Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana ekstrakcja DNA wysokiej jakości ze zmian miażdżycowych u ludzi utrwalonych w formalinie

DOI:

10.3791/61452

⸱

12 lutego 2021

 ,  , 
1Department for Vascular and Endovascular Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technical University Munich, 2partner site Munich Heart Alliance, Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung (DZHK), 3Department of Vascular Surgery, University Hospital Zurich, 4Department of Experimental Cardiology, German Heart Centre, Technical University Munich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół półautomatycznej ekstrakcji DNA z utrwalonych w formalinie zatopionych w parafinie zmian ludzkich tętnic szyjnych. Liza tkanek odbywa się bez toksycznego ksylenu, po czym następuje zautomatyzowany protokół ekstrakcji DNA, w tym drugi etap lizy, wiązanie DNA z cząstkami paramagnetycznymi w celu wiązania na bazie celulozy, etapy płukania i elucja DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie stanowią cenne źródło do analiz molekularnych i klinicznych badań genomicznych. Tkanki te są często ubogie w komórki lub trudne do przetworzenia. Dlatego kwasy nukleinowe muszą być starannie izolowane. W ostatnich latach opracowano różne metody izolacji DNA dla tkanek pochodzących z wielu chorób, głównie nowotworów. Niestety, genomowe DNA wyekstrahowane z tkanek FFPE jest wysoce zdegradowane z powodu sieciowania między niciami kwasów nukleinowych a białkami, a także przypadkowych podziałów sekwencji. W związku z tym jakość DNA z tych próbek jest znacznie obniżona, co stanowi wyzwanie dla dalszych analiz molekularnych. Inne problemy z trudnymi tkankami to na przykład brak komórek w zwapniałych ludzkich zmianach miażdżycowych i tkance tłuszczowej, małe biopsje skóry, a co za tym idzie niska dostępność pożądanych kwasów nukleinowych, jak ma to miejsce również w starych lub utrwalonych tkankach.

W naszych laboratoriach opracowaliśmy metodę ekstrakcji DNA ze zmian miażdżycowych utrwalonych formaliną, przy użyciu półautomatycznego systemu izolacji. Porównaliśmy tę metodę z innymi dostępnymi na rynku protokołami ekstrakcji i skupiliśmy się na dalszych analizach. Czystość i stężenie DNA mierzono za pomocą spektrometrii i fluorometrii. Oceniono stopień rozdrobnienia i ogólną jakość.

Najwyższa ilość i jakość DNA została uzyskana za pomocą zmodyfikowanego protokołu DNA krwi dla automatycznego systemu ekstrakcji, zamiast komercyjnego protokołu FFPE. Dzięki temu protokołowi krok po kroku wyniki DNA z próbek FFPE były średnio czterokrotnie wyższe, a mniej próbek nie przeszło procesu ekstrakcji, co ma kluczowe znaczenie w przypadku biopsji małych naczyń. Amplikony o rozmiarach od 200 do 800 pz można wykryć za pomocą PCR. Badanie to pokazuje, że chociaż DNA uzyskane z naszej tkanki FFPE jest wysoce rozdrobnione, nadal może być wykorzystywane do udanej amplifikacji i sekwencjonowania krótszych produktów. Podsumowując, w naszych rękach zautomatyzowana technologia wydaje się być najlepszym systemem do ekstrakcji DNA, szczególnie w przypadku małych próbek tkanek FFPE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrwalanie formaliny, a następnie zatapianie parafiny (FFPE) jest standardową procedurą długoterminowego przechowywania próbki patologicznej w biobankingu1. Próbki te stanowią cenne źródło do badań histologicznych, jak również analiz molekularnych, zwłaszcza badań genetycznych2. Kolejnymi zaletami tkanek FFPE są lepsze długotrwałe przechowywanie, niższe koszty i łatwiejsze warunki przechowywania. Naszą intencją jest zapewnienie niezawodnego i łatwego w użyciu protokołu do powtarzalnej izolacji kwasów nukleinowych z niewielkich ilości skrawków FFPE, ponieważ wysokiej jakości ekstrakcja DNA jest pierwszym kluczowym krokiem w szerokim zakresie technik molekularnych, a tkanki FFPE są najbardziej dostępnym źródłem próbek.

Nowe podejścia naukowe, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) i badania "omiczne", wymagają wysokiej jakości kwasów nukleinowych3,4,5. Ekstrakcja DNA z próbek tkanek FFPE pozostaje trudnym przedsięwzięciem. DNA z próbek FFPE może się znacznie różnić pod względem jakości i ilości w zależności od jego wieku i warunków utrwalania. Formalina, najczęściej stosowany związek, prowadzi do sieciowania DNA-białko6,7,8 i powoduje niespecyficzne losowe przerwanie sekwencji nukleotydów9. Może to znacząco wpłynąć na dalsze analizy genomowe, ponieważ sieciowanie może uniemożliwić amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)6,10. Ze względu na zanieczyszczenia podczas procesu utrwalania, czystość DNA wyizolowanego z próbek FFPE jest często ograniczona. W ostatnich latach opracowano różne metody izolacji DNA, głównie z próbek tkanek nowotworowych2,11,12,13.

Ogólnie rzecz biorąc, protokoły ekstrakcji kwasów nukleinowych z tkanki FFPE można podzielić na trzy główne grupy. Pierwszą, najczęściej stosowaną grupą metod są dostępne na rynku systemy kolumnowe oparte na krzemionce14. Druga grupa obejmuje ręczne metody ekstrakcji fazy organicznej za pomocą fenolu i chloroformu, po raz pierwszy opisane przez Josepha Sambrooka i Davida W. Russella15. Jako trzecia grupa, w ciągu ostatnich lat powstały zautomatyzowane systemy, takie jak systemy obsługi cieczy, a także systemy oparte na cząstkach paramagnetycznych16. Każdy z trzech wymienionych systemów ma inne zalety i wady, takie jak niebezpieczne chemikalia (np. ksylen, fenol, chloroform), wysokie koszty17, manpower18 i zużycie czasu19. Zwłaszcza w przypadku trudnych próbek tkanek, a także analiz o wysokiej przepustowości, standaryzacja, odtwarzalność, stosunkowo niska czasochłonność, siła robocza i koszty są najważniejszymi cechami w znalezieniu odpowiedniej metody izolacji kwasów nukleinowych20. Wiadomo, że zautomatyzowane metody ekstrakcji dają lepsze powtarzalne wyniki i są bardziej czułe w przypadku małych biopsji. Ponadto potrzebna jest mniejsza ilość tkanki lub krwi i zmniejsza się ryzyko zatkania układu z powodu dużej ilości parafiny. Chociaż maszyny do automatycznej ekstrakcji kwasów nukleinowych i potrzebne zestawy są droższe w porównaniu z metodami ręcznymi, nadal przekonują ze względu na mniej problematyczne procesy ekstrakcji. Wyszukiwanie w literaturze zawiera wiele publikacji, które ilustrują bezpośrednie porównanie ręcznych, kolumnowych i zautomatyzowanych metod ekstrakcji DNA i RNA z różnych tkanek i organizmów, takich jak rośliny, zwierzęta i ludzie, a także komórki w hodowli20,21,22. W literaturze znajdują się również dowody na to, że DNA i RNA wyizolowane z 10-letniej zamrożonej tkanki mogą być wykorzystywane do dalszych analiz, takich jak PCR, ilościowy PCR, NGS, analizy metylacji i klonowanie9,23,24,25,26.

Głównym problemem z, na przykład, starą ludzką tkanką naczyniową, jak również małymi biopsjami tkanek, szczególnie w odniesieniu do próbek FFPE, jest brak komórek w wysoce zwapniałych zmianach miażdżycowych, co w konsekwencji prowadzi do niskich stężeń kwasów nukleinowych1. Chociaż kilka metod ekstrakcji DNA z tkanki FFPE zostało już ustalonych i jest szeroko stosowanych, ręczne metody przygotowania próbek wymagają długiego czasu pracy27, a do deparafinowania niezbędne są odczynniki toksyczne, takie jak ksylen lub fenol2. Jak opisano, proces deparafinowania jest kluczowym, czasochłonnym etapem (np. około 30 minut), który znacząco wpływa na jakość i ilość wyekstrahowanego DNA (np. toksyczne skutki dla DNA, takie jak fragmentacja i degradacja roztworu deparafinowania oraz wysokie temperatury)28. Niedawno opracowane nowe protokoły ekstrakcji DNA koncentrują się na wykorzystaniu innych nietoksycznych roztworów deparafinowania, strategii naprawczych i zautomatyzowanych technologii perełek. W szczególności wykazano, że zautomatyzowane i półautomatyczne metody są skuteczne w ekstrakcji DNA dzięki skutecznemu odzyskiwaniu, braku zanieczyszczenia krzyżowego i łatwemu wykonaniu29. Opracowaliśmy protokół, który pokonuje te ograniczenia. W rezultacie, nasza technika pozwala na skrócenie czasu przetwarzania i pracy przy zachowaniu najwyższych standardów ilościowych i jakościowych.

Szczególnie dla powtarzalnych analiz o wysokiej przepustowości, takich jak genotypowanie, badania epigenomiczne i sekwencjonowanie RNA, obsługa próbki FFPE za pomocą systemów oczyszczania opartych na kolumnach jest często trudna i czasochłonna (np. długie etapy deparafinowania, zapychanie kolumn i długie czasy pracy). Głównym problemem jest zatykanie się membran krzemionkowych z powodu dużej ilości parafiny. Inne okoliczności, które mogą pogorszyć izolację wysokiej jakości kwasów nukleinowych, to niewielkie ilości tkanek, takie jak mikrobiopsje skóry, małe tkanki myszy, bardzo tłuste lub zwapniałe tkanki, takie jak płytki, skostniałe tkanki i stare próbki. Zwłaszcza w diagnostyce i kryminalistyce zautomatyzowane i półautomatyczne systemy, takie jak obsługa cieczy lub metody ekstrakcji oparte na cząstkach paramagnetycznych, stały się w ciągu ostatnich kilku lat coraz bardziej istotne30,31, głównie ze względu na stosunkowo krótki czas pracy i możliwość standaryzacji. Większość z już opublikowanych protokołów doskonale sprawdza się w przypadku tkanek gładkich z dużą lub średnią ilością komórek, takich jak biopsje guza lub tkanki roślinne13,22,32. Literatura na temat metod półautomatycznych metod opartych na cząsteczkach stosowanych do izolowania DNA ze stosunkowo trudnych do opanowania tkanek, takich jak utrwalone pojedyncze komórki, zwapniałe naczynia, tkanka bogata w kolagen i tkanka tłuszczowa o niskiej liczbie komórek, jest słabo opisana33.

W tym badaniu opisano zoptymalizowaną półautomatyczną metodę izolacji DNA z naczyniowych odcinków zatopionych w parafinie, porównując ją z dwoma ręcznymi protokołami opartymi na kolumnach. Do walidacji wykorzystano ilość, czystość i stopień fragmentacji DNA. Jako punkt wyjścia wykorzystano dostępny na rynku protokół DNA krwi, a następnie zoptymalizowano ręczne kroki półautomatycznego systemu pod kątem wykorzystania FFPE, a także świeżych mrożonych próbek tkanek z tkanek ludzkich i zwierzęcych, łącząc etapy z FFPE i protokołu tkankowego. Zautomatyzowany krok tego protokołu jest wstępnie zainstalowany w instrumencie i zależy od używanego zestawu (w tym przypadku zestawu DNA krwi). Dzięki opisanemu półautomatycznemu systemowi opartemu na kartridżu możliwe jest wyizolowanie DNA z krwi, świeżo zamrożonej tkanki, tkanki utrwalonej w formalinie, a nawet pojedynczych komórek za pomocą tego samego protokołu, maszyny, zestawu i materiałów eksploatacyjnych, zamiast używania różnych protokołów i zestawów do instrumentu, jak jest to zalecane przez firmę. Istnieją tylko niewielkie różnice w protokołach, takie jak jeden bufor i niektóre czasy inkubacji dla różnych zastosowań, co sprawia, że protokół ten jest bardzo przydatny do ekstrakcji DNA ze wszystkich rodzajów tkanek. Nasz protokół jest przede wszystkim zoptymalizowany pod kątem zwapniałych, ubogich w komórki i włóknistej ludzkiej tkanki naczyniowej, ale oczywiście może być stosowany i dalej optymalizowany dla wszystkich rodzajów trudnych tkanek wymienionych powyżej.

Podsumowując, dla badaczy zajmujących się miażdżycą tętnic (np. aorty, tętnic szyjnych, tętnic wieńcowych) oferujemy łatwy w użyciu protokół punkt po punkcie do półautomatycznej ekstrakcji DNA z naczyniowych próbek FFPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozwolenie na pobieranie próbek ludzkich tętnic szyjnych w naszym biobanku zostało zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki Szpitala (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Monachium, Niemcy). Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Przygotować 5–8 skrawków tkanki o wielkości 10 μm z próbki FFPE za pomocą mikrotomu i przenieść ją do probówki o pojemności 1,5 ml. Nie ma potrzeby redukcji nadmiaru parafiny z bloku.
    UWAGA: Cieńsze pojedyncze sekcje zamiast jednej dużej sekcji przyspieszają reakcję buforu. Wyrzuć pierwsze sekcje ze względu na ekspozycję naO2. W przypadku większych próbek możliwe jest również użycie mniejszej liczby sekcji.
  2. Odwirować te probówki w wirówce stołowej, ustawionej na 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać każdą próbkę na dnie probówki.
    UWAGA: Zbyt długie wirowanie prowadzi do krzepnięcia próbki i komplikuje lizę.

2. Rozpuszczanie i deparafinizacja lipidów

UWAGA:Ten krok jest potrzebny do deparafinizacji i trawienia lipidów. Zastosowany bufor jest mniej toksyczny niż komercyjne roztwory deparafinowania.

  1. Do każdej probówki dodać 300 μl dostępnego w handlu buforu do inkubacji i 6 μl 1-tioglicerolu.
    UWAGA: Nie używaj więcej niż 300 μl, ponieważ jest to maksymalna objętość wkładu systemu automatyki.
  2. Wirować przez 10 s i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 80 °C i 500 obr./min w bloku grzewczym w celu rozpuszczenia parafiny.
    UWAGA: Na końcu tkanka powinna być całkowicie rozpuszczona. W razie potrzeby kilkakrotnie wiruj podczas inkubacji.

3. Trawienie próbki i białka

UWAGA:Naturalne trawienie z proteazą K jest niezbędne, aby uzyskać czyste ekstrakty DNA bez białek. Redukuje również obecność wszelkich zanieczyszczających białek. Co więcej, nukleazy są również niszczone, aby uratować DNA34. Ten etap nocny jest również potrzebny do całkowitego roztwarzenia próbki.

  1. Pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury 60 °C, a następnie dodać 30 μl dostarczonego roztworu proteinazy K.
  2. Ponownie wykonać wir i inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C i 500 obr./min przez noc (4–20 godzin) w bloku grzewczym. Od czasu do czasu należy wirować próbki podczas inkubacji, aby uzyskać pełne roztrawienie próbki.
    UWAGA: Inkubacja przez noc prowadzi do lepszych wyników. Zaleca się mieszanie co 30–60 minut. W końcu wewnątrz rurki nie powinien znajdować się żaden wizualny fragment tkanki.

4. Liza komórek

  1. Dodać 400 μl buforu do lizy, znajdującego się w zestawie do krwi, i krótko
    2. przetoczyć wir.
  2. Ponownie inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 30 minut z prędkością 500 obr./min.
  3. Pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Parafina stwardnieje na wierzchu.
    UWAGA: Nie należy ponownie wirować, aby parafina była oddzielona od próbki. W przeciwnym razie parafina miesza się z tkanką, co niszczy próbkę. Próbka zostanie pobrana w kroku 6.1.

5. Przygotowanie wstępnie dozowanych wkładów

  1. Włącz urządzenie oraz powiązany z nim tablet
    2. .
  2. Uruchom aplikację i kliknij przycisk drzwi, aby otworzyć instrument.
  3. Wyjmij stojak z instrumentu i włóż wstępnie napełniony wkład do stojaka na sondę. Upewnij się, że wkład zatrzasnął się dwukrotnie po włożeniu na miejsce i usuń folię uszczelniającą.
  4. Dodać tłok do ostatniej (8) studzienki wkładu. Służy jako końcówka do pipet w instrumencie.
  5. Napełnij dostarczone probówki elucyjne o pojemności 0,5 ml 65 μl buforu elucyjnego dostarczonego z zestawem. Pozostaw rurki otwarte i włóż je w dedykowaną pozycję w przedniej części stojaka, za wkładem.
    UWAGA: Minimalna objętość elucji wynosi 60 μL. System straci 5–10 μl dodanej objętości elucji.

6. Automatyczna ekstrakcja DNA

  1. Ostrożnie nakłuć parafinę na górze probówki o pojemności 1,5 ml z kroku 4.3, aby dotrzeć do czystej próbki na dnie probówki bez ponownego mieszania jej z parafiną.
  2. Przenieść całą mieszaninę (730 μl) przygotowanej próbki do pierwszego dołka wkładu.
  3. Włóż stojak do automatycznej maszyny do ekstrakcji DNA. Upewnij się, że stojak blokuje się najpierw z tyłu maszyny, a następnie z przodu.
  4. Rozpocznij bieg, klikając lewy górny pomarańczowy przycisk Start w oprogramowaniu. Otworzy się okno z różnymi wstępnie zainstalowanymi protokołami. Wybierz protokół Blood DNA w instrumencie. Upewnij się, że tłok, probówka elucyjna i próbka zostały dodane, klikając tak w oprogramowaniu. Drzwi przyrządu zamkną się automatycznie i rozpocznie się bieg (lampka zmieni kolor na zielony). Bieg trwa około 38 minut. Dalsza kalibracja nie jest wymagana.
    UWAGA: Obserwuj, aż system podniesie tłoki dla wszystkich próbek w stojaku. Jeśli tak się nie stanie, system zatrzyma się automatycznie i należy ponownie uruchomić protokół komputera.
  5. Upewnij się, że system wykonuje automatyczny etap lizy w pierwszym dołku wkładu, a następnie etapy mycia w dołkach od 3 do 7. Nie jest wymagany żaden dalszy etap programowania. Kompletny program jest preinstalowany przez firmę.
  6. Po zakończeniu upewnij się, że system eluuje DNA w przygotowanych probówkach elucyjnych za pomocą dodanego tłoka. Cząstki magnetyczne pozostają w tłoku. Tłok na końcu wraca do ostatniego dołka wkładu.

7. Zakończ bieg

  1. Po zakończeniu pracy (maszyna na zielono), otwórz instrument, klikając przycisk otwierania (tabliczka przy drzwiach) i wyjmij stojak z systemu.
  2. Wyrzuć naboje.
  3. Włóż ponownie pusty stojak do instrumentu i zamknij drzwi za pomocą przycisku drzwi w prawym górnym rogu. Zamknij aplikację i wyłącz urządzenie oraz tablet.
  4. Eluaty należy przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub używać bezpośrednio do dalszej analizy lub pomiarów stężenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do ustalenia protokołu użyto 5 bloków tkankowych FFPE od pacjentów z miażdżycą tętnicy szyjnej. DNA wyizolowano za pomocą zoptymalizowanego protokołu półautomatycznego (zestaw C), a także za pomocą dwóch dostępnych na rynku ręcznych protokołów opartych na kolumnach (zestaw A i zestaw B, patrz tabela materiałów). Ekstrakcję DNA za pomocą zestawów A i B przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Jedyna zmiana, jaka została wprowadzona w protokole dwóch dostępnych na rynku zestawów (zestaw A i zestaw B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody ekstrakcji DNA dla tkanki FFPE różnią się jakością i ilością wyizolowanego DNA, co nieuchronnie wpływa na wydajność dalszych analiz. W związku z tym automatyzacja staje się niezbędna do poprawy przepływu pracy i standaryzacji, a także zarządzania jakością. Dlatego w niniejszym badaniu oceniono półautomatyczną metodę ekstrakcji DNA z próbek FFPE, która wykazała lepsze wyniki niż inne testowane ręczne protokoły oparte na kolumnach.

Aby zoptymalizować opisaną metodę półautomatyczną, naszym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustanowienie protokołu automatycznej ekstrakcji DNA było wspierane przez dr Paula Muschlera z firmy Promega. Dziękujemy Paulowi Muschlerowi za jego wsparcie i wkład naukowy. Dziękujemy również naszemu koledze, dr Moritzowi von Scheidtowi (Niemieckie Centrum Kardiologiczne w Monachium) za dostarczenie nam instrumentu Maxwella i wsparcie w części eksperymentalnej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w laboratoriach Niemieckiego Centrum Kardiologicznego (Monachium, Niemcy) i Klinikum rechts der Isar (Monachium, Niemcy). Badania zostały sfinansowane przez DFG (PE 900/6-1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 ml do inkubacji próbekEppendorf, Hamburg, Niemcy30120086
1-ThioglycerolPromega, Walldorf, NiemcyA208
Agilent 3.2Agilent, Waldbronn, Niemcy
Zestaw dsDNA HSThermoFisher Scientific, Schwerte, NiemcyQ32851
(zestaw A)Norgene Biotek, Heidelberg, Niemcy47400
Próbki tkanek FFPE n=5Monachijski Biobank Naczyniowy, Monachium, Niemcy
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)Qiagen, Hilden, Niemcy180134
Bloki grzewcze, ustawione na 80° C oraz 65° CVWR, Darmstadt, Niemcy460-0250
Odczynniki D5000 o wysokiej czułościAgilent, Waldbronn, Niemcy5067-5593
Taśma ekranowa o wysokiej czułości D5000Agilent, Waldbronn, Niemcy5067-5592
Bufor inkubacyjnyPromega, Walldorf, NiemcyMaxwella D920
RSC, w tym: Bufor do lizy, Bufor elucyjny, Proteinaza KPromega, Walldorf, NiemcyAS1400
Maxwell RSC 48 InstrumentPromega, Walldorf, NiemcyMikrowirówka AS8500
Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Spektrometr NanoDrop 2000cThermoFisher Scientific, Schwerte, NiemcyND-2000C
Nakładki optyczneAgilent, Waldbronn, Niemcy401425
Paski tub optycznychAgilent, Waldbronn, Niemcy401428
Pipety i końcówki do pipetEppendorf, Hamburg, Niemcy
Prism 6 do statystyki, wersja 6.01GraphPad Inc., San Diego, Kalifornia
Fluorometr Qubit 3.0ThermoFisher Scientific, Schwerte, NiemcyQ33216
TapeStation 4200Agilent, Waldbronn, Niemcy
Tecan Infinite M200 ProTecan, Mä nnedorf, SzwajcariaIN-MNANO
Oprogramowanie stacji taśmowej Zestawy do oczyszczania DNA FFPE Q32851 Zestaw do krwi

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251(2019).
  2. Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications. 130 (1), 118-126 (1985).
  3. Busch, A., Eken, S. M., Maegdefessel, L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Annals of Translational Medicine. 4 (12), (2016).
  4. Kandpal, R. P., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. BioTechniques. 46 (5), 351-355 (2009).
  5. McDonough, S. J., et al. Use of FFPE-derived DNA in next generation sequencing: DNA extraction methods. PloS One. 14 (4), (2019).
  6. Gilbert, M. T. P., et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when. PloS One. 2 (6), (2007).
  7. Williams, C., et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American Journal of Pathology. 155 (5), 1467-1471 (1999).
  8. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  9. Gillio-Tos, A., et al. Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39 (3), 345-348 (2007).
  10. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  11. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Experimental and Molecular Pathology. 94 (1), 121-125 (2013).
  12. Sarnecka, A. K., et al. DNA extraction from FFPE tissue samples–a comparison of three procedures. Contemporary Oncology. 23 (1), 52(2019).
  13. Kalmár, A., et al. Comparison of automated and manual DNA isolation methods for DNA methylation analysis of biopsy, fresh frozen, and formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal cancer samples. Journal of Laboratory Automation. 20 (6), 642-651 (2015).
  14. McCormick, S. F. Multilevel adaptive methods for partial differential equations. (SIAM). , (1989).
  15. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 4455(2006).
  16. Berensmeier, S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 73 (3), 495-504 (2006).
  17. Petrigh, R. S., Fugassa, M. H. DNA extraction and a cost-effective detection method for Echinococcus granulosus protoscoleces. Veterinary Parasitology. 198 (3-4), 410-413 (2013).
  18. Lee, J. H., Park, Y., Choi, J. R., Lee, E. K., Kim, H. S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Medical Journal. 51 (1), 104-110 (2010).
  19. Rohland, N., Siedel, H., Hofreiter, M. A rapid column-based ancient DNA extraction method for increased sample throughput. Molecular Ecology Resources. 10 (4), 677-683 (2010).
  20. Gutiérrez-López, R., Martínez-de la Puente, J., Gangoso, L., Soriguer, R. C., Figuerola, J. Comparison of manual and semi-automatic DNA extraction protocols for the barcoding characterization of hematophagous louse flies (Diptera: Hippoboscidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 40 (1), 11-15 (2015).
  21. Seiler, C., et al. Nucleic acid extraction from formalin-fixed paraffin-embedded cancer cell line samples: a trade off between quantity and quality. BMC Clinical Pathology. 16 (1), 17(2016).
  22. Harada, S. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples. , Springer. 125-138 (2016).
  23. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PloS One. 12 (6), 0178706(2017).
  24. Fujii, T., et al. Evaluation of DNA and RNA quality from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue for next-generation sequencing-Retrospective study in Japanese single institution. Pathology International. , (2020).
  25. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Archiv: An International Journal of Pathology. 460 (2), 131-140 (2012).
  26. Niland, E. E., McGuire, A., Cox, M. H., Sandusky, G. E. High quality DNA obtained with an automated DNA extraction method with 70+ year old formalin-fixed celloidin-embedded (FFCE) blocks from the indiana medical history museum. American Journal of Translational Research. 4 (2), 198(2012).
  27. Riemann, K., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 21 (4), 244-248 (2007).
  28. Steinau, M., Patel, S. S., Unger, E. R. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 13 (4), 377-381 (2011).
  29. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. The Journal of Molecular Diagnostics. 10 (4), 311-316 (2008).
  30. Okello, J. B., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Analytical Biochemistry. 400 (1), 110-117 (2010).
  31. Witt, S., Neumann, J., Zierdt, H., Gébel, G., Röscheisen, C. Establishing a novel automated magnetic bead-based method for the extraction of DNA from a variety of forensic samples. Forensic Science International: Genetics. 6 (5), 539-547 (2012).
  32. Ivanova, N. V., Fazekas, A. J., Hebert, P. D. Semi-automated, membrane-based protocol for DNA isolation from plants. Plant Molecular Biology Reporter. 26 (3), 186(2008).
  33. Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., Berktas, M. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. International Journal of Medical Sciences. 11 (5), 494(2014).
  34. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16 (3), 1215(1988).
  35. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  36. Khokhar, S. K., Mitui, M., Leos, N. K., Rogers, B. B., Park, J. Y. Evaluation of Maxwell 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 50 (2), 267-272 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka FFPEautomatyczna izolacjaprotok izolacji DNA z krwioczyszczanie DNAfragmentacja DNAamplifikacja PCRanaliza spektrometrycznaocena fluorometryczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły