkowe mogą modelować pewne aspekty neuronów, ich natura jako komórek pochodzących z nowotworu, brak rozwoju zdefiniowanych aksonów i ciągły podział komórek budzi wątpliwości, czy wiernie odwzorowują właściwości neuronów postmitotycznych in vivo²³. Inną alternatywą dla neuronów pierwotnych jest wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (HiPSC). Technologia wykorzystania HiPSC, zwłaszcza tych, które są pobierane od pacjenta, rozwinęła się w ostatnich latach^{bardzo daleko 24} . Jednak nadal istnieją ograniczenia w pracy z HiPSC, w tym zmienność między liniami komórkowymi, brak dojrzałości funkcjonalnej i różnice w profilach epigenetycznych²⁵. Chociaż istnieją również ograniczenia w pracy z redukcjonistycznym modelem pierwotnych neuronów gryzoni, hodowane neurony zachowują postmitotyczną naturę neuronów in vivo. Ponadto ekspansywne narzędzia biologii molekularnej i modyfikacje genetyczne dostępne dla myszy faworyzują wykorzystanie pierwotnych neuronów zamiast HiPSC w wielu zastosowaniach, a badania na myszach można łatwo przełożyć na bardziej złożone organizmy in vivo bez utraty eksperymentalnego systemu genetycznego. Z tych powodów wielu badaczy wykorzystuje pierwotne neurony gryzoni do weryfikacji kluczowych aspektów, jeśli nie większości, swoich badań.

W przypadku niektórych testów neurony mogą być analizowane bezpośrednio po izolacji od mózgu ex vivo. Jest to szczególnie pożądane w przypadku eksperymentów z udziałem dorosłych myszy, które mogą być poddane określonym warunkom eksperymentalnym lub które mogą zależeć od interakcji wielu typów komórek; Istnieje jednak kilka kwestii, które ograniczają rodzaj analiz, które można wykonać. Przygotowanie zawiesiny neuronów w pojedynczej komórce z mózgów dorosłych myszy jest technicznie trudne, ponieważ neurony są unikalnie połączone i otoczone mieliną²⁶. Nieenzymatyczne metody rozszczepiania tkanek są nieskuteczne w dysocjacji tkanki i powodują śmierć komórki, podczas gdy preparaty enzymatyczne często rozszczepiają antygeny powierzchniowe komórek²⁷. Ponadto, chociaż mielina jest w dużej mierze nieobecna u embrionalnych myszy, stanowi około 20% dorosłego mózgu i może upośledzać żywą izolację komórek i utrudniać analizę cytometrii przepływowej²⁸. Wiele z opracowanych technik ostatecznie pozbawia neurony cytozolu i pozostawia małe, zaokrąglone ciała komórkowe, które składają się głównie z jąder²⁹. Chociaż jest to dopuszczalne w przypadku niektórych analiz, nie jest to odpowiednie do ilościowego określania cytoplazmatycznej lub zewnątrzkomórkowej ekspresji białek. Co więcej, redukcjonistyczny system hodowli komórkowych pozwala na testowanie konkretnych pytań mechanistycznych w krótszym czasie, niż jest to często możliwe w przypadku systemu in vivo.

W niniejszym protokole opisano również metody farmakologicznej stymulacji ekspresji MHCI za pomocą IFNβ oraz ilościowe oznaczanie zewnątrzkomórkowej ekspresji MHCI za pomocą cytometrii przepływowej. Stymulacja przez IFNβ jest użyteczną kontrolą pozytywną do testowania innych warunków eksperymentalnych, ale można zauważyć, że IFNγ i kwas kainowy mogą również stymulować ekspresję MHCI w neuronach ^9,30, podczas gdy tetrodotoksyna zmniejsza ekspresję MHCI¹⁴. Poprzednie metody wykrywania ekspresji MHCI opierały się na hybrydyzacji in situ i analizie immunohistochemicznej 14,15,20,31. Podczas gdy testy oparte na mRNA, takie jak hybrydyzacja in situ i qRT-PCR, mogą określić lokalizację czasoprzestrzenną, specyficzność typu komórki i poziomy transkrypcji genów, testy te nie mogą ocenić translacji białka ani transportu do błony komórkowej. Analiza immunohistochemiczna i western blot mogą określić różnice w ekspresji białek i potencjalnie lokalizacji komórkowej, ale mogą być trudne do dokładnego określenia ilościowego. Co więcej, wiele przeciwciał MHCI rozpoznaje trzeciorzędową strukturę kompleksu i jest bardzo wrażliwych na zmiany konformacyjne. Tak więc warunki przepuszczalności lub denaturacji powodują utratę immunoreaktywności MHCI³². Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje barwienie immunologiczne in situ dla MHCI, które pozwala na rozpoznanie białka przez przeciwciało w jego natywnej konformacji, a następnie metody utrwalania i przepuszczalności.

Z niewielkimi modyfikacjami, opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do hodowli innych populacji neuronów lub do oceny ekspresji innych białek zewnątrzkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania. W tym protokole odnotowano łatwe modyfikacje, które można wprowadzić w celu hodowli neuronów korowych, ale opisane tutaj metody mogą być również wykorzystane do hodowli innych populacji neuronów, takich jak neurony prążkowia³³. Ponadto, chociaż protokół ten określa barwienie immunologiczne MHCI i NeuN, inne markery komórkowe można zidentyfikować w podobny sposób. Ogólnie rzecz biorąc, markery zewnątrzkomórkowe mogą być traktowane jak MHCI, a markery wewnątrzkomórkowe mogą być leczone jak NeuN. Należy jednak zauważyć, że na etapie dysocjacji komórkowej wypustki aksonalne są odcinane od somy. Ponieważ zdefiniowana tutaj strategia bramkowania odsiewa szczątki komórkowe i koncentruje się na markerze jąder neuronalnych NeuN, białka, które ulegają ekspresji wyłącznie w projekcjach aksonalnych, mogą nie zostać wykryte.

Do niedawna uważano, że neurony wyrażają MHCI tylko w odpowiedzi na uszkodzenie, infekcję lub stymulację cytokinami in vitro w celu zaangażowania cytotoksycznych limfocytów T CD8 ^{+ 9}. Nowe badania wyjaśniły inną funkcję MHCI w regulacji połączeń synaptycznych podczas rozwoju¹³. Opisany tutaj protokół wykorzystuje IFNβ do stymulowania ekspresji MHCI w neuronach hodowanych w typie dzikim, ale podobne metody mogą być stosowane z różnymi bodźcami komórkowymi lub modyfikacjami genetycznymi w celu przetestowania określonych hipotez. Metoda ta umożliwi naukowcom zbadanie mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję MHCI, co poprawi zrozumienie dychotomicznej roli MHCI w tych dwóch odrębnych funkcjach komórkowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Fisher	05-408-129	Materiały laboratoryjne
100 mm sterylne naczynie hodowlane	Fisher	FB012924	Materiały do kultur tkankowych
15 ml Probówki wirówkowe	Genesee	21-103	Materiały laboratoryjne
Probówka wirówkowa 50 ml	Genesee	21-108	Materiały laboratoryjne
500 mM EDTA	Invitrogen	AM9260G	Odczynnik buforowy FACS
70% etanolu	Fisher	BP82031Gal	Hodowla tkankowa Dostarcza
96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U	Genesee	25-221	Cytometria przepływowa
B27	Gibco	17504044	Odczynnik do hodowli neuronów
Bufor boranowy	Thermo Scientific	28341	Materiały do hodowli tkankowych
Szkło borokrzemianowe Pipeta Pasteura	Fisher	13 678 20C	Materiały laboratoryjne
Bufor do dysocjacji komórek	Gibco	13 151 014	Materiały do cytometrii
przepływowej DNase I	Thermo	90083	Roztwór dysocjacyjny Odczynnik
dPBS	Gibco	14190-235	Materiały do hodowli tkankowych
Dumont #5 Kleszcze	Narzędzia do nauki precyzyjnej	91150-20	Narzędzie do preparacji
Dumont #7 Kleszcze	Narzędzia do nauki o jakości	91197-00	Narzędzie do preparowania
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	26140079	Materiały do hodowli tkankowych
Cienkie kleszcze	Narzędzia do nauki o	91113-10	Narzędzie do preparacji
Drobne nożyczki	Narzędzia do	91460-11	Narzędzie do preparowania
Napraw i trwałą ondulację komórek	Invitrogen	GAS003	Cytometria przepływowa Materiały eksploatacyjne
Glutamax	Gibco	35050061	Odczynnik do hodowli neuronów
Hibernate-E Medium	Gibco	A1247601	Odczynnik do hodowli neuronów
Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem	Fisher	181254	Materiały do hodowli tkankowych
Test interferonu beta	PBL Science	12405-1	Materiały do cytometrii przepływowej
Przeciwciało Milli-Mark Anty-NeuN-PE, klon A60	MiliporeSigma	FCMAB317PE	Cytometria przepływowa Przeciwciało
Neurobaseal Media	Gibco	21103049	Odczynnik do hodowli neuronów
Pacific Blue anty-mysie przeciwciało H-2Kb	BioLegend	116513	Cytometria przepływowa
Roztwór papainy	Odczynnik
do roztworu dysocjacyjnego Worth LS003126 ingtonParaformaldehydowa	mikroskopia elektronowa Nauki	15714	Utrwalająca
penicylina-streptomycyna	Gibco	15140122	Odczynnik do hodowli neuronów
Poli-D-lizyna	Sigma	P7280	Odczynnik do hodowli neuronów
Kleszcze o standardowym wzorze	Narzędzia do nauki o	91100-12	Narzędzie do preparacji
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Swift	M29TZ-SM99CL-BTW1	Narzędzie do preparacji
Nożyczki chirurgiczne	Narzędzia do nauki	91401-10	Narzędzie do preparacji
Pipety transferowe	Corning	357575	Materiały laboratoryjne
TruStain FcX (anty-mysie CD16/32) Przeciwciało	BioLegend	101319	Cytometria przepływowa Przeciwciało
Trypan Blue	Sigma	T8154-100ML	Materiały do hodowli tkankowych