Method Article

Biomimetyczna replikacja mikrostruktury powierzchni korzenia przy użyciu zmiany miękkiej litografii

DOI:

10.3791/61437

⸱

August 5th, 2020

 ,  , 
1Institute of Plant Sciences, Agricultural Research Organization (Volcani Center), 2Agro-NanoTechnology and Advanced Materials Center, Agricultural Research Organization (Volcani Center)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomimetyka była wcześniej używana jako narzędzie do badania interakcji między liśćmi a mikroorganizmami. Jednak takie narzędzie nie istnieje dla korzeni. W tym miejscu opracowujemy protokół tworzenia syntetycznych powierzchni naśladujących mikrostrukturę powierzchni korzenia w celu badania interakcji między korzeniami a środowiskiem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomimetyka to wykorzystanie chemii i nauk o materiałach do naśladowania systemów biologicznych, w szczególności struktur biologicznych, w celu ulepszenia ludzkości. Ostatnio powierzchnie biomimetyczne naśladujące mikrostrukturę powierzchni liści zostały wykorzystane do zbadania wpływu mikrostruktury liści na interakcje między liśćmi a środowiskiem. Jednak takie narzędzie nie istnieje dla korzeni. Opracowaliśmy narzędzie pozwalające na syntetyczne naśladowanie mikrostruktury powierzchni korzenia w sztuczną powierzchnię. Oparliśmy się na metodzie miękkiej litografii, znanej z replikacji mikrostruktury powierzchni liści, przy użyciu dwuetapowego procesu. Pierwszy krok jest trudniejszy, ponieważ obejmuje tkankę biologiczną. W tym przypadku zastosowaliśmy inny polimer i strategię utwardzania, opierając się na mocnym, sztywnym poliuretanie, utwardzanym promieniami UV do formowania korzeni. Pozwoliło nam to uzyskać wiarygodny negatywny obraz mikrostruktury powierzchni korzenia, w tym delikatnych, trudnych cech, takich jak włośniki. Następnie wykorzystaliśmy ten negatywny obraz jako szablon do osiągnięcia replikacji mikrostruktury powierzchni korzenia przy użyciu zarówno dobrze znanego polidimetylosiloksanu (PDMS), jak i pochodnej celulozy, etylocelulozy, która reprezentuje bliższe naśladowanie korzenia i która może być również degradowana przez enzymy celulazy wydzielane przez mikroorganizmy. Ta nowo powstała platforma może być wykorzystana do badania efektów mikrostrukturalnych powierzchni w interakcjach korzeni-mikroorganizmy w sposób podobny do tego, jaki wcześniej wykazano w liściach. Dodatkowo system umożliwia śledzenie lokalizacji mikroorganizmu względem cech powierzchniowych, a w przyszłości jego aktywności w postaci wydzielania celulazy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Replikacja mikrostruktury powierzchni liści jest znaną metodą w dziedzinie badań biomimetycznych1,2,3,4. Najwcześniejsze replikacje mikrostruktury powierzchni liścia zostały wykonane przy użyciu lakieru do paznokci i materiałów gumowych nałożonych na powierzchnię liścia w celu lepszej wizualizacji mikrostruktury, w szczególności aparatów szparkowych5,6,7,8,9,10. Metoda została następnie ulepszona, a zaawansowane polimery zostały wykorzystane do naśladowania mikrostruktury powierzchni liści za pomocą miękkiej litografii, szczególnie w kontekście biomimetyki powierzchni super hydrofobowych2,3,4,11,12. W ostatnich latach udowodniono, że metoda ta jest użytecznym narzędziem w badaniu interakcji między powierzchnią liścia a mikroorganizmami bytującymi na powierzchni, niezależnie od tego, czy są one chorobotwórcze13,14 czy korzystne, jako część naturalnej filosfery liści15. Uproszczenie systemu naturalnego okazało się niezwykle przydatne w badaniu interakcji powierzchnia-mikroorganizmy, nawet gdy jako powierzchnie używano czysto syntetycznych systemów15,16,17,18.

Podczas gdy replikacja mikrostruktury powierzchni liści okazała się użytecznym narzędziem do badania interakcji zachodzących na powierzchni liścia z różnymi mikroorganizmami, nie ma takiego narzędzia dla korzeni roślin. Korzenie roślin są trudniejsze do zbadania, ponieważ znajdują się pod ziemią, a wszystkie interakcje zachodzą w glebie. Podobnie jak w przypadku liści, mikrostruktura powierzchni korzeni może odgrywać rolę w interakcjach między korzeniami a mikroorganizmami. Jednak obecnie nie istnieje żadna metoda pozwalająca na wyizolowanie specyficznej roli mikrostruktury powierzchni korzenia w złożonych interakcjach korzeni-mikroorganizm. Najczęściej badaną cechą mikrostrukturalną powierzchni korzenia jest włośnik19,20,21. Włośniki odgrywają ważną rolę w zwiększaniu powierzchni, a tym samym umożliwiają bardziej efektywne pobieranie składników odżywczych i wody22, jednak ich udział jako cechy strukturalnej w interakcjach korzeni-mikroorganizm nigdy nie został przetestowany.

Najczęściej używanym polimerem do miękkiej litografii liści jest polidimetylosiloksan (PDMS). Właściwości PDMS są podobne do właściwości naskórka liścia15,23. Jednak w korzeniach roślin najobficiej występującym materiałem jest celuloza24,25, który ma inne właściwości niż PDMS26,27,28. Wykorzystanie PDMS do zbudowania syntetycznej platformy do badania efektów mikrostruktury powierzchni w interakcjach między korzeniem a środowiskiem jest zatem dalekie od ideału.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia tworzenie syntetycznej repliki mikrostruktury powierzchni korzenia z różnych materiałów. Podobnie jak w przypadku metody replikacji mikrostruktury powierzchni liścia, jest to proces dwuetapowy. W pierwszym etapie wykorzystuje się tkankę biologiczną (korzeń) jako źródło do formowania w formę poliuretanową (replikę negatywową). Forma poliuretanowa, która reprezentuje negatywny obraz mikrostruktury powierzchni korzenia, może być następnie wykorzystana jako podstawa do generowania pozytywnej replikacji mikrostruktury powierzchni korzenia z różnych materiałów, w tym PDMS i pochodnych celulozy. Ta replikacja powierzchni korzenia może być później wykorzystana jako platforma do zrozumienia roli struktury powierzchni w interakcjach korzeń-mikroorganizm.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawa roślin i przygotowanie korzeni

  1. Opcja 1: Przygotuj korzenie przybyszowe z łodygi.
    1. Weź tacę do ukorzeniania do uprawy roślin.
    2. Napełnij tacę ziemią.
    3. Dodaj jedno nasiono odmiany pomidora M82 do każdej komórki w tacy.
    4. Przykryj nasiona niewielką ilością ziemi.
    5. Podlewaj tacę od dołu zakraplaczem, ponieważ woda wypełnia dno tacy, a gleba wchłania wodę.
    6. Raz w tygodniu dodawaj 2 ml nawozu na 1 l wody na dno tacy.
    7. Rośnie w komorze uprawowej w temperaturze 25 °C.
    8. Stosuj warunki oświetleniowe 9 h światła (7:00-16:00) na przemian z 15 h ciemności.
    9. Po 3 tygodniach usuń roślinę z gleby.
    10. Odetnij system korzeniowy od rośliny w miejscu interakcji z łodygą.
    11. Umieść roślinę bez korzeni w zlewce wypełnionej wodą.
    12. Po kilku dniach odetnij korzenie przybyszowe, które wyłaniają się z łodygi i użyj ich do replikacji.
  2. Opcja 2: Przygotuj kiełkujące korzenie nasion.
    1. Zwilż wodą bibułę filtracyjną wielkości szalki Petriego.
    2. Umieść kilka nasion M82 (nie więcej niż 10) na papierze, wewnątrz szalki Petriego.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C.
    4. Nawilżaj papier codziennie.
    5. Gdy wykiełkowane korzenie będą wystarczająco długie (około 5 dni), usuń nasiona i użyj korzeni do replikacji.

2. Przygotowanie repliki negatywu korzeniowego z poliuretanu

  1. Aby wytworzyć ujemny roztwór repliki, dodać 9,49 g dimetakrylanu diuretanu do fiolki o pojemności 20 ml.
    1. Dodać 1,45 ml metakrylanu etylu do fiolki.
    2. Mieszać w temperaturze pokojowej (RT), aż roztwór będzie klarowny i stanie się jednorodny.
      UWAGA: Do uzyskania jednorodnego roztworu wystarcza około 2 godziny.
    3. Dodać 3 ml plastyfikatora, ftalanu dietylu i mieszać przez 1 godzinę w temperaturze RT.
      UWAGA: Ftalan dietylu miesza się z monomerem akrylowym.
    4. Dodać 300 μl fotoinicjatora, 2-hydroksy-2-metylopropiofenonu, i mieszać przez noc w temperaturze suchej masy. Kontynuować mieszanie, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Roztwór można przechowywać w RT.
  2. Aby wygenerować ujemną replikę korzenia, weź czyste szklane szkiełko i wlej na nie 1 ml roztworu repliki negatywu.
    1. Umieść 2\u20123 korzenie nad roztworem. Nie pozwól, aby korzenie zostały całkowicie pokryte roztworem.
    2. Trzymaj szkiełko pod lampą ultrafioletową (UV) o mocy 8 W przez 8\u201210 min. Nie przechowuj roztworu zbyt długo w świetle UV.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie trzymać roztworu zbyt długo pod wpływem światła UV, ponieważ sprawia to, że poliuretan jest zbyt twardy, co uniemożliwia usunięcie korzenia.
    3. Wyłącz lampę UV, zdejmij replikę ze szkiełka i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej etanolem, aby usunąć nieprzereagowany monomer.
    4. Aby uzyskać replikę negatywową, należy bardzo powoli usunąć korzeń z repliki za pomocą kleszczy.

3. Przygotuj główną replikę dodatnią z PDMS.

  1. Aby wytworzyć mieszaninę do repliki dodatniej, umieść 10 g dimetylosiloksanu w papierowym kubku.
    1. Dodaj 1 g utwardzacza i dokładnie wymieszaj.
    2. Przechowywać mieszaninę w eksykatorze pod próżnią przez 2 godziny w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
  2. Aby wygenerować replikę pozytywu, umieść poliuretanową replikę negatywu na szalce Petriego.
    1. Wylej mieszaninę PDMS na wierzch repliki negatywowej.
    2. Stosować podciśnienie przez 2 godziny, aby zapewnić pokrycie mikrostruktury.
    3. Trzymaj szalkę Petriego przez noc w temperaturze RT.
    4. Ręcznie oddzielić utwardzoną replikę dodatnią od repliki ujemnej.

4. Przygotuj replikę dodatnią z etylocelulozy.

  1. Aby wytworzyć roztwór etylocelulozy, umieść 1,32 ml ftalanu dietylu jako plastyfikatora w kubku o pojemności 100 ml.
    1. Dodaj 20 ml etanolu i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    2. Dodaj 3,3 g etylocelulozy i mieszaj przez noc.
  2. Aby wygenerować replikę pozytywu, umieść poliuretanową replikę negatywu na szalce Petriego.
    1. Wlać roztwór etylocelulozy na wierzch repliki negatywowej.
    2. Trzymaj szalkę Petriego przez noc w temperaturze RT pod maską.
    3. Bardzo powoli wyjmij replikę pozytywową z repliki negatywowej za pomocą kleszczy.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby utworzyć replikację mikrostruktury powierzchni korzenia, należy wybrać korzeń do formowania. Uprawiamy pomidory w glebie, co sprawia, że wykorzystanie naturalnego korzenia z systemu korzeniowego jest niezwykle trudne. Usunięcie gleby z systemu korzeniowego może być trudne, a dodatkowo korzenie systemu korzeniowego są kruche i mogą pękać przy próbach formowania. Dlatego sugerujemy, aby najpierw użyć bardziej sztywnych korzeni, aby ustalić protokół w laboratorium. Formowanie takich korzeni opisane jest w Rysunek 1A. System korzeniowy rośliny usuwa się po 3 tygodniach uprawy rośliny, a roślinę bez korzeni umieszcza się w wodzie na około tydzień, aż z łodygi wyłonią się korzenie przybyszowe. Te korzenie mogą być używane do replikacji podczas ustanawiania protokołu. Po ustaleniu protokołu pożądana jest bardziej realistyczna struktura powierzchni korzenia. W tym miejscu sugerujemy unikanie korzeni rosnących w glebie, ponieważ pełne usunięcie gleby jest niezwykle trudne. Zamiast tego sugerujemy użycie kiełkujących korzeni, dostarczających cennych informacji na temat mikrostruktury powierzchni korzeni genetycznie specyficznej rośliny. Wzrost takich korzeni opisany jest w Rysunek 1B. Nasiona umieszcza się na mokrej bibule filtracyjnej i inkubuje w temperaturze 25 °C. Po około 5 dniach, podczas których bibuła filtracyjna jest wilgotna, kiełkujące korzenie są wystarczająco długie do replikacji. Korzenie te są bardziej kruche niż wcześniej sugerowane korzenie i wymagają delikatniejszej pielęgnacji.

Produkcja repliki mikrostruktury powierzchni korzenia jest procesem dwuetapowym. W pierwszym etapie naturalny korzeń jest formowany w formę na bazie poliuretanu (replika negatywu). Zaletą tego etapu jest to, że wszystkie materiały na formę poliuretanową są przygotowywane, a korzeń umieszcza się na przygotowanym roztworze na samym końcu na 10 minut ekspozycji na promieniowanie UV. W rezultacie, tkanka biologiczna nie jest zbyt długo narażona na trudne warunki i może być delikatnie traktowana pod koniec procesu. Jeśli zostaną wykonane wszystkie kroki protokołu, zostanie wygenerowana dobra replika ujemna. Ta replika pokaże strukturę komórkową powierzchni korzenia, a także otwory reprezentujące lokalizację włośników (Rysunek 2A). Jeśli niektóre krytyczne kroki w protokole nie są przestrzegane, procedura zakończy się niepowodzeniem. Jednym z takich kroków jest umieszczenie korzenia na roztworze poliuretanu przed utwardzeniem. Korzeń należy umieścić bardzo delikatnie, aby uniknąć zanurzenia go w roztworze poliuretanu. Takie zanurzenie jakiejkolwiek części korzenia spowoduje uwięzienie korzenia w twardym polimerze bez możliwości jego usunięcia. Jeśli takie zdarzenie wystąpi, korzeń pozostanie w replice ujemnej po jej utwardzeniu (Rysunek 2B). Kolejnym kluczowym krokiem jest czas utwardzania światłem UV. Zalecany czas utwardzania to 8\u201210 min. Przekroczenie 10 minut spowoduje powstanie niezwykle twardej formy poliuretanowej, co uniemożliwi usunięcie korzenia bez złamania go w formie poliuretanowej. Złamanie korzenia może być czasami widoczne gołym okiem, np. gdy złamany jest duży kawałek (Rysunek 2C, u góry, zaznaczony fioletowymi strzałkami). Zdarza się jednak, że w materiale pozostają małe kawałki korzeni, które są trudne do zauważenia gołym okiem i trzeba użyć mikroskopu (Rysunek 2C, na dole, zaznaczony fioletowymi strzałkami). Zalecamy dokładne zbadanie poliuretanowej repliki negatywu pod mikroskopem przed kontynuacją protokołu, aby upewnić się, że nie ma w niej pozostałości korzenia.

Po przygotowaniu repliki negatywu poliuretanowego; do przygotowania repliki pozytywowej można użyć wielu materiałów. Przygotowanie repliki pozytywu, przy użyciu poliuretanowej repliki negatywu jako formy, jest proste i zależy całkowicie od jakości repliki negatywu poliuretanowego. Do wygenerowania pozytywnej repliki użyliśmy zarówno PDMS - jak dobrze wiadomo w dziedzinie miękkiej litografii (Rysunek 3A) - jak i etylocelulozy jako materiału, który lepiej naśladuje właściwości powierzchni korzenia, która składa się głównie z celulozy (Rysunek 3B). Obraz SEM repliki PDMS pokazuje bardzo wyraźnie włośniki. Włosy znajdują się w strefie wydłużenia, gdzie zaczynają się wyłaniać. W związku z tym długość włośników zmienia się wzdłuż powierzchni korzenia, gdy stają się one dłuższe, podobnie jak w naturalnym korzeniu (Rysunek 3A). Etyloceluloza wytwarza twardszą i mniej elastyczną folię niż PDMS. W związku z tym usunięcie go z formy ujemnej wymaga większej staranności. Jednak niektóre włoski i mikrostruktura powierzchni są widoczne pod mikroskopem świetlnym (Ryc. 3B). Użyliśmy tych dwóch materiałów do wygenerowania repliki pozytywowej, jednak każdy materiał, który może tworzyć film, będzie dobrym kandydatem na replikę pozytywową, przy użyciu poliuretanowej repliki negatywowej.

figure-results-1
Rysunek 1: Korzenie pomidora do replikacji. (A) Roślina pomidora (M82) jest uprawiana w temperaturze 25 °C, przy 9 godzinach światła i 15 godzinach ciemności. Po 3 tygodniach roślinę usuwa się z gleby, a system korzeniowy odcina się. Bezkorzeniową roślinę umieszcza się w wodzie, aż po około tygodniu z łodygi wyłonią się korzenie przybyszowe. Korzenie te nie wykazują dokładnej struktury jak korzenie z systemu korzeniowego, ale stanowią dobry model. Korzenie te są mniej kruche niż korzenie systemu korzeniowego i dlatego preferowane jest do pracy z nimi podczas ustalania techniki w laboratorium. B) Nasiona pomidora (M82) umieszcza się na mokrej bibule filtracyjnej na płytce Petriego i inkubuje w temperaturze 25 °C. Papier jest codziennie nawilżany, a nasiona kiełkują. Korzenie rosną i po około 5 dniach są wystarczająco długie, aby można je było wykorzystać do replikacji. Te korzenie są łagodniejsze i powinny być używane, gdy metoda jest dobrze ugruntowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazy mikroskopowe repliki negatywu poliuretanowego. (A) Obraz SEM repliki negatywu poliuretanowego wykonany zgodnie z protokołem wykonanym zgodnie ze wszystkimi krokami. Struktura komórkowa jest wyraźnie widoczna. Żółte strzałki wskazują otwory utworzone przez włosy w korzeniu. (B) Obrazy z mikroskopii świetlnej poliuretanowej repliki negatywu z korzeniem w jej wnętrzu, ponieważ była ona całkowicie pokryta roztworem i jej usunięcie było niemożliwe. Negatyw poliuretanowy został utwardzony z korzeniem w środku. Korzeń jest widoczny gołym okiem i przy użyciu mikroskopii świetlnej. Nie ma możliwości usunięcia tego korzenia z utwardzonej repliki. (C) Obrazy z mikroskopii świetlnej poliuretanowej repliki negatywu, która była zbyt długo przechowywana w świetle UV. W rezultacie, korzeń nie mógł być całkowicie usunięty z polimeru ani za pomocą dużych cząstek widocznych gołym okiem (górne zdjęcie, oznaczone fioletowymi strzałkami), ani małych frakcji widocznych tylko przez mikroskop (dolny obraz, zaznaczony fioletowymi strzałkami). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazy mikroskopowe repliki pozytywowej. (A) Mikrofotografia SEM repliki pozytywowej wykonanej z PDMS. Powiększenie pokazuje włośniki. (B) Obrazy z mikroskopii świetlnej pozytywowej repliki wykonanej z etylocelulozy. Włosy są pokazane na obrazach po prawej stronie, podczas gdy tekstura powierzchni jest widoczna na obrazie po lewej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy nowatorską metodę replikacji mikrostruktury powierzchni korzeni. Metoda ta opiera się na istniejących metodach replikacji mikrostruktury powierzchni liścia4. Aby opracować tę metodę, musieliśmy dostosować istniejącą metodę dla liści. Zdaliśmy sobie sprawę, że problematyczny etap kopiowania metody replikacji liści do korzeni obejmuje pierwszy etap formowania korzeni. Jest to najbardziej wrażliwa część metody, ponieważ obejmuje tkankę biologiczną. W związku z tym zależało nam na wyborze polimeru, który wymagałby stosunkowo łagodnych warunków do utwardzenia, a tym samym powodował minimalne uszkodzenia tkanki biologicznej. Wybraliśmy poliuretan, ponieważ można go szybko (w ciągu 10 minut) polimeryzować w świetle UV29. Dodatkowo jest bardzo twardy po spolimeryzowaniu30 i mieliśmy nadzieję, że ta właściwość pozwoli na stosunkowo łatwe usunięcie korzenia z formy poliuretanowej.

Przedstawiona metoda jest podejściem dwuetapowym, w którym w pierwszym kroku tworzony jest obraz negatywowy (replika negatywowa), a w drugim etapie tworzona jest replikacja, oparta na replice negatywowej. Rozszerza to zakres materiałów, z którymi możemy pracować. Replikację mikrostruktury powierzchni liści przeprowadzono głównie na PDMS lub materiałach epoksydowych11,31. Niektóre prace wykonano z innymi materiałami, w szczególności z materiałami wspomagającymi wzrost mikroorganizmów13,32. Wynika to z faktu, że w ostatnich latach metoda ta jest wykorzystywana do badania interakcji mikroorganizm-powierzchnia w kontekście budowy powierzchni liści. W tej metodzie nie użyto jednak materiałów celulozopodobnych w kontekście liści. Sugerujemy użycie poliuretanowej repliki negatywu jako formy i różnych materiałów do wykonania repliki pozytywowej. Innymi słowy, wykonanie repliki pozytywowej, z różnych materiałów, jest stosunkowo łatwe, gdy już zostanie wykonana dobra replika negatywowa. Obecnie używamy pochodnych celulozy, ale badamy możliwości zastosowania bardziej odpowiednich materiałów do powierzchni korzeni, takich jak pektyna i lignina33,34 w połączeniu z pochodnymi celulozy.

Metoda ta rozszerza również istniejącą metodę replikacji mikrostruktury powierzchni liścia, ponieważ liść jest powierzchnią 2D, podczas gdy powierzchnia korzenia jest zakrzywiona, a zatem jest powierzchnią 3D. Nasza metoda nie pozwala na odtworzenie całej powierzchni, ponieważ zatopienie całego korzenia w roztworze poliuretanu nie pozwala na jego uwolnienie. W związku z tym podczas replikowania mikrostruktury powierzchni korzenia należy wybrać jedną stronę korzenia. Wygenerowana powierzchnia syntetyczna jest zakrzywiona i reprezentuje mniej więcej połowę powierzchni, ale nie całą. Zakładamy, że cechy strukturalne powierzchni korzenia są w większości symetryczne względem osi wzdłuż długości korzenia. Jednak w badaniach, w których taka symetria nie jest zakładana, należy uważać, aby wybrać odpowiedni korzeń boczny do replikacji.

Przedstawiamy dwie opcje korzeni, które można wykorzystać jako formy. Pierwsza to opcja korzeni przybyszowych wyrastających z łodygi, a druga to opcja kiełkujących korzeni na papierze. Pierwsza opcja ma na celu głównie pomoc naukowcom w praktykowaniu metody, ponieważ te korzenie są bardziej wytrzymałe i łatwiejsze w obróbce. Druga opcja reprezentuje różnice genetyczne, które można znaleźć między korzeniami różnych odmian, niezależnie od warunków środowiskowych. Powierzchnie te mogą być wykorzystywane jako ważne narzędzia badawcze, jednak należy mieć świadomość, że środowisko może mieć silny wpływ na strukturę powierzchni korzeni, a w szczególności na glebę, w której rosną korzenie 35,36. Ze względu na naprężenia mechaniczne wywierane przez glebę, muszą wystąpić pewne zmiany morfologiczne, oprócz ran narastających na powierzchni, gdy korzeń wnika w glebę37. Usunięcie korzeni z gleby, a także ich oczyszczenie, bez uszkodzenia ich struktury, jest bardzo trudnym zadaniem. W związku z tym nie jesteśmy optymistami co do możliwości wykorzystania tej metody do wiarygodnego naśladowania mikrostruktury powierzchni korzeni rosnących w glebie. Jednak w przypadku badań, które koncentrują się na różnicach genetycznych lub różnicach środowiskowych, w których zmiana mikrostruktury jest zauważalnie wyraźna, metoda ta może być stosowana jako narzędzie do badania wpływu mikrostruktury powierzchni korzenia.

Nasza metoda pozwala uzyskać obojętną powierzchnię naśladującą jedynie właściwości mikrostrukturalne powierzchni korzenia. Chociaż metoda ta ma na celu oddzielenie efektów strukturalnych w interakcjach pierwiastek - środowisko od wszystkich innych efektów, nie możemy ignorować związków chemicznych w tych interakcjach. Niektóre mikroorganizmy mogą nie przetrwać lub nie funkcjonować na powierzchni bez dodatku związków, w szczególności składników odżywczych. Kolejnym krokiem w rozwoju tej platformy będzie kontrolowane dodawanie związków chemicznych w celu zbadania ich wpływu na różne interakcje w połączeniu ze strukturą.

Metoda ta została opracowana jako pierwszy krok w rozwoju syntetycznej platformy do badania interakcji między korzeniami a mikroorganizmami. Tutaj naśladujemy mikrostrukturę powierzchni korzenia, a ta początkowa platforma może być wykorzystana do badania wpływu mikrostruktury powierzchni na zachowanie mikroorganizmów. Jednak ta platforma jest ograniczona, ponieważ brakuje jej wielu innych elementów z systemu naturalnego. Platforma ta powinna być dalej rozwijana przy użyciu odpowiednich materiałów do generowania powierzchni oraz z dodaniem do systemu innych, krytycznych substancji chemicznych. Na bardziej zaawansowanej platformie możemy również wyobrazić sobie przestrzenny rozkład chemikaliów. Ponieważ jednak obecnie nie istnieje żadna inna metoda izolowania efektów strukturalnych w interakcjach korzeni-mikroorganizm, mamy nadzieję, że naukowcy będą mogli wykorzystać tę początkową platformę do zadawania pytań dotyczących specyficznej struktury w tych interakcjach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania były wspierane przez fundusze zalążkowe od Organizacji Badań Rolniczych do MK.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-hydroksy-2-metylopiofenonSigma405655
Ftalan dietyluAcross114520010
Diuretan dimetarylanuSigma436909
EtylocelulozaAcross232705000
Metakrylan etyluSigma234893
Shaphir SolutionNawóz GAT6-2-4
Sylgard 184 zestawPolymer-G510018400500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lotus-Like Biomimetic Hierarchical Structures Developed by the Self-Assembly of Tubular Plant Waxes. Langmuir. 25, 1659-1666 (2009).">Bhushan, B., Jung, Y. C., Niemietz, A., Koch, K. Lotus-Like Biomimetic Hierarchical Structures Developed by the Self-Assembly of Tubular Plant Waxes. Langmuir. 25, 1659-1666 (2009).
  2. Superhydrophobic and superhydrophilic plant surfaces: an inspiration for biomimetic materials. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 367, 1487-1509 (2009).">Koch, K., Barthlott, W. Superhydrophobic and superhydrophilic plant surfaces: an inspiration for biomimetic materials. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 367, 1487-1509 (2009).
  3. Biomimetic replicas: Transfer of complex architectures with different optical properties from plant surfaces onto technical materials. Acta Biomaterialia. 5, 1848-1854 (2009).">Schulte, A. J., Koch, K., Spaeth, M., Barthlott, W. Biomimetic replicas: Transfer of complex architectures with different optical properties from plant surfaces onto technical materials. Acta Biomaterialia. 5, 1848-1854 (2009).
  4. A fast, precise and low-cost replication technique for nano- and high-aspect-ratio structures of biological and artificial surfacese. Bioinspiration & Biomimetics. 3, 046002(2008).">Koch, K., Schulte, A., Fischer, A., Gorb, S., Barthlott, W. A fast, precise and low-cost replication technique for nano- and high-aspect-ratio structures of biological and artificial surfacese. Bioinspiration & Biomimetics. 3, 046002(2008).
  5. Accurate Estimation of Stomatal Aperture From Silicone Rubber Impressions. New Phytology. 101, 109-115 (1985).">Weyers, J. D. B., Johansen, L. G. Accurate Estimation of Stomatal Aperture From Silicone Rubber Impressions. New Phytology. 101, 109-115 (1985).
  6. Convenient Method for Studying Grass Leaf Epidermis. Taxon. 33, 413-415 (1984).">Hilu, K. W., Randall, J. L. Convenient Method for Studying Grass Leaf Epidermis. Taxon. 33, 413-415 (1984).
  7. Method of replicating Dry or Moist Surfaces for Examination by Light. Nature. 191, 932-933 (1961).">Sampson, J. A. Method of replicating Dry or Moist Surfaces for Examination by Light. Nature. 191, 932-933 (1961).
  8. Selection and Preparation of Leaf Epidermis for Experiments on Stomatal Physiology. Journal of experimental botany. 32, 837-850 (1981).">Weyers, J. B. D., Travis, A. J. Selection and Preparation of Leaf Epidermis for Experiments on Stomatal Physiology. Journal of experimental botany. 32, 837-850 (1981).
  9. The Use of Silicone Rubber Plastic for Replicating Leaf Surfaces. Acta Botanica. Neerlandica. 18, 703-708 (1969).">Groot, J. The Use of Silicone Rubber Plastic for Replicating Leaf Surfaces. Acta Botanica. Neerlandica. 18, 703-708 (1969).
  10. Plant Pattern Recognition Receptors. , 243-248 (2017).">Wu, S., Zhao, B. Using Clear Nail Polish to Make Arabidopsis Epidermal Impressions for Measuring the Change of Stomatal Aperture Size in Immune Response. Plant Pattern Recognition Receptors. , 243-248 (2017).
  11. Plant leaves as templates for soft lithography. RSC Advances. 6, 22469-22475 (2016).">Wu, W., Guijt, R., Silina, Y., Koch, M., Manz, A. Plant leaves as templates for soft lithography. RSC Advances. 6, 22469-22475 (2016).
  12. Plant Surfaces: Structures and Functions for Biomimetic Innovations. Nano-Micro Letters. 9, 23(2017).">Barthlott, W., Mail, M., Bhushan, B., Koch, K. Plant Surfaces: Structures and Functions for Biomimetic Innovations. Nano-Micro Letters. 9, 23(2017).
  13. Fabrication of biomimetically patterned surfaces and their application to probing plant-bacteria interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, 12467-12478 (2014).">Zhang, B., et al. Fabrication of biomimetically patterned surfaces and their application to probing plant-bacteria interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, 12467-12478 (2014).
  14. Entrapment of bed bugs by leaf trichomes inspires microfabrication of biomimetic surfaces. Journal of the Royal Society Interface. 10, 20130174(2013).">Szyndler, M. W., Haynes, K. F., Potter, M. F., Corn, R. M., Loudon, C. Entrapment of bed bugs by leaf trichomes inspires microfabrication of biomimetic surfaces. Journal of the Royal Society Interface. 10, 20130174(2013).
  15. Artificial Surfaces in Phyllosphere Microbiology. Phytopathology. 105, 1036-1042 (2015).">Doan, H. K., Leveau, J. H. J. Artificial Surfaces in Phyllosphere Microbiology. Phytopathology. 105, 1036-1042 (2015).
  16. Impact of engineered surface microtopography on biofilm formation of Staphylococcus aureus. Biointerphases. 2, 89-94 (2007).">Chung, K. K., et al. Impact of engineered surface microtopography on biofilm formation of Staphylococcus aureus. Biointerphases. 2, 89-94 (2007).
  17. Attachment of Escherichia coli on plant surface structures built by microfabrication. Biosystems Engineering. 108, 244-252 (2011).">Sirinutsomboon, B., Delwiche, M. J., Young, G. M. Attachment of Escherichia coli on plant surface structures built by microfabrication. Biosystems Engineering. 108, 244-252 (2011).
  18. Effects of Growth Surface Topography on Bacterial Signaling in Coculture Biofilms. ACS Applied Materials and Interfaces. 9, 18531-18539 (2017).">Bhattacharjee, A., Khan, M., Kleiman, M., Hochbaum, A. I. Effects of Growth Surface Topography on Bacterial Signaling in Coculture Biofilms. ACS Applied Materials and Interfaces. 9, 18531-18539 (2017).
  19. Measuring roots: an updated approach. Mancuso, S. , Springer Science & Business Media. (2011).">Measuring roots: an updated approach. Mancuso, S. , Springer Science & Business Media. (2011).
  20. Structural and genetic analysis of epidermal cell differentiation in Arabidopsis primary roots. Development. 1798, 1789-1798 (1997).">Schneider, K., Wells, B., Dolan, L., Roberts, K. Structural and genetic analysis of epidermal cell differentiation in Arabidopsis primary roots. Development. 1798, 1789-1798 (1997).
  21. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 2474, 2465-2474 (1994).">Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 2474, 2465-2474 (1994).
  22. A dynamic model of nutrient uptake by root hairs. New Phytology. 185, 792-802 (2010).">Leitner, D., et al. A dynamic model of nutrient uptake by root hairs. New Phytology. 185, 792-802 (2010).
  23. Replicating Arabidopsis Model Leaf Surfaces for Phyllosphere Microbiology. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).">Soffe, R., Bernach, M., Remus-emsermann, M. N. P., Nock, V. Replicating Arabidopsis Model Leaf Surfaces for Phyllosphere Microbiology. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  24. Plant fibre: Molecular structure and biomechanical properties, of a complex living material, influencing its deconstruction towards a biobased composite. Materials. 9, 618(2016).">Sorieul, M., Dickson, A., Hill, S. J., Pearson, H. Plant fibre: Molecular structure and biomechanical properties, of a complex living material, influencing its deconstruction towards a biobased composite. Materials. 9, 618(2016).
  25. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9, 2749-2766 (2012).">Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9, 2749-2766 (2012).
  26. Cellulose-fundamental aspects. , 45-68 (2013).">Poletto, M., Pistor, V., Zattera, A. J. Structural characteristics and thermal properties of native cellulose. Cellulose-fundamental aspects. , 45-68 (2013).
  27. Cellulose Nanomaterials Review: Structure, Properties. Chemical Society Reviews. 40, 3941-3994 (2011).">Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J. A., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose Nanomaterials Review: Structure, Properties. Chemical Society Reviews. 40, 3941-3994 (2011).
  28. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, 035017(2014).">Johnston, I., McCluskey, D., Tan, C., Tracey, M. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, 035017(2014).
  29. Water-soluble UV curable urethane methyl acrylate coating: preparation and properties. Journal of Zhejiang University-SCIENCE A. 5, 906-911 (2004).">Yan-yan, W., Ying-wu, L., Bao-fang, L., Bo-geng, L. Water-soluble UV curable urethane methyl acrylate coating: preparation and properties. Journal of Zhejiang University-SCIENCE A. 5, 906-911 (2004).
  30. Synthesis and Properties of UV Curable Waterborne Polyurethane Acrylate Based on Modified Castor Oil. The pharmaceutical and chemical journal. 4, 34-40 (2017).">Bao, L., Huang, Y. Synthesis and Properties of UV Curable Waterborne Polyurethane Acrylate Based on Modified Castor Oil. The pharmaceutical and chemical journal. 4, 34-40 (2017).
  31. Gladiolus dalenii Based Bioinspired Structured Surface via Soft Lithography and Its Application in Water Vapor Condensation and Fog Harvesting. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 6, 6981-6993 (2018).">Sharma, V., Orejon, D., Takata, Y., Krishnan, V., Harish, S. Gladiolus dalenii Based Bioinspired Structured Surface via Soft Lithography and Its Application in Water Vapor Condensation and Fog Harvesting. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 6, 6981-6993 (2018).
  32. Comparison of replica leaf surface materials for phyllosphere microbiology. PloS one. 14, 1-19 (2019).">Soffe, R., Altenhuber, N., Bernach, M., Remus-Emsermann, M. N. P., Nock, V. Comparison of replica leaf surface materials for phyllosphere microbiology. PloS one. 14, 1-19 (2019).
  33. Composition and decomposition of roots of ryegrass and red clover. Soil Biology and Biochemistry. 11, 619-628 (1979).">Whitehead, D. C., Buchan, H., Hartlay, R. D. Composition and decomposition of roots of ryegrass and red clover. Soil Biology and Biochemistry. 11, 619-628 (1979).
  34. Fiber dimensions, lignin and cellulose content of various plant material and their suitability for paper production. Industrial crops and products. 19, 245-254 (2004).">Ververis, C., Georghiou, K., Christodoulakis, N., Santas, P., Santas, R. Fiber dimensions, lignin and cellulose content of various plant material and their suitability for paper production. Industrial crops and products. 19, 245-254 (2004).
  35. The effect of mechanical impedance on root growth in pea (Pisum sativum). II. Cell expansion and wall rheology during recovery. Physiologia Plantarum. 109, 150-159 (2000).">Croser, C., Bengough, A. G., Pritchard, J. The effect of mechanical impedance on root growth in pea (Pisum sativum). II. Cell expansion and wall rheology during recovery. Physiologia Plantarum. 109, 150-159 (2000).
  36. Effects of soil compaction on root elongation and anatomy of different cereal plant species. Soil and Tillage Research. 121, 74-81 (2012).">Lipiec, J., Horn, R., Pietrusiewicz, J., Siczek, A. Effects of soil compaction on root elongation and anatomy of different cereal plant species. Soil and Tillage Research. 121, 74-81 (2012).
  37. Morphological responses of plant roots to mechanical stress. Annals of botany. 122, 711-723 (2018).">Potocka, I., Szymanowska-Pulka, J. Morphological responses of plant roots to mechanical stress. Annals of botany. 122, 711-723 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biomimetic ReplicationRoot Surface MicrostructureSoft LithographyPolyurethane MoldingPDMS ReplicaEthyl CelluloseRoot HairsUV CuringNegative ReplicaPositive Replica

Related Articles