Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Summary

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Abstract

Przedstawione tutaj metody określają ilościowo niektóre parametry zlewającej się przylegającej monowarstwy komórek z wielu odpowiednio wybarwionych obrazów konfokalnych: adhezja do podłoża jako funkcja liczby i wielkości zrostów ogniskowych oraz kształt komórki, charakteryzowany przez indeks kształtu komórki i inne deskryptory kształtu. Zrosty ogniskowe uwidoczniono za pomocą barwienia paksyliną, a granice komórka-komórka oznaczono połączeniem plakoglobiny i aktyny. Metody hodowli komórkowej i barwienia były standardowe; obrazy reprezentują pojedyncze płaszczyzny ogniskowe; Analizę obrazu przeprowadzono przy użyciu publicznie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Przedstawione protokoły służą do ilościowego określenia liczby i wielkości zrostów ogniskowych oraz różnic w rozkładzie kształtu komórki w monowarstwach, ale można je ponownie wykorzystać do ilościowego określenia wielkości i kształtu dowolnej innej odrębnej struktury komórkowej, która może być barwiona (np. mitochondria lub jądra). Ocena tych parametrów jest ważna w charakterystyce sił dynamicznych w przylegającej warstwie komórkowej, w tym adhezji komórek i kurczliwości aktomiozyny, które wpływają na kształt komórki.

Introduction

Monowarstwy komórek nabłonkowych działają jak zbiorowość, w której adhezja komórka-komórka i komórka-substrat, a także siły skurczu i napięcia reprezentują ważne parametry, a ich właściwa równowaga przyczynia się do ogólnej integralności jednostki1^,2,3. W związku z tym ocena tych parametrów stanowi sposób na ustalenie aktualnego stanu warstwy komórkowej.

Dwie opisane tutaj metody reprezentują dwuwymiarową analizę zlewających się monowarstw przylegających komórek nabłonkowych (w tym przypadku linii komórkowej raka piersi MCF7). Analiza jest wykonywa....

Protocol

1. Kroki przygotowawcze

1. Wysiewanie komórek w celu uzyskania zlewających się monowarstw
   1. Przed wysiewem należy pokryć dołki 4-dołkowego szkiełka komorowego kolagenem I (lub innym wybranym składnikiem ECM). W przypadku powlekania kolagenem I należy postępować zgodnie z protokołem handlowym: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html w stężeniu 8 μg/^cm2.
   2. Wysiej 400 000 komórek do jednego dołka w 4-dołkowym szkiełku komorowym.
   3. Hodować komórki przez 24 godziny (lub dłużej, w zależności od eksperymentalnych punktów końcowych) przed barwieniem, w inkubatorze w temp....

Results

Analiza przyczepności ogniskowej
Wcześniej wykazano, że knockdown genu HAX1 wpływa na zrosty ogniskowe⁶. Komórki hodowano na powierzchni pokrytej kolagenem I przez 48 godzin. Obrazy komórek kontrolnych MCF7 i komórek MCF7 z knockdownem HAX1 (HAX1 KD) z trzech niezależnych eksperymentów barwionych ogniskowym białkiem adhezyjnym paxillin uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego (obraz z pojedynczej płaszczyzny ogniskowej / plasterka Z z okolicy pod.......

Discussion

Adhezja komórka-komórka i komórka-substrat stanowią nieodłączne atrybuty komórek nabłonkowych i odgrywają kluczową rolę w morfogenezie i embriogenezie tkanek. W tkankach dorosłych prawidłowa regulacja właściwości mechanicznych warstwy komórkowej ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy i zapobiegania reakcjom patologicznym, takim jak progresja guza i przerzuty. Wielkość i liczba zrostów ogniskowych zależy od siły adhezji komórka-substrat, podczas gdy kształt komórki zależy od sił kurczliwych i jest związany ze sta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	kozia anty-króliczka, 1:500
Chlorek amonu	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Kolagen ze skóry cielęcej	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (zapas 1 mg/ml w H2O), kwas nukleinowy barwienie
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glukoza, pirogronian	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Złącze plakoglobina	Sygnalizacja komórkowa	2309S	królik, 1:400
Szafa laminarna klasy 2	Alpina		standardowe wyposażenie
Linia komórkowa oparta na MCF7HAX1KD	Linia komórkowa założona w Narodowym Instytucie Onkologii w Warszawie, opisana w Balcerak i wsp., 2019		MCF7 linia komórkowa zHAX1knockdown
Linia komórkowa MCF7 (KONTROLA)	ATCC	ATCC HTB-22	nabłonek, przylegająca linia komórkowa raka piersi
Mikroskop świetlny Olympus CK2	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	królik, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
koniugatat falloidyny-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (zapas 5 mg / ml w DMSO), znakowanie aktyny
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Podstawa Trizma	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM800	Zeiss