Artykuł metodologiczny

Metoda dysocjacji pojedynczych komórek do analizy molekularnej pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/61455

⸱

17 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Division of Hematology/Oncology, Harvard Medical School Boston, 4Dana-Farber Cancer Institute, 5Broad Institute, 6Biological Biomedical Sciences Program, Division of Medical Sciences, Harvard Medical School, 7Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest zastosowanie zoptymalizowanego protokołu dysocjacji tkanek do mysiego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego i walidacja podejścia do analizy pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy implementację uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy w celu wywołania dyssynergii detrusor-zwieracz, funkcjonalnej niedrożności ujścia pęcherza moczowego i późniejszej przebudowy ściany pęcherza. Aby ułatwić ocenę składu komórkowego ściany pęcherza moczowego u myszy kontrolnych i myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół dysocjacji, który wspiera wysoką żywotność komórek i umożliwia wykrywanie dyskretnych subpopulacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Uraz rdzenia kręgowego powstaje w wyniku całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego klatki piersiowej. W momencie pobierania tkanek zwierzę jest poddawane perfuzji soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w głębokim znieczuleniu, a pęcherze są zbierane do buforu Tyrode. Tkanki są mielone przed inkubacją w buforze trawiennym, który został zoptymalizowany na podstawie zawartości kolagenu w pęcherzu myszy, określonej na podstawie badania publicznie dostępnych baz danych ekspresji genów. Po wytworzeniu zawiesiny pojedynczej komórki materiał jest analizowany za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny żywotności komórek, liczby komórek i określonych subpopulacji. Wykazaliśmy, że metoda daje populacje komórek o żywotności większej niż 90% i solidnej reprezentacji komórek pochodzenia mezenchymalnego i nabłonkowego. Metoda ta umożliwi dokładną analizę poszczególnych typów komórek w pęcherzu moczowym myszy i potencjalnie w innych narządach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia normalnego funkcjonowania pęcherza moczowego mogą prowadzić do obniżenia jakości życia wielu osób. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób uraz lub choroba zakłóca normalne funkcjonowanie pęcherza moczowego, ważne jest zbadanie normalnego stanu biologicznego komórek w pęcherzu moczowym i tego, jak zmieniają się one pod wpływem eksperymentalnych zakłóceń. Do tej pory jednak specyficzne populacje komórek, które znajdują się w pęcherzu moczowym, i sposób, w jaki zmieniają się one pod wpływem urazu, nie zostały w pełni scharakteryzowane.

Metody profilowania pojedynczych komórek, takie jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) mają potencjał, aby rzucić światło na określone typy komórek w pęcherzu moczowym. Jednak, aby te podejścia miały charakter informacyjny, tkanka musi być trawiona w sposób, który nie wpływa na żywotność, ekspresję genów i reprezentatywną procentową populację komórek pobranej tkanki. Protokoły, które wykorzystują dezagregację enzymatyczną, mogą wpływać na ekspresję markerów powierzchniowych poprzez masową aktywność proteazy1, wpływając w ten sposób na identyfikację komórek za pomocą cytometrii przepływowej, podczas gdy sam proces dysocjacji może prowadzić do indukcji natychmiastowych wczesnych genów, jak opisano niedawno przez Van den Brink i współpracowników2. Autorzy wykazali, że chociaż subpopulacja dotknięta dysocjacją była niewielka, może wywołać silny sygnał zanieczyszczający w badaniach nad ekspresją masową ze względu na wysoki poziom ekspresji natychmiastowych wczesnych genów. Ponadto czas trwania protokołu dysocjacji wpłynął na wykryte poziomy ekspresji masowej genów, które okazały się unikalne dla niektórych subpopulacji. W związku z tym zestawy danych z pojedynczych komórek wygenerowane bez uwzględnienia wpływu protokołu dysocjacji mogą powodować zmiany ekspresji genów wynikające z metody dysocjacji, w przeciwieństwie do leżącej u jej podstaw biologii. Obserwacje te sugerują, że opublikowane dane transkryptomiczne z pojedynczych komórek powinny być interpretowane z ostrożnością, a wyniki powinny być walidowane niezależnymi metodami.

Chociaż metody ostrej i długotrwałej dysocjacji mogą zmienić ekspresję genów w komórkach2; skuteczna izolacja komórek jest niezbędna do uzyskania dokładnej reprezentacji obecnych typów komórek. Ponieważ pęcherz moczowy jest złożonym narządem składającym się z wielu typów komórek, niektóre populacje, takie jak komórki urotelialne lub zrębowe, mogą być stosunkowo słabo reprezentowane, podczas gdy inne typy komórek, takie jak fibroblasty, istnieją w macierzy zewnątrzkomórkowej i mogą być trudne do wyizolowania. Dysocjacja staje się jeszcze trudniejsza, jeśli pęcherz moczowy przeszedł znaczną przebudowę i zwłóknienie, takie jak obserwowane w urazie rdzenia kręgowego3,4 lub przeszkoda w ujściu pęcherza moczowego5,6.

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną metodę dysocjacji tkanek do dalszej analizy pojedynczych komórek w pęcherzu myszy z uszkodzonym rdzeniem kręgowym. Korzystając z cytometrii przepływowej, porównaliśmy cztery protokoły trawienia enzymatycznego pod kątem ich zdolności do uzyskiwania zawiesiny pojedynczej komórki, wspierania żywotności komórek i utrzymywania prawidłowej proporcji populacji komórek. Na podstawie tej analizy dochodzimy do wniosku, że minimalizacja śmierci komórki, agregatów komórkowych, niekomórkowych kwasów nukleinowych i potencjalnych inhibitorów dalszej analizy ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury zostały wykonane zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Dziecięcego w Bostonie.

UWAGA: Myszy były trzymane w akredytowanym przez AAALAC obiekcie dla zwierząt z dostępem ad libitum do jedzenia i wody. Do tych eksperymentów wykorzystano samice myszy w wieku 8-12 tygodni. Biorąc pod uwagę charakter urazu, myszom zapewniono dodatkowe wzbogacenie żywieniowe, aby zapewnić im dobre samopoczucie.

1. Przecięcie rdzenia kręgowego w dolnej części klatki piersiowej u myszy

  1. Przygotowanie przed przecięciem rdzenia kręgowego
    UWAGA: Narzędzia chirurgiczne wymagane do tej procedury to sprężynowe nożyczki do mikro preparacji, mikrokleszcze preparacyjne, sterownik igieł do mikroszycia, hemostatyki i nici 7-0 polyglactin 910. Inne wymagane materiały chirurgiczne to serwety chirurgiczne, sterylne prześcieradła do pola operacyjnego, gąbki z gazy, aplikatory z bawełnianymi końcówkami oraz strzykawki o pojemności 1 ml z igłami 25 G.
    1. Autoklawuj narzędzia i materiały chirurgiczne przed operacją.
    2. Oczyść obszar operacyjny i poduszki grzewcze chusteczkami nasączonymi alkoholem. Jedna poduszka grzewcza będzie używana podczas zabiegu, a druga przez okres bezpośrednio pooperacyjny w celu utrzymania temperatury ciała zwierzęcia do momentu odzyskania pełnej aktywności.
    3. Użyj lup powiększających (2,5x lub więcej) do wykonania zabiegu chirurgicznego.
    4. Włącz poduszki grzewcze, źródło światła i sterylizator z kulkami szklanymi, aby być gotowym do użycia podczas zabiegu.
    5. Otwórz obłożenia chirurgiczne i narzędzia. Użyj sterylnych rękawiczek, aby udrapować pole operacyjne i umieść narzędzia w polu operacyjnym.
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Przynieś myszy do sali zabiegowej, a także przynieś czystą klatkę dla myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego.
    2. Podaj znieczulenie, umieszczając mysz w komorze indukcyjnej z przepływem izofluranu ustawionym na 3,0%, przepływem tlenu na poziomie 1 l/min i odsysaniem na poziomie 20 mmHg, aż nie będzie reakcji na uszczypnięcie łapy.
    3. Natychmiast zważ zwierzę, a następnie połóż zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej.
    4. Umieść stożek znieczulający ciasno na nosie myszy, przełącz przepływ gazu z komory indukcyjnej na stożek nosowy i ustaw przepływ izofluranu na 2%, a przepływ tlenu na 1 l/min.
    5. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone przy braku reakcji na uszczypnięcie łapy. Przyklej kończyny zwierzęcia do poduszki grzewczej. Umieść zwinięty kawałek gąbki z gazy pod dolną częścią klatki piersiowej, aby podnieść i zegnąć dolne kręgi piersiowe.
    6. Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy. Podawać leki przeciwbólowe (meloksykam, 10 mg/kg, podskórnie) i antybiotyk (enrofloksacyna, 5 mg/kg, podskórnie).
      UWAGA: Użytkownicy końcowi powinni stosować leki przeciwbólowe i antybiotyki zalecane przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich używania.
    7. Badanie palpacyjne najbardziej widocznego wyrostka kolczystego w odcinku piersiowym kręgosłupa, który zazwyczaj odpowiada wyrostkowi kolczystemu T137. Ogol podłużny prostokątny obszar z tyłu myszy od dolnej części szyi do tuż poniżej najbardziej widocznego wyrostka kolczystego (T13) i na 1 cm z każdej strony linii środkowej.
  3. Zabiegu chirurgicznego
    1. Przygotuj ogolony obszar za pomocą 10% roztworu jodu powidonu i 70% etanolu trzy razy, na przemian w sposób okrężny, zaczynając od miejsca nacięcia, kierując się na zewnątrz, a następnie przykryj zwierzę sterylną gąbką z gazy 4 x 4 z okienkiem pośrodku pokrywającym pole operacyjne.
    2. Wykonaj 1,5 cm nacięcie w linii środkowej pleców za pomocą cienkich nożyczek, które kończy się na najbardziej widocznym wyrostku kolczystym (T13). Nacięcie powinno obejmować skórę i powięź powierzchowną. Za pomocą nożyczek oddziel skórę i powięź powierzchowną po obu stronach, aby odsłonić wyrostki kolczyste i otaczające mięśnie przykolcowe.
    3. Za pomocą ostrej i sekcji oddziel mięśnie od wyrostków kolczystych i blaszek kręgów T9, T10 i T11.
    4. Ostro podziel więzadła międzykolcowe między T9 i T10 oraz między T10 i T11 za pomocą cienkich nożyczek, a następnie wytnij wyrostek kolczysty T10 i ostrożnie wykonaj laminektomię T10 obustronnie, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Upewnij się, że blaszki są całkowicie wycięte.
    5. Przeciąć rdzeń kręgowy za pomocą cienkich nożyczek. Minimalne krwawienie zwykle występuje w tym momencie z powodu przecięcia naczyń rdzenia kręgowego. Ściskaj krwawiące miejsce sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby uzyskać hemostazę. Po potwierdzeniu całkowitej hemostazy zamknij skórę szwami ciągłymi 7-0 polyglactin 910.
    6. Podawać podskórnie 1 ml roztworu soli fizjologicznej, aby zapobiec pooperacyjnemu odwodnieniu.
  4. Opieka pooperacyjna
    1. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej do czasu pełnego wyzdrowienia, a następnie przenieś je do klatki tylko dla myszy z uszkodzonym rdzeniem kręgowym.
    2. Opieka pooperacyjna obejmuje codzienną obserwację i ważenie zwierząt oraz monitorowanie miejsca nacięcia pod kątem oznak infekcji przez okres do 7 dni. Podawać 1 ml roztworu soli fizjologicznej, środka przeciwbólowego (meloksykam 10 mg/kg) i antybiotyku (enrofloksacyna 5 mg/kg) podskórnie codziennie przez 3 dni.
      UWAGA: Użytkownicy końcowi powinni stosować leki przeciwbólowe i antybiotyki zalecane przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich używania.
    3. Wykonuj ręczne odciąganie pęcherza (manewr Credé) co 12 godzin, aż zwierzę będzie w stanie samodzielnie oddać mocz (zwykle w ciągu 10 do 14 dni). Przytrzymaj zwierzę jedną ręką i masuj dolną część brzucha drugą ręką, a następnie poczuj i delikatnie ściśnij rozszerzony pęcherz moczowy palcem wskazującym i kciukiem. Delikatna przejściowa kompresja powinna przeplatać się z rozluźnieniem. Zgodnie z instrukcją odciągania należy umyć dolną część brzucha wodą z kranu i delikatnie osuszyć ręcznikiem papierowym bez nadmiernego pocierania.
      UWAGA: Niewielki rozmiar pęcherza moczowego przed rozpoczęciem odciągania i zwilżanie dolnej części brzucha moczem wskazują, że zwierzę nabyło zdolność do samodzielnego oddawania moczu.
    4. Aby zminimalizować utratę wagi, zapewnij myszom wzbogacenie składników odżywczych w postaci żelu odżywczego i innych pożywnych smakołyków (miękkie bekon, chrupki owocowe i kęsy warzyw) umieszczonych na podłodze klatki w celu łatwego dostępu UWAGA: W tym badaniu myszy poddano perfuzji, a pęcherze pobrano po 8 tygodniach od SCI.
  5. Powikłania pooperacyjne
    1. Zminimalizuj ryzyko pęknięcia pęcherza moczowego z powodu nadgorliwości manualnego wyrażania pęcherza moczowego poprzez niepełne odciąganie pęcherza.
    2. Zapobiegaj przetarciom skóry krocza w wyniku ciągłego narażenia na mocz kapiący z niewydolnego zwieracza poprzez mycie okolicy krocza wodą z kranu. Zminimalizuj stan zapalny poprzez zastosowanie potrójnej maści antybiotykowej.
      UWAGA: Niedrożność cewki moczowej spowodowana zakrzepem krwi w okresie przejściowego krwiomoczu lub skrzepem nasienia spowodowana wytryskiem wstecznym u samców myszy może wystąpić po urazie rdzenia kręgowego. Całkowita niedrożność cewki moczowej u samców myszy często kończy się pęknięciem pęcherza moczowego i śmiercią. Z naszego doświadczenia wynika, że częstość niedrożności cewki moczowej u samców myszy, która doprowadziła do śmierci, wynosiła 10%.

2. Perfuzja i pobieranie tkanek

UWAGA: Dla dalszych analiz niektórych typów komórek, takich jak komórki odpornościowe w tkankach obwodowych, korzystne jest usunięcie krwi przez perfuzję w czasie pobierania tkanek, jak opisano poniżej.

  1. Podaj znieczulenie, jak wspomniano w procedurze chirurgicznej (krok 2.2) i upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone bez reakcji szczypania przedniej łapy (zwierzę jest sparaliżowane, dlatego tylne kończyny mają zmniejszone czucie, a reakcja na uszczypnięcie tylnej łapy staje się nieistotna).
  2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i przetrzyj jamę brzuszną i klatkę piersiową 70% etanolem, aby zwilżyć sierść, aby zapobiec jej dostaniu się do miejsca operacji.
  3. Wykonaj laparotomię w linii środkowej od miednicy do przepony. Odetnij membranę od żeber.
    UWAGA: Po tym kroku ważna jest szybkość, ponieważ różnica ciśnień w klatce piersiowej już nie istnieje, a płuca nie mogą się napompować, więc zwierzę zaczyna się dusić.
  4. Rozciąć klatkę piersiową wzdłuż żeber po lewej i prawej stronie, podążając za granicą między kością a chrząstką na linii równoległej do mostka, zaczynając od przepony i biegnąc aż do pierwszego żebra.
  5. Umieść całą przednią ścianę klatki piersiowej nad głową zwierzęcia i przymocuj ją w tej pozycji za pomocą zacisków na ręczniki. Nie należy odcinać przedniej ściany klatki piersiowej, ponieważ spowoduje to silne krwawienie z dwóch wewnętrznych tętnic piersiowych.
  6. Odetnij osierdzie cienkimi nożyczkami.
  7. Podłącz igłę 23 G do aparatu perfuzyjnego, a następnie włóż ją do lewej komory i powoli do aorty, uważając, aby jej nie przebić.
    UWAGA: Aparat perfuzyjny składa się z pompy perfuzyjnej i strzykawki o pojemności 50 ml podłączonej do rurki dożylnej.
  8. Rozpocznij perfuzję i szybko wykonaj małe nacięcie czubkiem cienkich nożyczek w prawym przedsionku w celu drenażu. Należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas wlewu płynów.
  9. Przeprowadzić perfuzję roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w tempie 15 ml/min. Perfuzja jest zakończona, gdy drenaż jest czysty i uzyskuje się rozjaśniony kolor wątroby (Rysunek 1).
    UWAGA: Średni czas perfuzji wynosił 3,5–4 min. Niedostateczna perfuzja objawia się powolnym postępem blanszowania tkanek i zwykle jest spowodowana nieprawidłowym ułożeniem igły w lewej komorze. Ustawienie igły i wydłużenie czasu trwania perfuzji o 1 do 2 minut zapewni odpowiednią perfuzję tkanek.
  10. Przerwać perfuzję i odciąć pęcherz moczowy od szypułek naczyniowych i cewki moczowej, a następnie umieścić go w probówce do mikrowirówki zawierającej lodowaty roztwór Tyrode'a.

3. Trawienie pęcherza moczowego pod kontrolą i myszy z uszkodzonym rdzeniem kręgowym

UWAGA: Aby stworzyć wydajną mieszankę trawienną, która jest dostosowana do pęcherza moczowego myszy, staraliśmy się dostosować jednostkę enzymów używanych do degradacji dominujących składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolageny i kwas hialuronowy. W związku z tym wykorzystaliśmy publicznie dostępne dane sekwencjonowania RNA wygenerowane przez projekt Mouse ENCODE (BioProject: PRJNA66167) w celu wyodrębnienia odczytów na kilobazę na milion (RPKM) oraz Tabula Muris8 do oceny ekspresji przestrzennej w pęcherzu moczowym. Kolageny 1, 3 i 6 były trzema genami o najwyższej ekspresji spośród 42 różnych kolagenów (Figura 2A). Ekspresję tych kolagenów i syntazy hialuronianu 1 (Has1) obserwowano głównie w komórkach mięśniowych i fibroblastach ściany pęcherza moczowego (Rysunek 2B).

  1. Przygotowanie i roztworów
    1. Przygotować roztwór sodu Tyrode zgodnie z tabelą 1 w czystej butelce o pojemności 500 ml. Dodać 300 ml ddH2O. Po przygotowaniu roztwór jest kwaśny. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Doprowadzić objętość do 500 ml za pomocą podwójnie destylowanegoH2O, a następnie podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Bufor ten utrzymuje pH i równowagę osmotyczną w buforze trawiennym oraz dostarcza komórkom wodę i niezbędne jony nieorganiczne. Zawiera magnez, a także glukozę jako źródło energii. Potas zawarty w roztworze zapewnia działanie ochronne na aktywność elektromechaniczną w izolowanym roztworze komórkowym. Sproszkowane sole są higroskopijne i należy je chronić przed wilgocią. Całą zawartość mieszanki należy zużyć natychmiast po przygotowaniu. Nie zaleca się przygotowywania stężonego roztworu soli, ponieważ mogą tworzyć się osady. Sterylizację za pomocą filtracji (filtr 0,22 μm) można przeprowadzić, jeśli komórki mają być hodowane po analizie.
    2. Przygotować roztwór do wytrawiania enzymatycznego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, dodając zalecane objętości i ilości dla każdego składnika (Tabela 2). Dodaj roztwór sodu Tyrode do 2,5 ml. Dokładnie zwirować, aby się rozpuścić.
      UWAGA: Papaina to proteaza sulfhydrylowa z lateksu Carica papaya. Papaina ma szeroką specyficzność i degraduje większość substratów białkowych9. Papaina okazała się mniej szkodliwa i bardziej skuteczna niż inne proteazy w protokołach dysocjacji komórek10. Szczegółowe informacje na temat czterech protokołów dysocjacji znajdują się w tabeli 2; Zaobserwowaliśmy sekcję 3 protokołu w celu wspierania najwyższej żywotności (93%) zawiesin komórkowych przygotowanych z pęcherza myszy.
  2. Procedura dysocjacji i przygotowanie zawiesiny komórkowej
    1. Zbierz pęcherz od myszy po perfuzji.
    2. Nakłuj pęcherz, aby uwolnić zawartość, jeśli taka istnieje.
    3. Dodać 100 μl roztworu Tyrode'a do pustej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wytarować. Umieść pęcherz w rurce i zważ ponownie, aby określić dokładną wagę pęcherza.
    4. Umieść pęcherz na 10 cm szalce Petriego na lodzie i dodaj 100 μl roztworu Tyrode'a do mielenia.
    5. Za pomocą nożyczek chirurgicznych pokrój kawałki tak małe, jak to możliwe, minimalizując czas mielenia do nie więcej niż 2-3 min na pęcherz. W przypadku gromadzenia tkanki pęcherza moczowego od wielu zwierząt, zmiel pęcherze wszystkie naraz.
    6. Przenieść rozdrobnioną tkankę pęcherza moczowego za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze do 2,5 ml buforu do trawienia dla każdego pęcherza. Dostosuj głośność, jeśli zgrupowanych jest wiele pęcherzy. Inkubować tkankę w roztworze wytrawiającym w temperaturze 37 °C w inkubatorze na mieszalniku nutatorowym przez 40 minut.
    7. Pod koniec okresu inkubacji wyjąć rurkę wytrawiającą z inkubatora. Roztwór wytrawiający rozcierać (pipetować w górę i w dół) za pomocą pipety o pojemności 5 ml przez 1 minutę.
    8. Wirować przez 10 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu do oddzielania komórek. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na mieszadle nutatorowym na 10 minut.
    9. Wirować przez 10 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy RBC (1x). Inkubować przez 1 minutę.
    10. Dodać 9 ml PBS, aby rozcieńczyć bufor RBC i zatrzymać lizę RBC.
    11. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, używając tłoka ze strzykawki, aby delikatnie zeskrobać sitko do komórek, aby zapewnić pełne przejście komórek. Upewnij się, że zebrałeś płyn, który przechodzi przez sitko, ale może zostać złapany na spodzie sitka.
    12. Wirować przez 10 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do barwienia komórek (PBS z 2% FBS).
    13. Policz komórki.
  3. Znakowanie immunologiczne określonych komórek do cytometrii przepływowej
    UWAGA: Aby wykryć różne typy komórek w pęcherzu moczowym, zaprojektowaliśmy wielokolorowy panel cytometrii przepływowej. Aby przeprowadzić kompensację i opracować odpowiednią strategię bramkowania, uwzględniamy kontrole niebarwione i fluorescencyjne minus jeden (FMO). Kontrole FMO są ważne dla bramki populacji dodatniej, szczególnie gdy frakcja dodatnia jest przyćmiona. Procedura barwienia jest następująca.
    1. Blokowanie receptorów FcγRII/III na komórkach
      UWAGA: Zalecamy blokowanie nieswoistego wiązania przeciwciał monoklonalnych poprzez wstępną inkubację komórek z przeciwciałami monoklonalnego receptora anty-Fc lub rekombinowanym białkiem Fc.
      1. Przemyć komórki przez odwirowanie w sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i dodać bufor do barwienia komórek.
      2. Odrzucić supernatant i zablokować receptory FcγRII/III na komórkach, aby zapobiec niespecyficznemu barwieniu przeciwciałami poprzez dodanie przeciwciał CD16 i CD32 do buforu do barwienia komórek w rozcieńczeniu 1:100.
      3. Inkubować na lodzie przez 10 min.
        UWAGA: Nie ma potrzeby mycia komórek; Komórki można barwić bezpośrednio po tym etapie.
    2. Barwienie dla FMOs
      UWAGA: Kontrola fluorescencji minus jeden (FMO) to probówka ze wszystkimi fluorochromami użytymi w eksperymencie, która zawiera wszystkie fluorochromy z wyjątkiem jednego.
      1. Na przykład, jeśli masz 4 różne fluorochromy (A, B, C i D + Aneksyna V i jodek propidyny (PI)), przygotuj probówki FMO w następujący sposób. Rurka FMO 1: Przeciwciała sprzężone z fluorochromami B, C, D + (Aneksyna V i PI); Rurka FMO 2: Przeciwciała sprzężone z fluorochromami A, C, D + (Aneksyna V i PI); Probówka FMO 3: Przeciwciała sprzężone z fluorochromami A, B, C + (Aneksyna V i PI); Probówka FMO 4: Przeciwciała sprzężone z fluorochromami A, B, C, D + (Aneksyna V); Probówka FMO 5: Przeciwciała sprzężone z fluorochromami A, B, C, D + (PI).
      2. Rozważ charakter sprzężonego fluorochromu z przeciwciałem aneksyny V.
    3. Barwienie zablokowanych komórek pożądanymi przeciwciałami
      1. Inkubować zablokowane komórki z odpowiednimi mieszankami wzorcowymi przeciwciał sprzężonych z fluoroforem przeciwko pożądanym białkom przez 20 minut na lodzie chronionym przed światłem. Pamiętaj o dołączeniu FMO.
      2. Przemyć komórki 1 ml buforu do barwienia komórek dodanego do każdej probówki, a następnie ponownie odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C.
      3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do barwienia komórek. Przechowywać na lodzie do czasu, aż będzie można uzyskać dane dotyczące fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego.
    4. Nałożyć bejcę Annexin V/ PI.
      1. Przygotować roztwór roboczy PI (100 μg/ml) w 1x bufor wiążący anekcynę, zgodnie z opisem w protokole producenta dla zestawu do apoptozy martwych komórek.
      2. Określ gęstość komórek i zanotuj bufor i objętość, w której są przechowywane.
      3. Odwirować próbki przy 350 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1x buforze wiążącym anekcynę do gęstości ~1 x 106 komórek/ml w objętości 100 μL.
      4. Dodać FITC-anektynę V (5 μl) i roztwór roboczy PI (1 μl) do każdej próbki (100 μl), zgodnie z opisem w protokole producenta, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      5. Dodać 400 μl 1x buforu wiążącego anekcynę do próbek, wymieszać przez inwersję i trzymać na lodzie do czasu cytometrii przepływowej.
  4. Kalibracja FACS
    1. Cytometria przepływowa i kontrola czystości
      1. Rozpocznij analizę cytometrii przepływowej od pomiaru niewybarwionych komórek w celu wyznaczenia morfologii komórek i dolin fluorochromów.
      2. Dostosuj rozproszenie boczne (SSC) i rozproszenie do przodu (FSC), modyfikując napięcia każdego parametru fluorescencji. Zmierzyć emisję fluorescencji przy 530 nm (załącznik V) i >575 nm (PI).
      3. Zdefiniuj ujemną populację w pierwszej dekadzie, używając siatek na każdym wykresie kropkowym. Umieść każdą kontrolę FMO w cytometrze i skoryguj nakładanie się widma, aż ujemna i dodatnia mediana populacji zostanie wyrównana.
      4. Zmierz 100 000 zdarzeń. Mierz komórki barwione określonymi markerami i twórz bramki dla interesujących populacji komórek.
  5. analiza danych
    1. Zbierz dane z cytometru przepływowego. Otwórz oprogramowanie, aby zwizualizować obszar roboczy do analizy.
    2. Tworzenie obszaru roboczego
      1. Pliki FCS można importować, przeciągając je do obszaru roboczego. Pliki będą widoczne w sekcji próbki i grupy obszaru roboczego. Kliknij dwukrotnie nazwę próbki, aby otworzyć plik.
      2. Użyj bocznego obszaru rozproszenia (SSC-A) dla osi y i obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) dla osi x (Rysunek 3A). Kliknij ikonę bramkowania wielokątnego.
      3. Utwórz bramkę wokół interesującej nas populacji komórek na wykresie kropkowym, klikając, aby utworzyć węzeł bramki, a następnie kontynuuj klikanie wokół populacji komórek, aż do zakończenia; kliknij dwukrotnie, aby zamknąć bramkę.
      4. Nazwij bramę zgodnie z przechwyconą populacją (np. "Wszystkie komórki") i kliknij OK.
        UWAGA: Dwukrotne kliknięcie w bramce "Wszystkie komórki" otworzy nowe okno wykresu pokazujące tylko zdarzenia zawarte w "Wszystkie komórki".
      5. Dostosuj oś y nowego wykresu punktowego do SSC-H (wysokość rozrzutu bocznego), klikając czarną strzałkę i wybierz opcję zmiany osi y.
        UWAGA: To bramki dla pojedynczych komórek (singletów) i wykluczają dublety lub większe agregaty (Rysunek 3B). Ponieważ pojedyncze komórki mają proporcjonalną szerokość i długość, powinny być reprezentowane jako populacja po przekątnej. Komórki znajdujące się poza tą ukośną bramą są dubletami lub większymi agregatami.
      6. Kliknij dwukrotnie bramkę, aby przeanalizować komórki nekrotyczne (PI-dodatnie), wczesnoapoptotyczne (aneksyna V-dodatnia, PI-ujemna) i późno apoptotyczne (aneksyna V-dodatnia, PI-ujemna) (Rysunek 3C).
      7. Oznacz oś x jako załącznik V, a oś y jako PI.
        UWAGA: W niektórych przypadkach, gdy intensywność sygnału jest niska, populacje komórek mogą wydawać się mieć ujemne wartości fluorescencji w wyniku korekcji tła. W takim przypadku zaleca się wykonanie transformacji dwuwykładniczej. Aby to zrobić, kliknij literę T obok osi y i wybierz opcję Dostosuj oś. W nowym oknie zmień skalę na dwuwykładniczą (Biex), dodaj wartości ujemne do osi, zwiększając podstawę szerokości i kliknij Zastosuj. Poprawi to rozdzielczość zdarzeń o niskiej intensywności sygnału.
      8. Pokazuje dane jako wykres zliczający. Użyj zakładki Opcja znajdującej się tuż pod osią x i wybierz z menu wykres przeciwstawny.
      9. Narysuj bramkę Quat na wykresie, aby zdefiniować 4 odrębne populacje docelowe.
      10. Kliknij w górnej części okna, aby otworzyć edytor układu, klikając w Edytor układu i przeciągnij populacje do każdego oddzielnego obszaru.
      11. Umieść wykresy w edytorze układu, przeciągając i upuszczając populacje z obszaru roboczego do okna edytora układu.
    3. Wizualizacja za pomocą histogramów
      1. Wybierz histogram z karty Opcje.
      2. Zastosuj bramkę, aby wybrać komórki V-dodatnie aneksyny; alternatywnie populacje dodatnie i ujemne można zdefiniować za pomocą narzędzia dwusiecznego. Sekcja próbki musi teraz pokazywać różne populacje, które zostały utworzone, oraz ich hierarchię.
      3. Aby porównać próbki, przeciągnij wszystkie histogramy jeden na drugi; kliknij prawym przyciskiem myszy na histogramie i z histogramu wybierz Przesunięcie schodkowe.
    4. Dodawanie analiz statystycznych
      1. Otwórz zakładkę Statystyki, klikając dwukrotnie na interesującą Cię populację. Wybierz funkcję, która ma zostać zastosowana, i odpowiedni parametr.
      2. Powtórz te czynności w przypadku innych populacji, przeciągając ikonę Sigma do nazwy populacji.
      3. Zastosuj analizę do wszystkich próbek, wybierając strategię bramkowania z próbki będącej przedmiotem zainteresowania i przeciągając ją do grupy zdefiniowanej przez znacznik zainteresowania, np. Aneksyna V.
      4. Utwórz bramki w próbkach kontrolnych FMO i zdefiniuj populacje ujemne i pozytywne; ta strategia bramkowania zostanie zastosowana do całego eksperymentu (Rysunek 3D\u2012F).
        UWAGA: Sprawdź każdą próbkę indywidualnie, aby upewnić się, że bramkowanie jest prawidłowe i zmodyfikuj w razie potrzeby.
      5. Jeśli komórki zostały wybarwione przeciwciałem markerowym (np. CD45), należy użyć odpowiedniego FMO i odpowiednio bramki.
      6. Aby wyeksportować układ, kliknij Plik | Eksportuj obraz | Wybierz format pliku (np. jpg, pdf).
      7. Kliknij przycisk Utwórz tabelę, aby otworzyć okno z ostateczną wersją tabeli.
      8. Wyeksportuj tabelę, wybierając punkt menu Plik | Zapisz jako | Nazwa pliku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zabieg chirurgiczny
O powodzeniu przecięcia rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym decyduje ocena szeregu parametrów, z których najbardziej oczywistym jest porażenie kończyn tylnych. Zwierzę porusza się tylko za pomocą kończyn przednich, ciągnąc za sobą kończyny tylne. W przeciwnym razie poziomy aktywności, w tym karmienie, pielęgnacja i czujność, są zazwyczaj normalne. Ponadto zwierzęta tracą wolicjonalną kontrolę nad pęcherzem, co skutkuje koniecznością ręcznego odciągania pęcherza przez badacza co 12 godzin, aż do powrotu odruchowego oddawania moczu po 10 do 14 dniach od urazu. Po eutanazji dodatkowe oznaki sukcesu urazu dotyczą przede wszystkim wzrostu stosunku masy pęcherza moczowego do masy ciała, co wskazuje na przebudowę tkanek. Analiza histologiczna ujawnia przerost zarówno w obrębie przedziałów urotelialnych, jak i mięśni gładkich3.

Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki
Korzystając z publicznie dostępnych danych dotyczących ekspresji, określono wzbogacenie tkanki pęcherza moczowego w białka macierzy zewnątrzkomórkowej (Ryc. 2) i wykorzystano do poinformowania o formułowaniu mieszanki trawiennej. Ponieważ kolageny są kluczowymi składnikami ściany pęcherza moczowego11,12, najpierw staraliśmy się określić najliczniejszy kolagen (kolageny) w pęcherzu myszy za pomocą zestawów danych profilowania RNA wygenerowanych przez projekt Mouse ENCODE13. Nasza analiza wykazała, że kolagen 1A1, kolagen 3A1, kolagen 1A2 i kolagen 6A1 są najliczniejszymi typami kolagenu w pęcherzu myszy (Rysunek 2A). Użyliśmy również Tabula Muris (kompendium danych transkryptomu pojedynczej komórki od myszy (Mus musculus))8 w celu określenia poziomu ekspresji mRNA kolagenów 1, 3, 6 i hialuronianu. Dane pozwalają na bezpośrednie i kontrolowane porównanie ekspresji genów w typach komórek wspólnych dla różnych tkanek. Analiza ta wykazała, że ekspresja tych składników macierzy zewnątrzkomórkowej jest bardziej rozpowszechniona w typach komórek mezenchymalnych niż w nabłonku dróg dróg moczowych (Figura 2B).

Wpływ dysocjacji na żywotność izolowanych komórek z pęcherza moczowego
Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że trawienie enzymatyczne przy użyciu 4 różnych protokołów dało żywotność odpowiednio 83%, 86%, 93% lub 90%. W związku z tym sekcja 3 protokołu została uznana za najbardziej wartościową dla zachowania żywotności komórek. Zaobserwowaliśmy również, że około 4% komórek było martwiczych (PI+/Aneksyna V-) (Ryc. 4A). Obserwacje te podkreślają skuteczność protokołu trawienia i wynikające z niego korzyści dla żywotności komórek.

Wpływ uszkodzenia rdzenia kręgowego na różne populacje komórek w pęcherzu moczowym
Zaobserwowaliśmy znaczny wzrost całkowitej liczby komórek w pęcherzach moczowych myszy SCI w porównaniu z grupą kontrolną. Wzór wykresów kropkowych uzyskanych z pęcherzy SCI był również nieco inny, co było zgodne z trwającą przebudową narządów z powodu urazu rdzenia kręgowego (Rysunek 4B: pierwsza kolumna). W porównaniu z grupą kontrolną, pęcherze moczowe zwierząt po SCI wykazywały znaczny wzrost liczby komórek CD45-dodatnich.

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne zakończenie perfuzji z rozjaśnionym kolorem wątroby.(A) Pokazuje kolor wątroby na początku perfuzji. (B) Pokazuje rozjaśniony kolor wątroby pod koniec perfuzji. Mysz w (A) miała przecięcie rdzenia kręgowego dwa tygodnie przed perfuzją, co spowodowało przerost pęcherza moczowego i jego wysunięcie się z miednicy, w przeciwieństwie do myszy w (B), która nie miała urazu rdzenia kręgowego; W tym przypadku pęcherz moczowy jest mały i ukryty w miednicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Transkryptomiczna ekspresja składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w pęcherzu myszy. (A) Wykres słupkowy 43 różnych typów kolagenu. Wyrażenie jest wyrażone przez Odczyty na kilobazę transkryptu, na milion zmapowanych odczytów (RPKM) (dane są zbierane z BioProject: PRJNA66167)14. (B) Wykresy skrzypcowe ekspresji genów w typach komórek uzyskane z mikroprzepływowego zliczania końcówek 3' na podstawie kropelek mikroprzepływowych w puli męskich i żeńskich zdysocjowanych próbek pęcherza moczowego (mężczyzn i kobiet). Liczby zostały znormalizowane logarytmicznie dla każdej komórki przy użyciu logarytmu naturalnego 1+ zliczeń na milion ln(CPM+1)8. Pseudoliczenie 1 CPM zostało dodane przed pobraniem logarytmów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Strategia bramkowania i kontrole FMO w celu określenia rozprzestrzeniania się fluorescencji. (A) Wybór populacji komórek. (B) Strategia bramkowania dla podkoszulków. (C) Bramkowanie komórek nekrotycznych oraz wczesnej i późnej apoptozy przy użyciu przeciwciała PI i aneksyny V. (D\u2012F) Schematyczny wykres punktowy wielokolorowej cytometrii przepływowej (np. przeciwciała sprzężone z fluorochromami A, B, C, D + (Aneksyna V i PI). Pokazuje to fluorescencję rozprzestrzeniającą się do przeciwciała z kanałem fluorochromu A wykazaną przez kontrolę FMO w porównaniu z kontrolą niebarwioną. Pomarańczowa przerywana linia reprezentuje granicę bramkowania FMO w porównaniu z niebarwioną granicą w kolorze czerwonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Cytometria przepływowa różnych typów komórek w pęcherzu moczowym. (A) Schematy blokowe podwójnego barwienia Aneksyny V/PI. Różne kombinacje enzymów i substancji chemicznych stosowanych w każdym protokole są przedstawione przed odpowiednim wykresem żywotności. Dane te wskazują, że najwyższą żywotność uzyskano w sekcji 3 protokołu. (B) Reprezentatywne histogramy ilustrujące intensywność Ly-6A/E (Sca-1) i CD326 (Ep-CAM) wykrytych w pojedynczych kanałach. (C) Wpływ SCI na populację komórek pęcherza moczowego myszy. Górny panel pokazuje wyniki barwienia na trzech zdysocjowanych pęcherzach uzyskanych od kontrolnych myszy niechirurgicznych, a dolny panel pokazuje wyniki barwienia na trzech zwierzętach z SCI. Pierwsza kolumna to łączna populacja komórek. Druga kolumna pokazuje wybór bramkowania singletowego. Trzecia kolumna pokazuje subpopulację żywych komórek, które są ujemne dla komórek B, limfocytów T i komórek NK. Czwarta kolumna pokazuje barwienie żywych komórek dodatnie dla CD45. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

składnikIlość (na 500 ml)Molarność
Zawartość NaCl4,091 gr140 mM
Kcl0,186 gr5 mM
MgCl20,0476 gr1 mM
D-glukoza0,9 gr10 mM
HEPESY1,19 gr10 mM

Tabela 1: Składniki do przygotowania roztworu Tyrode'a. Wskazane składniki służą do przygotowania 500 ml roztworu Tyrode.

składnikkwotaSekcja 1 protokołuSekcja 2 protokołuRozdział 3 protokołuRozdział 4 protokołu
Bsa5 mg tabletki powlekaniataktaktaktak
CaCl20,03 mMtaktaktaktak
Kolagenaza typu I132.5 jednostektaktaktaktak
Kolagenaza typu III96,4 jednostektaktaktaktak
Kolagenaza typu VI50 jednostek--tak-
Strefa DNaza10 jednostektaktaktak-
papaina115 jednostek--taktak
Kolagenaza patelniowa50 jednostek--taktak
Hialuronidazy10,5 jednostki--taktak
Dypaza II1,25 jednostkitaktak--
Rozwiązanie do dysocjacji komórek1 mltak-tak-
Enzym rekombinowany1 ml-tak-tak

Tabela 2: Składniki do przygotowania buforu trawiennego. Wskazane składniki służą do przygotowania 2,5 ml mieszanki wytrawiającej (1 U katalizuje hydrolizę 1 μmol substratu na minutę w temperaturze 37 °C. Patrz karta charakterystyki produktu, aby zapoznać się z definicją jednostki każdego enzymu).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj model uszkodzenia rdzenia kręgowego myszy zapewnia powtarzalną metodę tworzenia funkcjonalnej niedrożności ujścia pęcherza z powodu utraty koordynacji między skurczem pęcherza a rozluźnieniem zewnętrznego zwieracza cewki moczowej. To z kolei wywołuje głęboką przebudowę ściany pęcherza moczowego już 2 tygodnie po urazie, charakteryzującą się rozszerzeniem przedziałów dróg moczowych i mięśni gładkich. Kluczowe kroki we wdrażaniu modelu SCI u gryzoni obejmują: (i) rygorystyczne zwracanie uwagi na manualną ekspresję pęcherza moczowego w okresie wstrząsu rdzeniowego, który następuje przez 10-14 dni po urazie; (ii) wzbogacenie składników odżywczych w celu zminimalizowania utraty masy ciała; oraz (iii) ograniczenie ryzyka oparzenia moczem, szczególnie w przypadku eksperymentów, które wykraczają poza powrót odruchowego oddawania moczu. Ograniczenia modelu obejmują możliwość niedrożności cewki moczowej u myszy z powodu zakrzepów krwi w okresie przejściowego krwiomoczu, a dodatkowo u samców myszy z krzepnięcia nasienia po wytrysku wstecznym po operacji.

Opisane tutaj podejście do dysocjacji tkanek ilustruje znaczenie uwzględnienia zmian strukturalnych w tkankach, które wynikają z eksperymentalnego urazu, w tym przypadku znaczącej przebudowy tkanek po SCI, które mogą mieć wpływ na dalsze analizy. Wraz ze wzrostem liczby analiz pojedynczych komórek kluczowe znaczenie ma zapewnienie, że obserwowane różnice w ekspresji genów nie są po prostu wynikiem perturbacji wywołanych dysocjacją, ale są naprawdę reprezentatywne dla podstawowych zmian biologicznych istotnych dla modelu choroby. Wykorzystanie publicznie dostępnych danych dotyczących ekspresji pozwoliło nam zmodyfikować formułę trawiennych, aby zapewnić skuteczne trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnej maksymalizacji żywotności. Dodatkowe modyfikacje, które mogą być brane pod uwagę w przyszłych zastosowaniach, obejmują dodanie aktynomycyny D, w celu zatrzymania transkrypcji natychmiastowych wczesnych genów, które są wrażliwe na protokół dysocjacji15.

Technika pipetowania ma kluczowe znaczenie w przypadku dysocjacji tkanek lub przenoszenia komórek, które są już w zawiesinie. Aby zmniejszyć fizyczne uszkodzenia komórek spowodowane siłami ścinającymi, ważne jest, aby pipetować delikatnie i powoli podczas ponownego zawieszania komórek. Ogólnie zaleca się stosowanie końcówek do pipet o szerokim otworze. W przypadku korzystania ze standardowych końcówek szczególnie ważne jest, aby delikatnie pipetować zawiesiny komórek, aby uniknąć sił ścinających, które w przeciwnym razie mogłyby uszkodzić komórki. W tym protokole nie da się uniknąć stosowania filtrów siatkowych, jednak stężenie komórek może spaść o 20% lub więcej, czemu towarzyszy utrata objętości o 100 μl lub więcej. Zalecamy określenie stężenia komórek po odcedzeniu, aby zapewnić dokładną liczbę komórek.

W cytometrii przepływowej kontrole FMO zapewniają pomiar tła z powodu przebijania sygnału z nakładających się pików emisji. Nie są one miarą niespecyficznego wiązania przeciwciał ani barwienia tła, które może być obecne, gdy przeciwciało jest włączone do tego kanału. Aby uwzględnić niespecyficzne wiązanie przeciwciał, należy uwzględnić odpowiednie kontrole izotypu; Do barwienia tła należy uwzględnić kontrole negatywne. Podsumowując, te kontrole zapewniają dokładny pomiar populacji komórek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (R01 DK077195 do R.M.A, R01 DK104641 do R.M.A i D.R.B.). Doceniamy cenny wkład dr Stuarta Orkina z Oddziału Hematologii/Onkologii Szpitala Dziecięcego w Bostonie, Oddziału Pediatrii Harvard Medical School i Dana-Farber Cancer Institute. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Kyle'a Costy w opiece pooperacyjnej nad myszami, Mary Taglienti i dr Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Wydział Pediatrii, Oddział Medycyny Noworodków, Wydział Pediatrii, Oddział Medycyny Noworodków, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) za pomoc techniczną i pomocne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,5 X Lupy
7-0 Vicryl szew, igła 6,5mm koło 3/8 kołoETHICONJ546
70 μ m Sitko komórkoweThermofisher22363548
Accutase w BPBS, 0,5 mM EDTAMilliporeSCR005
Filtr aerozolowy Końcówki pipetora z szerokim otworem (1000 &mikro; L)VWR89049-168
Filtr aerozolowy Końcówki pipetora z szerokim otworem (1000 µ L)VWR89049-168
APC anty-mysi CD326 (Ep-CAM), monoklonalny szczur, IgG2a, κ, oczyszczony powinowactwemBioLegend118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, monoklonalny szczur, IgG2b, κ, Clone 30-F11BD Biosciences564590
Mikrokleszcze preparacyjne BONN, proste, 1x2 zęby, długość 3,75", szerokość końcówki 0,3 mm, zęby 0,12 mmFirma zajmująca się instrumentami chirurgicznymiInc.RS-5172ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA9647-100G
CaCl2Sigma2115-250ML
CASTROVIEJO Mikrouchwyt na igły do szycia, prosty z zamkiem, długość 5,75 calaROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.RS-6412ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Zestaw do liczenia komórek Gaithersburg MD
, 30 dwukomorowych szkiełek, 60 zliczeń, z błękitem trypanowymBiorad1450003
Bufor do barwienia komórekBioLegend420201
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Kolagenaza typu IWorthington Biochemical Corporation
Kolagenaza typu IIIWorthington Biochemical CorporationLS004182
Kolagenaza, typ 6Worthington Biochemical CorporationLS005319
Zestaw do apoptozy martwych komórek z załącznikiem V Alexa Fluor 488 i Jodek propydu (PI)ThermofisherV13241
Dispase IISigmaD4693-1G
DNaseSigmaDN25-1G
Enrofloksacyna (Baytril)Bayer Health Care LLC,NADA # 140-913 Zatwierdzony przez FDA. Nr partii: AH01CGP2,27% roztwór do wstrzykiwań
Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific352096
Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific352070
FITC anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1), monoklonalne szczury, IgG2a, κ, oczyszczone powinowactwoBioLegend122505
Hialuronidaza z jąder owiec, typ IIFiltry siatkowe SigmaH2126
MACS (100 µ m)Miltenyi Biotec, Inc.130-110-917
- McPHERSON-VANNAS - Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji, proste, długość 4", szerokość końcówki 0,15mmROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.RS-5630ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
MeloxicamPatterson Veterinary07-891-7959
PapainWorthington Biochemical CorporationLS003119
Przeciwciało anty-mysie CD19 PE / Cy5, monoklonalne szczura, IgG2a, κ, oczyszczone powinowactwoBioLegend115509Dump Channel
PE/Cy5 anty-mysi CD3 i epsilon; Przeciwciało, monoklonalne chomik ormiański, IgG, oczyszczone powinowactwoBioLegend100309Dump Channel
PE/Cy5 przeciwciało anty-mysie CD4, monoklonalne szczura, IgG2b, κ, oczyszczone powinowactwoBioLegend100409Dump Channel
PE/Cy5 przeciwciało anty-mysie CD8a, monoklonalne szczura, IgG2a, κ, oczyszczone powinowactwoBioLegend100709Dump Channel
PE / Cy5 przeciwciało anty-mysie NK-1.1, monoklonalne mysie, IgG2a, κ, oczyszczone powinowactwoBioLegend108715Dump Channel
PE / Cy5 przeciwciało przeciw mysim komórkom TER-119 / erytroidalnym, IgG2b, κ, oczyszczone powinowactwoBioLegend116209Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 (blok myszy BD Fc), monoklonalny szczur, IgG2b, κ, klon 2.4G2BD Biosciences553141
Bufor do lizy RBC (10X)BioLegend420301
Bufor do lizy czerwonych krwinek 1xBiolegend420201
Probówki do mikrowirówek z nakrętką, 1,5 mlVWR89004-290
TC20 Automatyczny licznik komórekBiorad1450102
Maść z potrójnym antybiotykiem (neomycyna/polimyksyna B/bacytracyna)Patterson Veterinary07-893-7216środek chroniący skórę
TrypLE Select Enzyme (10X), bez czerwieni fenolowejThermofisherA1217701
Vetropolycin maść do oczuDechra Veterinary ProductsNADA # 065-016. Zatwierdzony przez FDA.chronić oczy podczas znieczulenia
powiększająceLS004196

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  2. van den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  3. Seth, A., et al. The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility. BMC Urology. 13, 24(2013).
  4. Doyle, C., et al. Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway. Scientific Reports. 7, 44416(2017).
  5. Gheinani, A. H., et al. Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction. JCI Insight. 2 (2), 89560(2017).
  6. Gheinani, A. H., et al. Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).
  7. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).
  8. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  9. Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases. Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).
  10. Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice. MethodsX. 2, 39-46 (2015).
  11. Aitken, K. J., Bagli, D. J. The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease. Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).
  12. Aitken, K. J., Bagli, D. J. The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications. Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).
  13. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  14. Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  15. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p cherz myszycytometria przep ywowaywotno kom rektrawienie tkankianaliza kolagenusortowanie kom reksekwencjonowanie pojedynczych kom rekprzebudowa ciany p cherza

Powiązane artykuły