Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wewnątrzkomórkowy zapis neuronów rdzeniowych in vivo stanowi "złoty standard" do określania cech elektrofizjologicznych komórek w nienaruszonej sieci rdzeniowej i ma znaczące zalety w porównaniu z klasycznymi technikami zapisu in vitro lub zewnątrzkomórkowego. Zaletą nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo jest to, że metoda ta może być wykonywana na dorosłych zwierzętach z w pełni dojrzałym układem nerwowym, a zatem wiele obserwowanych mechanizmów fizjologicznych można przełożyć na praktyczne zastosowania. W niniejszej pracy metodologicznej opisano tę procedurę w połączeniu z zewnętrznie stosowaną stymulacją prądem stałym, która naśladuje procesy polaryzacji zachodzące w rdzeniowych sieciach neuronalnych. Przezrdzeniowa stymulacja prądem stałym (tsDCS) jest innowacyjną metodą coraz częściej stosowaną jako interwencja neuromodulująca w rehabilitacji po różnych urazach neurologicznych, a także w sporcie. Wpływ tsDCS na układ nerwowy pozostaje słabo poznany, a mechanizmy fizjologiczne stojące za jego działaniem są w dużej mierze nieznane. Zastosowanie tsDCS równocześnie z zapisami wewnątrzkomórkowymi umożliwia nam bezpośrednią obserwację zmian właściwości błony neuronu ruchowego i charakterystyki rytmicznego odpalania w odpowiedzi na polaryzację rdzeniowej sieci neuronalnej, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia działania tsDCS. Ponadto, gdy prezentowany protokół obejmuje identyfikację motoneuronu w odniesieniu do unerwionego mięśnia i jego funkcji (zginacz kontra prostownik), a także typu fizjologicznego (szybki kontra wolny), daje to możliwość selektywnego zbadania wpływu tsDCS na zidentyfikowane elementy obwodów rdzeniowych, które wydają się być w różny sposób dotknięte polaryzacją. Przedstawiona procedura skupia się na chirurgicznym przygotowaniu do zapisów wewnątrzkomórkowych i stymulacji, z naciskiem na etapy, które są niezbędne do osiągnięcia stabilności preparatu i powtarzalności wyników. Omówiono szczegóły metodyki zastosowania anodowego lub katodowego tsDCS zwracając uwagę na kwestie praktyczne i bezpieczeństwa.
Wprowadzenie
Stymulacja prądem stałym (tsDCS) zyskuje uznanie jako skuteczna metoda modyfikacji pobudliwości obwodów rdzeniowych w zdrowiu i chorobie1,2,3. W tej technice stały prąd jest przepływany między aktywną elektrodą umieszczoną nad wybranymi segmentami kręgosłupa, a elektrodą odniesienia umieszczoną brzusznie lub bardziej rostralnie4. Kilka badań potwierdziło już, że tsDCS może być stosowany w leczeniu niektórych stanów patologicznych, takich jak ból neuropatyczny5, spastyczność6, uraz rdzenia kręgowego7 lub w celu ułatwienia rehabilitacji8. Naukowcy sugerują, że tsDCS wywołuje zmiany w dystrybucji jonów między przestrzenią wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową przez błonę komórkową, a to może ułatwiać lub hamować aktywność neuronów w zależności od aktualnej orientacji9,10,11. Jednak do niedawna brakowało bezpośredniego potwierdzenia tego wpływu na neurony ruchowe.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo wewnątrzkomórkowego zapisu potencjałów elektrycznych z lędźwiowych neuronów rdzeniowych u znieczulonego szczura z jednoczesnym zastosowaniem tsDCS, w celu obserwacji zmian w błonie neuronu ruchowego i właściwościach odpalania w odpowiedzi na polaryzację anodową lub katodową rdzeniowej sieci neuronalnej. Zapisy wewnątrzkomórkowe otwierają kilka obszarów badania właściwości neuronów, niedostępnych dla wcześniej stosowanych technik zewnątrzkomórkowych9,12. Na przykład, możliwe jest precyzyjne zmierzenie odpowiedzi napięciowej błony motoneuronu na przepływ prądu stałego indukowany przez tsDCS, wskazanie progu napięcia dla generowania impulsów lub analiza parametrów potencjału czynnościowego. Co więcej, technika ta pozwala nam określić właściwości błony biernej motoneuronu, takie jak opór wejściowy, oraz obserwować zależność między prądem stymulacji wewnątrzkomórkowej a częstotliwością rytmicznego uruchamiania motoneuronów. Identyfikacja antydromiczna zarejestrowanego motoneuronu, oparta na stymulacji funkcjonalnie zidentyfikowanych nerwów (tj. nerwów dostarczających eferenty do zginaczy lub prostowników) pozwala dodatkowo zidentyfikować typy unerwionych jednostek motorycznych (szybkie i wolne), co daje możliwość przetestowania, czy polaryzacja w różny sposób wpływa na poszczególne elementy dojrzałego układu neuronów rdzeniowych. Ze względu na rozległą operację poprzedzającą zapis oraz wysokie wymagania dotyczące stabilności i wiarygodności zapisów, technika ta jest bardzo wymagająca, ale pozwala na bezpośrednią i długoterminową ocenę cech elektrofizjologicznych jednego motoneuronu: przed, w trakcie i po zastosowaniu tsDCS, co ma kluczowe znaczenie dla określenia zarówno jego ostrych działań, jak i trwałych efektów13. Ponieważ motoneuron bezpośrednio aktywuje pozafuzyjne włókna mięśniowe14 i bierze udział w kontroli sprzężenia zwrotnego skurczu mięśnia i rozwiniętej siły15,16 każdy zaobserwowany wpływ tsDCS na jednostkę motoryczną lub właściwości kurczliwe mięśni może być związany z modulacją pobudliwości motoneuronów lub charakterystyki odpalania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury związane z tym protokołem zostały zaakceptowane przez odpowiednie władze (np. Lokalną Komisję Etyki) i są zgodne z krajowymi i międzynarodowymi zasadami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zarządzania nimi.
UWAGA: Każdy uczestnik biorący udział w procedurze musi być odpowiednio przeszkolony w zakresie podstawowych procedur chirurgicznych i musi posiadać ważną licencję na przeprowadzanie eksperymentów na zwierzętach.
1. Znieczulenie i premedykacja
- Znieczulić szczura wstrzyknięciami dootrzewnowymi pentobarbitalu sodu (dawka początkowa 60 mg·kg-1 dla 6-miesięcznych samców szczurów rasy Wistar o masie ciała 400\u2012550g).
UWAGA: Protokół ten nie jest ograniczony do wskazanego szczepu, płci lub wieku szczurów. Można również zastosować alternatywne środki znieczulające, takie jak mieszanina ketaminy i ksylazyny, alfa-chloraloza lub fentanyl + midazolam + medetomidyna, jeśli są bardziej odpowiednie dla różnych celów badawczych lub gdy jest to wymagane przez komisję etyczną. - Po około 5 minutach sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palec tylnej kończyny szczura kleszczami. Kontynuuj kolejne kroki protokołu tylko wtedy, gdy nie zaobserwuje się odruchowego działania.
- Wstrzyknąć podskórnie 0,05 ml atropiny w celu zmniejszenia produkcji śluzu po intubacji.
- Wstrzyknąć podskórnie 5 ml buforu fosforanowego zawierającego 4% roztwór glukozy,NaHCO3 (1%) i żelatynę (14%). Ten bufor będzie wchłaniany przez naczynia skórne przez cały czas trwania eksperymentu i pomoże utrzymać równowagę płynów.
- Przez cały czas trwania zabiegu należy okresowo sprawdzać zwierzę pod kątem działań odruchowych i w razie potrzeby uzupełnić znieczulenie (10 mg·kg-1·h-1pentobarbitalu sodu).
2. Chirurgia
- Przygotuj zwierzę do leczenia chirurgicznego, goląc futro nad grzbietową częścią lewej kończyny tylnej, od kostki do biodra, grzbietem, od ogona do wysokich segmentów piersiowych, lewą stroną klatki piersiowej i brzuszną stroną szyi powyżej mostka
- Umieszczenie linii dożylnej
- Połóż szczura na plecach na poduszce grzewczej w zamkniętej pętli (i zabezpiecz ją mocowaniami kończyn).
- Za pomocą ostrza 21 wykonaj podłużne cięcie przez skórę od mostka do podbródka.
- Przytrzymaj skórę kleszczami i oddziel ją od leżącej pod nią tkanki.
- Stosując techniki preparowania, odsłaniaj prawą żyłę szyjną. Ostrożnie wypreparuj żyłę z otaczających tkanek.
- Zlokalizuj część żyły bez punktów rozgałęzień, wsuń pod nią dwie ligatury 4-0.
- Wykonaj jeden luźny węzeł na bliższym końcu wcześniej zidentyfikowanego nierozgałęzionego odcinka żyły i jeden luźny węzeł na dystalnym końcu tego odcinka żyły. Zaciśnij żyłę proksymalnie do serca, a następnie podwiąż dystalną część żyły.
- Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie między zaciskiem a odległą ligaturą. Przytrzymaj płatek żyły i wprowadź wstępnie napełniony cewnik do punktu, w którym jest zablokowany przez zacisk.
- Przytrzymując żyłę i cewnik razem kleszczami, zdejmij zacisk i wepchnij cewnik na kilka milimetrów do żyły. Przymocuj oba końce cewnika do żyły i dodaj dodatkowy punkt mocowania do skóry.
- Wprowadzenie rurki dotchawiczej
- Za pomocą kleszczy oddziel dwa gruczoły żuchwowe pokrywające mięśnie mostkowo-gnykowe. Oddziel mięśnie mostkowo-gnykowe w linii środkowej, aby odsłonić tchawicę.
- Wsuń trzy ligatury 4-0 pod tchawicę, a następnie wykonaj dwa węzły poniżej punktu wprowadzenia rurki dotchawiczej i jeden węzeł powyżej.
- Zlokalizuj chrząstkę krtaniową i wykonaj nacięcie poniżej trzeciej chrząstki tchawicy.
- Włóż rurkę dotchawiczą do tchawicy i zabezpiecz rurkę na miejscu za pomocą wcześniej przygotowanych ligatur, a następnie dodaj dodatkową ligaturę do skóry.
- Umieść mały kawałek waty nad oddzielonymi mięśniami i zszyj skórę na operowanym obszarze.
- Rozwarstwienie nerwów kończyn tylnych
- Za pomocą 21 ostrzy wykonaj podłużne cięcie po tylnej stronie lewej kończyny tylnej, od ścięgna Achillesa do biodra.
- Chwyć skórę kleszczami i za pomocą technik preparacji oddziel skórę od leżących pod nią mięśni po obu stronach nacięcia.
- Zlokalizuj dół podkolanowy z tyłu stawu kolanowego, który jest pokryty mięśniem dwugłowym uda, i za pomocą nożyczek wykonaj cięcie między przednią i tylną częścią tego mięśnia.
- Poruszając się w górę, odetnij dwie głowy bicepsa, kości udowej aż do biodra, aby odsłonić nerw kulszowy. Kauteryzuj w razie potrzeby, aby zapobiec krwawieniu.
- Zidentyfikuj gałęzie łydki, piszczelowe i strzałkowe nerwu kulszowego.
- Za pomocą nożyczek oddziel boczną od przyśrodkowej głowę mięśnia brzuchatego łydki, aby odsłonić nerw piszczelowy i jego gałęzie.
- Za pomocą 55 kleszczy chwyć dystalny koniec nerwu łydkowego, przetnij go dystalnie i wypreparuj tak daleko, jak to możliwe.
- Powtórz procedurę ze wspólnym nerwem strzałkowym.
- Za pomocą szklanego pręta oddziel nerw piszczelowy od otaczających tkanek, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych, i przetnij go dystalnie.
- Zidentyfikuj nerw brzuchaty łydki przyśrodkowego (MG) oraz nerwy brzuchate łydki i płaszczkowate boczne (LGS).
- Za pomocą 55 kleszczy ostrożnie wypreparuj nerwy MG i LGS, odłączając je od otaczających tkanek, ale zachowując ich połączenie z odpowiednimi mięśniami.
- Umieść nasączony solą fizjologiczną kawałek waty pod odsłoniętymi nerwami.
- Zamknij skórę nad operowanym obszarem.
- Laminektomia
- Za pomocą 21 ostrzy wykonaj podłużne nacięcie od kości krzyżowej do kręgów piersiowych.
- Oddziel skórę od mięśni leżących pod spodem.
- Przetnij mięsień najdłuższy po obu stronach wyrostków kolczystych piersiowych i lędźwiowych.
- Za pomocą skalpela o krawędziach wycofaj mięśnie z kręgosłupa, aby odsłonić wyrostki poprzeczne każdego kręgu.
- Za pomocą nożyczek z końcówką przetnij ścięgna mięśni połączonych z wyrostkami poprzecznymi wzdłuż odsłoniętego kręgosłupa. W razie potrzeby zastosuj środki hemostatyczne.
- Zidentyfikuj kręg Th13 jako najniższy segment klatki piersiowej z wstawieniem żeber i za pomocą drobnych rongeurów usuń wyrostki kolczyste i blaszki z kręgów Th13 do L2, aby odsłonić odcinki lędźwiowe rdzenia kręgowego. Należy pamiętać, aby nie uszkodzić wyrostka kolczystego L3, który posłuży jako punkt mocowania do stabilizacji kręgosłupa.
- Usuń wyrostek kolczysty Th12 i wygładź powierzchnię grzbietową kręgu tak bardzo, jak to możliwe.
- Stosując techniki sekcji, oddziel mięśnie od kręgu Th11, aby utworzyć punkty wprowadzenia uchwytu.
- Umieść cienką watę nasączoną solą fizjologiczną na odsłoniętych segmentach rdzenia kręgowego.
- Przenieś szczura do wykonanej na zamówienie metalowej ramy z dwoma równoległymi prętami i dwoma regulowanymi ramionami z zaciskami do podparcia i stabilizacji kręgosłupa.
3. Przygotowanie do nagrania i stymulacji
- Zespolenie kręgosłupa i ułożenie nerwów
- Umieść szczura w specjalnie wykonanej ramie na poduszce grzewczej, podłączonej do systemu grzewczego w pętli zamkniętej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 ± 1°C.
- Włóż elektrody EKG pod skórę i podłącz do amplifier w celu monitorowania tętna.
- Za pomocą płatów skóry utwórz głęboką kałużę nad odsłoniętym rdzeniem kręgowym.
- Za pomocą metalowych zacisków przymocuj kręgosłup, umieszczając zaciski poniżej wyrostków poprzecznych Th12 i wyrostka kolczystego L3.
- Upewnij się, że kręgosłup jest zabezpieczony i ułożony poziomo, a następnie zastosuj nacisk grzbietowo-brzuszny po obu stronach kolumny, aby cofnąć mięśnie.
- Napełnij basen ciepłym (37 °C) olejem mineralnym i utrzymuj go w tej temperaturze.
- Przewlecz ligaturę 4-0 przez ścięgno Achillesa, unieś i rozciągnij operowaną lewą tylną kończynę tak, aby kostka zrównała się z biodrem.
- Za pomocą płatów skóry wykonaj głęboką kałużę nad odsłoniętymi nerwami piszczelowymi, MG i LGS.
- Napełnij basen ciepłym (37 °C) olejem mineralnym.
- Umieść nerwy MG i LGS na bipolarnych elektrodach stymulujących srebrny drut i podłącz je do stymulatora impulsów kwadratowych. Używaj oddzielnych kanałów stymulacji dla każdego nerwu.
- Umieszczenie elektrody powierzchniowej
- Umieść srebrną elektrodę kulkową po lewej stronie ogonowej odsłoniętego rdzenia kręgowego, z elektrodą odniesienia włożoną w mięśnie pleców i podłącz obie elektrody do różnicowego wzmacniacza prądu stałego. Powierzchniowa elektroda kulowa będzie używana do rejestrowania aferentnych wolejów z nerwów.
- Za pomocą stymulatora prądu stałego stymuluj nerwy MG i LGS impulsami prostokątnymi o czasie trwania 0,1 ms, powtarzanymi z częstotliwością 3 Hz i obserwuj salwy aferentne.
- Określ próg (T) aktywacji nerwu, stymuluj każdy nerw o intensywności około 3·T i rejestruj amplitudę salwy aferentnej dla każdego nerwu.
- Przesuń elektrodę powierzchniową rostralnie i powtórz procedurę, aby zidentyfikować segmenty kręgosłupa, przy których amplitudy salw są najwyższe dla każdego nerwu. Po określeniu maksymalnej lokalizacji salwy przesuń elektrodę powierzchniową na bezpieczną odległość od rdzenia kręgowego.
- Paraliż mięśni i tworzenie odmy opłucnowej w celu zmniejszenia ruchów oddechowych
- Sparaliżować szczura dożylnie blokerem nerwowo-mięśniowym i podłączyć rurkę dotchawiczą do zewnętrznego respiratora w linii z kapnometrem kompatybilnym z gryzoniami (bromek pankuronium, w dawce początkowej 0,4 mg·kg-1, uzupełniany co 30 minut w dawkach 0,2 mg·kg-1)
- Monitoruj stężenie CO2 w okresie końcowo-oddechowym i utrzymuj je na poziomie około 3–4%, dostosowując parametry wentylacji (częstotliwość, ciśnienie powietrza i objętości przepływu).
- Wykonaj podłużne nacięcie w skórze między 5. a 6. żebrem z boku nagrania.
- Za pomocą nożyczek z końcówką przetnij leżące nad nimi mięśnie, aby uwidocznić przestrzeń międzyżebrową między żebrami.
- Za pomocą małych ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie w mięśniach międzyżebrowych i opłucnej, a następnie włóż końcówkę kleszczyków o krawędzi do otworu, uważając, aby nie naciskać na płuca.
- Pozwól, aby kleszcze się rozszerzyły lub włóż małą rurkę, aby odma opłucnowa była otwarta przez cały eksperyment.
- Po bloku nerwowo-mięśniowym monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając częstotliwość EKG i uzupełnij środek znieczulający, jeśli tętno przekracza 400 uderzeń na minutę. Paraliż mięśni i tworzenie się odmy opłucnowej w celu zmniejszenia ruchów oddechowych, co poprawi stabilność zapisu
- Otwieranie opony twardej i pia mater
- Za pomocą kleszczy #55 delikatnie podnieś oponę twardą i przetnij ją doogonowo od segmentu L5, rostralnie aż do segmentu L4.
- Za pomocą pary ultracienkich kleszczyków 5SF wykonaj mały plaster w pia pokrywający kolumnę grzbietową, między naczyniami krwionośnymi, dokładnie na poziomie maksymalnej salwy doprowadzającej z MG lub nerwu LGS.
- Użyj małych kawałków nasączonej solą fizjologiczną i wysuszonej pianki żelowej, aby w razie potrzeby zablokować krwawienie.
- Umieszczenie elektrody tsDCS
- Wykonaj małe nacięcie w skórze po brzusznej stronie odwłoka szczura na poziomie rostro-ogonowym odpowiadającym lokalizacji segmentów kręgosłupa L4-L5.
- Chwyć odsłonięty płat skóry metalowym klipsem, który posłuży jako elektroda odniesienia.
- Umieść gąbkę nasączoną solą fizjologiczną na grzbietowej stronie kręgu Th12. Upewnij się, że rozmiar gąbki jest równy rozmiarowi aktywnej elektrody tsDCS (okrągła płyta ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm).
- Za pomocą precyzyjnego manipulatora dociśnij gąbkę z aktywną elektrodą tsDCS do kości i upewnij się, że cała powierzchnia elektrody jest równomiernie dociśnięta.
- Podłącz zarówno referencyjne, jak i aktywne elektrody tsDCS do stymulatora prądu stałego, zdolnego do dostarczania ciągłego przepływu prądu stałego.
- Przygotowanie mikropipet
- Za pomocą ściągacza do mikroelektrod przygotuj mikroelektrodę.
UWAGA: Można stosować zarówno elektrody żarnikowe, jak i bezfilamentowe, należy jednak pamiętać, że trzon elektrody musi być wystarczająco długi, aby dotrzeć do rogu brzusznego, a jednocześnie być wystarczająco cienki, aby nie uciskać rdzenia kręgowego podczas schodzenia.- Wyreguluj ustawienie ściągacza tak, aby trzpień wchodzący do rdzenia kręgowego miał około 3 mm długości, podczas gdy końcówka elektrody miała średnicę nie większą niż 1\u20122 μm, a rezystancja mikroelektrody wynosiła od 10 do 20 MΩ.
- Napełnij mikroelektrody elektrolitem cytrynianu potasu 2M.
- Zamontuj przygotowaną mikroelektrodę na mikromanipulatorze, umożliwiając ruch krokowy 1\u20122 μm i kalibrację stereotaktyczną.
- Połącz mikroelektrodę ze wzmacniaczem wewnątrzkomórkowym z elektrodą referencyjną umieszczoną w mięśniach pleców.
- Za pomocą ściągacza do mikroelektrod przygotuj mikroelektrodę.
- Po bloku nerwowo-mięśniowym monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając częstotliwość EKG i uzupełnij środek znieczulający, aby tętno szczura nie przekraczało 400 uderzeń na minutę.
4. Śledzenie i penetracja motoneuronów
- Umieść elektrodę rejestrującą salwę aferentną z powrotem na grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego, doogonowo do miejsca rejestracji, na poziomie segmentu L6.
- Stymuluj nerwy MG i LGS impulsami elektrycznymi 0,1 ms o częstotliwości 3 Hz i intensywności 3T, aby aktywować wszystkie aksony alfa-motoneuronów w wybranym nerwie.
- Wbić mikropipetę w wybrany plaster w pia pod kątem środkowo-bocznym 15\u201220° (końcówką skierowaną na boki).
- Po zejściu pod powierzchnię należy skalibrować mikroelektrodę i skompensować jej pojemność oraz przesunięcie napięcia, a następnie kontynuować penetrację rdzenia kręgowego, gdy wszystkie parametry są stabilne. Potencjał pola antydromicznego puli motoneuronów będzie widoczny na śladzie napięcia mikroelektrody podczas zbliżania się do dedykowanego jądra ruchowego podczas stymulacji odpowiedniego nerwu.
- Kontynuuj penetrację mikroelektrodą w krokach co 1\u20122 μm i okresowo używaj funkcji brzęczenia wzmacniacza wewnątrzkomórkowego, aby oczyścić końcówkę elektrody z wszelkich pozostałości.
- Obserwuj penetrację neuronów ruchowych, która będzie charakteryzować się nagłą hiperpolaryzacją zarejestrowanego śladu napięcia i pojawieniem się antydromicznego potencjału skokowego.
5. Rejestrowanie właściwości błony i odpalania motoneuronów
- W trybie mostkowym wzmacniacza wewnątrzkomórkowego zidentyfikuj neuron ruchowy na podstawie wyglądu "wszystko albo nic" antydromicznego potencjału czynnościowego poprzez stymulację odpowiednich gałęzi nerwowych. Zapisać 20 kolejnych śladów w celu późniejszego uśrednienia.
- Wdrożenie ścisłego kryterium włączenia w celu zapewnienia wysokiej jakości danych: potencjał spoczynkowy błony o amplitudzie co najmniej -50 mV; amplituda potencjału czynnościowego większa niż 50 mV, z dodatnim przeregulowaniem; potencjał błonowy stabilny przez co najmniej 5 minut przed rejestracją.
- W nieciągłym trybie cęgowym prądu (tryb przełączania prądu 4–8 kHz) wzmacniacza wewnątrzkomórkowego wywołaj ortodromiczny potencjał czynnościowy w motoneuronie za pomocą wewnątrzkomórkowych impulsów prądu depolaryzującego 0,5 ms. Powtórz te czynności co najmniej 20 razy, aby uśrednić w trybie offline.
- Stymuluj motoneuron za pomocą 40 krótkich impulsów (100 ms) prądu hiperpolaryzacyjnego (1 nA) w celu obliczenia rezystancji wejściowej komórki.
- Stymuluj motoneuron impulsami fali prostokątnej o długości 50 ms o rosnących amplitudach, aby określić wartość reozasady jako minimalną amplitudę prądu depolaryzacyjnego wymaganą do wywołania pojedynczego skoku.
- Wstrzyknij impulsy fali prostokątnej o długości 500 ms prądu depolaryzującego o rosnących amplitudach w krokach co 0,1–2 nA, aby wywołać rytmiczne wyładowania neuronów ruchowych.
6. Przezrdzeniowa stymulacja prądem stałym (tsDCS)
- Utrzymując stabilną penetrację neuronu ruchowego, rozpocznij procedurę polaryzacji poprzez przezrdzeniowe zastosowanie prądu stałego. Dostosuj aktualną intensywność i czas aplikacji do projektu eksperymentu (np. 0,1 mA przez 15 min).
- Natychmiast po włączeniu prądu stałego obserwuj potencjał błony neuronu ruchowego. Polaryzacja anodowa (elektroda czynna jako anoda) powinna powodować depolaryzację potencjału błony, natomiast polaryzacja katodowa (elektroda aktywna jako katoda) powinna wywołać odwrotny efekt. Obserwuj, czy zmiana spoczynkowego potencjału błony w odpowiedzi na stymulację prądem stałym jest stała, co zapewnia, że natężenie pola elektrycznego nie jest zakłócone.
- Podczas aplikacji prądu ciągłego powtarzaj kroki 5.3\u20125.6 w odstępach 5-minutowych.
- Wyłącz kontroler domeny i kontynuuj powtarzanie kroków 5.3–5.6 w odstępach 5-minutowych, aż nagrania staną się niestabilne lub kryteria włączenia zostaną naruszone.
- Zakończyć eksperyment i poddać zwierzę eutanazji poprzez dożylne podanie śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu (180 mg·kg-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Parametry potencjałów czynnościowych oraz kilka właściwości błonowych można obliczyć na podstawie rejestracji wewnątrzkomórkowych, zapewniając stabilne warunki penetracji komórki. Rysunek 1A przedstawia typowy ortodromowy potencjał czynnościowy wywołany stymulacją wewnątrzkomórkową, który spełnia wszystkie kryteria włączenia danych (potencjał spoczynkowy błony wynoszący co najmniej -50 mV oraz amplituda kolca wyższa niż 50 mV, z dodatnim przestrzałem). Można zmierzyć parametry potencjału czy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, część chirurgiczna opisanego protokołu powinna zostać zakończona w ciągu około trzech godzin. Należy zwrócić szczególną uwagę na utrzymanie stabilnych warunków fizjologicznych zwierzęcia podczas zabiegu, w szczególności temperatury ciała i głębokości znieczulenia. Poza oczywistymi względami etycznymi, brak odpowiedniego znieczulenia może skutkować nadmiernymi ruchami kończyn podczas rozwarstwienia nerwów lub laminektomii i prowadzić do uszkodzenia preparatu lub przedwczesnego zakończen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem Narodowego Centrum Nauki nr 2017/25/B/NZ7/00373. Autorzy pragną wyrazić uznanie dla pracy Hanny Drzymały-Celichowskiej i Włodzimierza Mrówczyńskiego, którzy przyczynili się do zebrania i analizy danych dotyczących wyników przedstawionych w niniejszym artykule.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Durgs i roztwory- | -- | ||
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glukoza | Merck | ||
| Merck | |||
| 106329-Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant-Bloker | nerwowo-mięśniowy | |
| Pentobarbital sodu | Biowet Pu?awy Sp. z o.o-Główny | środek znieczulający | |
| Cytrynian potasu | Chempur | 6100-05-06-Tetraspan | |
| Braun-HES roztwór | |||
| Sprzęt chirurgiczny- | -- | 21 | |
| Ostrze | FST | 10021-00 | Ostrze |
| skalpelaKauteryzator | FST | 18010-00-Rurki | |
| na klatkę piersiową | Mila | CT1215-Dumont | |
| #4 Kleszcze | FST | 11241-30 | Kleszcze |
| do mięśni Dumont #5 Kleszcze | FST | 11254-20 | Kleszcze do opon Dura |
| Dumont #5F Kleszcze | FST | 11255-20 | Kleszcze do nerwów |
| Dumont #5SF Kleszcze | FST | 11252-00 | Kleszcze Pia |
| Kleszcze | FST | 11008-13 | Kleszcze do |
| Kleszcze | FST | 11053-10 | Kleszcze do skóry |
| Hemostat | FST | 13013-14-Rongeur | |
| FST | 16021-14 | Do laminektomii | |
| Nożyczki | FST | 15000-08 | Nożyczki do żył |
| Nożyczki | FST | 15002-08 | Nożyczki do opony twardej |
| Nożyczki | FST | 14184-09 | Do cięcia tchawicy |
| Nożyczki | FST | 104075-11 | |
| Nożyczki do mięśni Nożyczki | FST | 14002-13 | Nożyczki do skóry |
| Rurka tchawicza | - | - | Cewnik dożylny wykonany na zamówienie |
| Vygon | 1261.201-Kleszczyki | ||
| do kaniulacji naczyń | FST | 18403-11 | - |
| Zacisk do naczyń | FST | 18320-11 | Do zaciskania żył |
| Sonda rozszerzająca naczynia | FST | 10160-13 | Do rozwarstwiania |
| < mocne>materiały sugrgiczne< / mocne> | -- | ||
| Pianka żelowa | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Środek hemostatyczny |
| Szew jedwabny 4.0 | FST | 18020-40-Jedwabny | |
| szew 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Sprzęt | -- | ||
| Axoclamp 2B | Urządzenia molekularne | wycofane ze sprzedaży | Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy / nowy model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 Monitor CO2 końca pływowego | CWE | 11-10000 | Gaz analizator |
| Grass S-88 | A-M Systems | wycofany | z produkcji Stymulator prądu stałego |
| Hometermiczne systemy kocowe z elastyczną sondą | Aparat Harvarda | 507222F | System grzewczy |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy |
| Microdrive | - | Wykonane na zamówienie/zamiennik IVM/Scientifica | |
| P-1000 Mikroelektroda ściągacz | Sutter Instruments | P-1000 | Ściągacz mikroelektrod |
| SAR-830 / AP Wentylator dla małych zwierząt | CWE | 12-02100 | |
| Rama nośna | - | wykonana na zamówienie / zamienna standardowa podstawa laboratoryjna 51601 / Stoelting | |
| Zaciski kręgosłupa | - | wykonane na zamówienie / zamienne Adapter kręgosłupa dla szczurów 51695 / Stoelting | |
| TP-1 Stymulator DC | WiNUE | - | tsStymulator |
| DCSRóżne | -- | ||
| 1B150-4 kapilary szklane | WPI | 1B150-4 | Do produkcji mikroelektrod |
| Wata | - | -- | |
| elastyczna rurka | -Do | podłączenia | |
| respiratora i analizatora CO2MicroFil | WPI | MF28G67-5 | Do napełniania mikropipet |
| Srebrny drut | - | Do elektrod nerwowych |
Bibliografia
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846(2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114(2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
