Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzenie
Ludzka implantacja i pojawienie się wczesnego łożyska są historycznie trudne do zbadania i pozostają w dużej mierze nieznane, ponieważ ludzkie tkanki są niedostępne na tym etapie, kiedy ciąża jest klinicznie niewykrywalna. Modele zwierzęce są nieodpowiednie, ponieważ ludzkie łożysko ma swoje unikalne cechy w porównaniu z innymi ssakami eutheriańskimi. Na przykład ludzkie łożysko wnika głęboko w decidua, a niektóre komórki trofoblastu docierają co najmniej do wewnętrznej jednej trzeciej mięśniówki macicy, podczas gdy inne komórki przebudowują tętnice spiralne macicy. Nawet nasi najbliżsi ewolucyjni przodkowie, naczelne inne niż ludzie, wykazują różnice w morfologii łożyska i interakcjach trofoblastu z matczynymi tkankami dziesiętnymi1,2,3. Uzyskanie przedimplantacyjnych ludzkich embrionów in vitro nie było możliwe aż do lat 80-tych, kiedy kliniczne zapłodnienie in vitro (IVF) zaczęło być rutynową praktyką leczenia niepłodności4. Obecnie ludzkie blastocysty mogą być hodowane in vitro, aby umożliwić selekcję bardziej żywotnych zarodków do transferu, a także umożliwić bezpieczne badania genetyczne. Udoskonalenie technik hodowli zarodków, a także coraz powszechniejsze stosowanie zapłodnienia in vitro zaowocowało wieloma nadwyżkami blastocyst, które pozostają po zakończeniu cykli leczenia pacjenta. Za zgodą pacjenta, zgodą IRB i z pewnymi ograniczeniami, te blastocysty mogą być wykorzystywane do badań naukowych. Stały się one nieocenionym zasobem, który został wykorzystany do wyprowadzenia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych5, zrozumienie przejścia wewnętrznej masy komórkowej do embrionalnych komórek macierzystych6,7, a ostatnio zostały z powodzeniem wyhodowane do dnia (D) 13 w celu przebudowy ludzkiej implantacji8,9. Wykorzystując niedawno opracowane metody omiki pojedynczych komórek, dostęp do tkanek ludzkich embrionów w stadium implantacji dał unikalne możliwości opisania mechanizmów molekularnych, które regulują ten wysoce dynamiczny proces różnicowania komórek, które wcześniej były niemożliwe do zbadania10,11,12,13.
Tutaj opisujemy metody użyte w naszej ostatniej publikacji charakteryzującej dynamikę różnicowania trofoblastów podczas implantacji u ludzi12. Protokół ten obejmuje ogrzewanie zeszklonych blastocyst, rozszerzoną hodowlę zarodków do D12 po IVF, trawienie enzymatyczne zarodka na pojedyncze komórki oraz pobieranie komórek do dalszych testów (Ryc. 1). Ten rozszerzony system hodowli wspiera rozwój ludzkiego zarodka w fazie okołoimplantacyjnej bez udziału matki i podsumowuje różnicowanie trofoblastów, które wydaje się zgodne z obserwacjami poczynionymi na podstawie próbek histologicznych wiele lat temu14,15,16,17. Podczas implantacji populacja trofoblastów składa się z co najmniej dwóch typów komórek: monojądrowego cytotrofoblastu progenitorowego (CTB) i terminalnie zróżnicowanego, wielojądrowego syncytiotrofoblastu (STB). Po trawieniu trypsyny CTB są małymi, okrągłymi komórkami, które są morfologicznie nie do odróżnienia od innych linii komórkowych (Rysunek 2A, lewy panel). Oddzielenie CTB od innych linii komórkowych, takich jak epiblast i pierwotna endoderma, można osiągnąć dzięki ich odrębnym profilom transkryptomicznym ujawnionym przez sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki. Komórki syncytiotrofoblastu można łatwo zidentyfikować jako struktury o nieregularnych kształtach, które są znacznie większe niż inne typy komórek i znajdują się głównie na obrzeżach zarodka (Ryc. 2A, środkowy panel; Rysunek 2B, lewy panel). Migrujące komórki trofoblastu (MTB) to kolejna podlinia trofoblastu znaleziona podczas rozszerzonej hodowli zarodka i może być rozpoznana jako pozornie oddalająca się od głównego ciała zarodka (Rysunek 2A, prawy panel, Figura 2B, prawy panel). Trofoblast wędrowny, mimo że wykazuje ekspresję wielu tych samych markerów, co trofoblast kosmkowy (EVT), nie powinien być określany jako EVT, ponieważ struktury kosmkowe w łożysku nie pojawiły się na tym bardzo wczesnym etapie rozwoju.
Eksperymentalnie, udało nam się zebrać małe CTB i duże STB, które są łatwo rozróżnialne po strawieniu zarodków na pojedyncze komórki w D8, D10 i D12 (Rysunek 2A,B). Trofoblasty wędrowne powstają w późniejszych stadiach rozszerzonej hodowli zarodków i mogą być zebrane w D12 przed enzymatycznym trawieniem całego zarodka (Rysunek 2A,B). Poprzez fenotypowe oddzielenie tych trzech podlinii trofoblastu przed analizą pojedynczych komórek, możemy zidentyfikować specyficzne markery transkryptomiczne i określić biologiczną rolę każdego typu komórki. Cytotrofoblast jest wysoce proliferacyjny i działa jako komórki progenitorowe w zaopatrywaniu zróżnicowanych linii STB i MTB10,11,12,13. Syncytiotrofoblast bierze udział w produkcji hormonów łożyskowych w celu utrzymania ciąży i może być również odpowiedzialny za zarodki zagrzebujące się w błonie śluzowej macicy10,11,12,13. Trofoblast wędrowny ma jeszcze silniejsze cechy inwazyjnego, migrującego fenotypu i prawdopodobnie jest odpowiedzialny za głębszą i bardziej rozległą kolonizację endometrium macicy10,11,12,13. Po zdefiniowaniu sygnatury transkryptomicznej każdego typu komórki, analizy grupowania ujawniły również dwa dodatkowe podzbiory komórek, które były morfologicznie nie do odróżnienia od CTB i miały transkryptomy o cechach odpowiednio STB i MTB12. Te komórki w stadium pośrednim są prawdopodobnie w procesie różnicowania się od CTB do podlinii MTB lub STB i zostałyby pominięte, gdyby zarodki były trawione na ślepo, a komórki były rozdzielane przez sam transkryptom.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje dwuwymiarowy (2D) system hodowli i może nie być optymalny do wspierania trójwymiarowego (3D) rozwoju strukturalnego, jak sugeruje niedawna publikacja opisująca nowo opracowany system hodowli 3D13. Niemniej jednak w tym systemie 2D zróżnicowanie wczesnego trofoblastu wydaje się być zgodne z obserwacjami poczynionymi na podstawie próbek in vivo14,15,16,17. Protokół ten może być również łatwo zaadaptowany do użycia w niedawno opisanym systemie hodowli 3D13 przy minimalnych zmianach. Wszystkie kroki wykonuje się za pomocą ręcznej pipety do mikromanipulacji z dostępnymi w handlu jednorazowymi końcówkami lub pipety doustnej z drobno wyciągniętej szklanej pipety przymocowanej do gumowej rurki, filtra i ustnika.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie ludzkie embriony zostały oddane za zgodą do wykorzystania w badaniach. Protokoły dotyczące rozszerzonej hodowli ludzkich embrionów zostały zatwierdzone przez Zachodnią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (badanie nr 1179872) i są zgodne z międzynarodowymi wytycznymi. Jakiekolwiek wykorzystanie ludzkich embrionów musi zostać zweryfikowane przez odpowiednie organy etyczne i zarządzające związane z instytucją badawczą stosującą niniejszy protokół.
1. Przygotowanie
- Przygotuj pożywkę i płytki regeneracyjne na jeden dzień przed ogrzaniem zarodków w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.
- Przygotować 2 ml pożywki do hodowli blastocyst (BM) z 10% v/v substytutem białka surowicy (SPS).
UWAGA: Pożywki do hodowli blastocyst mogą, ale nie muszą, zawierać dodatek białka. Tutaj użyliśmy pożywki, którą należy uzupełnić o 10% wskazanego białka albuminowego. Zapoznaj się ze wskazówkami producenta, aby uzyskać informacje na temat zmian w tej suplementacji. Wszystkie podłoża należy przefiltrować za pomocą sterylnego filtra 0,22 μM dołączonego do sterylnej strzykawki przed wyrównaniem. - Napełnij dwa naczynia do mycia narządów w studzience centralnej 500 μl BM z 10% v/v SPS pokrytym 500 μl oleju do hodowli zarodków.
- W naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm ułóż warstwę 8 ml oleju z hodowli zarodków, a następnie zakotwicź 20 μl kropli BM z 10% v/v SPS na dnie płytki hodowlanej. Przygotuj 1 kroplę na każdy podgrzany zarodek.
UWAGA: W razie potrzeby można przygotować więcej mediów, kropli i umyć naczynia. Krople można również dodawać do potrawy przed nałożeniem warstwami oleju. Zakotwiczenie kropli pod olejem pomoże zmniejszyć parowanie i wszelkie późniejsze zmiany osmolalności. - Zrównoważyć BM z 10% v/v SPS wash naczynia i płytką odzysku w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO2, 5% O2 przez co najmniej 4 godziny.
- Rozmrozić jedną fiolkę z pierwszym etapem pożywki o przedłużonej pożywce hodowlanej (IVC1) w temperaturze 4 °C lub na stole laboratoryjnym.
- Przygotuj jedno naczynie do mycia 500 μl IVC1 bez nakładki olejowej. Podwielokrotność porcji około 4 ml IVC1 do probówki z nakrętką zatrzaskową o pojemności 5 ml.
- Równoważyć naczynie do mycia IVC1 i małą rurkę zatrzaskową IVC1 w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i atmosferycznym O2 przez co najmniej 4 godziny.
- Przygotować 2 ml pożywki do hodowli blastocyst (BM) z 10% v/v substytutem białka surowicy (SPS).
- Przygotuj rozszerzone płytki hodowlane na jeden dzień przed ogrzaniem zarodka w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.
- Rozcieńczyć fibronektynę z ludzkiej surowicy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do 30 μg/ml. Do pokrycia komór potrzeba 250 μl 30 μg/ml fibronektyny na zarodek.
- Otwórz pakiet szkiełek nakrywkowych z 8 studniami pod maską, uważając, aby nie dotknąć studzienek. Delikatnie odpipetować 250 μl 30 μg/ml fibronektyny do każdego dołka.
- Włożyć pokrywkę z powrotem do szkiełka nakrywkowego z komorą i umieścić w temperaturze 4 °C na 20-24 godziny.
- Przygotuj przedłużoną płytkę hodowlaną rano po rozgrzaniu zarodka.
- Pobrać szkiełko nakrywkowe z fibronektyną i umieścić w kapturze z przepływem laminarnym. Usunąć mieszaninę fibronektyny za pomocą pipety o pojemności 1 ml i wyrzucić do pojemnika na odpady.
- Pobrać podgrzaną, zrównoważoną pożywkę IVC1 z małej probówki z zatrzaskiem o pojemności 5 ml.
- Odpipetować 300 μl zrównoważonego IVC1 do każdego dołka. Uważaj, aby żaden płyn nie dotknął pokrywy, ponieważ zwiększy to ryzyko zanieczyszczenia.
- Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze z IVC1 do inkubacji w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i O2 w atmosferze aż do usunięcia osłonki przejrzystej w kroku 4.
2. Ocieplanie zeszklonych embrionów ludzkich D5
UWAGA: Inni producenci mogą mieć nieco inne protokoły zgodnie z ich własną technologią witryfikacji. W stosownych przypadkach zapoznaj się z instrukcją obsługi producenta.
- Podgrzać 3,0 ml roztworu do rozmrażania (TS) w naczyniu o średnicy 35 mm do temperatury 37 °C. Doprowadzić 300 μl roztworu rozcieńczającego (DS) i dwie studzienki po 300 μl roztworu myjącego (WS) na płytce 6-dołkowej do temperatury pokojowej.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie zdejmij rękaw urządzenia kriogenicznego, upewniając się, że zeszklony zarodek zawsze pozostaje pod ciekłym azotem.
- Szybko przenieś kriourządzenie z ciekłego azotu i zanurz końcówkę kriourządzenia w TS w temperaturze 37 °C. Ustaw timer na 1 minutę i trzymaj kriourządzenie zanurzone, aż zarodek odłączy się od TS.
UWAGA: Ogrzewaj zarodki pojedynczo, aby śledzić tożsamość zarodków, ponieważ mogą one odnosić się do informacji demograficznych pacjenta w dalszej analizie. - Podczas 1-minutowej inkubacji w TS ostrożnie wyjmij urządzenie kriogeniczne i delikatnie podnieś zarodek i przejdź na przeciwną stronę szalki TS.
UWAGA: W przypadku hodowli wielu zarodków należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować zarodki oddzielnie, aby zapewnić zachowanie właściwej tożsamości. - Po 1 minucie delikatnie nabierz zarodek z niewielką ilością TS, około 2 μl. Przenieś zarodek na dno studzienki 300 μl DS, pokrywając zarodek cienką warstwą TS z pipety. Ustaw minutnik na 3 minuty i umieść 6-dołkową płytkę na blacie stołu w temperaturze pokojowej.
- Po 3 minutach pobrać zarodek z niewielką ilością DS, około 2 μl, i przenieść zarodek na dno następnego dołka zawierającego 300 μl WS. Ponownie delikatnie nanieść niewielką ilość DS z pipety na zarodek. Ustaw minutnik na 5 minut i wróć na blat.
- Po 5 minutach pobrać zarodek z minimalną objętością WS i przenieść do górnej części ostatniej studzienki o pojemności 300 μL WS. Zarodek powoli opadnie i przemyje się przez WS na dno. Usunąć resztki WS z pipety do pustego dołka.
- Zebrać zarodek o minimalnej objętości i powrócić do górnej części tego samego dołka WS o pojemności 300 μl. Zarodek po raz kolejny spadnie na dno studni. Ustaw minutnik na 1 minutę i umieść 6-dołkową płytkę na blacie stołu.
3. Odzyskiwanie ogrzanych zarodków
- Pojedynczo przenieś podgrzane zarodki do naczynia na tkanki narządowe z centralną studzienką zawierającą 500 μl zrównoważonego BM z 10% v/v SPS pod 500 μl zrównoważonego oleju do hodowli zarodków.
- Umyj zarodki, podnosząc każdy zarodek i przenosząc je do kilku miejsc w naczyniu, jednocześnie wydmuchując stare media między ruchami. Weź zarodek i przenieś go do pojedynczej kropli hodowlanej o pojemności 20 μl zrównoważonego BM z 10% v/v SPS pod olejem.
- Pozostawić ogrzane zarodki do regeneracji przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i 5% O2 .
4. Usuwanie Zona
- Po 2 godzinach rekonwalescencji oceń zarodki pod kątem ponownej ekspansji i zrób zdjęcia każdego zarodka.
- Przenieść zarodki pojedynczo w 500 μl pożywki buforowanej kwasem 3-(N-morfolino)-propanosulfonowym (MOPS) z 5% (v/v) płodową surowicą cielęcą (FCS) przed poddaniem działaniu kwaśnego roztworu Tyrode.
- Przenieś szybko jeden zarodek przez 300 μl podgrzanego kwaśnego roztworu Tyrode'a, aktywnie obserwując przez mikroskop. Osłonka przejrzysta wizualnie zacznie się rozpuszczać. Zajmie to około 5 sekund.
- Natychmiast przenieś zarodek z rozpuszczoną strefą do 300 μl podgrzanego buforowanego podłoża MOPS, aby ugasić kwaśny roztwór Tyrode'a.
- Przenieść zarodek z minimalną objętością buforowanej pożywki MOPS do naczynia na tkanki narządowe z dołkiem centralnym zawierającego 500 μl zrównoważonego BM z 10% v/v SPS pod 500 μl zbilansowanego oleju do hodowli zarodków do przemycia.
- Przywróć zarodek do kropli regeneracyjnej 20 μl z kroku 3.2.
UWAGA: Po oględzinach po usunięciu zoni, wszelkie zarodki z zatrzymanymi osłonkami przejrzystymi mogą być w razie potrzeby poddawane dalszemu leczeniu kwaśnym roztworem Tyrode, powtarzając kroki 4.2-4.6. Pożądane jest zminimalizowanie narażenia na roztwór Tyrode.
5. Rozszerzona hodowla blastocysty
- Przenieś zarodki pojedynczo do naczynia do mycia ze zrównoważonym podłożem IVC1 z kroku 1.1.6. Ostrożnie przenieść jeden zarodek do jednego dołka w komorze szkiełka nakrywkowego ze zrównoważonym IVC1 i zachować identyfikację zarodka.
UWAGA: Ten krok należy zakończyć tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować parowanie medium. - Szkiełko nakrywkowe z komorą należy umieścić w inkubatorze nastawionym na 37 °C, 6% CO2 i atmosferycznymO2 na 2 dni.
UWAGA: Należy pamiętać o rozmrożeniu i zrównoważeniu mediów w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i temperaturze atmosferycznej O2 dla wymiany mediów 4 godziny wcześniej. - Przy wyrastaniu D2 (D7 po zapłodnieniu) dokładnie zbadaj przyczepienie zarodków pod mikroskopem i dokonaj wymiany pożywki.
- Zwróć uwagę, który zarodek jest przyczepiony do naczynia przed wymianą pożywki. Delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy zarodek bezpiecznie przyczepił się do płytki pod mikroskopem.
- Zdejmij pokrywkę i ostrożnie wyjmij 150 μl IVC1 i wyrzuć, nie naruszając przyczepionego zarodka. Jeśli zarodek nie przyczepił się jeszcze do płytki, nie należy wymieniać pożywki, ponieważ surowica zawarta w IVC1 pomoże w przyczepieniu zarodka.
- Powoli odpipetować 150 μl zrównoważonych rozszerzonych pożywek hodowlanych, IVC2, do każdej studzienki i umieścić pokrywkę z powrotem w komorze na szkiełku nakrywkowym.
UWAGA: Upewnij się, że zdejmowanie pokrywki z komory szkiełka nakrywkowego jest zminimalizowane, aby uniknąć parowania medium.
- Ostrożnie włóż szkiełko nakrywkowe z komorą do inkubatora, nie rozpryskując żadnych pożywek na pokrywę. Powtarzaj wymianę pożywki i kontrolę przyłączenia każdego dnia rozszerzonej hodowli, aż zarodki będą gotowe do utrwalenia lub trawienia pojedynczych komórek.
6. Opcjonalna kolekcja zużytych nośników
- Opcjonalnie należy zebrać zużyte pożywki podczas wymiany pożywek hodowlanych po D7 lub dowolnego dnia po nim. W kroku 5.3.2, zamiast wyrzucać pożywkę, należy zamrozić 150 μl usuniętego IVC1 w sterylnej probówce o niskiej zawartości wiązania 0,5 ml do przyszłej analizy.
7. Opcjonalna fiksacja dla immunofluorescencji
- Użyj pipety o pojemności 200 μl, aby przemyć zarodki za pomocą 1/2 pożywki wymiany PBS przez 3x przed utrwaleniem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia zewnątrzkomórkowe. Wypłukanie nadmiaru zanieczyszczeń i białka pomoże zoptymalizować klarowność i zmniejszyć tło na obrazach uzyskanych za pomocą immunofluorescencji.
- Usuń wszystkie podłoża i powoli dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS do studzienki. Zarodek będzie chciał przykleić się do powierzchni płynu. Wielokrotne płukanie 150 μl z 4% PFA przed usunięciem całego płynu pomoże zminimalizować wszelkie uszkodzenia zarodka.
- Inkubować zarodki w 4% PFA przez 20 minut w celu utrwalenia.
- Myj zarodki 3x przez 10 minut na mycie 200 μl 0,1% v/v polisorbatu 20 w świeżym PBS.
- Utrwalone zarodki należy przechowywać w 0,1% v/v polisorbat 20 w PBS w temperaturze 4 °C przed przystąpieniem do protokołu immunofluorescencji.
8. Trawienie jednokomórkowe za pomocą trypsyny
UWAGA: Świeże (nie stałe) zarodki są używane do trawienia pojedynczych komórek.
- Umyj zarodek raz 200 μl PBS i dodaj 200 μl roztworu trypsyny do każdego dołka. Umieścić szkiełko nakrywkowe z komorą z powrotem w inkubatorze na 5 minut.
- Wyjąć szkiełko nakrywkowe z komorą z inkubatora i zbadać zarodki pod stereoskopem. Komórki na obrzeżach zarodka zaczną się wycofywać, a MTB powinien być nadal przymocowany do płytki, w miejscu, w którym znajdują się w odległości od zarodka.
- Użyj małej pipety lub drobno wyciągniętej pipety doustnej, aby pobrać pojedynczy MTB przed rozbiciem całego zarodka. Przejdź od razu do kroku 9.1, aby zapisać MTB i wróć do kroku 8.4 po kroku 9.3.
- Użyj ręcznej pipety do mikromanipulacji lub pipety doustnej, aby delikatnie oddzielić zarodek poprzez zasysanie w górę iw dół.
- Komórki zaczną oddzielać się od całego zarodka. Kontynuuj delikatne i wielokrotne odsysanie zarodka za pomocą końcówki pipety o mniejszej średnicy lub pipety doustnej, aż zarodek będzie inkubowany w trypsynie przez łącznie 10 minut.
9. Wybór pojedynczej komórki i pobieranie próbek
- Przy minimalnej ilości trypsyny przenieś zdysocjowane komórki przez trzy krople do płukania po 20 μl PBS + 0,1% poliwinylopirolidonu (PVP) pod olejem z hodowli zarodków, uważając, aby nie stracić żadnych komórek.
- Po umyciu komórek użyj drobno wyciągniętej szklanej pipety, aby wybrać jedną komórkę. Ostrożnie odpipetuj pojedynczą komórkę do sterylnej probówki o pojemności 0,2 ml o niskim poziomie wiązania i minimalnej objętości PBS+0,1% PVP.
- Szybkie zamrażanie pojedynczych komórek w ciekłym azocie (LN2) i przechowywanie w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zdrowe zarodki wykazywały ciągłą proliferację w trakcie przedłużonej hodowli (Rysunek 2B). Zarodki nieprawidłowe zaczęły kurczyć się od zewnętrznych krawędzi i ulegać dezintegracji (Rysunek 2C). Z naszego doświadczenia wynika, że około 75% zarodków przytwierdziło się do dna naczynia pokrytego fibronektyną po 48 h, a stopień przytwierdzenia wzrósł do około 90% do 72 h hodowli. Na sukces przytwierdzenia zarodków może w dużej mierze wpływać początkowa jakość blasto...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowanie protokołu hodowli ludzkich embrionów poprzez implantację pozwoliło naukowcom na zbadanie wcześniej niezbadanego okresu rozwoju 8,9. W tym przypadku używamy rozszerzonego systemu hodowli do hodowli ludzkich embrionów i badamy wczesne różnicowanie trofoblastów przed utworzeniem kosmkowego łożyska. Opisane tutaj metody pozwalają nam zebrać różne podlinie gruźlicy do wykorzystania w dalszej analizie pojedynczych komórek. Prace te dają społeczności naukowe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować wielu pacjentkom z Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM), którzy łaskawie oddali swoje embriony do badań. Chcielibyśmy również podziękować Karen Maruniak i laboratorium klinicznemu w CCRM za pomoc w przetwarzaniu próbek hCG, a także Sue McCormick i jej klinicznemu zespołowi embriologii IVF w CCRM za pomoc w pobieraniu, przechowywaniu, śledzeniu i dawstwie zarodków. Finansowanie zostało zapewnione wewnętrznie przez CCRM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylna strzykawka NORM JECT Luer Lock | VWR | 53548-019 | Opakowanie 100 |
| inkubatorów CO2 z płaszczem wodnym 3130 lub 3110 Forma Series II | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Naczynie do hodowli tkankowych Corning Primaria | VWR | 62406-038 | Opakowanie 500 |
| probówek zatrzaskowych 5 ml | VWR | 60819-295 | Opakowanie 25 |
| 60 mm tkanek Corning Primaria naczynie hodowlane | VWR | 25382-687 | Etui na 200 |
| 6-dołkowych naczyń | Agtech Inc. | D18 | Opakowanie zawierające 1, 10 lub 50 |
| kwaśnych roztworów Tyrode'a | Millipore Sigma | T1788 | 100 ml |
| Biotix 1250 µ L końcówki do pipet | VWR | 76322-156 | Zestaw 960 |
| Blast, pożywka do hodowli blastocyst | Origio | 83060010 | 10 ml |
| roztworu do rozcieńczania | Kitazato | VT802 | 1 x 4 ml |
| Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5,75 cala. (146 mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Sulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Olej parafinowy do hodowli zarodków OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 ml |
| probówki Eppendorf PCR 0,2 ml | VWR | 47730-598 | Opakowanie 1 000 |
| probówek Eppendorf PCR 0,5 ml | VWR | 89130-980 | Opakowanie 500 |
| Fibronectin z ludzkiego osocza. Płynny roztwór .1% | Millipore Sigma | F0895 | 1 |
| mg Gilson 1 ml Pipeta | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipeta 200-1000 &mikro; L |
| Gilson 20 i mikro; L Pipeta | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipeta 2-20 & mikro; L |
| Gilson 200 & mikro; L Pipeta | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipeta 50-200 &mikro; L |
| G-MOPS Podłoża manipulacyjne | Vitrolife | 10129 | 125 ml |
| Podłoża manipulacyjne | Origio | 83100060 | 60 ml |
| Ibidi 8 dobrze komorowe szkiełko nakrywkowe | Ibidi | 80826 | 15 szkiełek w pudełku |
| IVC1/IVC2 | Systemy naprowadzania komórek | M11-25/ M12-25 | 5-5 ml podwielokrotności |
| K System T47 Płyta grzewcza | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterylne filtry strzykawkowe z membraną Durapore PVFD | Fisher Scientific SLGVR33RS | Zestaw 50 | |
| ustników | Sklep IVF | MP-001-Y | 100 sztuk |
| Miska ze studnią środkową Oosafe | OOPW-CW05-1 | Etui 500 | |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Gumowa rurka lateksowa do ustników | Sklep IVF | IVFS-NRL-B-5 | 5 stóp |
| Mikroskop stereoskopowy | Nikon | SMZ1270 | |
| Końcówki do ściągania izolacji | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µ |
| m Roztwór do rozmrażania | Kitazato | VT802 | 2 x 4 ml |
| Mikropipeter do strippingu | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 ml |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | Butelka 25 ml |
| VWR 1-20 µ L Końcówki do pipet | VWR | 76322-134 | Zestaw 960 |
| VWR 1-200 µ L końcówki do pipet | VWR | 89174-526 | Opakowanie 960 roztworu |
| myjącego | Kitazato | VT802 | 1 x 4 ml |
Bibliografia
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187(2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
