Artykuł metodologiczny

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

5.8K wyświetleń

DOI:

10.3791/61457

17 lipca 2020

W tym artykule

Podsumowanie

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Streszczenie

Domena Src-homologii 2 (SH2) zawierająca domenę fosfataza 2 (SHP2), kodowana przez protoonkogen PTPN11 , jest kluczowym mediatorem sygnalizacji komórkowej sterowanej kinazą receptorową (RTK), wspierając przeżywalność i proliferację komórek. Ponadto SHP2 jest rekrutowany przez receptory punktów kontrolnych układu odpornościowego, aby hamować aktywację komórek B i T. Nieprawidłowa funkcja SHP2 była powiązana z rozwojem, progresją i przerzutami wielu nowotworów. Rzeczywiście, inhibitory SHP2 na poziomie małych cząsteczek niedawno weszły do badań klinicznych w leczeniu guzów litych z aktywacją szlaku Ras/Raf/ERK, w tym guzów z niektórymi onkogennymi mutacjami Ras. Jednak obecna klasa inhibitorów SHP2 nie jest skuteczna przeciwko onkogennym wariantom SHP2, które często występują w białaczkach, a rozwój specyficznych małych cząsteczek celujących w onkogenny SHP2 jest przedmiotem obecnych badań. Częstym problemem większości kampanii odkrywania leków z udziałem białek cytosolowych, takich jak SHP2, jest to, że główne testy napędzające odkrycia chemiczne to często testy in vitro, które nie raportują zaangażowania związków kandydatów na cele komórkowe. Aby zapewnić platformę do pomiaru zaangażowania celów komórkowych, opracowaliśmy zarówno testy termiczne SHP2 dla typów dzikich, jak i mutantów. Testy te niezawodnie wykrywają zaangażowanie inhibitorów SHP2 w komórkach do celów. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół tego testu, który stanowi cenne narzędzie do oceny i charakteryzacji inhibitorów SHP2.

Wprowadzenie

Fosforylacja tyrozyny odgrywa ważną rolę w transdukcji sygnału w komórkach 1,2. Ta modyfikacja potranslowana jest katalizowana przez kinazy tyrozyny białkowe (PTK) i odwracana przez tyrozynowe fosforazy białkowe (PTP). Dlatego nieprawidłowa funkcja PTK lub PTP prowadzi do wielu dziedzicznych lub nabytych chorób ludzkich 3,4,5,6. Fosfataza 2 (SHP2) zawierająca domenę Src-homologia 2 (SHP2) to szeroko eksprimowany typ niereceptorowy PTP kodowany przez protoonkogen PTPN11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie hodowli komórkowych i odczynników

  1. Sformułuj butelkę 500 mL podłoża wzrostowego z 10% surowicy bydlęcej płodu, 1 razem antybiotyku/leku przeciwmikotycznego, 20 mM HEPES i 1 mM pirorurianianu sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozmroź komórkowe odczynniki termiczne (odczynnik EA, bufor lizy i podłoże) z mrożonych oryginalnych butelek.
  3. Podawaj odczynniki i bufor w formie 2 mL aliquotów i przechowuj w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Unikaj zamrożenia/rozmrażania dla powtarzalności i używaj tylko takiej ilości odczynnika potrzebnej do procesu testowania.

2. Wzrost i utrzymanie komórek H....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperyment gradientu termicznego dla SHP2-WT dał sigmoidalny profil termiczny komórkowy z wąskim przejściem topnienia, który jest typowy i spójny dla białka fałdowanego (Rysunek 4A). SHP2 składa się z trzech niezależnych dziedzin: dwóch domen SH2 oraz dziedziny katalitycznej (Rysunek 1). W autohamowanej zamkniętej konformacji te domeny samoasociują się; Przejście topnienia zaobserwowane w eksperymencie profilu termicznego prawdopodobnie odzwierciedlało ten stan.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy test zaangażowania celu, który może potwierdzić bezpośrednie wiązanie małych cząsteczek z fosfatazą SHP2 w komórkach. Test pozwala rozróżnić inhibitory o niskiej i wysokiej afinitecie oraz, co ważne, potwierdzać brak mocy allosterycznych inhibitorów typu SHP099 dla mutanta SHP2-E76K onkogennego GOF. Siłą tego zminiaturyzowanego testu jest jego zdolność do integracji z kampanią przesiewową inhibitorów SHP2. Zdolność testu do potwierdzenia wewnątrzkomórkowego wiązania SHP2 przez nieznaną materię chemiczną j.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów z treścią tego artykułu.

Podziękowania

Prace te zostały wsparte przez grant National Institutes of Health 1R21CA195422 (dla L. T.), Epstein Family Foundation Award (dla N. D. P.C.) oraz grant wsparcia NCI Cancer Center P30CA030199. Dodatkowo, projekt ten został w całości lub częściowo finansowany ze środków federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, w ramach umowy Chemical Biology Consortium nr HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, ani wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych czy organizacjach nie sugeruje poparcia przez rząd USA. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością au....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Termocykler wyposażony w gradient z 384 otworamiEppendorf AGX50h
384-dołkowy mikropłytkowy mikropłyt o niskiej martwej objętości kwalifikuje sięBeckman Coulter, Inc.LP-0200
Płytki hodowli komórek 6-dołkowyGreiner Bio-One657 160Sterylny z pokrywką
Antybiotyk przeciwmykotyczny (anty-anti-anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Licznik komórekThermo Fisher ScientificHrabina II FL
Dulbecco Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo akustyczny handler cieczyBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Elektroniczna pipeta wielokanałowaThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Surowica bydła płodowaThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
Bufor HEPESThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
Zestaw startowy InCell PulseEurofins DiscoverX Corp.94-4007Komponenty to bufor EA, bufor lizy oraz podłoże
Czytnik mikropłytTecan Trading AGIskra
Jednokanałowa kanałowa dolina roztworuThermo Fisher ScientificS253012005
Pirorotroczan soduThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Termiczna mikropłytowa impregnacjaAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Odczynniki transfekcyjneTransfekcja PolyplusjetPRIME
Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282
Odczynnik TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605-010
Płytki PCR Twin.tec 384 w czasie rzeczywistymEppendorf AG30132734

Bibliografia

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibitory SHP2kom rkowy test przesuni cia termicznegokom rki HEK293 Teksperyment z gradientem termicznymmiareczkowanie izotermiczneallosteryczny inhibitor SHP099onkogenne mutanty SHP2detekcja chemiluminescencyjna

Powiązane artykuły