Artykuł metodologiczny

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61457

⸱

17 lipca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Streszczenie

Domena Src-homologii 2 (SH2) zawierająca domenę fosfataza 2 (SHP2), kodowana przez protoonkogen PTPN11 , jest kluczowym mediatorem sygnalizacji komórkowej sterowanej kinazą receptorową (RTK), wspierając przeżywalność i proliferację komórek. Ponadto SHP2 jest rekrutowany przez receptory punktów kontrolnych układu odpornościowego, aby hamować aktywację komórek B i T. Nieprawidłowa funkcja SHP2 była powiązana z rozwojem, progresją i przerzutami wielu nowotworów. Rzeczywiście, inhibitory SHP2 na poziomie małych cząsteczek niedawno weszły do badań klinicznych w leczeniu guzów litych z aktywacją szlaku Ras/Raf/ERK, w tym guzów z niektórymi onkogennymi mutacjami Ras. Jednak obecna klasa inhibitorów SHP2 nie jest skuteczna przeciwko onkogennym wariantom SHP2, które często występują w białaczkach, a rozwój specyficznych małych cząsteczek celujących w onkogenny SHP2 jest przedmiotem obecnych badań. Częstym problemem większości kampanii odkrywania leków z udziałem białek cytosolowych, takich jak SHP2, jest to, że główne testy napędzające odkrycia chemiczne to często testy in vitro, które nie raportują zaangażowania związków kandydatów na cele komórkowe. Aby zapewnić platformę do pomiaru zaangażowania celów komórkowych, opracowaliśmy zarówno testy termiczne SHP2 dla typów dzikich, jak i mutantów. Testy te niezawodnie wykrywają zaangażowanie inhibitorów SHP2 w komórkach do celów. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół tego testu, który stanowi cenne narzędzie do oceny i charakteryzacji inhibitorów SHP2.

Wprowadzenie

Fosforylacja tyrozyny odgrywa ważną rolę w transdukcji sygnału w komórkach 1,2. Ta modyfikacja potranslowana jest katalizowana przez kinazy tyrozyny białkowe (PTK) i odwracana przez tyrozynowe fosforazy białkowe (PTP). Dlatego nieprawidłowa funkcja PTK lub PTP prowadzi do wielu dziedzicznych lub nabytych chorób ludzkich 3,4,5,6. Fosfataza 2 (SHP2) zawierająca domenę Src-homologia 2 (SHP2) to szeroko eksprimowany typ niereceptorowy PTP kodowany przez protoonkogen PTPN117 i jest kluczowym regulatorem licznych procesów fizjologicznych związanych z transdukcją sygnału poprzez aktywację szlaków sygnalizacyjnych Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt lub JAK/STAT8. Zazwyczaj aktywność SHP2 jest ściśle regulowana, aby zapobiec nieprawidłowym sygnalizacji. W warunkach podstawowych SHP2 jest autohamowany przez domenę N-końcową SH2, która blokuje dostęp do aktywnego miejsca w obrębie domeny katalitycznej fosfatazy (Rysunek 1A)9,10. Po aktywacji komórki tyrozynowe fosforylowane białka wiążące rekrutują SHP2, powodując jego aktywną konformację, w której miejsce aktywne jest teraz dostępne dla substratów. W wielu nowotworach aktywność SHP2 jest podwyższona. Mutacje somatyczne zyskujące funkcje (GOF) w PTPN11 zostały zidentyfikowane głównie w białaczkach i zapobiegają wiązaniu domeny N-SH2 z domeną fosfatazą, co skutkuje konstytutywnie aktywnym SHP2 (Rysunek 1B)11. Mutacje linii zarodkowej GOF w PTPN11 odpowiadają za ~50% przypadków zespołu Noonana, zaburzenia rozwojowego o zwiększonym ryzyku nowotworów12. W guzach litych, gdzie mutacje PTPN11 są rzadkie, wyższe poziomy fosforylowanych białek wiążących prowadzą do zwiększonej aktywności SHP2 (Rysunek 1C). SHP2 jest również istotny dla sygnalizacji punktów kontrolnych odporności, ponieważ receptory punktów kontrolnych, takie jak BTLA czy PD-1, rekrutują SHP2 do defosforylacji kluczowych cząsteczek sygnalizacji, zapobiegając aktywacji komórek odpornościowych 13,14,15.

Celowanie w PTP za pomocą małych cząsteczek stanowiło wyzwanie, ponieważ aktywne miejsce PTP jest silnie konserwowane i mocno naładowane; Inhibitory skierowane do miejsca aktywnego są często silne, ale wykazują słabą selektywność i biodostępność doustną 16,17,18,19,20,21,22. Rzeczywiście, wiele zgłaszanych inhibitorów SHP2 cierpi na słabą selektywność i brak skuteczności w komórkach23. Ostatnio zgłoszono allosteryczne inhibitory SHP2 o dobrej silności i doskonałej selektywności (np. SHP09924 oraz RMC-455025), które wzbudziły ponowne zainteresowanie inhibitorami SHP2. Związki oparte na SHP099 i RMC-4550 są obecnie w fazie I badań klinicznych dotyczących leczenia guzów litych za pomocą aktywacji szlaku receptorowo-tyrozynowej (RTK)26,27. Choć są przełomowe, związki te są nieskuteczne przeciwko wielu onkogennym mutantom SHP2, które powodują leukemogenezę u znacznej liczby pacjentów z nowotworami krwi(28,29,30). Brak siły związków podobnych do SHP099 wobec onkogennych wariantów SHP2 wynika z ich unikalnego mechanizmu allosterycznego, ponieważ hamują one aktywność SHP2 poprzez wiązanie i stabilizację nieaktywnej, zamkniętej konformacji, która jest zakłócana u mutantów SHP2. Ponadto, na podstawie niedawnego raportu31, mechanizmy adaptacyjnej oporności u pacjentów leczonych inhibitorami podobnymi do SHP099 są całkiem możliwe. W konsekwencji rozwój inhibitorów SHP2 nowej generacji, które celują w jego aktywny, otwarty stan, jest przedmiotem intensywnych badań.

Charakterystyka nowych inhibitorów SHP2 w komórkach jest istotnym elementem procesu optymalizacji ołowiu. Co istotne, udowodnione zaangażowanie inhibitora w cele w warunkach fizjologicznych zapewnia dodatkowy poziom pewności, że zasoby chemii medycznej są efektywnie wykorzystywane na związkach o obiecującej skuteczności komórkowej. W przeszłości opracowano kilka metod oceny wiązania inhibitorów małych cząsteczek z ich celami, głównie dla kinaz białkowych32. Aby opracować test zaangażowania komórek SHP2, zastosowaliśmy test termiczny33. Test, podobny do testu in vitro thermal shift (PTS) dla białek34, monitoruje stabilność termiczną białka docelowego, która zazwyczaj jest zmieniana przez wiązanie małych cząsteczek. Oryginalny test to test o niskiej przepustowości, który wykorzystuje przeciwciała do ilościowego określania docelowych poziomów białek. Alternatywnie wybraliśmy niedawno opisaną odmianę testu termicznego przesunięcia, która wykorzystuje test komplementacji fragmentów enzymu β-galaktozydazy (EFC) (Rysunek 2)35. W tych eksperymentach interesujące białko jest wyrażane w komórkach jako N- lub C-końcowe białko fuzyjne niosące wzmocniony tag ProLabel (ePL, fragment 42 aminokwasów β-galaktozydazy). Następnie komórki są przenoszone na płytki zgodne z PCR z 384 dołkami i inkubowane z interesującymi się związkami. Termocykler służy do nałożenia gradientu temperatury na komórki, których białka denaturują się i agregują wraz ze wzrostem temperatury w zależności od ich stabilności termicznej. Zdolność związku kandydata do wiązania i stabilizacji interesującego białka prowadzi do zwiększonej stabilności termicznej tego białka. Dlatego po analizie komórek, te oznakowane białka ustabilizowane przez związek kandydatski pozostaną w roztworze w wyższych temperaturach niż oznakowane białka komórek inkubowane z kontrolą pojazdu. Akceptor enzymu reporterowego (EA) jest w stanie uzupełniać rozpuszczalne białka oznaczone ePL, co skutkuje wykrywalną aktywnością β-galaktozydazy przy użyciu luminescencyjnego substratu.

Niedawno opracowaliśmy solidny test przesunięcia termicznego komórkowego dla dzikiego typu SHP2 (SHP2-WT) oraz częstego onkogennego wariantu SHP2 (SHP2-E76K) w zminiaturyzowanym formacie36 z 384 dołkami. Przedstawiamy szczegółowy protokół tego testu, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów SHP2 w komórkach i wykazuje wysoki stopień korelacji między mocą inhibitora a danymi termicznymi komórek. Ogólny sposób pracy analizy przedstawiono na Rysunku 3. Nasza platforma wykorzystuje pełnowymiarowe białka fuzyjne ePL-SHP2 z oznakowaniem N-terminalnym. Aby uzyskać odpowiadające im plazmidy ekspresyjne pICP-ePL-N-SHP2-WT oraz pICP-ePL-N-SHP2-E76K, prosimy o zapoznanie się z naszą najnowszą publikacją36. Test ten można wykonać za pomocą gradientu termicznego w celu ustalenia profili termicznych SHP2 oraz określenia temperatur topnienia SHP2 niezależnie od obecności lub braku inhibitora. Po ustaleniu profili termicznych można je również wykonać w warunkach izotermicznych, co umożliwia ocenę dawki i odpowiedzi inhibitora. Oba typy eksperymentów opisano poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie hodowli komórkowych i odczynników

  1. Sformułuj butelkę 500 mL podłoża wzrostowego z 10% surowicy bydlęcej płodu, 1 razem antybiotyku/leku przeciwmikotycznego, 20 mM HEPES i 1 mM pirorurianianu sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozmroź komórkowe odczynniki termiczne (odczynnik EA, bufor lizy i podłoże) z mrożonych oryginalnych butelek.
  3. Podawaj odczynniki i bufor w formie 2 mL aliquotów i przechowuj w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Unikaj zamrożenia/rozmrażania dla powtarzalności i używaj tylko takiej ilości odczynnika potrzebnej do procesu testowania.

2. Wzrost i utrzymanie komórek HEK293T

  1. Uzyskaj komórki HEK293T o niskim przepustku z magazynu kriogenicznego.
  2. Utrzymuj HEK293T komórki w podłożu wzrostu w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  3. Rozdzielaj komórki co 4 dni w proporcji 1:14.
    UWAGA: Dla najlepszej wydajności HEK293T komórki nie mogą przejść dłużej niż 25 razy.

3. HEK293T przygotowanie komórek do transfekcji przejściowej

  1. Odłącz HEK293T ogniwa od płytek 16 mL, używając 3 mL odczynnika odłączającego komórkę.
  2. Rozcieńcz 12 mL podłoża wzrostowego. Zbieraj komórki przez wirowanie w 1 400 x g przez 4 minuty.
  3. Ponownie zawiesij granulek w podłożu do wzrostu o pojemności 10 mL. Zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą trypanowego niebieskiego i licznika komórek.
  4. Płytka 7,0 x 10 5 wykładniczo rosnąca HEK293T komórek na dołek w 6-dołkowej płytce hodowli komórek około 24 godziny przed transfekcją.
    UWAGA: Zarezerwuj jeden dołek na transfekcję każdego plazmidu.
  5. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5%CO2.

4. Transfekcja komórek HEK293T

  1. Z oczyszczonego zapasu plazmidów pICP-ePL-N-SHP2-WT lub pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) rozcieńcz 2 μg DNA plazmidowego do 200 μL buforu transfekcyjnego.
  2. Wiruj przez 10 sekund i wirówkę z 1 400 x g przez 4 minuty.
  3. Dodaj 4 μL odczynnika transfekcyjnego do rozcieńczonego DNA. Wiruj przez 10 sekund i wirówkę z 1 400 x g przez 4 minuty.
  4. Inkubuj w temperaturze 23 °C przez 10 minut.
  5. Usuń płytkę z 6 dołkami zawierającą rosnące HEK293T komórki z inkubatora. Dodaj mieszankę transfekcyjną do przymocowanych komórek na płytce 6-dołkowej. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5%CO2.

5. Przygotowanie płytek testowych

  1. Przygotuj 10 mM roztworów zapasowych w DMSO z związkami do testu.
  2. Roztwory inhibitorów należy wydać do płytki źródłowej o niskiej martwej objętości o pojemności 384 dołków do natychmiastowego użycia.
  3. Określ pożądaną objętość inhibitorów lub nośnika (DMSO) za pomocą płynowego urządzenia do płytek PCR z 384 dołkami w czasie rzeczywistym przy docelowej objętości końcowej poniżej 0,5% DMSO (v/v). Uszczelnij płytę za pomocą uszczelniacza z oczyszczaniem gazów obojętnych.
    UWAGA: W przypadku testów dawka-odpowiedź inhibitora należy odpowiednio uzupełnić DMSO, aby dla każdego stężenia inhibitora były stosowane równe ilości DMSO. Dla najlepszych rezultatów przechowuj talerze w temperaturze 23 °C i używaj w ciągu 24 godzin.

6. Odłączenie i przygotowanie komórek transfekowanych

  1. Preinkubuj podłoże wzrostu i odczynnik odłączający komórkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Usuń transfekowane komórki z inkubatora. Delikatnie zasysaj medium z wgłębień płyty.
    UWAGA: Użyj nowego aspiratora dla każdego dołka zawierającego inny transfekowany plazmid.
  2. Dodaj 0,3 mL odczynnika odłączającego komórkę. Delikatnie kołysz talerzem tam i z powrotem, aby dokładnie zakryć powierzchnię dna talerza. Inkubuj w temperaturze 23 °C przez 2 minuty.
  3. Dodaj 1 ml podłoża do każdego dołu. Delikatnie pipetować podłoże i komórki do studni i przelać do 15 mL rurki wirówki Falcon. Zbieraj komórki przez wirowanie w 1 400 x g przez 4 minuty.
  4. Delikatnie, ale dokładnie odpompuj z podłoża.
    UWAGA: Resztki czerwieni fenolowej w odczynniku odłączającym komórkę mogą zakłócać działanie testu.
  5. Ostrożnie ponownie zawiesnij pellet komórkowy w 2 mL podłoża wzrostowego. Zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą trypanowego niebieskiego i licznika komórek.
    UWAGA: Żywotność komórek powinna wynosić > 90%, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
  6. Rozcieńcz komórki do stężenia 125 komórek/μL. Na przykład dla testu 5 μL to ~625 komórek/μL. Dla optymalnej żywotności utrzymuj komórki w zawiesinie nie dłużej niż 2 godziny.

7. Inkubacja komórek z inhibitorami SHP2

  1. Komórki wydawaj do sterylnej jednokanałowej koryty.
  2. Wirówka 384-dołkowa płyta PCR w czasie rzeczywistym, przygotowana wcześniej przez depozycję inhibitora SHP2 w dawce 2 500 x g przez 5 minut w 23 °C.
  3. Usuń uszczelkę z płyty złożonej. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 125 μL, dodaj 5 μL rozcieńczonych komórek do pożądanych dołków.
  4. Wiruj płytę w 42 x g przez 30 sekund bez pokrywki na płytce. Po jej obrócie przymocuj uszczelkę pokrywy i inkubuj płytkę testową w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 1 godzinę.

8. Przygotowanie chemiluminescencyjnej mieszanki głównej odczynników

  1. Usuń niezbędną ilość odczynników detekcyjnych (odczynnik EA, bufor lizy i podłoże) z magazynu o temperaturze -20 °C po powleknięciu komórek. Odmrażają odczynniki w temperaturze 23 °C.
    UWAGA: Dla wygody transferu przygotuj objętość 1,5 razy całkowitą objętość komórek zdeponowanych na płytce. Nie używaj odczynników ponownie po użyciu.
  2. Przygotuj mieszankę główną odczynników według warunków EA-10, która składa się z ułamków składników i objętościowych w następujący sposób: odczynnik EA (0,17), bufor lizy (0,17), substrat (0,67).
    UWAGA: Proporcje odczynników opierają się na eksperymentach optymalizacyjnych przeprowadzanych zgodnie z instrukcjami dostawcy określonymi.

9. Impuls cieplny gradientu izotermicznego lub profilu termicznego

  1. Zaprogramuj termocykler zdolny do gradientu do dostarczania impulsu cieplnego.
    1. W eksperymentach z gradientem profilu termicznego należy wstępnie zaprogramować termocykler według następujących przykładowych specyfikacji:
    2. Impuls cieplny: 3 minuty pożądanej temperatury topnienia (gradient pionowy lub poziomy +/- 15 °C; przykład 38-68 °C rozłożony na 24 otworach daje przyrosty temperatury o 1,25 °C).
  2. Krok odzyskiwania równowagi: 3 min 20 °C z prędkością rampy = 1 °C/s
    1. Do eksperymentów izotermicznych ustaw protokół następujący:
    2. Impuls cieplny: 3 min 55 °C. Krok odzyskiwania równowagi: 3 min 20 °C z prędkością rampy = 1°C/s
      UWAGA: Aby zwiększyć powtarzalność, ponieważ może być trudno dokładnie umieścić płytę w momencie, gdy termocykler osiągnie pożądaną temperaturę, ustaw program tak, by odliczał 15 sekund przed rozpoczęciem 3-minutowego impulsu. W przypadku termocyklera używanego w tym eksperymencie zobacz Tabelę materiałów, pokrywa jest utrzymywana podczas impulsu cieplnego.

10. Wykrywanie i pomiar lizy

  1. Uzupełnij płytki testowe mieszanką główną do wykrywania lizy, dodając do każdej jamki do analizy za pomocą pipety wielokanałowej dodając równe objętości (5 μL).
  2. Wiruj płytę 42 x g przez 30 sekund. Przechowuj w 23 °C w ciemności przez 30-60 minut.
  3. Mierz chemiluminescencję za pomocą czytnika mikropłytek zdolnego do wykrywania luminescencji w formacie 384-dołkow. Wykonaj pomiar luminescencji z zoptymalizowanym typem płyty i czasem integracji (czas integracji 1000 ms, czas stabilizacji 0 s). Mierz wartości jako liczby/s i wyniki do dalszej analizy.

11. Analiza danych

  1. Analizuj dane luminescencji za pomocą naukowego oprogramowania do grafiki 2D i statystyki.
  2. Generuj profile termiczne poprzez analizę znormalizowanych danych luminescencji (znormalizowanych do sterowania pojazdem) za pomocą regresji nieliniowej i modelu sigmoidalnego Boltzmanna.
    UWAGA: W eksperymentach z profilami termicznymi obliczona wartość V50, czyli temperatura będąca punktem pośrednim między dolną a górną częścią krzywej, definiuje temperaturę topnienia SHP2. W eksperymentach izotermicznych EC50 definiuje stężenie inhibitora, które daje odpowiedź półmaksymalną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperyment gradientu termicznego dla SHP2-WT dał sigmoidalny profil termiczny komórkowy z wąskim przejściem topnienia, który jest typowy i spójny dla białka fałdowanego (Rysunek 4A). SHP2 składa się z trzech niezależnych dziedzin: dwóch domen SH2 oraz dziedziny katalitycznej (Rysunek 1). W autohamowanej zamkniętej konformacji te domeny samoasociują się; Przejście topnienia zaobserwowane w eksperymencie profilu termicznego prawdopodobnie odzwierciedlało ten stan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy test zaangażowania celu, który może potwierdzić bezpośrednie wiązanie małych cząsteczek z fosfatazą SHP2 w komórkach. Test pozwala rozróżnić inhibitory o niskiej i wysokiej afinitecie oraz, co ważne, potwierdzać brak mocy allosterycznych inhibitorów typu SHP099 dla mutanta SHP2-E76K onkogennego GOF. Siłą tego zminiaturyzowanego testu jest jego zdolność do integracji z kampanią przesiewową inhibitorów SHP2. Zdolność testu do potwierdzenia wewnątrzkomórkowego wiązania SHP2 przez nieznaną materię chemiczną j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów z treścią tego artykułu.

Podziękowania

Prace te zostały wsparte przez grant National Institutes of Health 1R21CA195422 (dla L. T.), Epstein Family Foundation Award (dla N. D. P.C.) oraz grant wsparcia NCI Cancer Center P30CA030199. Dodatkowo, projekt ten został w całości lub częściowo finansowany ze środków federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, w ramach umowy Chemical Biology Consortium nr HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, ani wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych czy organizacjach nie sugeruje poparcia przez rząd USA. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Termocykler wyposażony w gradient z 384 otworamiEppendorf AGX50h
384-dołkowy mikropłytkowy mikropłyt o niskiej martwej objętości kwalifikuje sięBeckman Coulter, Inc.LP-0200
Płytki hodowli komórek 6-dołkowyGreiner Bio-One657 160Sterylny z pokrywką
Antybiotyk przeciwmykotyczny (anty-anti-anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Licznik komórekThermo Fisher ScientificHrabina II FL
Dulbecco Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo akustyczny handler cieczyBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Elektroniczna pipeta wielokanałowaThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Surowica bydła płodowaThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
Bufor HEPESThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
Zestaw startowy InCell PulseEurofins DiscoverX Corp.94-4007Komponenty to bufor EA, bufor lizy oraz podłoże
Czytnik mikropłytTecan Trading AGIskra
Jednokanałowa kanałowa dolina roztworuThermo Fisher ScientificS253012005
Pirorotroczan soduThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Termiczna mikropłytowa impregnacjaAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Odczynniki transfekcyjneTransfekcja PolyplusjetPRIME
Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282
Odczynnik TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605-010
Płytki PCR Twin.tec 384 w czasie rzeczywistymEppendorf AG30132734

Bibliografia

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibitory SHP2kom rkowy test przesuni cia termicznegokom rki HEK293 Teksperyment z gradientem termicznymmiareczkowanie izotermiczneallosteryczny inhibitor SHP099onkogenne mutanty SHP2detekcja chemiluminescencyjna

Powiązane artykuły