Artykuł metodologiczny

Podejście oparte na cytometrii przepływowej w celu scharakteryzowania właściwości fagocytarnych ostro izolowanych dorosłych mikrogleju i makrofagów mózgowych in vitro

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

23 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

W tym artykule

Podsumowanie

Ocena właściwości fagocytarnych mikrogleju i makrofagów mózgowych może dostarczyć cennego funkcjonalnego wymiaru do badań nad profilowaniem molekularnym. Opisujemy zwalidowany protokół, który wykorzystuje cytometrię przepływową do szybkiego i wiarygodnego ilościowego oznaczania fagocytozy mikrosfer fluorescencyjnych i włókien beta amyloidu za pomocą ostro izolowanych mikrogleju i makrofagów mózgowych z modeli mysich.

Streszczenie

Mikroglej i makrofagi naciekające ośrodkowy układ nerwowy (OUN), zbiorczo nazywane jednojądrzastymi fagocytami OUN (CNS-MPS), odgrywają kluczową rolę w chorobach neurologicznych, w tym neurodegeneracji i udarze. CNS-MP biorą udział w fagocytarnym usuwaniu patologicznych białek, szczątków i synaps neuronalnych, z których każda ma odrębne szlaki molekularne. Scharakteryzowanie tych właściwości fagocytarnych może zapewnić funkcjonalny odczyt, który uzupełnia profilowanie molekularne mikrogleju przy użyciu tradycyjnej cytometrii przepływowej, transkryptomiki i proteomiki. Profilowanie fagocytarne mikrogleju opierało się na wizualizacji mikroskopowej i hodowlach in vitro mikrogleju noworodków myszy. Pierwsze podejście cierpi z powodu ograniczonego pobierania próbek, podczas gdy drugie podejście z natury słabo odzwierciedla prawdziwy stan in vivo dorosłych OUN-MP. W artykule opisano zoptymalizowane protokoły fenotypu właściwości fagocytarnych ostro izolowanych mysich OUN-MP za pomocą cytometrii przepływowej. CNS-MP są ostro izolowane z mózgu dorosłej myszy za pomocą dysocjacji mechanicznej, a następnie wirowania w gradifikacji gęstości, inkubowane z fluorescencyjnymi mikrosferami lub fluorescencyjnymi włókienkami Aβ, przemywane, a następnie znakowane panelami przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym (CD11b, CD45). Korzystając z tego podejścia, możliwe jest porównanie właściwości fagocytarnych mikrogleju rezydującego w mózgu z makrofagami naciekającymi OUN, a następnie ocena wpływu starzenia się i patologii choroby na te fenotypy fagocytarne. Ta szybka metoda ma również potencjał do funkcjonalnego fenotypowania ostro izolowanych ludzkich OUN-MP z pośmiertnych lub chirurgicznych próbek mózgu. Ponadto specyficzne mechanizmy fagocytozy przez podzbiory OUN-MP można badać poprzez hamowanie wybranych szlaków fagocytarnych.

Wprowadzenie

Wrodzone komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) składają się głównie z mikrogleju i naciekających monocytów/makrofagów, zwanych razem fagocytami jednojądrzastymi OUN (CNS-MPS)1. CNS-MP są zaangażowane w choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD), zaburzenia neurozapalne i udar mózgu2,3,4. CNS-MP, wraz z astrocytami, perycytami i komórkami wyściółki, mają funkcje fagocytarne5,6. W stanie homeostatycznym OUN-MP są zaangażowane w ciągły nadzór nad lokalnym mikrośrodowiskiem, wraz z fagocytarnym usuwaniem resztek komórek apoptotycznych i białek oraz przycinaniem synaptycznym w celu przebudowy połączeń neuronalnych7,8,9,10. W stanach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, OUN-MP przyjmują odrębne molekularne i funkcjonalne fenotypy związane z chorobą, które mogą odgrywać patologiczne role, w tym usuwanie zagregowanego beta-amyloidu (Aβ) i elementów neuronalnych, a także uwalnianie cytokin zapalnych i czynników, co skutkuje złożonymi rolami prozapalnymi, szkodliwymi i przeciwzapalnymi, ochronnymi11,12,13,14. Fagocytoza makrocząstek, szczątków komórkowych, białek i innych zakaźnych cząstek przez CNS-MP jest wywoływana przez odrębne receptory wyrażane na ich powierzchni9. Zakłócenie tych szlaków fagocytarnych może prowadzić do wadliwego klirensu i postępującej akumulacji Aβ, co ostatecznie prowadzi do postępującego uszkodzenia neuronów w AD4,9. Podczas gdy postępy w profilowaniu molekularnym OUN-MP przy użyciu podejść transkryptomicznych i proteomicznych dostarczyły bezcennych informacji na temat heterogeniczności molekularnej w obrębie OUN-MP w chorobach neurologicznych15,16, obecnie brakuje funkcjonalnej charakterystyki właściwości fagocytarnych OUN-MP i ich podzbiorów. Funkcjonalna charakterystyka właściwości fagocytarnych OUN-MP może uzupełniać strategie profilowania molekularnego, ułatwiać lepsze funkcjonalne fenotypowanie i pomagać w ocenie skuteczności terapii, które mogą skorygować wadliwą fagocytozę w modelach choroby17.

Tradycyjne testy fagocytozy dla CNS-MP obejmują inkubację pierwotnego mikrogleju wraz z substratami fluorescencyjnymi, takimi jak Aβ lub cząsteczki lateksu/polistyrenu. Fagocytoza jest następnie badana jako funkcja wychwytu substratu fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej18,19,20. Powszechnie wiadomo, że CNS-MP, gdy są utrzymywane w długich kulturach, mogą radykalnie zmienić swoją morfologię i profile transkrypcyjne21,22. Utrudnia to badanie właściwości fagocytarnych OUN-MP w ich reprezentatywnym stanie w OUN. Test funkcjonalnej cytometrii przepływowej do profilowania ostro izolowanych żywych OUN-MP może zapewnić szybką ocenę właściwości fagocytarnych i może pobrać próbki znacznie większej puli CNS-MP niż podejścia mikroskopowe9,23. Ponadto cytometria przepływowa eliminuje potrzebę utrzymywania OUN-MP w hodowli, a także stanowi platformę do badania właściwości fagocytotycznych w różnych subpopulacjach OUN-MP. W tym manuskrypcie opisano zoptymalizowane protokoły fenotypu właściwości fagocytarnych ostro izolowanych mysich OUN-MP za pomocą cytometrii przepływowej. Adaptacja testów fagocytozy za pomocą cytometrii przepływowej umożliwia szybkie multipleksowanie fenotypu fagocytarnego OUN-MP w połączeniu z fenotypowaniem immunologicznym, zapewniając w ten sposób wgląd w niejednorodność właściwości fagocytarnych w obrębie OUN-MP w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na myszach zostały przeprowadzone po uzyskaniu zgody od Emory University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i w ścisłej zgodności z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health.

1. Przygotowanie w dniu izolacji

  1. Przygotuj wiadro na lód, aby wszystkie odczynniki, i zawiesiny komórek były zimne przez cały czas trwania procedury izolacji.
  2. Umieścić butelkę z 1× soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (co najmniej 1 l) w temperaturze 4 °C na 30 minut do 1 godziny przed perfuzją i przechowywać 1× PBS na lodzie podczas procedury perfuzji i izolacji.
  3. Przygotować stężenie robocze medium o gradiencie gęstości (określane jako 35% SIP, patrz Tabela Materiałów).
  4. Oznacz wszystkie probówki do cytometrii stożkowej i przepływowej używane w eksperymencie przed izolacją komórek, aby uniknąć opóźnień w czasie przetwarzania. Dodatkowo zbierz wszystkie inne materiały niezbędne do izolacji przed perfuzją, takie jak sitka do komórek 40 μm, strzykawki i igły.

2. Ostra izolacja mikrogleju dorosłych myszy

  1. Znieczulij dorosłą mysz, umieszczając ją w szklanej komorze indukcyjnej z izofluranem (5 ml), aż mysz przestanie oddychać i nie będzie reagować na szczypanie łapy tylnych kończyn.
  2. Użyj igły 26 G i strzykawki o pojemności 10 ml, aby wykonać perfuzję serca z 30 ml lodowatego 1× PBS, aż do momentu, gdy nie będzie widać krwi.
  3. Odetnij głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi. Użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę, odsłaniając czaszkę. Usuń czaszkę bez uszkadzania tkanki mózgowej zgodnie z opisem24. Natychmiast usuń mózg i przenieś go do sterylnego sitka o wielkości 40 μm umieszczonego na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Użyj tylnej strony tłoka strzykawki o pojemności 3 ml, aby przepchnąć mózg przez sitko i mechanicznie zdysocjować całą tkankę mózgową. Podczas dysocjacji należy przemyć sitko i tłok z przerwami 2 ml lodowatego 1× PBS za każdym razem, aby upewnić się, że cała tkanka przechodzi przez sitko.
  5. Zeskrobać spód sitka komórkowego za pomocą tłoka, aby zebrać resztki zawiesiny do stożka. Dokładnie przepłukać sitko komórkowe lodowatym 1× PBS i wlać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: W przypadku przetwarzania wielu zwierząt w serii, zawiesiny komórek należy umieścić na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.
  6. Dodać lodowato zimny 1× PBS, aby doprowadzić objętość zawiesiny komórek do 30 ml i odwirować przy 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odlać sklarowany osad bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 6 ml 35% SIP za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę komórek + 35% mieszaninę SIP do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 × g przez 25 minut w temperaturze 15 °C bez hamulca.
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków podczas ponownego zawieszania. Nadmierne pęcherzyki mogą być szkodliwe dla wydajności komórek.
  8. Ostrożnie wyjmij stożkową probówkę o pojemności 15 ml z wirówki, nie naruszając warstw, i odessać górną pływającą warstwę mieliny.
  9. Przenieść zawiesinę komórek + 35% mieszaninę SIP za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml lodowatego 1× PBS i odwirować w temperaturze 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odlać supernatant, pozostawiając osad komórkowy wraz z 500\u2012800 μl 1× PBS.
  10. Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety p1000 i przenieść do probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Dodać 2 ml lodowatego 1× PBS do probówki z okrągłym dnem i odwirować przy 1 400 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Szybko odleć supernatant, pozostawiając osad komórek zawierający CNS-MP w około 100 μl 1× PBS (Rysunek 1).

3. Przygotowanie fagocytozy i barwienie cytometryczne przepływowe

  1. Przenieś 20 μl (≈200 000 komórek) ponownie zawieszonych CNS-MP do świeżej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i dodaj 80 μl lodowatego 1× PBS. Nie dodawaj do tej probówki żadnych substratów fluorescencyjnych ani przeciwciał cytometrii przepływowej. Komórki te służą jako kontrola negatywna do określania fluorescencji tła OUN-MP do analiz cytometrii przepływowej.
  2. Aby ustalić żywotność wyizolowanych OUN-MP, należy użyć żywych/martwych barwników na bazie amin (np. Fixable Blue UV).
    1. Zawiesić pozostałą część osadu komórkowego w 500 μl 1× PBS i dodać 1 μl odtworzonego barwnika do każdej probówki z próbką, z wyjątkiem kontroli ujemnej.
    2. Delikatnie zwirować, przykryć probówki folią i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie dodaj 1 ml 1× PBS do każdej probówki i delikatnie odwiruj.
    3. Odwirować komórki w temperaturze 1 400 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Szybko odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1× PBS.
      UWAGA: Barwniki na bazie amin będą wiązać się z zewnątrzkomórkowymi włókienkami Aβ, zakłócając wyniki fagocytozy. Inne żywe/martwe wskaźniki mogą zakłócać fluorescencję włókienek/mikrosfer Aβ. Dlatego zaleca się stosowanie wskaźnika żywego/martwego tylko we wstępnych eksperymentach w celu ustalenia żywotności izolowanych OUN-MP.
  3. Dokładnie zwirować probówkę zawierającą mikrosfery polistyrenu PE i dodać 2 μl (≈200 mikrosfer/komórkę) do 100 μl zawiesiny komórek w rurkach przepływowych, z wyjątkiem kontroli ujemnej. Delikatnie zwirować każdą probówkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie substratu z komórkami i umieścić probówki z okrągłym dnem w sterylnym, wilgotnym inkubatorze na 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    1. Delikatnie wirować i inkubować probówkę kontroli ujemnej, aby zapewnić podobne warunki eksperymentalne między próbkami dodatnimi i ujemnymi.
      UWAGA: Jeśli używasz włókienek Aβ zamiast mikrosfer PE, przygotuj fluorescencyjne fibryle HiLyte488 Aβ zgodnie z wcześniejszym opisem9. Końcowe stężenie włókienek Aβ wynosi 200 μM, które następnie rozcieńcza się w celu przygotowania świeżego 20 μM zapasu w PBS fluorescencyjnych monomerów Aβ. Dodać 12,5 μl podstawowych monomerów Aβ o wielkości 20 μM do każdej probówki zawierającej izolowane komórki.
  4. Wyjmij komórki z inkubatora i dodaj 1 ml 1× PBS do każdej probówki i delikatnie odwiruj. Odwirować komórki w temperaturze 1 400 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i szybko odlać supernatant. Powtórzyć płukanie 1 ml 1× PBS, odwirować przy 1 400 × g przez 2 minuty, odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 100 μl 1× PBS.
    UWAGA: Po każdym wirowaniu ważne jest, aby utrzymywać komórki na lodzie, aby zahamować ciągły wychwyt fagocytarny.
  5. Wirować przeciwciała cytometrii przepływowej i odwirowywać je w mikrowirówce przez 10 sekund. Do każdej probówki zawiesiny komórek dodać po 1 μl CD11b-APC/Cy7 i CD45-PE/Cy7 do testu fagocytozy Aβ lub CD45-FITC do fagocytozy mikrosfery PE. Delikatnie zwirować każdą probówkę i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Użytkownicy mogą również dołączyć oddzielną probówkę zawierającą silne komórki fagocytarne, takie jak hodowany mikroglej BV2 lub makrofagi otrzewnowe jako kontrolę pozytywną i traktować je mikrosferami PE i przeciwciałami cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej. Dane z tej próbki można wykorzystać do zdefiniowania kontroli pozytywnej oznaczającej prawdziwą fagocytozę we wstępnych eksperymentach.
  6. Podczas gdy komórki są w inkubacji, ustaw probówki kompensacyjne za pomocą czterech okrągłych probówek przepływowych o pojemności 5 ml. Dokładnie zmieszaj kulki kompensacyjne i dodaj 1 kroplę do każdej probówki. Dodaj 1 μl CD11b-APC/Cy7 do pierwszej probówki i CD45-FITC do drugiej probówki. Dodaj 1 μl polistyrenu PE do trzeciej probówki i trzymaj niepoplamione koraliki kompensacyjne w czwartej probówce. Użyj tej czwartej probówki jako kontroli ujemnej, aby ustawić panel kompensacyjny na cytometrze przepływowym.
    UWAGA: Gdy fibryle Aβ są używane do badania fagocytozy, dodaj CD45-PECy7 do drugiej probówki zamiast CD45-FITC. Dodać 1 μl oddzielnego przeciwciała cytometrii przepływowej znakowanego FITC lub przeciwciała drugorzędowego FITC (dowolnego gatunku) do trzeciej probówki kompensacyjnej. Jest to ważne, ponieważ kulki nie mogą wiązać się z włókienkami Aβ i zostaną zmyte po umyciu rurek kompensacyjnych.
  7. Pozwól kulkom kompensacyjnym inkubować się z odpowiednimi przeciwciałami przez co najmniej 10 minut. Po inkubacji dodać 1 ml 1× PBS do każdej probówki, odwirować przy 1 400 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i szybko odlać supernatant. Umieść probówki kompensacyjne na lodzie i przykryj je folią do czasu cytometrii przepływowej.
  8. Po inkubacji z przeciwciałami cytometrii przepływowej przemyć barwione komórki 1 ml 1× PBS. Delikatnie zwirować i odwirować komórki w temperaturze 1 400 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Szybko odlać sklarowany nad osadem i powtórzyć płukanie z 1 ml 1× PBS. Po odwirowaniu odlać sklarowany nad osadem i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1× PBS.
  9. Umieść probówki z próbkami na lodzie i przykryj je folią aluminiową do cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Użyj 1× PBS (pH 7,0) bez Ca2 + / Mg2 + jako bufora przepływu przez cały czas trwania eksperymentu. Upewnij się, że surowica bydlęca płodu (FBS) została wykluczona z buforu przepływowego, aby uniknąć możliwej aktywacji mikrogleju.

4. Cytometria przepływowa i analiza

  1. Konfiguracja i kompensacja przyrządu
    UWAGA: Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie przeprowadzono na cytometrze przepływowym z laserami ultrafioletowymi, fioletowymi, niebieskimi, żółto-zielonymi i czerwonymi. Eksperyment ten można również dostosować do trójlaserowych cytometrów przepływowych z laserami tylko niebieskimi, żółto-zielonymi i czerwonymi. Użytkownicy muszą przejść formalne szkolenie przed rozpoczęciem obsługi instrumentu.
    1. Napełnij zbiornik buforowy z osłoną przepływową i włącz cytometr. "Zalej" cytometr rurką przepływową o pojemności 5 ml z okrągłym dnem zawierającą ddH2O. Zaloguj się do oprogramowania analitycznego na komputerze podłączonym do cytometru przepływowego. Utwórz "eksperyment" i wybierz FSC, SSC, FITC, PECy7 i APC-Cy7 jako parametry. W przypadku korzystania z mikrosfer PE wybierz PE zamiast PECy7 w panelu parametrów.
    2. Utwórz odpowiedni panel wynagrodzeń.
      UWAGA: W naszych eksperymentach zazwyczaj napięcia FSC/SSC dla koralików kompensacyjnych wynoszą około 350/280, podczas gdy napięcia FSC/SSC dla CNS-MP wynoszą około 320/260. Wartości te mogą się różnić między dowolnymi dwoma różnymi cytometrami i muszą zostać skalibrowane przed właściwym eksperymentem.
    3. Rozpuścić każdą probówkę kompensacyjną i zawiesinę komórek w 500 μl 1× PBS, krótko odwirować i umieścić na lodzie. Uruchom rurkę kontroli ujemnej/niebarwionej kulki, aby ustawić odpowiednie napięcia, tak aby pik na każdym histogramie fluoroforu był poniżej 102. Uruchom pozostałe jednokolorowe rurki kompensacyjne, aby zidentyfikować ich wyraźne dodatnie piki.
      UWAGA: Powinna istnieć co najmniej połowa logarytmu (podstawa 10) różnicy między dodatnimi i ujemnymi pikami każdego fluoroforu.
    4. Zarejestruj 5000 zdarzeń z każdej rury kompensacyjnej, aby umożliwić komputerowi automatyczne obliczenie konfiguracji kompensacji. Połącz konfigurację kompensacji z bieżącym eksperymentem25.
    5. Utwórz nową "probówkę" pod zakładką próbki. Delikatnie zawiruj i uruchom probówkę kontroli ujemnej zawierającą niebarwione CNS-MP. Dostosuj napięcia rozproszenia przedniego i bocznego, aby uchwycić interesującą populację. Nagrywaj wydarzenia i bramkę podrzędną na żywo CNS-MP, jak wspomniano poniżej.
    6. Przechwytuj i rejestruj zdarzenia ze wszystkich kolejnych lamp jako osobne pliki, zachowując spójność parametrów i napięć. Delikatnie wymieszaj każdą probówkę przed uruchomieniem jej na cytometrze przepływowym.
  2. Strategia bramkowania i pomiar fagocytozy
    1. Narysuj początkową bramę jednojądrową, aby przechwycić wszystkie CNS-MP. Te żywe komórki jednojądrzaste muszą być bramkowane na poniższym wykresie, aby obejmowały tylko pojedyncze komórki, z wyłączeniem kupletów i trojaczków.
    2. Rzutuj bramkowaną pojedynczą, żywą populację CNS-MP na kolejnym wykresie przedstawiającym fluorofory CD11b i CD45.
      UWAGA: Mikroglej rezydujący w mózgu jest zazwyczajpośredni CD11b + CD45, podczas gdy naciekające makrofagi mająwysoki poziom CD11b + CD45. Dodatkowe markery, takie jak Ly6c, mogą być włączone do panelu, aby jeszcze pewniej oddzielić monocyty zapalne (wysoki poziom Ly6c i wysoki CD45) od mikrogleju (Ly6cniski poziom pośredni CD45).
    3. Zastosuj odpowiednie bramki do dalszego badania fagocytozy w odpowiednich populacjach, jak pokazano na Rysunek 2F.
      UWAGA: Fagocytoza w OUN-MP jest mierzona jako funkcja ich wychwytu fluorescencji Hilyte488/Alexa488 (Aβ) lub PE (mikrosfera). Wyraźny dodatni pik na odpowiednich histogramach wskazuje, że OUN-MP fagocytozowały substrat. Ilość fagocytozowanego materiału jest wprost proporcjonalna do intensywności fluorescencji. W związku z tym obecność wielu pików musi być interpretowana jako wyższa fagocytoza. Można je następnie potwierdzić za pomocą immunohistochemii.
    4. Po zarejestrowaniu wszystkich probówek z próbkami na cytometrze przepływowym, wyeksportuj pliki danych w formacie .fcs do dalszej analizy.
  3. Statystyczna analiza danych
    1. Używaj dowolnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej wraz z arkuszami kalkulacyjnymi i oprogramowaniem do analizy statystycznej do wszystkich analiz danych.
    2. Dodaj pliki .fcs do oprogramowania analitycznego i kliknij dwukrotnie pierwszy plik. Wykres przedstawiający wszystkie nagrane
      pojawią się wydarzenia. Postępuj zgodnie z podobną strategią bramkowania, jak pokazano na rysunku 2, aby następnie bramkować pojedyncze, żywe komórki jednojądrzaste i badać fagocytozę na określonej populacji, na przykładpośrednich komórkach mikrogleju CD11b + CD45 (Figura 2H).
      UWAGA: Indeks fagocytarny ocenia się na podstawie proporcji komórek internalizujących fluorescencyjne fibryle Aβ lub mikrosferę ≥1. Zgodnie z wcześniejszą definicją, fagocytoza niskiego poziomu to wychwyt co najmniej 1 mikrosfery, a fagocytoza wysokiego poziomu to wychwyt >1 kulki 8,9. Opierając się na wcześniejszych eksperymentach, hamowanie procesów zależnych od aktyny przez cytochalazynę D całkowicie hamuje wychwyt kulki >1 i częściowo hamuje wychwyt 1 kulki9, a także całkowicie hamuje wychwyt Aβ, potwierdzając zależny od aktyny wychwyt fagocytarny, a nie bierne wiązanie się z powierzchnią komórki. Immunocytochemia potwierdza również, że każdy sekwencyjny pik w teście mikrosfery jest reprezentatywny dla jednostkowego wzrostu liczby kulek phagocytosed8,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować typowe wyniki fagocytarnego wychwytu mikrosfer i włókienek Aβ42 przez ostro izolowane CNS-MP, uzyskano ostro izolowane CNS-MP z półkuli ipsilateralnej po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO)8. Szczegółowe informacje na temat właściwości fagocytarnych CNS-MP w modelu MCAO można znaleźć we wcześniejszych publikacjach8. Krótko, po 72 godzinach rekonwalescencji, CNS-MP zostały ostro odizolowane od świeżego mózgu za pomocą dysocjacji mechaniczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cytometria przepływowa to technika, która może wykryć ekspresję białek lub markerów będących przedmiotem zainteresowania na powierzchni komórki lub w przedziałach wewnątrzkomórkowych za pomocą znakowanych fluorescencyjnie sond (zwykle przeciwciał) w celu znakowania tych markerów. Przeciwciała na powierzchni komórki lub wewnątrzkomórkowe są zwykle sprzężone z pobudliwymi laserowo fluorochromami, które mają unikalne widma emisyjne. Komórki inkubowane z tymi przeciwciałami można podzielić na wiele subpopulacji w oparciu o w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie zostało wsparte nagrodami NIH dla dr Rangaraju (NINDS K08 NS099474-1 i R01 NS114130-01A1) oraz dr Rayaprolu (NIA F32AG064862). Badanie to było częściowo wspierane przez Emory Flow Cytometry Core (EFCC), jeden z Emory Integrated Core Facilities (EICF) i jest subsydiowane przez Emory University School of Medicine. Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez Georgia Clinical & Translational Science Alliance przy NIH (UL1TR002378). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie odzwierciedla ona oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Zbilansowany roztwór soli Hanka(10x HBSS)ThermoFisher14065056Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Służy do wytwarzania SIP zgodnie z opisem w protokole
1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (1x HBSS)ThermoFisher14175095Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Służy do wytwarzania 35% SIP zgodnie z opisem w protokole
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Przechowywać 10xPBS w temperaturze pokojowej. Przygotować świeży 1xPBS, rozcieńczając jedną część 10xPBS na dziewięć części MilliQ dH20 i przechowywać w temperaturze 4 & deg; C na godzinę przed użyciem. Upewnij się, że pH 1xPBS wynosi 7,0 przed włożeniem do lodówki.
35% SIPAby zrobić 20 ml 35% SIP, użyj 7 ml SIP i 13 ml lodowatego 1 razy; HBSS. Przechowywać na lodzie do czasu dalszego przetwarzania
APC-Cy7 rat anty-CD11bBD Pharmingen557657Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C lub przechowywać na lodzie podczas użytkowania. Ukryty przed światłem. Rozcieńczenie cytometrii przepływowej - 1:100
FITC szczur anty myszy CD145BD Pharmingen553080Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C lub przechowywać na lodzie podczas użytkowania. Ukryty przed światłem. Rozcieńczenie cytometrii przepływowej - 1:100
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich martwych komórekThermoFisherL34961Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Dodać 50 ul DMSO do jednej probówki barwnika, dokładnie wirować i wirować z maksymalną prędkością przez 1 min. Zrobić 10&mikro; L porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Użyć świeżej podwielokrotności do każdego doświadczenia i dodać do próbek w rozcieńczeniu 1:500.
Stopki kompensacyjne OneComp eBeadsThermoFisher01-1111-42Przechowywać w 4 stopniach; C, dokładnie wymieszaj probówkę przed dodaniem do probówki (probówek) z próbką, trzymaj na lodzie podczas użytkowania.
PE-Cy7 szczur przeciw myszy CD145BD Pharmingen 552848Przechowywać w 4 & stopni; C lub przechowywać na lodzie podczas użytkowania. Ukryty przed światłem. Rozcieńczenie metodą cytometrii przepływowej - 1:100
Percoll pH8,5-9,5SigmaP1644Przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 10 ml standardowego izotonicznego perkolu (SIP): Użyj 9 ml zimnego Percollu i 1 ml zimnego 10 razy; HBSS.
Mikrosfery sprzężone z fikoerytrynąThermoFisherF13083Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C lub przechowywać na lodzie podczas użytkowania.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - znakowany, HumanAnaSpecAS-60479-01Końcowe stężenie włókienek Ab wynosi 200&mikro; M, który jest następnie rozcieńczany przed użyciem. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Do każdego eksperymentu należy przygotować świeży roztwór roboczy.

Bibliografia

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mikroglejumononuklearne fagocyty OUNdysocjacja mechanicznawirowanie w gradiencie g sto cimikrosfery fluorescencyjneznakowanie markerami powierzchniowymiCD11b CD45
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły