Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wewnątrzkomórkowy zapis neuronów rdzeniowych in vivo stanowi "złoty standard" do określania cech elektrofizjologicznych komórek w nienaruszonej sieci rdzeniowej i ma znaczące zalety w porównaniu z klasycznymi technikami zapisu in vitro lub zewnątrzkomórkowego. Zaletą nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo jest to, że metoda ta może być wykonywana na dorosłych zwierzętach z w pełni dojrzałym układem nerwowym, a zatem wiele obserwowanych mechanizmów fizjologicznych można przełożyć na praktyczne zastosowania. W niniejszej pracy metodologicznej opisano tę procedurę w połączeniu z zewnętrznie stosowaną stymulacją prądem stałym, która naśladuje procesy polaryzacji zachodzące w rdzeniowych sieciach neuronalnych. Przezrdzeniowa stymulacja prądem stałym (tsDCS) jest innowacyjną metodą coraz częściej stosowaną jako interwencja neuromodulująca w rehabilitacji po różnych urazach neurologicznych, a także w sporcie. Wpływ tsDCS na układ nerwowy pozostaje słabo poznany, a mechanizmy fizjologiczne stojące za jego działaniem są w dużej mierze nieznane. Zastosowanie tsDCS równocześnie z zapisami wewnątrzkomórkowymi umożliwia nam bezpośrednią obserwację zmian właściwości błony neuronu ruchowego i charakterystyki rytmicznego odpalania w odpowiedzi na polaryzację rdzeniowej sieci neuronalnej, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia działania tsDCS. Ponadto, gdy prezentowany protokół obejmuje identyfikację motoneuronu w odniesieniu do unerwionego mięśnia i jego funkcji (zginacz kontra prostownik), a także typu fizjologicznego (szybki kontra wolny), daje to możliwość selektywnego zbadania wpływu tsDCS na zidentyfikowane elementy obwodów rdzeniowych, które wydają się być w różny sposób dotknięte polaryzacją. Przedstawiona procedura skupia się na chirurgicznym przygotowaniu do zapisów wewnątrzkomórkowych i stymulacji, z naciskiem na etapy, które są niezbędne do osiągnięcia stabilności preparatu i powtarzalności wyników. Omówiono szczegóły metodyki zastosowania anodowego lub katodowego tsDCS zwracając uwagę na kwestie praktyczne i bezpieczeństwa.
Wprowadzenie
Stymulacja prądem stałym (tsDCS) zyskuje uznanie jako skuteczna metoda modyfikacji pobudliwości obwodów rdzeniowych w zdrowiu i chorobie1,2,3. W tej technice stały prąd jest przepływany między aktywną elektrodą umieszczoną nad wybranymi segmentami kręgosłupa, a elektrodą odniesienia umieszczoną brzusznie lub bardziej rostralnie4. Kilka badań potwierdziło już, że tsDCS może być stosowany w leczeniu niektórych stanów patologicznych, takich jak ból neuropatyczny5, spastyczność6, uraz rdzenia kręgowego
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury związane z tym protokołem zostały zaakceptowane przez odpowiednie władze (np. Lokalną Komisję Etyki) i są zgodne z krajowymi i międzynarodowymi zasadami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zarządzania nimi.
UWAGA: Każdy uczestnik biorący udział w procedurze musi być odpowiednio przeszkolony w zakresie podstawowych procedur chirurgicznych i musi posiadać ważną licencję na przeprowadzanie eksperymentów na zwierzętach.
1. Znieczulenie i premedykacja
- Znieczulić szczura wstrzyknięciami dootrzewnowymi pentobarbitalu sodu (dawka początkowa 60 mg·kg-1 dla 6-miesięcznych samców szc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Parametry potencjałów czynnościowych oraz kilka właściwości błonowych można obliczyć na podstawie rejestracji wewnątrzkomórkowych, zapewniając stabilne warunki penetracji komórki. Rysunek 1A przedstawia typowy ortodromowy potencjał czynnościowy wywołany stymulacją wewnątrzkomórkową, który spełnia wszystkie kryteria włączenia danych (potencjał spoczynkowy błony wynoszący co najmniej -50 mV oraz amplituda kolca wyższa niż 50 mV, z dodatnim przestrzałem). Można zmierzyć parametry potencjału czy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, część chirurgiczna opisanego protokołu powinna zostać zakończona w ciągu około trzech godzin. Należy zwrócić szczególną uwagę na utrzymanie stabilnych warunków fizjologicznych zwierzęcia podczas zabiegu, w szczególności temperatury ciała i głębokości znieczulenia. Poza oczywistymi względami etycznymi, brak odpowiedniego znieczulenia może skutkować nadmiernymi ruchami kończyn podczas rozwarstwienia nerwów lub laminektomii i prowadzić do uszkodzenia preparatu lub przedwczesnego zakończen.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem Narodowego Centrum Nauki nr 2017/25/B/NZ7/00373. Autorzy pragną wyrazić uznanie dla pracy Hanny Drzymały-Celichowskiej i Włodzimierza Mrówczyńskiego, którzy przyczynili się do zebrania i analizy danych dotyczących wyników przedstawionych w niniejszym artykule.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Durgs i roztwory- | -- | ||
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glukoza | Merck | ||
| Merck | |||
| 106329-Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant-Bloker | nerwowo-mięśniowy | |
| Pentobarbital sodu | Biowet Pu?awy Sp. z o.o-Główny | środek znieczulający | |
| Cytrynian potasu | Chempur | 6100-05-06-Tetraspan | |
| Braun-HES roztwór | |||
| Sprzęt chirurgiczny- | -- | 21 | |
| Ostrze | FST | 10021-00 | Ostrze |
| skalpelaKauteryzator | FST | 18010-00-Rurki | |
| na klatkę piersiową | Mila | CT1215-Dumont | |
| #4 Kleszcze | FST | 11241-30 | Kleszcze |
| do mięśni Dumont #5 Kleszcze | FST | 11254-20 | Kleszcze do opon Dura |
| Dumont #5F Kleszcze | FST | 11255-20 | Kleszcze do nerwów |
| Dumont #5SF Kleszcze | FST | 11252-00 | Kleszcze Pia |
| Kleszcze | FST | 11008-13 | Kleszcze do |
| Kleszcze | FST | 11053-10 | Kleszcze do skóry |
| Hemostat | FST | 13013-14-Rongeur | |
| FST | 16021-14 | Do laminektomii | |
| Nożyczki | FST | 15000-08 | Nożyczki do żył |
| Nożyczki | FST | 15002-08 | Nożyczki do opony twardej |
| Nożyczki | FST | 14184-09 | Do cięcia tchawicy |
| Nożyczki | FST | 104075-11 | |
| Nożyczki do mięśni Nożyczki | FST | 14002-13 | Nożyczki do skóry |
| Rurka tchawicza | - | - | Cewnik dożylny wykonany na zamówienie |
| Vygon | 1261.201-Kleszczyki | ||
| do kaniulacji naczyń | FST | 18403-11 | - |
| Zacisk do naczyń | FST | 18320-11 | Do zaciskania żył |
| Sonda rozszerzająca naczynia | FST | 10160-13 | Do rozwarstwiania |
| < mocne>materiały sugrgiczne< / mocne> | -- | ||
| Pianka żelowa | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Środek hemostatyczny |
| Szew jedwabny 4.0 | FST | 18020-40-Jedwabny | |
| szew 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Sprzęt | -- | ||
| Axoclamp 2B | Urządzenia molekularne | wycofane ze sprzedaży | Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy / nowy model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 Monitor CO2 końca pływowego | CWE | 11-10000 | Gaz analizator |
| Grass S-88 | A-M Systems | wycofany | z produkcji Stymulator prądu stałego |
| Hometermiczne systemy kocowe z elastyczną sondą | Aparat Harvarda | 507222F | System grzewczy |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy |
| Microdrive | - | Wykonane na zamówienie/zamiennik IVM/Scientifica | |
| P-1000 Mikroelektroda ściągacz | Sutter Instruments | P-1000 | Ściągacz mikroelektrod |
| SAR-830 / AP Wentylator dla małych zwierząt | CWE | 12-02100 | |
| Rama nośna | - | wykonana na zamówienie / zamienna standardowa podstawa laboratoryjna 51601 / Stoelting | |
| Zaciski kręgosłupa | - | wykonane na zamówienie / zamienne Adapter kręgosłupa dla szczurów 51695 / Stoelting | |
| TP-1 Stymulator DC | WiNUE | - | tsStymulator |
| DCSRóżne | -- | ||
| 1B150-4 kapilary szklane | WPI | 1B150-4 | Do produkcji mikroelektrod |
| Wata | - | -- | |
| elastyczna rurka | -Do | podłączenia | |
| respiratora i analizatora CO2MicroFil | WPI | MF28G67-5 | Do napełniania mikropipet |
| Srebrny drut | - | Do elektrod nerwowych |
Bibliografia
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
