Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Summary

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Abstract

Przedstawione tutaj metody określają ilościowo niektóre parametry zlewającej się przylegającej monowarstwy komórek z wielu odpowiednio wybarwionych obrazów konfokalnych: adhezja do podłoża jako funkcja liczby i wielkości zrostów ogniskowych oraz kształt komórki, charakteryzowany przez indeks kształtu komórki i inne deskryptory kształtu. Zrosty ogniskowe uwidoczniono za pomocą barwienia paksyliną, a granice komórka-komórka oznaczono połączeniem plakoglobiny i aktyny. Metody hodowli komórkowej i barwienia były standardowe; obrazy reprezentują pojedyncze płaszczyzny ogniskowe; Analizę obrazu przeprowadzono przy użyciu publicznie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Przedstawione protokoły służą do ilościowego określenia liczby i wielkości zrostów ogniskowych oraz różnic w rozkładzie kształtu komórki w monowarstwach, ale można je ponownie wykorzystać do ilościowego określenia wielkości i kształtu dowolnej innej odrębnej struktury komórkowej, która może być barwiona (np. mitochondria lub jądra). Ocena tych parametrów jest ważna w charakterystyce sił dynamicznych w przylegającej warstwie komórkowej, w tym adhezji komórek i kurczliwości aktomiozyny, które wpływają na kształt komórki.

Introduction

Monowarstwy komórek nabłonkowych działają jak zbiorowość, w której adhezja komórka-komórka i komórka-substrat, a także siły skurczu i napięcia reprezentują ważne parametry, a ich właściwa równowaga przyczynia się do ogólnej integralności jednostki1^,2,3. W związku z tym ocena tych parametrów stanowi sposób na ustalenie aktualnego stanu warstwy komórkowej.

Dwie opisane tutaj metody reprezentują dwuwymiarową analizę zlewających się monowarstw przylegających komórek nabłonkowych (w tym przypadku linii komórkowej raka piersi MCF7). Analiza jest wykonywana przy użyciu obrazów konfokalnych (pojedynczych warstw Z) z różnych obszarów na osi Z; obszar podstawowy w pobliżu podłoża do pomiarów adhezji ogniskowej (FA) i obszar wierzchołkowy do pomiarów kształtu komórki. Przedstawione metody są stosunkowo proste i wymagają standardowych technik laboratoryjnych oraz oprogramowania typu open source. Mikroskopia konfokalna jest wystarczająca dla tego protokołu, więc można ją wykonać bez stosowania bardziej specjalistycznej mikroskopii TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). W związku z tym protokół może zostać wdrożony w stosunkowo standardowych warunkach laboratoryjnych. Chociaż dokładność metod jest ograniczona, mogą one rozróżnić podstawowe różnice w adhezji ogniskowej i kształcie komórki.

Obie opisane tutaj metody składają się ze standardowych procedur eksperymentalnych, takich jak hodowla komórek, barwienie immunologiczne, obrazowanie konfokalne i analiza obrazu wykonywane za pomocą ImageJ. Można jednak użyć dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazu z odpowiednimi funkcjami. Przedstawione metody pozwalają śledzić i porównywać zmiany wywołane leczeniem farmakologicznym lub minimalną modyfikacją genetyczną. Uzyskiwanie określonych wartości nie jest zalecane ze względu na ograniczoną precyzję tych metod. Dołączono dwa zautomatyzowane makra, aby ułatwić pomiary wielu obrazów.

Protocol

1. Kroki przygotowawcze

1. Wysiewanie komórek w celu uzyskania zlewających się monowarstw
   1. Przed wysiewem należy pokryć dołki 4-dołkowego szkiełka komorowego kolagenem I (lub innym wybranym składnikiem ECM). W przypadku powlekania kolagenem I należy postępować zgodnie z protokołem handlowym: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html w stężeniu 8 μg/^cm2.
   2. Wysiej 400 000 komórek do jednego dołka w 4-dołkowym szkiełku komorowym.
   3. Hodować komórki przez 24 godziny (lub dłużej, w zależności od eksperymentalnych punktów końcowych) przed barwieniem, w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Ten etap pozwala na dojrzewanie kontaktów komórka-komórka i tworzenie monowarstw.
   4. Użyj optycznego mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić zbieżność (wymagane jest około 90%) i ogólny stan monowarstw. Nie kontynuuj, jeśli komórki unoszą się w powietrzu lub wyglądają na zestresowane.
2. Barwienie immunofluorescencyjne
   UWAGA: Komórki można barwić za pomocą wybranego protokołu. W tym przypadku przeprowadzono immunofluorescencję, jak opisano wcześniej⁴.
   1. W celu analizy adhezji ogniskowej wybarwić komórki wybranym białkiem adhezji ogniskowej (w tym protokole paxilliną). Do analizy kształtu komórki wybarwić wybranym białkiem połączenia komórka-komórka (w tym protokole białkiem desmosomalnym plakoglobiną).
   2. Do zabiegu należy użyć 0,5 ml określonych roztworów, chyba że określono inaczej.
   3. Utrwal komórki w 4% formaldehydzie w PBS przez 30 minut na lodzie.
   4. Inkubować z 0,1 M chlorkiem amonu (w PBS) przez 10 minut w celu wygaszenia autofluorescencji.
   5. Dodać 0,5% Triton X-100 (w PBS) przez 30 minut (przepuszczalność).
   6. Blok z 5% mlekiem (lub 1% BSA) w TBS-T przez 1 godzinę.
   7. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc (anty-paksylina: królik, 1:250, anty-plakoglobina: królik, 1:400)
   8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut (Alexa Fluor 594 koza anty-królik, 1:500, 1:500)
   9. Plama z 300 nM DAPI przez 1-5 min, chroniona przed światłem.
      UWAGA: Opcjonalnie można wykonać dodatkowe barwienie aktyny fluorescencyjnymi koniugatami falloidyny (stężenie 1:400); Faloidynę należy dodawać na tym samym etapie, co przeciwciało drugorzędowe.
3. Obrazowanie konfokalne
   1. Rób zdjęcia pojedynczych warstw Z za pomocą mikroskopu konfokalnego (np. Zeiss LSM800).
      UWAGA: Opcjonalne barwienie aktyną może pomóc w ocenie właściwej płaszczyzny ogniskowej. Barwienie aktyny korowej jest obecne w obszarze wierzchołkowym, podczas gdy włókna naprężeniowe aktyny są obecne w obszarze podstawnym, w pobliżu podłoża, jak pokazano na Rysunek 1.
   2. Obrazowanie zrostu ogniskowego
      1. Wybierz plasterki Z do analizy przyczepności ogniskowej z obszaru podstawowego, blisko podłoża.
      2. Używaj obiektywu z największą dostępną przysłoną numeryczną (preferowany 63x N.A.: 1.4).
         UWAGA: Kształt FA jest bardzo specyficzny i łatwo rozpoznawalny. Dlatego zaleca się rozpoczęcie skanowania od płaszczyzny ogniskowej poniżej komórek, a następnie powolne skanowanie w ich kierunku, aż FA będą wyraźnie widoczne. Analiza obrazu będzie dokładniejsza z mniejszych pól widzenia, które są zwykle bardziej jednolite, ale oznacza to, że mniej komórek zostanie obliczonych w jednym polu widzenia.
   3. Obrazowanie kontaktów komórka-komórka
      1. Użyj obiektywu 40x lub 63x.
      2. Wybierz kanały do barwienia jądrowego i preferowanego barwienia białka połączenia.
      3. Wybierz plasterki Z do analizy kształtu komórki z obszaru wierzchołkowego monowarstw.
      4. Rób zdjęcia dla co najmniej 3 różnych pól widzenia (200-400 komórek).

2. Analiza obrazu

UWAGA: Dostarczone makra działają optymalnie na ImageJ w wersji 1.50f lub nowszej. Służy tylko do kwantyfikacji obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu i bez niedosyconych lub przesyconych pikseli. Opisane metody obejmują kroki wymagające ręcznej regulacji parametrów. W związku z tym zalecana jest ślepa analiza/ślepy eksperyment. Do szyfrowania nazw plików graficznych można użyć wtyczek ImageJ, takich jak "Blind Analysis Tool" (dostępne pod adresem: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools).

1. Analiza przyczepności ogniskowej
   UWAGA: Zalecanymi plikami wejściowymi dla następujących metod są: obrazy FA reprezentowane w 8-bitowej skali szarości zapisane w .tiff formacie.
   1. Otwórz obraz za pomocą ImageJ.
   2. Ustawianie skali obrazu w pikselach (punkt menu Analizuj | Ustaw skalę; Usuń skalę i zaznacz opcję Globalne).
   3. Uwzględnij nazwę pliku i obszar zwrotu z inwestycji w opcjach pomiaru (Analizuj | Ustaw wymiary...); Sprawdź opcje Obszar i Wyświetl etykietę.
   4. Odejmowanie tła (punkt menu Proces | Odejmij tło; ustaw parametr Promień toczącej się kuli na 50 pikseli; sprawdź opcję Paraboloidy przesuwnej). W przypadku pseudokolorowych obrazów RGB: podziel kanały RGB, pozostaw kanał z otwartymi FA, zamknij pozostałe kanały (Obraz | Kolor | Podział kanałów).
   5. Określ obszar najmniejszego obszaru zainteresowania (ROI). Korzystając z zaznaczenia odręcznego lub wielokątnego, obrysuj najmniejszą pojedynczą przyczepność ogniskową i zmierz jej powierzchnię (Analizuj | Środek). Powtórz ten krok dla różnych ROI (FA) z kilku losowo wybranych obrazów (w sumie 20 ROI). Oblicz i zapisz średnią uzyskanych wyników.
      UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko wtedy, gdy dany zestaw obrazów jest analizowany po raz pierwszy (określona linia komórkowa, szkiełka powlekające z określonymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, różne warunki hodowli).
   6. Przekonwertuj obraz na binarny, korzystając z jednej z następujących metod:
      1. Ustawianie progu globalnego (punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg; zaznacz opcje Domyślne, Czarno-białe i Ciemne tło, dostosuj próg ręcznie lub ustaw go automatycznie).
      2. Ustawianie progu lokalnego (punkt menu Obraz | Dostosuj | Automatyczny próg lokalny...; ustaw Metodę na Phansalkar i zaznacz opcję Białe obiekty na czarnym tle. Następnie odwróć obraz (Edycja | Odwrócić).
   7. Zmierz liczbę i obszar ROI. Wybierz pozycję Analizuj | Analizuj cząstki; sprawdź Jednostki pikseli, Wyświetl wyniki, Wyczyść wyniki i Podsumowanie opcje, ustaw parametr Rozmiar, jako dolną granicę użyj średniej najmniejszych ROI z kroku 2.1.5. Górną granicę można ustawić na 25% typowego obszaru komórki.
   8. Przenieś dane (w tym nazwę obrazu, liczbę FA, całkowitą i średnią powierzchnię FA; odpowiednio Wycinek, Liczba, Całkowita powierzchnia, Średni rozmiar) z okna Podsumowanie do wybranego programu do zarządzania danymi.
   9. Określ liczbę komórek na obrazie, licząc jądra barwione DAPI. Liczenie można wykonać ręcznie (Wtyczki | Analizowanie | Cell Counter) lub jak w dostępnych protokołach takich jak: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. Alternatywnie, aby ułatwić zliczanie FA, należy użyć dołączonego makra ImageJ (FAs.ijm).
       1. Przenieś plik .ijm z makrem do folderu wtyczek lub makr znajdującego się w folderach plików źródłowych ImageJ.
       2. Określ obszar o najmniejszym ROI zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.
       3. Otwórz plik makra (Wtyczki | Makra | Edycja...).
       4. Przed uruchomieniem makra ustaw wartość trzech zmiennych: wypełnij wartość area_of_the_smallest_region_of_interest liczbą uzyskaną w kroku 2.1.4. Ustaw wartość threshold_type na ręczną lub automatyczną.
       5. Zapisz zmiany (makro powinno być gotowe do użycia).
       6. Wywołaj makro z panelu ImageJ lub utwórz do niego skrót. Makro rozpoczyna się od standardowego okna dialogowego otwierania. Wybierz obraz do przetworzenia.
          UWAGA: W przypadku ręcznej regulacji progu wymagane będzie ręczne potwierdzenie wartości progowej (unikaj akceptowania zmian za pomocą przycisku Zastosuj w oknie dialogowym Próg, zamiast tego użyj niestandardowego okna dialogowego Wymagane działanie). Wyniki uzyskane podczas pracy z makrem są takie same, jak te opisane w kroku 2.1.8 (zawartym w oknie dialogowym Podsumowanie). Dodatkowo, w przypadku ręcznej regulacji progu, w oknie dialogowym Log wyświetlany jest Dolny Poziom Próg, ponieważ wartość ta pozwala na odtworzenie uzyskanych wyników w przyszłości, jeśli zajdzie taka potrzeba. Rysunki uzupełniające S1 i S2 zostały dołączone jako zestaw danych treningowych dla makra FAs.ijm.
2. Analiza kształtu komórki
   1. Ręcznie
      1. Otwórz obraz w ImageJ lub innym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu z podobnym zestawem funkcji (dalsze instrukcje dotyczą ImageJ). Wybierz parametry, które mają być mierzone, wybierając z menu Analiza | Ustaw Miary i zaznaczanie Deskryptory kształtu w wyświetlonym polu.
      2. Ręcznie wyznacz granice komórek, oznaczone wybranymi białkami połączeniowymi, za pomocą ikony wyboru odręcznego. Wybrane parametry są obliczane automatycznie dla każdej komórki. Zapisz wyniki po obrysowaniu każdej komórki, klikając przycisk Edytuj | Selekcja | Dodaj do menedżera. Należy liczyć tylko kompletne, całkowicie widoczne komórki z nieprzerwanymi obramowaniami.
      3. Gdy wszystkie komórki w polu widzenia zostaną obrysowane, dokonaj pomiaru, zaznaczając wszystkie liczby pojawiające się w lewym polu Menedżera ROI (odpowiadające komórkom) i klikając Zmierz Wyniki pojawią się w polu Wyniki i można je przenieść do wybranego arkusza kalkulacyjnego.
   2. Zautomatyzowany
      UWAGA: Aby ułatwić kwantyfikację deskryptorów kształtu komórki (CSI, proporcje, zaokrąglenie, solidność) przygotowano makro ImageJ i dołączono je do tego artykułu (CSI.ijm). Makro jest głównie oparte na wtyczce ImageJ o nazwie MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. Makro wykonuje następujące kroki: 1) Rozszerzenie każdej krawędzi obrazu o 10 czarnych pikseli [MorpholibJ]; 2) Rundy dylatacji i nadżerek - filtr morfologiczny [MorpholibJ]; 3) Generowanie binarnego obrazu granic komórek poprzez segmentację morfologiczną [MorpholibJ]; 4) Dylatacja granic komórkowych; 5) Odwrócenie wartości pikseli; 6) Generowanie selekcji oraz pomiar powierzchni i obwodu komórek na obrazie; i 7) Zapisywanie obrazu z obrysowanymi komórkami i wyborami ROI ImageJ do nowego pliku.
      1. Przenieś plik .ijm z makrem do folderu wtyczek lub makr znajdującego się w folderach plików źródłowych ImageJ. Wywołaj makro z panelu ImageJ lub utwórz do niego skrót.
      2. Przed kwantyfikacją nowego zestawu danych należy określić wartości najmniejszych i największych obszarów zainteresowania. Obrysuj (zaznaczanie odręczne lub wielokątne) kilka (3-10) przykładów najmniejszych i największych komórek na obrazie, a następnie zmierz ich powierzchnię (Analizuj | Środek).
      3. Alternatywnie uruchom makro z ustawieniami domyślnymi (dolny limit rozmiaru jest ustawiony na 0, a górny limit jest ustawiony na nieskończoność), poczekaj na zakończenie makra i wybierz opcję Ustaw granice rozmiaru komórki. Zmierz obszar najmniejszych i największych komórek, klikając ich etykietę, a następnie naciśnij Zmierz w Menedżerze ROI ImageJ. Ustaw wartość zmiennych the_smallest_cell i the_biggest_cell. Zapisz zmiany, zamknij wszystkie okna dialogowe makr i ponownie uruchom makro.
         UWAGA: Makro może być używane bez ustawiania granic rozmiaru ROI, ale nie jest to zalecane, ponieważ znacznie zwiększa szansę na pomiar nieodpowiednich fragmentów komórek lub klastrów komórek.
      4. Uruchom makro za pomocą standardowego okna dialogowego Otwórz. Wybierz obraz do przetworzenia (skala szarości).
      5. Przeanalizuj wyniki. Dane wyjściowe dostarczane przez makro składają się z: tabeli wyników (etykieta komórki, etykieta obrazu, obszar komórki [pixels²], obwód komórki [pixels²], okrągłość [CSI], współczynnik proporcji, zaokrąglenie, solidność), obraz z obrysowanymi komórkami i listą wyborów ROI (która zostanie również zapisana w nowym pliku w podfolderze Wyniki). Tabela wyników zostanie automatycznie skopiowana do schowka użytkownika.
         UWAGA: Rysunki uzupełniające S3 i S4 zostały dołączone jako zestaw danych treningowych dla makra CSI.ijm.

3. Kwantyfikacja

1. Kwantyfikacja FA
   1. Obliczyć średnią liczbę FA i średnią wielkość FA na komórkę/jądra.
      UWAGA: W przypadku niektórych linii komórkowych możliwe jest osobne liczenie FA w odrębnych komórkach. W przypadku linii komórkowych, które mają silne kontakty komórka-komórka i rosną jako monowarstwy, takie jak MCF7, liczbę i rozmiar FA na komórkę można obliczyć, dzieląc wartości uzyskane z liczenia FA przez liczbę jąder na całym obrazie.
   2. Ocena istotności statystycznej potencjalnych różnic między populacjami (grupami eksperymentalnymi). W zależności od rozkładu i wariancji danych, do porównania dwóch różnych grup należy użyć testu t-Studenta (rozkład normalny) lub nieparametrycznego testu U (Mann-Whitney). Do porównania wielu grup należy użyć jednoczynnikowej ANOVA lub Kruskala-Wallisa w połączeniu z odpowiednimi testami post-hoc.
2. Analiza kształtu komórki
   1. Obliczanie deskryptorów kształtu
      1. Analiza ręczna: Oblicz indeks kształtu komórki (CSI, zwany również okrągłością lub kształtem komórki) w wybranym arkuszu kalkulacyjnym dla każdej mierzonej komórki z odpowiedniego obszaru i obwodu, korzystając ze wzoru:
         
         UWAGA: CSI przyjmuje wartości z zakresu od 1 (kołowy) do 0 (wydłużony). Przykłady różnych kształtów komórek (o tym samym obszarze) i odpowiadających im CSI przedstawiono w Rysunek 2. W analizie automatycznej wartości deskryptorów kształtu (wymienionych i zdefiniowanych poniżej) są obliczane automatycznie i pojawiają się w polu wyniku:
         (1) CSI = 4π*obszar/(obwód)2
         (2) AR = oś główna/oś pomocnicza
         (3) Okrągłość = 4*obszar/π*(oś główna)²
         (4) Solidność = powierzchnia/powierzchnia wypukła
   2. Histogramy rozkładu kształtu komórki
      1. Wykreśl rozkład kształtu komórki jako histogram cyrkularności (CSI). Klasyfikuj komórki według ich wartości CSI (obliczonej dla minimum 200–400 komórek) do jednego z dziesięciu jednolitych przedziałów (zakres: 0-1, szerokość kosza: 0,1). Na histogramie wyświetlana jest liczba komórek w każdej kategorii.
         UWAGA: Histogram przedstawiający rozkład kształtu typowej warstwy komórek MCF7 pokazuje pik około 0,7-0,8 CSI. Jeśli kształt komórek jest zniekształcony przez jakiś czynnik (na przykład leczenie paklitakselem, które powoduje zatrzymanie fazy G2/M, a w konsekwencji więcej komórek jest okrągłych), powinno to zostać odzwierciedlone na histogramie.
   3. Wykresy rozkładu skumulowanego
      1. Porównaj skumulowane rozkłady CSI dla każdej linii komórkowej, ponieważ jest to najlepszy sposób oceny statystycznie istotnych różnic w zmianach kształtu komórki (lub wszelkich innych zmian w dystrybucji). Na przykład można go zastosować do śledzenia zmieniającego się rozkładu FA.
      2. Oblicz funkcję rozkładu skumulowanego (CDF), aby porównać rozkłady. CDF przypisuje dla danej wartości CSI (wykreślonej na osi X) procent (lub liczbę względną), dla której wszystkie wartości są mniejsze lub równe tej wartości CSI (wykreślonej na osi Y). W związku z tym, gdy wartość CSI rośnie, procent zestawu wartości, które są mniejsze lub równe tej wartości, również rośnie. CDF można obliczyć za pomocą wybranego oprogramowania statystycznego lub ręcznie.
      3. Do analizy statystycznej użyj testu nieparametrycznego Kołgomorowa-Smirnowa.

Results

Analiza przyczepności ogniskowej
Wcześniej wykazano, że knockdown genu HAX1 wpływa na zrosty ogniskowe⁶. Komórki hodowano na powierzchni pokrytej kolagenem I przez 48 godzin. Obrazy komórek kontrolnych MCF7 i komórek MCF7 z knockdownem HAX1 (HAX1 KD) z trzech niezależnych eksperymentów barwionych ogniskowym białkiem adhezyjnym paxillin uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego (obraz z pojedynczej płaszczyzny ogniskowej / plasterka Z z okolicy pod...

Discussion

Adhezja komórka-komórka i komórka-substrat stanowią nieodłączne atrybuty komórek nabłonkowych i odgrywają kluczową rolę w morfogenezie i embriogenezie tkanek. W tkankach dorosłych prawidłowa regulacja właściwości mechanicznych warstwy komórkowej ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy i zapobiegania reakcjom patologicznym, takim jak progresja guza i przerzuty. Wielkość i liczba zrostów ogniskowych zależy od siły adhezji komórka-substrat, podczas gdy kształt komórki zależy od sił kurczliwych i jest związany ze sta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	kozia anty-króliczka, 1:500
Chlorek amonu	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Kolagen ze skóry cielęcej	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (zapas 1 mg/ml w H2O), kwas nukleinowy barwienie
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glukoza, pirogronian	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Złącze plakoglobina	Sygnalizacja komórkowa	2309S	królik, 1:400
Szafa laminarna klasy 2	Alpina		standardowe wyposażenie
Linia komórkowa oparta na MCF7HAX1KD	Linia komórkowa założona w Narodowym Instytucie Onkologii w Warszawie, opisana w Balcerak i wsp., 2019		MCF7 linia komórkowa zHAX1knockdown
Linia komórkowa MCF7 (KONTROLA)	ATCC	ATCC HTB-22	nabłonek, przylegająca linia komórkowa raka piersi
Mikroskop świetlny Olympus CK2	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	królik, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
koniugatat falloidyny-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (zapas 5 mg / ml w DMSO), znakowanie aktyny
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Podstawa Trizma	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM800	Zeiss