Artykuł metodologiczny

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego

DOI:

10.3791/61470

⸱

14 października 2021

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chłoniaki skórne z komórek T (CTCL) powstają w wyniku transformacji i niekontrolowanej proliferacji dojrzałych komórek T naprowadzających się na skórę, a mycosis fungoides (MF) i zespół Sézary'ego (SS) reprezentują najczęstsze podtypy. Pomimo wielu badań nad charakteryzacją ekspresji genów, zmian genetycznych i nieprawidłowości epigenetycznych CTCL, patogeneza molekularna MF / SS pozostaje niejasna. MF odnosi się do bardziej powszechnego CTCL z przewagą skóry i zwykle ogranicza się do skóry, podczas gdy SS jest agresywnym wariantem białaczkowym CTCL z rozległym zajęciem skóry i charakteryzuje się dystrybucją nowotworową obejmującą głównie krew, skórę i węzły chłonne. Koncentrując się na praktyce klinicznej, identyfikacja biomarkerów ekspresji genów ma ogromny potencjał w zakresie poprawy diagnostyki i leczenia MF/SS. Rzeczywiście, ostatnie badania transkryptomiczne zidentyfikowały potencjalne biomarkery diagnostyczne wynikające z różnic w ekspresji genów między normalnymi i złośliwymi limfocytami T, co może poprawić nasze zrozumienie biologii SS i ujawnić potencjalne cele terapeutyczne. Niniejszy manuskrypt opisuje szczegółowy, powtarzalny protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej ze świeżej krwi pełnej od pacjentów, u których zdiagnozowano SS, selekcji limfocytów T pamięci CD4 + (limfocyty T CD4 + CD45RO +), stymulacji chemicznej i przygotowania RNA odpowiedniego do profilowania transkryptomicznego w celu odkrycia nowych prognostycznych markerów molekularnych w celu uzyskania dodatkowego wglądu w etiologię choroby. Stymulacja wykorzystująca agonistę chemicznego do aktywacji regulacji jądrowej zapewnia bardziej szczegółową ocenę szlaków ważnych w dynamicznej regulacji transkrypcji i ekspresji genów oraz eliminuje defekty zakłócające, które mogą wynikać z defektów sygnalizacji wstępnej wynikających z utraty antygenu TCR na błonie komórkowej. Dane uzyskane z porównania transkryptomu niestymulowanych i stymulowanych limfocytów T SS demaskują funkcjonalne defekty ekspresji genów regulatorowych, które nie są widoczne w analizie spoczynkowych komórek niestymulowanych. Co więcej, metoda opisana w ramach tego podejścia może zostać zaadaptowana do badania defektów ekspresji genów limfocytów T w innych chorobach immunologicznych limfocytów T.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chłoniak skórny z komórek T (CTCL), w tym najczęstsze podtypy mycosis fungoides (MF) i zespół Sézary'ego (SS), to niejednorodna grupa chorób powstałych w wyniku transformacji i niekontrolowanej proliferacji dojrzałych komórek T naprowadzających skórę1,2. Nowotworowe limfocyty T mają dojrzały CD4 + CD45RO +, fenotyp pamięci3 i wyrażają markery adhezji naprowadzania skóry, zwiększając epidermotropizm4, co objawia się wysypką, szczególnie we wczesnej fazie choroby. Przebieg kliniczny MF jest często powolny, gdy jest objęty rutynową opieką, ale podgrupa pacjentów może przejść do bardziej zaawansowanej choroby. W tych przypadkach MF zmiany skórne rosną i pogrubiają się w duże guzy, a nowotworowe limfocyty T mogą rozprzestrzeniać się do węzłów chłonnych i narządów trzewnych. W przeciwieństwie do tego, SS jest bardziej agresywnym, białaczkowym wariantem CTCL5, charakteryzującym się triadą objawów: uogólnioną erytrodermią (zdefiniowaną jako wpływająca na >80% całkowitej powierzchni ciała), powiększeniem węzłów chłonnych i obecnością więcej niż 1000/mm3 krążących klonalnych atypowych limfocytów T z jądrami mózgowymi, tzw. komórek Sézarego6,7. Rokowanie dla pacjentów z SS jest znacznie gorsze niż MF. SS występuje rzadko, a częstość występowania wynosi 0,1/100 000 i stanowi około 3% wszystkich przypadków CTCL8,9. CTCL zwykle występuje u osób starszych, których mediana wieku wynosi około 60 lat10. Częstość występowania CTCL rosła i chociaż przyczyna jest niejasna, wskaźnik ustabilizował się od 1998 roku11,12.

Molekularna patogeneza SS pozostaje niejasna. Badania genetyczne, epigenetyczne i ekspresji genów przyniosły wiele nowych danych, jednak nadal istnieją niespójne wyniki, głównie ze względu na małe badane kohorty pacjentów2, a także różnice w projekcie eksperymentalnym i populacjach kontrolnych13,14. Ulepszona charakterystyka genomiczna i transkryptomiczna może rzucić światło zarówno na mechanizmy choroby, jak i wcześniej niezbadane cele terapeutyczne. Dlatego potrzebne są dalsze badania z większej populacji pacjentów, aby lepiej zrozumieć ten niejednorodny nowotwór złośliwy. Panele biomarkerów, które są bardzo czułe i specyficzne w jednej kohorcie SS, działały mniej jednolicie w innych kohortach15, co stanowi poważną przeszkodę w opracowaniu wiarygodnych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych dla SS16. Idealne biomarkery diagnostyczne będą konsekwentnie i wysoce eksprymowane w złośliwych limfocytach T, podczas gdy będą nieobecne lub prawie nieobecne w normalnych limfocytach T17. Odkrycie biomarkerów specyficznych dla choroby jest ważne dla postępu w zakresie protokołów diagnostycznych i terapeutycznych dla SS.

Wysokiej jakości dane transkryptomiczne zarówno dla złośliwych, jak i prawidłowych limfocytów T wymagają wydajnego i niezawodnego podejścia do przygotowania próbek. W tym miejscu omówimy szczegółową, ale prostą strategię uzyskiwania próbek RNA z populacji limfocytów T istotnych dla SS. Omówimy izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej, negatywną selekcję magnetyczną istotnych dla choroby populacji limfocytów T CD4 + CD45RO +, aktywację chemiczną w celu ujawnienia różnic w odpowiedziach funkcjonalnych oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego. W obecnym protokole aktywacja chemiczna została przeprowadzona przy użyciu octanu mirystynianu forbolu (PMA) i jonoforu wapnia (A23187)18,19, ponieważ poprzednie badania wykazały wadliwą sygnalizację receptora komórek T w CTCL, a stymulacja PMA/A23187 omija receptor limfocytów T20,21. Ponadto PMA/A23187 pozwala na bardziej bezpośrednią proksymalną aktywację sygnałów jądrowych potrzebnych do aktywacji genu cytokin. Wreszcie, stymulacja limfocytów T zapewnia dodatkowy poziom wglądu w regulację ekspresji genów, którego nie można uzyskać z limfocytów T w stanie spoczynku, w których brak jest dynamicznych zmian.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie komórki są potencjalnie zakaźne. W związku z tym eksperymenty są przeprowadzane ściśle zgodnie z wymaganymi środkami ostrożności i procedurami omawianymi jako administracja bezpieczeństwa i higieny pracy (OSHA) oraz środki ochrony osobistej (PPE).

1. Izolacja PBMC z krwi pełnej

  1. Zbierz wszystkie potrzebne materiały z Tabeli 1 i doprowadź je do temperatury pokojowej (RT). Podgrzej RP10F do 37 °C. Dostosuj wirówkę do temperatury regulowanej. Z wyjątkiem wirowania i liczenia komórek, wykonaj wszystkie kroki, używając żywych komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Pobrać krew w pięciu probówkach o pojemności 10 ml (pożądana ilość) zawierających antykoagulant. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze otoczenia (18–24 °C). Oznacz probówki separacyjne o pojemności 50 ml numerem uczestnika badań na ludziach dla próbki krwi, która ma być przetworzona.
  3. Przenieś 10\u201215 ml krwi do każdej probówki separacyjnej o pasującym numerze pacjenta. Rozcieńczyć krew co najmniej 2-krotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS). Nie należy przekraczać 35 ml rozcieńczonej krwi na probówkę.
  4. Ostrożnie i powoli podłóż krew ~13 ml pożywki o gęstości. Obserwuj przezroczystą pożywkę o dużej gęstości na dnie probówki i przerwij pipetowanie, gdy pipeta jest prawie pusta (aby zapobiec uwalnianiu się pęcherzyków). Ostrożnie wyjmij pipetę, aby uniknąć mieszania się warstwy krwi i gęstości.
  5. Ostrożnie przenieś napełnione probówki separacyjne do wirówki, nie naruszając warstw.
  6. Wirować przy 500 x g przez 30 minut z wyłączonym hamulcem wirówki (opóźnienie ustawione na zero).
    UWAGA: Jeśli wirówka wyświetla tylko prędkość obrotową, zapoznaj się ze specyfikacją wirnika, aby oszacować odpowiednik prędkości obrotowej dla 500 x g.
  7. Ostrożnie wyjmij probówki separacyjne z wirówki, nie naruszając warstw. Obserwuj kożuszek, który powstał pomiędzy warstwami ośrodka o dużej gęstości i plazmy.
  8. Odpipetować od góry, aby usunąć i wyrzucić większość górnej frakcji osocza, tak aby 10 ml pozostało nad kożuchem. Ostrożnie i powoli zbierz kożuchową sierść. Przenieś kożuchy z dwóch probówek separacyjnych do nowej, wstępnie oznakowanej i sterylnej probówki o pojemności 50 ml, jak pokazano na Rysunek 1.
  9. Rozcieńczyć PBMC co najmniej 2-krotnie HBSS, zwiększając objętość w każdej nowej probówce do 50 ml. Pamiętaj, aby przełączyć hamulec wirówki na pełnię. Granulki PBMC przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min. Usuń supernatant tak bardzo, jak to możliwe i postukaj w spód probówki, aby poluzować osad.
  10. Aby zlizować resztkowe krwinki czerwone (RBC), należy ponownie zawiesić każdą komórkę w 1\u20122 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) na 10 ml pierwotnej objętości krwi. Inkubować dokładnie przez 5 minut. Natychmiast przerwij lizę z równą lub większą objętością HBSS i dostosuj objętość do 50 ml. Wirować przy 400 x g przez 10 min.
  11. Usunąć supernatant i postukać w spód probówki, aby poluzować osad komórkowy. Pula komórek od tego samego dawcy. Zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą HBSS. Wirować przy 400 x g przez 10 min.
  12. Usunąć supernatant i postukać w spód probówki, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml ciepłej pożywki RP10F i pobrać podwielokrotność do zliczenia żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego.
  13. Oblicz całkowitą liczbę komórek w każdej próbce za pomocą hemocytometru.

2. Oczyszczanie limfocytów T CD4+CD45RO+ z PBMC

UWAGA: Oczyszczanie limfocytów T CD4+CD45RO+ z PBMC odbywa się za pomocą dostępnej na rynku separacji magnetycznej (patrz Tabela materiałów) z niewielkimi modyfikacjami. Zaleca się przestrzeganie instrukcji zestawu dotyczącej czasu inkubacji, ponieważ każdy zestaw komercyjny ma swoje własne instrukcje.

  1. Przemyć żądaną ilość PBMC w 10 ml buforu selekcyjnego. Wirować przy 400 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i postukać w spód probówki, aby poluzować osad.
  2. Rozcieńczyć PBMC do 5 x 107 komórek/ml w buforze selekcyjnym i przenieść je do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej (12 x 75 mm).
  3. Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał na 1 ml próbki i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Bezpośrednio przed użyciem wiruj cząsteczki magnetyczne przez 30 sekund z dużą prędkością. Dodać 50 μl cząstek magnetycznych na 1 ml próbki do probówki zawierającej PBMC i delikatnie wymieszać.
  5. Zwiększ objętość do 2,5 ml za pomocą buforu selekcyjnego i delikatnie wymieszaj. Umieść probówkę (bez pokrywki) w magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2,5 minuty.
  6. Podnieś magnes i ciągłym ruchem odwróć magnes i rurkę, aby wlać wzbogaconą zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki.
  7. Aby zwiększyć odzysk, dodaj 2,5 ml buforu selekcyjnego do probówki pozostałej w magnesie, nie naruszając unieruchomionych kulek. Trzymaj magnes przez kolejne 2,5 minuty i powtórz krok 2,6, aby odzyskać dodatkowe komórki.
  8. Weź podwielokrotność do zliczania żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego. Oblicz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
  9. Potwierdź czystość za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3).

3. Aktywacja chemiczna

  1. Dostosuj limfocyty T CD4 + CD45RO + do 5 x 106 komórek/ml z ciepłym podłożem RP10F i rozprowadź komórki w szalkach hodowlanych o pożądanej wielkości. Odpocznij komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 przez noc.
  2. Osad z odpoczętych komórek przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i postukać w spód probówki, aby poluzować osad komórkowy.
  3. Dostosuj stężenie komórek do 5 x 106 komórek/ml za pomocą ciepłej pożywki RP10F i rozprowadź 0,5\u20121 x 107 komórek do każdej z trzech sterylnych probówek z nakrętką.
    UWAGA: Jeśli dostępna jest wystarczająca liczba komórek, w projekcie eksperymentalnym mogą zostać uwzględnione zduplikowane stymulacje lub dodatkowe punkty czasowe.
  4. Stymuluj komórki w probówkach 2 i 3 za pomocą PMA i A23187. Dodaj PMA do 25 ng/ml i A23187 do 500 ng/ml i delikatnie wymieszaj. Dodać równą objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) do komórek w probówce 1, które będą służyć jako nośnik (kontrola). Na przykład, jeśli używasz 1 μl PMA i 1 μl A23187, dodaj 2 μl DMSO do rurki pojazdu. Utrzymuj końcowe stężenie DMSO poniżej 0,5% we wszystkich probówkach.
  5. Poluzować nakrętki na probówkach i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 na 2 godziny (probówka 2) i 6 godzin (probówki 1 i 3). We wskazanym czasie odwirować komórki o sile 500 x g przez 10 minut.
  6. Przed lizą należy wyrzucić jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego.
  7. Niezwłocznie poddać komórki lizie, zgodnie z instrukcjami z dostępnego na rynku zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Kontynuuj izolację RNA lub zamroź lizat w temperaturze -80 °C, aby później przetworzyć go z dodatkowymi próbkami.
    UWAGA: Czystość i integralność RNA można zweryfikować za pomocą elektroforezy mikrokapilarnej.
  8. Opcjonalnie: Aby całkowicie usunąć wszelkie ślady DNA z oczyszczonej próbki RNA, należy użyć zestawu do czyszczenia RNA (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera procedury izolacji PBMC z krwi SS, oczyszczania limfocytów T CD4+CD45RO+ przez selekcję negatywną, stymulacji oczyszczonych limfocytów T oraz izolacji całkowitego RNA do profilowania transkryptomicznego. Rysunek 1 opisuje proces izolacji PBMC z krwi pełnej. Należy pamiętać, że całkowita wydajność PBMC SS będzie się różnić w zależności od początkowej objętości krwi i krążącego guza u każdego pacjenta. W naszym laboratorium średnia wydajność SS PBMC wynosiła 4,6 × 106 komórek/ml krwi pełnej (1,85 × 106 – 3,25 x 107 komórek/ml dla 7 SS). Średnia żywotność izolowanych PBMC wynosiła 95–99%. Rysunek 2 pokazuje wysoką czystość i żywotność wybranych komórek T pamięci CD4+CD45RO+. Średnia wydajność limfocytów T CD4 + CD45RO + z SS PBMC wynosiła 75% (75,6% – 84%), w porównaniu do 15,9% (3% – 30%) od normalnych dawców (ND) PBMC uzyskanych z komór systemu leukoredukcji (LRS). Żywotność i czystość limfocytów T CD4 + CD45RO + uzyskanych za pomocą tego protokołu selekcji negatywnej była niezmiennie wysoka (Rysunek 3).

Wcześniej połączyliśmy powyższy protokół aktywacji z mikromacierzami, aby zbadać funkcjonalne zmiany w transkryptomach limfocytów T zarówno SS, jak i ND, i wykazaliśmy, że limfocyty T pamięci SS i SS PBMC słabo wyrażają cytokiny i inne geny odpowiedzi immunologicznej w porównaniu do komórek T ND i PBMCs19,22,23. Rysunek 4 pokazuje silną aktywację kilku genów cytokin, w tym IL4, IL 10, IL13 i IL22 w limfocytach T ND, ale nie w limfocytach T SS. Ten defekt w funkcjonalnej ekspresji genów w limfocytach T SS został od tego czasu potwierdzony przez inne grupy24. Ponadto wiele genów, które nie ulegają normalnej ekspresji w limfocytach ND T, ulega silnej ekspresji w limfocytach T SS, zarówno w spoczynku, jak i po stymulacji (Ryc. 4). Należą do nich wcześniej opisane geny biomarkerów SS DNM3, PLS3, TOX i TWIST125,26,27, a także ANK1 i SGCE, które zostały po raz pierwszy zgłoszone przez naszą grupę. Te dodatnie biomarkery są silnie eksprymowane w SS, ale nie w ND, i pozwalają uniknąć technicznych pułapek związanych z negatywnymi biomarkerami.

figure-results-1
Rycina 1: Izolacja PBMC z krwi pełnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ryc. 2: Negatywna selekcja limfocytów T pamięci CD4 + z izolowanych PBMC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Czystość limfocytów T CD4 + CD45RO + potwierdzono cytometrią przepływową. Limfocyty bramkowano przez rozproszenie światła (A), żywe limfocyty wykluczyły barwnik żywotności eFluor780 (B), a (C) reprezentują niewyselekcjonowanych normalnych dawców (ND). Selekcja negatywna skutkowała prawie czystymi populacjami limfocytów T CD45RO + u pacjentów z ND (D) i SS (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Różnicowa ekspresja genów w spoczynkowych i aktywowanych komórkach T pamięci CD4 + CD45RO + z SS i ND. Z-score ekspresji genów jest reprezentowany przez skalę kolorów od czerwonego (wysoka ekspresja) do zielonego (niska ekspresja). Kolorowe paski u góry mapy cieplnej reprezentują leczenie komórkami: pozorowane/leczone nośnikiem (czerwone), 2 godziny stymulowane (niebieski) i 6 godzin stymulowane (żółty). Kilka genów biomarkerów SS ulega silnej ekspresji, a geny cytokin są słabo eksprymowane w limfocytach T SS w porównaniu z komórkami T ND. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynniki
Średni gęstośćPożywka do separacji limfocytów, Ficoll-Hypaque lub pożywka o równoważnej gęstości o gęstości = 1,077-1,080 g / ml w temperaturze 20oC.
HBSS (Sieć HBSS)1x Zbilansowany roztwór soli Hanka, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2
Przekaźnik RP10FRPMI 1640 pożywka, 10 % inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS), 1x roztwór penicyliny i streptomycyny, pH 7,2
Bufor do lizy ACK155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Nie ma potrzeby regulacji pH. Powinno być ~ 7,3.
Bufor wyboru1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA
octan forbolu12-mirystynianu 13 (PMA)50 μg/ml w DMSO
A23187 jonofor500 μg/ml w DMSO

Tabela 1: Odczynniki.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano kilka sposobów izolowania PBMC, a każdy z nich ma swoje zalety i ograniczenia28. Rutynowo pobieramy do 50 ml krwi do pięciu probówek o pojemności 10 ml zawierających antykoagulant. Objętość krwi do izolacji PBMC zależy od kilku czynników, takich jak stan zdrowia i wiek osoby badanej, a także od wiedzy flebotomisty. Krytycznym etapem proceduralnym w protokole jest utworzenie gradientu stopnia. Słabe nakładanie warstw może spowodować częściowe lub całkowite uszkodzenie PBMC do osadzania się na granicy faz. Preferujemy opisaną tutaj metodę podwarstwiania, ponieważ łatwo jest rozpocząć dolną warstwę. Aby całkowicie usunąć całą pożywkę o dużej gęstości poniżej krwi, bardzo ważne jest, aby użyć pipety bez wycieków powietrza. Zanieczyszczenie frakcji PBMC przez niepożądane typy komórek można zminimalizować poprzez staranne i konsekwentne pobieranie kożucha, które powinno być wykonywane w ten sam sposób dla każdej izolacji. Jeżeli PBMC nie będą poddawane dalszemu frakcjonowaniu, należy unikać zbierania różnych ilości gradientu gęstości i warstw plazmy między izolacjami. Liza RBC jest przeprowadzana w celu zminimalizowania potencjalnego wpływu zanieczyszczenia RNA pochodzącego z RBC i retikulocytów na dalsze analizy ekspresji genów. Liza hipotoniczna zostanie zahamowana przez nadmiar buforu izotonicznego.

Dalsza izolacja podzbioru limfocytów T jest ważna dla badań molekularnych. Tutaj opisaliśmy kolejną selekcję limfocytów T CD4 + CD45RO + przez selekcję negatywną w celu usunięcia niepożądanych typów komórek. Selekcja negatywna opiera się na tym, że przeciwciała rozpoznają określone markery powierzchni komórek dla wszystkich niepożądanych komórek. Komórki pokryte przeciwciałami są następnie usuwane za pomocą kulek magnetycznych. Ten protokół selekcyjny usuwa niechciane komórki, jednocześnie pozwalając nietkniętym i niestymulowanym komórkom docelowym pozostać w swobodnym unoszeniu się, co jest niezbędne w badaniu aktywacji genów. Należy jednak zachować ostrożność, aby uniknąć grudek komórkowych, które obniżają ostateczną czystość wybranych limfocytów T CD4+ CD45RO+. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) obecny w buforze selekcyjnym minimalizuje zlepianie się komórek. Wydajność limfocytów T zależy od takich czynników, jak początkowa objętość krwi, zmienne pacjenta, takie jak leczenie podawane pacjentowi i stadium choroby w momencie pobierania próbki. Leczenie podawane pacjentom może również wpływać na żywotność komórek. Ponadto pobieranie próbek przed jakimkolwiek zabiegiem, takim jak fotofereza, ma również pozytywny wpływ na czystość limfocytów T CD4 + CD45RO +. Zaobserwowaliśmy, że pobranie próbki po zabiegu fotoferezy ma negatywny wpływ na wydajność limfocytów T CD4 + CD45RO +.

Klony nowotworowych limfocytów T od pacjentów z SS najczęściej wykazują ekspresję markerów powierzchniowych zgodnych z dojrzałym, pamięciowym fenotypem limfocytów T CD429,30. Jednak sporadycznie obserwowano plastyczność fenotypową w odniesieniu do markerów powierzchniowych, w tym CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 i / lub CD2631. Wcześniejsze badania wykazały również niejednorodność ekspresji CD45RO i CD45RA wśród pacjentów z SS29, podczas gdy większość przypadków SS to nadal CD45RO+. Roelens i wsp.31 wykazali również, że SS może wykazywać niejednorodność międzyosobniczą i wewnątrzosobniczą z mieszaną populacją podzbiorów naiwnych (TN), pamięci centralnej (TCM), pamięci przejściowej (TTM), pamięci efektorowej (TEM) i końcowej pamięci efektorowej (TEMRA). Jednak ich wyniki wyraźnie pokazują, że większość komórek SS ma fenotyp TCM. Skoncentrowaliśmy nasze badanie na immunofenotypie powierzchniowym CD45RO+ najczęściej występującym u pacjentów z SS i potwierdzonym fenotypem za pomocą cytometrii przepływowej. Planując badania podzbiorów limfocytów T u pacjentów, ważne jest, aby wziąć pod uwagę heterogeniczność fenotypową badanej choroby, a zatem strategia oczyszczania może być dostosowana w razie potrzeby, aby uzyskać pożądaną populację limfocytów T do analizy.

Istnieje kilka sposobów stymulowania limfocytów T i PBMC do badania funkcjonalnej ekspresji genów. Preferujemy aktywację chemiczną (jonofor PMA + A23187), ponieważ interesuje nas regulacja genów w jądrze. Aktywacja chemiczna jest najlepszą opcją do tego celu, ponieważ działa jako szeroki aktywator i jest bardziej jednolita w porównaniu ze stymulacją specyficzną dla antygenu. PMA to mały związek organiczny, który dyfunduje przez błonę komórkową do cytoplazmy i bezpośrednio aktywuje kinazę białkową C. A23187 umożliwia przenikanie wapnia przez błony. Związki te omijają receptory powierzchniowe i razem naśladują efekty ligacji receptora limfocytów T z kostymulacją, w której pośredniczy CD28. Substancje chemiczne aktywują kilka wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, powodując aktywację jądrowych czynników transkrypcyjnych i regulację w górę genów cytokin, które są dostępne do aktywacji transkrypcji. Chociaż aktywacja chemiczna i ligacja CD3CD28 wytwarzają uderzająco podobne globalne profile ekspresji genów w normalnych komórkach32, aktywacja chemiczna za pomocą PMA + A23187 jest dobrym wyborem, ponieważ limfocyty T SS mogą stracić ekspresję receptorów powierzchniowych, w tym składników TCR33. Chong i wsp.22 porównali aktywację genów cytokin między przeciwciałami PMA/A23187 a przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 w PBMC od prawidłowych, wczesnych i późnych pacjentów z MF/CTCL. Poinformowali, że PMA/A23187 spowodował szybszą i intensywniejszą aktywację genu IL-2 w porównaniu ze stymulacją anty-CD3/CD28. Ponadto wykazali, że wolniejsza kinetyka aktywacji przeciwciał anty-CD3/CD28 jest potencjalnie spowodowana sieciowaniem i sygnalizacją błonową niezbędną do stymulacji. Ponadto trendy w ekspresji cytokin między różnymi badanymi populacjami komórek zostały zachowane dzięki PMA/A23187. Ponieważ interesuje nas aktywacja ekspresji genów, stymulacja chemiczna jest idealnym podejściem, ponieważ działa jako szeroki aktywator i jest bardziej spójna w porównaniu ze stymulacją specyficzną dla antygenu. Ligacja CD3/CD28 jest idealna do badania szlaków ważnych w transdukcji sygnału przez błonę. Ponadto aktywacja chemiczna jest tańsza i nie wymaga specjalnego sprzętu. W obecnym badaniu PMA + A23187 znacząco aktywowały geny cytokin w komórkach T ND, ale nie w limfocytach T SS, co sugeruje, że limfocyty T SS mają funkcjonalne braki za TCR.

Podsumowując, protokół ten zapewnia fenotypowo czyste limfocyty T z cennej krwi pochodzącej od pacjenta oraz metodę oceny zmian funkcjonalnych w całym genomie w ekspresji genów. Wykazujemy, że profilowanie transkryptomiczne limfocytów T SS w porównaniu z normalnymi limfocytami T CD45RO+ ujawnia głębokie różnice w aktywacji genów w świeżych ludzkich limfocytach T od pacjentów z CTCL. Badania te pomogą w opracowaniu biomarkerów diagnostycznych i strategii terapeutycznych ukierunkowanych na nowe markery w CTCL. Ponadto ta strategia i protokół w badaniu pierwotnych ludzkich limfocytów T może być cenny w adaptacji do badań nad innymi chorobami, w których pośredniczą limfocyty T.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ujawnienie etyczne:
Ten protokół badawczy został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Nauk Medycznych Arkansas (UAMS, Little Rock, AR) Dane z mikromacierzy przedstawione w tym badaniu zostały wykonane na próbkach rekrutowanych w ramach protokołu badawczego zatwierdzonego przez IRB szpitala Henry Ford Hospital (Detroit, MI).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy pacjentom i ochotnikom, którzy wzięli udział w naszych badaniach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific02-681-320
10 ml Jednorazowa plastikowa pipetaThermo Scientific 170356
1000 ul Końcówki do pipetVWR10017-038
15 ml Rurki stożkoweCorning352196
25 ml Jednorazowa plastikowa pipetaThermo Scientific170357
5 ml Jednorazowa plastikowa pipetaThermo Scientific170355
50 ml Rurki stożkoweThermo Scientific339652
A23187 jonoforFisher ScientificBP595
WirówkaThermo Scientific75004381
DMSOSigmaD2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ Zestaw do wzbogacania limfocytów TStemCell19157
FBSGIBCO16140-071
HBSSGIBCO14185-052
HEPESFisher BioreagentsBP310-500
KHCO3Fisher BioreagentsP184-500
Medium do separacji limfocytów Corning25-072-CV
Na2EDTAACROS10378-23-1
Bioodczynniki NaHCO3FisherS233-500
NH4ClBioodczynniki FisherA661-500
Roztwór penicyliny i streptomycynyGIBCO15140122
octan forbolu12-mirystynianu 13 (PMA)SigmaP-8139
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+RAININ17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+RAININ17014388
Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+RAININ17014391
Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+RAININ17014392
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1013
Rneasy Plus Mini KitQiagen74136
RPMI 1640GIBCO31800-022
T-25 KolbaThermo Scientific2024-10

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, E. J., et al. Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).
  2. Wong, H. K., et al. Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome). British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).
  3. Whittaker, S. Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL). Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).
  4. Kallinich, T., et al. Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides. Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).
  5. Rodd, A. L., et al. Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors. Lymphoma. 2012, Article ID 290685 1-10 (2012).
  6. Olsen, E., et al. Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blood. 110, 1713-1722 (2007).
  7. Hameetman, L., et al. EPHA4 is overexpressed but not functionally active in Sézary syndrome. Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).
  8. Willemze, R., et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood. 105, 3768-3785 (2005).
  9. Bradford, P. T., et al. Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases. Blood. 113, 5064-5073 (2009).
  10. Wilson, L. D., et al. Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma. Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).
  11. Li, Y., et al. Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options. Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).
  12. Korgavkar, K., et al. Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma. Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).
  13. Dulmage, B. O., Geskin, L. J. Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma. British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).
  14. Boonk, S. E., et al. Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for Sézary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients. Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).
  15. Scarisbrick, J. J., et al. Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model. Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).
  16. Benoit, B. M., et al. CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in Sézary syndrome: the Sézary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214. Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).
  17. Dulmage, B., et al. The biomarker landscape in mycosis fungoides and Sézary syndrome. Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).
  18. Pick, E., et al. Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187. Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).
  19. Chong, B. F., et al. Induced Sézary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells. Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).
  20. Fargnoli, M. C., et al. Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk. Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).
  21. Hansen, E. R., et al. Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex. Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).
  22. Chong, B. F., et al. Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides. Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).
  23. Moerman-Herzog, A. M., et al. Transcriptome analysis of Sézary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes. Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).
  24. Fanok, M. H., et al. Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma. Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).
  25. Su, M. W., et al. Aberrant expression of T-plastin in Sezary cells. Cancer Research. 63, 7122-7127 (2003).
  26. van Doorn, R., et al. Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis. Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).
  27. Booken, N., et al. Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 22, 393-399 (2008).
  28. Dagur, P. K., McCoy, J. P. Collection , storage, and preparation of human blood cells. Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).
  29. Fierro, M. T., et al. Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma. Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).
  30. Campbell, J. J., et al. Sézary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors. Blood. 116 (5), 767-771 (2010).
  31. Roelens, M., et al. Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity. Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).
  32. Diehn, M., et al. Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).
  33. Fuji, K. New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma. Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rekcytometria przep ywowaselekcja za pomoc kulek magnetycznychekstrakcja RNAstymulacja kom rekocena ywotno ci

Powiązane artykuły