Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Podsumowanie

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Streszczenie

Domena Src-homologii 2 (SH2) zawierająca domenę fosfataza 2 (SHP2), kodowana przez protoonkogen PTPN11 , jest kluczowym mediatorem sygnalizacji komórkowej sterowanej kinazą receptorową (RTK), wspierając przeżywalność i proliferację komórek. Ponadto SHP2 jest rekrutowany przez receptory punktów kontrolnych układu odpornościowego, aby hamować aktywację komórek B i T. Nieprawidłowa funkcja SHP2 była powiązana z rozwojem, progresją i przerzutami wielu nowotworów. Rzeczywiście, inhibitory SHP2 na poziomie małych cząsteczek niedawno weszły do badań klinicznych w leczeniu guzów litych z aktywacją szlaku Ras/Raf/ERK, w tym guzów z niektórymi onkogennymi mutacjami Ras. Jednak obecna klasa inhibitorów SHP2 nie jest skuteczna przeciwko onkogennym wariantom SHP2, które często występują w białaczkach, a rozwój specyficznych małych cząsteczek celujących w onkogenny SHP2 jest przedmiotem obecnych badań. Częstym problemem większości kampanii odkrywania leków z udziałem białek cytosolowych, takich jak SHP2, jest to, że główne testy napędzające odkrycia chemiczne to często testy in vitro, które nie raportują zaangażowania związków kandydatów na cele komórkowe. Aby zapewnić platformę do pomiaru zaangażowania celów komórkowych, opracowaliśmy zarówno testy termiczne SHP2 dla typów dzikich, jak i mutantów. Testy te niezawodnie wykrywają zaangażowanie inhibitorów SHP2 w komórkach do celów. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół tego testu, który stanowi cenne narzędzie do oceny i charakteryzacji inhibitorów SHP2.

Wprowadzenie

Fosforylacja tyrozyny odgrywa ważną rolę w transdukcji sygnału w komórkach ^1,2. Ta modyfikacja potranslowana jest katalizowana przez kinazy tyrozyny białkowe (PTK) i odwracana przez tyrozynowe fosforazy białkowe (PTP). Dlatego nieprawidłowa funkcja PTK lub PTP prowadzi do wielu dziedzicznych lub nabytych chorób ludzkich 3,4,5,6. Fosfataza 2 (SHP2) zawierająca domenę Src-homologia 2 (SHP2) to szeroko eksprimowany typ niereceptorowy PTP kodowany przez protoonkogen PTPN11

Protokół

1. Przygotowanie hodowli komórkowych i odczynników

1. Sformułuj butelkę 500 mL podłoża wzrostowego z 10% surowicy bydlęcej płodu, 1 razem antybiotyku/leku przeciwmikotycznego, 20 mM HEPES i 1 mM pirorurianianu sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Rozmroź komórkowe odczynniki termiczne (odczynnik EA, bufor lizy i podłoże) z mrożonych oryginalnych butelek.
3. Podawaj odczynniki i bufor w formie 2 mL aliquotów i przechowuj w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Unikaj zamrożenia/rozmrażania dla powtarzalności i używaj tylko takiej ilości odczynnika potrzebnej do procesu testowania.

2. Wzrost i utrzymanie komórek H....

Wyniki

Eksperyment gradientu termicznego dla SHP2-WT dał sigmoidalny profil termiczny komórkowy z wąskim przejściem topnienia, który jest typowy i spójny dla białka fałdowanego (Rysunek 4A). SHP2 składa się z trzech niezależnych dziedzin: dwóch domen SH2 oraz dziedziny katalitycznej (Rysunek 1). W autohamowanej zamkniętej konformacji te domeny samoasociują się; Przejście topnienia zaobserwowane w eksperymencie profilu termicznego prawdopodobnie odzwierciedlało ten stan.......

Dyskusja

Przedstawiliśmy test zaangażowania celu, który może potwierdzić bezpośrednie wiązanie małych cząsteczek z fosfatazą SHP2 w komórkach. Test pozwala rozróżnić inhibitory o niskiej i wysokiej afinitecie oraz, co ważne, potwierdzać brak mocy allosterycznych inhibitorów typu SHP099 dla mutanta SHP2-E76K onkogennego GOF. Siłą tego zminiaturyzowanego testu jest jego zdolność do integracji z kampanią przesiewową inhibitorów SHP2. Zdolność testu do potwierdzenia wewnątrzkomórkowego wiązania SHP2 przez nieznaną materię chemiczną j.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Termocykler wyposażony w gradient z 384 otworami	Eppendorf AG	X50h
384-dołkowy mikropłytkowy mikropłyt o niskiej martwej objętości kwalifikuje się	Beckman Coulter, Inc.	LP-0200
Płytki hodowli komórek 6-dołkowy	Greiner Bio-One	657 160	Sterylny z pokrywką
Antybiotyk przeciwmykotyczny (anty-anti-anti) 100 X	Thermo Fisher Scientific	15240-062
Licznik komórek	Thermo Fisher Scientific	Hrabina II FL
Dulbecco Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566-016	500 mL
Echo akustyczny handler cieczy	Beckman Coulter, Inc.	Echo 550
Elektroniczna pipeta wielokanałowa	Thermo Fisher Scientific	E1 ClipTip
Surowica bydła płodowa	Thermo Fisher Scientific	26140-079	500 mL
Bufor HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-680	100 mL
Zestaw startowy InCell Pulse	Eurofins DiscoverX Corp.	94-4007	Komponenty to bufor EA, bufor lizy oraz podłoże
Czytnik mikropłyt	Tecan Trading AG	Iskra
Jednokanałowa kanałowa dolina roztworu	Thermo Fisher Scientific	S253012005
Pirorotroczan sodu	Thermo Fisher Scientific	11360-010	100 mM
Termiczna mikropłytowa impregnacja	Agilent Technologies, Inc.	PlateLoc
Odczynniki transfekcyjne	Transfekcja Polyplus	jetPRIME
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282
Odczynnik TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605-010
Płytki PCR Twin.tec 384 w czasie rzeczywistym	Eppendorf AG	30132734