Artykuł metodologiczny

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

DOI:

10.3791/61477

⸱

29 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 2Department of Biology, Miami University, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interferencja RNA (RNAi) pozostaje potężną techniką, która pozwala na celowe zmniejszenie ekspresji genów poprzez degradację mRNA. Technika ta ma zastosowanie do wielu różnych organizmów i jest bardzo skuteczna w bogatym gatunkowo rzędzie Coleoptera (chrząszcze). Tutaj podsumowujemy niezbędne kroki do opracowania tej techniki w nowym organizmie i ilustrujemy jej zastosowanie do różnych etapów rozwojowych wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus. Docelowe sekwencje genów można uzyskać w sposób ekonomiczny poprzez składanie transkryptomów z bliskim krewnym o znanym genomie lub de novo. Klonowanie genów kandydujących wykorzystuje specyficzny wektor klonujący (plazmid pCR4-TOPO), który umożliwia syntezę dwuniciowego RNA (dsRNA) dla dowolnego genu przy użyciu jednego wspólnego startera. Zsyntetyzowane dsRNA można wstrzykiwać zarówno do zarodków we wczesnych procesach rozwojowych, jak i larw do późniejszych procesów rozwojowych. Następnie ilustrujemy, w jaki sposób RNAi można wstrzykiwać do larw wodnych za pomocą immobilizacji w agarozie. Aby zademonstrować tę technikę, podajemy kilka przykładów eksperymentów z RNAi, generujących specyficzne knockdowny z przewidywanymi fenotypami. W szczególności RNAi dla genu garbowania lakkazy2 prowadzi do rozjaśnienia naskórka zarówno u larw, jak i dorosłych, a RNAi dla genu pigmentacji oka na biało powoduje rozjaśnienie/brak pigmentacji w rurkach ocznych. Ponadto powalenie kluczowego białka soczewki prowadzi do powstania larw z brakami optycznymi i zmniejszoną zdolnością do polowania na zdobycz. W połączeniu wyniki te ilustrują moc RNAi jako narzędzia do badania zarówno wzorców morfologicznych, jak i cech behawioralnych w organizmach dysponujących jedynie transkryptomicznymi bazami danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pytanie o to, jak konkretne geny przyczyniają się do ewolucji różnorodnych cech, jest ekscytującym tematem w biologii. W ciągu ostatnich kilku dekad poczyniono znaczne postępy w zakresie analizy genetycznych podstaw procesów rozwojowych w kilku organizmach modelowych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans, muszka owocowa Drosophila melanogaster i mysz domowa Mus musculus1. Niedawno, wynalezienie potężnych technik edycji genów, takich jak zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas92, umożliwiło zmianę kodu genetycznego organizmów niemodelowych (na przykład zobacz3,4). W rezultacie nastąpił gwałtowny wzrost badań genetycznych nad różnymi organizmami, do których wcześniej nie podchodzono za pomocą technik molekularnych. Biorąc pod uwagę ogromną różnorodność naszego królestwa zwierząt, z wieloma interesującymi cechami lub różnicami cech, które są reprezentowane tylko u określonych gatunków, postęp ten sprawił, że jest to ekscytujący czas dla prac związanych z biologią ewolucyjno-rozwojową ("evo-devo"). Jednak techniki edycji genomu, które są dostępne dla organizmów niemodelowych, są stosunkowo ograniczone w odniesieniu do punktów czasowych rozwoju, do których można je zastosować, co utrudnia rozpoznanie właściwości czasowych związanych z rolą, jaką określone geny odgrywają w dowolnej cesze. Ponadto techniki transgeniczne są często ograniczone do genów, które nie są niezbędne do przeżycia (tj. których nokaut nie powoduje śmiertelności). Dlatego, chociaż techniki edycji genów zaczęły stawać się popularne, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczne techniki, które można zastosować do wielu różnych organizmów w określonych punktach czasowych rozwoju i ułatwiają częściowe knockdowny (a nie całkowitą utratę funkcji). W tym miejscu zwracamy uwagę na interferencję RNA (RNAi), nieco przestarzałą, ale potężną technikę knockdown genów5, która jest szczególnie cenna jako synergiczne podejście do edycji genów. W szczególności opracowaliśmy procedury, które pozwalają na zastosowanie RNAi do wodnych chrząszczy nurkujących jako przykład, który ilustruje realizację tej techniki, od uzyskania niezbędnych sekwencji molekularnych po udane wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) do jaj i larw.

Knockdown genu oparty na RNAi wykorzystuje wrodzony mechanizm obronny organizmów, w którym cząsteczki dsRNA ułatwiają wyciszanie inwazyjnych sekwencji kwasów nukleinowych, takich jak wirusy i transpozony6. Krótko mówiąc, dsRNA jest pobierane do komórki, gdzie jest cięte na 20-25 fragmentów nukleotydowych przez enzym Dicer. Fragmenty te następnie aktywują tworzenie kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC), który hamuje docelowe mRNA poprzez wiązanie się z nim w określonych miejscach za pomocą nici prowadzącej. Proces ten ostatecznie prowadzi do degradacji mRNA, a tym samym zakłóca translację mRNA do odpowiedniego białka6. Przedstawiona tutaj technika knockdownu genów oparta na RNAi opiera się zatem na wstrzyknięciu dsRNA. W przypadku modeli zwierzęcych technika ta została pierwotnie opracowana w C. elegans7 i D. melanogaster8, ale od tego czasu pojawiła się jako potężne funkcjonalne narzędzie genetyczne w organizmach niemodelowych9,10. Ze względu na swoją wysoką skuteczność u niektórych owadów, RNAi może być nawet stosowany w ochronie przed szkodnikami11.

Jako narzędzie badawcze, RNAi zostało wykorzystane do zbadania, jak funkcjonują kluczowe szlaki molekularno-rozwojowe w nietradycyjnych modelach owadów. Na przykład RNAi w chrząszczu mącznym Tribolium castaneum odegrało zasadniczą rolę w określeniu, jak głęboko konserwatywne geny przyczyniają się do określonych cech tego chrząszcza, czego przykładem jest rozwój skrzydeł o specyficznym kształcie12,13,14 i eyes15,16. Techniki, które leżą u podstaw manipulacji u T. castaneum, zostały dobrze opisane17 i opierają się na zdolności do unieruchamiania stosunkowo suchych jaj i larw na lepkiej powierzchni. Takie unieruchomienie nie jest jednak możliwe w przypadku mokrych form rozwojowych organizmów wodnych, takich jak chrząszcz nurkujący Sunburst Thermonectus marmoratus. Podobnie jak w przypadku wielu nietradycyjnych organizmów modelowych, brakuje mu genomu z adnotacjami. Aby manipulować ekspresją genów w dowolnym organizmie bez genomu, rozsądnym i opłacalnym pierwszym krokiem jest wygenerowanie transkryptomów i zidentyfikowanie przypuszczalnych sekwencji nukleotydowych eksprymowanych genów w oparciu o podobieństwo sekwencji do spokrewnionych, ale bardziej ugruntowanych organizmów modelowych, w tym przypadku głównie genów Tribolium (Coleoptera) i Drosophila.

Tutaj, aby pokazać, jak RNAi może być użyte na organizmach wodnych, najpierw omawiamy protokoły i oprogramowanie do ekstrakcji RNA oraz generowania i łączenia transkryptomu, które pozwalają na identyfikację specyficznych sekwencji genów docelowych. Następnie podsumowujemy niezbędne kroki do syntezy dsRNA specyficznego dla genu. Następnie pokazujemy, w jaki sposób jaja mogą być wstrzykiwane do środowiska wodnego i demonstrujemy protokoły inkubacji do hodowli rozwijających się zarodków. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób żel agarozowy może być używany do całkowitego unieruchomienia larw podczas procesu wstrzykiwania, techniki, która jest ogólnie przydatna podczas różnych zabiegów i może być stosowana do różnych stawonogów. Aby zademonstrować, w jaki sposób RNAi może być stosowane na różnych etapach rozwoju, podajemy przykład, w którym wyciszyliśmy gen pigmentacji oka na biało w zarodkach. Ponadto opisujemy przykład, w którym gen garbarstwa lakkaza2 (lac2) został wyciszony zarówno w drugim stadium larwalnym (w celu wpływu na larwy w trzecim stadium larwalnym), jak i w trzecim stadium larwalnym (w celu doprowadzenia do dorosłych). Na koniec wykazujemy, że wstrzyknięcie niższego stężenia dsRNA prowadzi do częściowego knockdownu, co pokazuje, że technika ta może być również stosowana do genów, o których wiadomo, że utrata funkcji jest śmiertelna.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja RNA i składanie transkryptomu de novo

  1. Przeprowadzić całkowitą izolację RNA z rurki ocznej larwalnej chrząszczy nurkujących w późnym stadium rozwoju i dorosłych chrząszczy za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz tabela materiałów), który jest przeznaczony do tkanek bogatych w lipidy. Wyizoluj całkowite RNA z T. marmoratus i zsekwencjonuj je zgodnie z wcześniej opisanymi metodami18.
  2. De novo transcriptom assembly
    UWAGA: Do złożenia transkryptomu de novo można wykorzystać różne platformy bioinformatyczne (patrz tabela materiałów). Platformy te są dostępne na rynku, a w niektórych przypadkach istnieją jako skrypty wiersza poleceń oparte na systemie Unix. Ponieważ montaż odbywa się de novo, zaleca się złożenie transkryptomów niezależnie na dwóch platformach i porównanie wyników w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych.
    1. Aby rozpocząć składanie transkryptomów, prześlij surowe odczyty na odpowiednią platformę bioinformatyczną.
      UWAGA: Pliki te są zwykle skompresowane i w formacie FASTQSANGER. GZ. Nie ma potrzeby dekompresji plików, ponieważ ten format jest akceptowany w następnym kroku.
    2. Korzystając z wiersza poleceń Trimmomatic, przytnij nieprzetworzone odczyty, aby usunąć sekwencje adapterów lub krótkie odczyty, które spadają poniżej domyślnego progu. Dekompresuj przycięte odczyty surowe; pliki będą teraz w formacie FASTQ. Połącz nieprzetworzone odczyty FASTQ dla każdej próbki, aby uzyskać pliki, które są gotowe do montażu de novo.
    3. Zbierz połączone surowe odczyty de novo za pomocą dowolnego skryptu wiersza poleceń, który może złożyć transkryptomy de novo. Zapisz zmontowany transkryptom, który będzie teraz zawierał listę kontigów wraz z ich odpowiednimi sekwencjami, jako plik FAPSA. Aby zwiększyć zasięg złożenia, połącz i złóż wiele transkryptomów dla tego samego gatunku.
      UWAGA: Proces ten zwiększa szanse na wygenerowanie dokładniejszych kontigów i jest szczególnie ważny, jeśli interesujące są geny o niskiej liczbie kopii.
    4. Po złożeniu oceń transkryptom pod kątem kompletności, obliczając wyniki pokrycia (oprogramowanie do oceny pokrycia jest ogólnodostępne, patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Transkryptom z wynikiem pokrycia >75% jest uważany za dobry. Jednak znaczenie tego wyniku zależy od przyczyny generowania transkryptomu. Na przykład, jeśli transkryptom jest używany do identyfikacji genów o niskiej liczbie kopii, wynik >85% jest lepszy, ponieważ oznacza większe pokrycie.
    5. Opisz transkryptom złożony de novo za pomocą podstawowego narzędzia do wyszukiwania wyrównania lokalnego (BLAST; patrz tabela materiałów).
      UWAGA: W tym eksperymencie transkryptom został opisany głównie w bazie danych znanych białek Drosophila i bazie danych znanych białek chrząszczy. Listę adnotacji można pobrać jako plik arkusza kalkulacyjnego, a contig/contigs, które wskazują na podobieństwo sekwencji do białek innych organizmów, można pobrać jako plik FASTA.
    6. Zidentyfikuj liczbę/numery kontigowe białka będącego przedmiotem zainteresowania i wyodrębnij sekwencje nukleotydów. Użyj BLAST, aby określić, czy konserwatywne regiony specyficzne dla białka (takie jak domeny homeobox) są obecne w interesującej nas sekwencji nukleotydów z adnotacjami. Sprawdź inne kontigi z tą samą adnotacją pod kątem nakładania się sekwencji nukleotydów, aby wygenerować sekwencję transkryptu specyficznego dla genu.
      UWAGA: Identyfikacja kontigów z nakładaniem się sekwencji zwykle nie jest możliwa dla wszystkich genów, zwłaszcza dla genów o niskiej liczbie kopii.
    7. Jeśli potrzebna jest sekwencja genu o pełnej długości, zacznij od kontigu, który ma największe podobieństwo sekwencji, jako punkt inicjacji do identyfikacji sekwencji nukleotydowej całego dojrzałego transkryptu przy użyciu technik takich jak szybka amplifikacja końców cDNA 3′ i 5′ (klasa RACE19).
    8. Opisz zestaw uzyskany z drugiej platformy, wykonując kroki 1.2.4–1.2.7.
      UWAGA: Idealnie, wyniki powinny być podobne dla interesujących białek; Jednak zasięg może się w pewnym stopniu różnić w zależności od platformy.
    9. Użyj zmontowanego transkryptomu do syntezy specyficznego dla gatunku dsRNA, jak opisano w sekcji 2.

2. Klonowanie i synteza dsRNA specyficzna dla genu

UWAGA: Klonowanie specyficzne dla genu i synteza dsRNA zostały szczegółowo opisane dla T. castaneum20,21,22. Poniższe kroki stanowią krótki przegląd.

  1. Klonowanie, transformacja bakteryjna i sekwencjonowanie plazmidu
    1. Wyizolować całkowite RNA z organizmu (zgodnie z opisem w kroku 1.1) i utworzyć komplementarne DNA (cDNA) za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji (patrz tabela materiałów). Zidentyfikuj jedną lub dwie sekwencje nukleotydowe o długości 100–1000 pz z kontigów, które są specyficzne dla genów będących przedmiotem zainteresowania.
      1. Zaprojektuj pary starterów obejmujące cały zidentyfikowany odcinek nukleotydów i amplifikuj sekwencję poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Dodaj dodatkowy 30-minutowy krok na końcu, aby utworzyć 3′ nawisy adeniny w produkcie amplifikowanego DNA. Oczyść ten produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (patrz tabela materiałów).
    2. Sklonuj oczyszczony produkt do wektora plazmidowego pCR4-TOPO (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem dostawcy dostarczonym z zestawem do klonowania. Stosując leczenie szokiem termicznym, przekształć sklonowane plazmidy w kompetentne komórki bakteryjne (szczep: E.coli DH10B) zgodnie z protokołem dostawcy dla kompetentnych komórek (patrz Tabela materiałów) i przeprowadź badanie przesiewowe pod kątem pomyślnie przekształconych komórek.
      UWAGA: Płytki z koloniami można zawinąć w folię parafinową w celu zatrzymania wilgoci i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
    3. Pobrać kolonie transformowanych komórek za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl i wyhodować w bulionie lizogenicznym (LB) zawierającym ampicylinę (50 μg/ml) w wytrząsarce-inkubatorze w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 200 obr./min przez 24 h.
      UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania, hodowane komórki można rozcieńczyć 1:1 100% glicerolem i zamrozić w temperaturze -80 °C jako zapasy glicerolu.
    4. Wyizoluj plazmidy zawierające gen będący przedmiotem zainteresowania z tej kultury za pomocą zestawu do izolacji miniprep (patrz tabela materiałów). Przechowywać wyizolowane plazmidy (minipreparaty) w temperaturze -20 °C po dokonaniu spektrofotometrycznej oceny wydajności. W szczególności należy zmierzyć absorbancję próbki przy 260 nm, 280 nm i 230 nm. Oblicz proporcje A260/A280 do ilościowego oznaczania DNA i A260/A230 do ilościowego określania czystości DNA.
      UWAGA: Stosunek 260/280 wynoszący 1,8 jest ogólnie akceptowany jako wystarczająco czyste DNA, proporcje niższe niż 1,5 wskazują na obecność resztkowych odczynników ekstrakcyjnych, takich jak fenol. Stosunek 260/230 powinien być większy lub równy stosunkowi 260/280. Niższe proporcje wskazują na resztkowe zanieczyszczenie odczynnikiem. Wydajność zwykle waha się od 100 do 500 ng/μl.
    5. Sekwencjonuj izolowane minipreparaty, aby potwierdzić, że fragment specyficzny dla genu został pomyślnie zintegrowany, będąc otoczony między regionami promotora 5′ T7 i 3′ T3 w plazmidzie; można to zrobić za pomocą uniwersalnych starterów sekwencjonowania T7 i T322. Użyj miniprepów z sekwencją specyficzną dla genu, która jest przedmiotem zainteresowania do przygotowania dsRNA.
  2. Amplifikacja PCR i synteza dsRNA in vitro
    1. Amplifikacja PCR i oczyszczanie produktu
      1. Zaprojektuj startery specyficzne dla plazmidu lub genu, które mają sekwencję promotora T7 po swoich stronach 5' (szczegóły patrz odniesienie22), aby amplifikować liniowy fragment wstawionego genu. Zoptymalizuj wydajność, ustawiając co najmniej 10 reakcji po 20 μl każda.
        UWAGA: Otrzymany produkt jest otoczony dwoma miejscami wiązania polimerazy T7 o ciśnieniu 20 pz.
      2. Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania produktu PCR (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z protokołem elucji opartym na kolumnach dostawcy. Aby zwiększyć wydajność, powtórz ostatni etap elucji do 3 razy z tym samym eluentem. Ocenić wydajność spektrofotometrycznie.
        UWAGA: Wydajność zwykle waha się od 100 do 700 ng/μL. Ten oczyszczony produkt może być przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    2. Synteza i oczyszczanie dsRNA in vitro
      1. Użyj oczyszczonego produktu PCR specyficznego dla genu do syntezy dsRNA in vitro zgodnie z protokołem wybranego zestawu do syntezy dsRNA. W razie potrzeby wydłuż czas inkubacji, aby zwiększyć produkcję dsRNA.
      2. Oceń postęp reakcji na podstawie zmętnienia mieszaniny reakcyjnej (im większa ilość produktu dsRNA, tym większe zmętnienie). Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą leczenia DNazą. W tym celu dodać 1 μl z zapasu 2 U/μl do mieszaniny reakcyjnej. Przedłuż ten zabieg do 1-2 godzin, aby zapewnić optymalną degradację matrycowego DNA.
      3. Oczyść dsRNA za pomocą zestawu do oczyszczania lub wykonując następujące czynności.
        1. Rozcieńczyć otrzymany produkt w 115 μl wody wolnej od nukleaz i dodać 15 μl 3 M octanu sodu. Dodać 2 objętości lodowatego 100% etanolu do tej mieszaniny reakcyjnej i wytrącić dsRNA przez noc w temperaturze -20 °C.
          UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być bezpiecznie przechowywane bez wpływu na ostateczną wydajność.
        2. Odwirować osad w temperaturze 0 °C przez 20 minut przy 9000 x g i odrzucić supernatant. Umyj produkt raz lodowatym 70% etanolem i odwiruj przez 15 minut przy 13000 x g.
        3. Usunąć supernatant i wysuszyć osad na powietrzu przez 5–15 minut. Zawiesić osad w objętości do 40 μl wody wolnej od nukleaz (objętość tę można dostosować w zależności od wielkości izolowanej osadki) i ocenić wydajność i czystość spektrofotometrycznie, jak opisano w ppkt 2.1.4.
        4. Oczyszczone dsRNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Użyj oczyszczonego dsRNA do wstrzyknięcia na pożądanym etapie rozwoju.

3. Pobieranie i przygotowanie wczesnych zarodków T. marmoratus do wstrzyknięć dsRNA

  1. Przygotuj płytkę agarozową do inkubacji zarodków T. marmoratus.
    1. Najpierw rozpuść 20 mg niskotopliwego proszku agarozy w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej (2% agarozy), a następnie gotuj tę mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż do uzyskania klarownego roztworu. Uważaj na gorący roztwór, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować jego przelanie.
    2. Dozuj ten roztwór do małej szalki Petriego. Aby wykonać rowki (które będą utrzymywać zarodki) na powierzchni płytki agarozowej, umieść trzy plastikowe rurki o szerokości 1–2 mm (takie jak końcówki plastikowych pipet transferowych) na powierzchni płynnej agarozy, zanim zastygnie.
    3. Gdy agaroza zastygnie, użyj pary kleszczy, aby usunąć te rurki. Dodać 500 μl autoklawizowanej wody destylowanej za pomocą mikropipety P1000, aby pokryć te wgłębienia w agarozie.
  2. Za pomocą cienkiego pędzla z naturalnego włosia zbierz zarodki T. marmoratus w wieku 5–8 godzin z miejsc gniazdowania chrząszczy w szklanym naczyniu wypełnionym autoklawowaną wodą destylowaną. Często monitoruj miejsca gniazdowania, aby upewnić się, że uzyskane jaja są w odpowiednim wieku.
  3. Dekorionację zarodków pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą drobnych kleszczy preparacyjnych. W tym celu należy zobrazować kosmówkę pod mikroskopem (w pożądanym powiększeniu), ustawiając źródło światła pod odpowiednim kątem, a następnie chwyć kosmówkę z dwóch stron ostrymi kleszczami, rozerwij ją i delikatnie wysuń zarodek. Ponieważ są dwie warstwy, upewnij się, że obie zostały usunięte.
  4. Za pomocą cienkiego pędzla z naturalnego włosia ostrożnie przenieś zarodki ze szklanego naczynia na płytkę agarozową i ułóż je w rowkach pod mikroskopem stereoskopowym. Zachowaj szczególną ostrożność podczas tego procesu, ponieważ zarodki z dekorionacją są bardzo delikatne. Przygotowane zarodki należy wykorzystać do wstrzyknięć dsRNA.
    UWAGA: Nieco grubszy koniec to strona zarodka, w której rozwinie się głowa.

4. mikroiniekcje dsRNA we wczesnym stadium zarodków T. marmoratus

  1. Aby wstrzyknąć zarodki we wczesnym stadium z genowo specyficznym dsRNA, należy przygotować igły do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do igieł do mikroiniekcji (patrz Tabela materiałów). Wizualizując końcówkę igły pod mikroskopem stereoskopowym, użyj pary cienkich kleszczyków, aby złamać końcówkę igły, tworząc ostrą krawędź. Najlepiej złamać końcówkę igły po przekątnej, tak aby po jednej stronie pozostała ostrzejsza krawędź, co pozwoli jej dostać się do zarodka, powodując minimalne obrażenia.
  2. Rozmrozić oczyszczony roztwór podstawowy dsRNA na lodzie, dodać 1 μl 10-krotnego buforu do wstrzykiwań i uzupełnić wodą podwójnie destylowaną, aby uzyskać 10 μl roztworu do wstrzykiwań. Do wstrzykiwań zwykle odpowiednie jest stężenie dsRNA wynoszące 1 μg/μl, ale można je dostosować w zależności od nasilenia fenotypowego otrzymanych zwierząt).
    UWAGA: Przygotuj 1 ml 10x buforu do wstrzykiwań22, dodając 10 μl 0,1 M buforu fosforanu sodu (otrzymanego przez zmieszanie 8,5 ml 1 M Na2HPO4 i 1,5 ml 1 M NaH2PO4 dostosowanego do pH 7,6 w 25 °C ze 100 μL 0,5 M KCl), 100 μl barwnika spożywczego i 790 μl podwójnie destylowanej wody.
    1. Za pomocą pipety P10 napełnij igłę do mikroiniekcji roboczym roztworem dsRNA. Gdy roztwór wypełni końcówkę igły, przymocuj ją do uchwytu na mikroigłę podłączonego do systemu mikroiniekcji, który wykorzystuje technologię wyrzutu ciśnienia (patrz Tabela materiałów).
  3. Włączyć system mikroiniekcji i dopływ sprężonego powietrza. Za pomocą mikrozaworu w systemie mikroiniekcji wyreguluj ciśnienie wtrysku na 15 psi. Wyreguluj czas wstrzyknięcia za pomocą pokrętła regulacji czasu (ustaw je na "Sekundy").
    1. Ponieważ czas trwania wstrzyknięcia zależy od wymaganej objętości iniekcji, w razie potrzeby należy dostosować ten parametr w systemie mikroiniekcji przed każdym wstrzyknięciem. Stosować objętość wstrzyknięcia 1–2 nL w przypadku zarodków T. marmoratus we wczesnym stadium rozwoju.
      UWAGA: Większe objętości wstrzyknięć mają tendencję do ingerowania w przeżywalność zarodków.
  4. Aby zmierzyć objętość płynu iniekcyjnego, który jest dozowany przez system do mikroiniekcji, należy skalibrować igłę do wstrzykiwań, oceniając objętość pęcherzyka płynu, który tworzy się na końcu igły podczas wstrzykiwania do powietrza. W przypadku zarodków T. marmoratus należy użyć optymalnej wielkości pęcherzyków 100–200 μm. Igła do wstrzykiwań jest dobrej jakości, jeśli można to osiągnąć przy ciśnieniu 15 psi przy czasie wstrzyknięcia ~3 s.
  5. Ustawić igłę i płytkę agarozową zawierającą zarodki pod mikroskopem stereoskopowym w taki sposób, aby igła zbliżała się do zarodków pod kątem między 45° a 60°.
  6. Za pomocą mikromanipulatora powoli przesuwaj mikroigłę, monitorując postęp za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Gdy końcówka igły dotknie powierzchni zarodka, ostrożnie przesuń igłę do przodu, aż przebije powierzchnię zarodka. Nie należy głęboko przebijać zarodka końcówką igły, ponieważ może to wpłynąć na przeżycie zarodka. Aby zmniejszyć zmienność, należy wykonać wstrzyknięcie w środku zarodka.
  7. Gdy igła znajdzie się w zarodku, ostrożnie naciśnij przycisk wstrzyknięcia mikrowstrzykiwacza, aby dostarczyć dawkę dsRNA do zarodka. Po wstrzyknięciu 1–2 nL dsRNA należy powoli wycofać igłę z zarodka, tak aby nie spowodowało to pęknięcia zarodka.
    1. Pozostałe zarodki należy wstrzyknąć w podobny sposób. Jeśli igła do mikroiniekcji zostanie zablokowana podczas zabiegu, należy ją odblokować, zwiększając ciśnienie i czas trwania iniekcji. Wizualnie identyfikuj pomyślnie wstrzyknięte zarodki na podstawie obecności kolorowej plamki w miejscu wstrzyknięcia (ponieważ bufor do wstrzyknięć zawiera barwnik spożywczy).
  8. Ostrożnie umieść naczynie z wstrzykniętymi zarodkami w komorze wilgotnościowej.
    1. Aby zbudować taką komorę, weź dowolne plastikowe pudełko z pokrywką, wysterylizuj je 70% etanolem, pozostaw do wyschnięcia i umieść na dnie tkankę nasączoną wodą w autoklawie, aby zapewnić wilgotne środowisko. Umieść tę komorę wilgotnościową w inkubatorze o odpowiedniej temperaturze (w tym przypadku 25 °C) i cyklu świetlnym trwającym 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.
  9. Pozwól, aby wstrzyknięte zarodki rozwinęły się w larwy w pierwszym stadium rozwojowym, co wymaga 4–5 dni. Codziennie monitoruj postęp rozwoju zarodka za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zidentyfikować morfologicznie widoczne fenotypy knockdown, jak pokazano na Rysunek 2.
  10. Udokumentuj ten postęp, robiąc zdjęcia cyfrowe za pomocą aparatu o wysokiej rozdzielczości. Usuń martwe zarodki i codziennie uzupełniaj wodę na płytce agarozy, aby uniknąć wysuszenia i możliwego rozprzestrzenienia się zanieczyszczenia mikrobiologicznego na inne zarodki, które przeżyły podczas okresu inkubacji.
  11. Wykonaj odpowiednie kontrole dla wstrzyknięć dsRNA, w tym wstrzyknięć buforowych, wstrzyknięć dsRNA syntetyzowanych przeciwko nici sensownej genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz wstrzyknięć dsRNA syntetyzowanych przeciwko sekwencjom, które nie istnieją w organizmie docelowym. Potwierdź knockdown RNAi za pomocą dodatkowych metod molekularnych22.

5. Przygotowanie larw T. marmoratus do iniekcji dsRNA

UWAGA: W przeciwieństwie do wczesnych stadiów zarodków, larwy T. marmoratus są stosunkowo mocne i mogą być wstrzykiwane większymi objętościami. Na przykład w drugim stadium rozwojowym można wstrzyknąć do 2 μl roztworu roboczego dsRNA, a w trzecim stadium rozwojowym co najmniej 3 μl bez zauważalnego negatywnego wpływu na przeżywalność. Aby wstrzyknąć dsRNA, pomocne jest unieruchomienie larw poprzez osadzenie ich w agarozie.

  1. Przed zebraniem larw rozpuść 2% agarozy i przechowuj ją w łaźni wodnej w temperaturze 60–70 °C, aby utrzymać ją w postaci płynnej. Przygotuj naczynie do unieruchomienia, wlewając stopioną 2% agarozę do małej szalki Petriego, a następnie schładzając do zestalenia. Użyj kleszczy, aby zrobić płytki rowek w płytce agarozowej (mniej więcej wielkości stawonoga, który ma być osadzony) dla każdego zwierzęcia, które zostanie wstrzyknięte.
  2. Zebrać młode larwy w odpowiednim stadium rozwojowym (jeden etap przed etapem pożądanym do analizy). Aby to zrobić, ostrożnie spuść wodę z kubków hodowlanych zawierających larwy i postępuj zgodnie z instrukcjami wymienionymi poniżej.
  3. Znieczulenie na lodzie (ostrożnie wyjmij larwę z kubka z wodą i delikatnie umieść ją na lodzie), aż larwa nie wykaże żadnych zauważalnych ruchów. Użyj, miękko zakończonych kleszczy, aby ostrożnie podnieść larwę z lodu i umieścić ją na etapie unieruchomienia z szyją i ciałem w rowku, ale ogonem umieszczonym nad powierzchnią agarozy, tak aby nie był zakryty, co pozwala larwie kontynuować oddychanie przez przetchlinki ogona.
  4. Przykryj larwę grubą warstwą agarozy, która jest nadal płynna, ale nie niebezpiecznie gorąca. Jeśli został przypadkowo zakryty, użyj kleszczy, aby uwolnić ogon i dwa segmenty pod nim z agarozy. Gdy agaroza zastygnie, użyj larwy do wstrzyknięć dsRNA.

6. mikroiniekcja dsRNA u larw T. marmoratus

  1. Przygotować igłę do mikroiniekcji i wypełnić ją żądaną ilością roztworu roboczego dsRNA specyficznego dla genu (zgodnie z opisem w krokach 4.1–4.2). Umieścić igłę w uchwycie igły podłączonym do ręcznie sterowanej strzykawki do mikroiniekcji. Przed założeniem igły należy całkowicie wyciągnąć tłok strzykawki, aby uniknąć wyczerpania ciśnienia wstrzyknięcia w trakcie zabiegu.
  2. Unieruchomioną larwę należy ustawić w taki sposób, aby miejsce wstrzyknięcia, które znajduje się grzbietowo między trzecim a czwartym segmentem płytki ciała, było wyrównane z trajektorią igły do mikroiniekcji pod stosunkowo płaskim kątem (prawie równolegle do stadium).
    UWAGA: Ustawienie igły i larwy pod kątem w tej pozycji jest ważne, ponieważ zapewnia ścieżkę najmniejszego oporu dla końcówki igły, aby przebić larwy przy minimalnych uszkodzeniach.
  3. Po umieszczeniu igły i larwy ostrożnie wsuń końcówkę igły do larwy za pomocą mikromanipulatora, monitorując postęp za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
  4. Po tym, jak końcówka przebije tkankę, powoli i ostrożnie dociśnij strzykawkę. Wyreguluj ciśnienie iniekcji, obserwując ruch kolorowego płynu iniekcyjnego w igle pod mikroskopem.
  5. Po wstrzyknięciu należy ostrożnie wycofać igłę. Użyj miękkich kleszczy, aby oderwać, a tym samym uwolnić larwę z agarozy. Przenieść larwę z powrotem do pojemnika z wodą (o temperaturze pokojowej) i pozwolić jej na dalszy rozwój w inkubatorze lub pomieszczeniu do hodowli w temperaturze 25–28 °C i cyklu świetlnym trwającym 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.
  6. Zastosować odpowiednie zastrzyki kontrolne i kwantyfikacje knockdown, jak opisano w kroku 4.10.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, zniszczyliśmy trzy różne geny, a mianowicie white, laccase2 (lac2) i Lens3 (Tabela 1), na różnych etapach rozwoju Sunburst Diving Beetle T. marmoratus. Przeprowadziliśmy RNAi u T. marmoratus, wstrzykując dsRNA na bardzo wczesnym etapie podczas embriogenezy (Figura 1A). Ponieważ niektóre zarodki nie przeżywają tego procesu i stają się nekrotyczne (Ryc. 1B), muszą zostać usunięte, aby utrzymać pozostałe zarodki w zdrowiu. Przykładem są tutaj zastrzyki dsRNA przeciwko białemu genowi. Gen ten jest dobrze znany u Drosophila jako jeden z trzech transporterów kasety wiążącej ATP (ABC) biorących udział w wychwytywaniu i przechowywaniu prekursorów pigmentu oka23. W związku z tym utrata funkcji skutkuje niepigmentowanym, białym fenotypem oczu. Nasze wyniki pokazują, że wstrzyknięcia dsRNA ukierunkowane na ortologiczny gen bieli w zarodkach T. marmoratus prowadzą do utraty pigmentacji oczu u nowo pojawiających się larw. W tym przypadku larwy typu dzikiego charakteryzują się silnie pigmentowanymi oczami, a knockdown RNAi bieli prowadzi do różnych poziomów redukcji, a nawet całkowitej eliminacji pigmentu oka. Ogólnie rzecz biorąc, zaobserwowaliśmy co najmniej pewne zmniejszenie zabarwienia oczu u 34% ocalałych zarodków (n = 35). Rysunek 2A porównuje osobę kontrolną i osobę o nieco jaśniejszym kolorze oczu. Rysunek 2B ilustruje poważniejszy nokdaun u osoby, w którym bardziej brzuszne oczy (Oczy 2-5) w klastrze są całkowicie niepigmentowane, podczas gdy oczy grzbietowe nadal wykazują pewną pigmentację. Różnice te podkreślają, w jaki sposób skuteczność knockdownu może różnić się regionalnie, co może być związane z różnicami w skuteczności penetracji dsRNA w gęstej tkance. Inna osoba wykazuje zasadniczo całkowitą utratę pigmentu we wszystkich oczach (Rysunek 2C).

Aby zbadać, jak dobrze RNAi działa w stadium larwalnym T. marmoratus, wstrzyknęliśmy dsRNA ukierunkowane na gen garbnika lac2 larwom drugiego stadium na kilka dni przed planowanym topnieniem do trzeciego stadium rozwojowego (Rysunek 3) i oceniliśmy wpływ na ubarwienie skórki larw trzeciego stadium rozwojowego. Lac2 to rodzaj fenolooksydazy, która oksydacyjnie sprzęga białka, czyniąc je nierozpuszczalnymi, twardszymi i ciemniejszymi. Wykazano, że powalenie chrząszcza mącznego T. castaneum prowadzi do jaśniejszych osób w niskich dawkach, ale jest uważane za śmiertelne w wysokich dawkach24. Rysunek 4 ilustruje, że ten zabieg prowadzi również do powstania jaśniejszych larw Sunburst Diving Beetle. W szczególności w tym eksperymencie 75% larw, którym przeżyliśmy, miało zmniejszoną pigmentację (w porównaniu z 0% w grupie kontrolnej). Rycina 4A przedstawia osobnika ze stosunkowo łagodną depigmentacją, podczas gdy Rycina 4C ilustruje głowę larwy T. marmoratus, u której ciemne zabarwienie naskórka jest prawie nieobecne. Depigmentacja była szczególnie widoczna w przypadku centralnego ciemnego wzoru, który jest typowy dla tych larw, podczas gdy wzór ten pozostał wyraźnie widoczny u osobnika, któremu wstrzyknięto kontrolnie (Ryc. 4B). Ponadto zaobserwowano rozjaśnienie tchawicy ogonowej, jak pokazano na Rysunek 4D. W przypadku, gdy lac2 dsRNA wstrzyknięto larwom trzeciego stadium rozwojowego, uzyskano lżejsze dorosłe osobniki (Ryc. 5). Zwróć uwagę, że skrzydła powalonego chrząszcza są nieco zdeformowane, prawdopodobnie z powodu jego niezwykłej miękkości.

Oprócz zmiany cech morfologicznych, możliwe jest użycie RNAi do celowania w geny, które wpływają na zachowanie. Aby to zademonstrować, przeprowadziliśmy RNAi na kluczowym genie kodującym białko soczewki, Lens318, i wstrzyknęliśmy go do larw drugiego stadium rozwojowego, aby wpłynąć na właściwości optyczne oczu larw trzeciego stadium rozwojowego. Jakikolwiek wpływ na soczewkę obserwowany tutaj jest prawdopodobny, ponieważ oczy larw T. marmoratus przechodzą znaczny wzrost oka podczas tego przejścia, co wiąże się również z poważnymi zmianami optycznymi soczewki25. Knockdown RNAi w tym eksperymencie był bardzo skuteczny. Weryfikacja za pomocą qPCR wykazała 100% skuteczność; Spośród 13 badanych osób, 12 zostało znokautowanych do mniej niż 10% poziomu ekspresji osób kontrolnych, a pozostała osoba miała poziom ekspresji 17% poziomu kontrolnego (obserwacja niepublikowana). Na poziomie fenotypowym tylko niektóre osobniki były poważnie upośledzone lub niezdolne do chwytania zdobyczy, co ilustruje Rysunek 6 dla osobnika, który wielokrotnie zbliżał się do swojej ofiary z bardzo bliskiej odległości, ale konsekwentnie ją przestrzeliwał.

Tabela 1: Sekwencje starterów i amplikony dla białek, lac2 i Lens3. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-results-1
Rycina 1: Ilustracja wstrzyknięć zarodków. (A) Zarodki pozbawione chorówki ustawione w rzędzie na płytce agarozowej i wstrzyknięte w pobliżu ich środka za pomocą igły do mikroiniekcji wypełnionej dsRNA i buforem do wstrzykiwań zawierającym barwnik spożywczy. Pasek skali reprezentuje 500 μm. (B) Osoba z poważniejszym nokdaunem. Wstrzyknięte zarodki są trzymane w komorze wilgotnościowej i codziennie monitorowane w celu oceny fenotypów i usunięcia martwych osobników (które brązowieją). Podziałka reprezentuje 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Przykład w pełni rozwiniętych zarodków, którym wstrzyknięto dsRNA na tle bieli. (A) Porównanie osoby z redukcją pigmentacji oczu (po lewej) i osoby, której wstrzyknięto skórę kontrolną (po prawej). E1–E6 odnoszą się do Oczu 1–6. (B) Osoba z poważniejszym fenotypem nokdaunu, co ilustruje, że czasami niektóre oczy w grupie są bardziej dotknięte nokdautem, niż inne. (C) Osoba z prawie całkowitą utratą pigmentacji oczu. Podziałka skali reprezentuje 200 μm; Panele B i C są reprezentowane w tej samej skali. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Ilustracja wstrzyknięć larw. (A) Kilka larw unieruchomionych przez zanurzenie w 2% agarozie z przetchlinkami ogonowymi pozostawionymi z dala od jakiejkolwiek agarozy. (B) Mikroelektroda zawierająca roztwór do wstrzykiwań umieszczona w taki sposób, aby jej końcówka mogła przeniknąć przez cienką błonę między dwoma segmentami. (C) Niebieski barwnik do wstrzykiwań widoczny w miejscu wstrzyknięcia po wstrzyknięciu. Podziałka skali wynosi 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: RNAi dla lakazy2 zastosowana do larw w drugim stadium rozwojowym, co skutkuje zmniejszonym zabarwieniem naskórka u larw w trzecim stadium rozwojowym. (A) Stosunkowo łagodna utrata zabarwienia u osobnika lac2 RNAi (na dole) w porównaniu z osobnikiem, któremu wstrzyknięto kontrolnie (na górze). Podziałka skali reprezentuje 5 mm. (B) Głowa osobnika kontrolnego z charakterystycznym ciemnym wzorem w środku głowy. (C) Stosunkowo silne powalenie lac2 prowadzące do prawie całkowitej utraty centralnego zabarwienia głowy. (D) Utrata zabarwienia w głównym kutyku ogona osobnika lac2 RNAi (na dole) w porównaniu z osobnikiem, któremu wstrzyknięto kontrolnie (na górze). Podziałka liniowa w B\u2012D reprezentuje 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 5: RNAi dla lakazy2 nałożony na larwę w trzecim stadium rozwojowym, co skutkuje zmniejszeniem zabarwienia naskórka u osoby dorosłej. Osobnik powalający (po lewej) charakteryzuje się również bardzo miękką elytrą w porównaniu z kontrolą (po prawej). Podziałka reprezentuje 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Knockdown głównego białka soczewki prowadzący do braków w chwytaniu zdobyczy. (A–C). Trzy przykłady, w których larwa chrząszcza nurkującego Sunburst, u której deficyty optyczne były indukowane przez RNAi, nie była w stanie złapać zdobyczy (larw komarów). Reprezentatywne zdjęcia zostały wybrane z nagrania wideo przedstawiającego charakterystyczne schwytanie zdobyczy. (D) Zwalczanie larw łapiących zdobycz. Wszystkie paski skali reprezentują 2 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naszym celem jest, aby ta kompilacja metod sprawiła, że RNAi stanie się szeroko dostępny, zwłaszcza że narzędzie to pozostaje potężną techniką synergiczną do edycji genów opartej na CRISPR/Cas9, z tą zaletą, że można je zastosować do pożądanych etapów rozwoju badanych organizmów. Aby zilustrować tę siłę, wstrzyknęliśmy dsRNA do zarodków i do różnych stadiów larwalnych. Wstrzyknięcia do jaj wpływały na rozwój zarodków (ryc. 2), wstrzyknięcia do drugiego stadium larwalnego miały wyraźny wpływ na trzecie stadium larwalne (ryc. 4 i ryc. 6), a wstrzyknięcia do trzeciego stadium larwalnego wykazały efekty u dorosłych (ryc. 5). Chociaż dokładny czas musi być ustalony eksperymentalnie, zazwyczaj zastrzyki zaczynają działać w ciągu kilku dni. Na powodzenie tego procesu może mieć wpływ długość sekwencji dsRNA. Tutaj przedstawiliśmy przykłady z użyciem nieco ponad 200 pb do ponad 800 pz. Z reguły preferowane są sekwencje od 100 do 600 pz w celu ograniczenia efektów niedocelowych, ale sekwencje do 1000 pz dają dobre wyniki22. Jednym z pytań dotyczących RNAi jest czas trwania knockdownu, który można osiągnąć za pomocą tej techniki. Ponieważ fenotypy były terminalne na każdym etapie, nie możemy komentować tej kwestii na podstawie przedstawionych przez nas wyników. Jednak wcześniej zauważono, że efekty RNAi są na ogół stosunkowo długotrwałe, a wyższe stężenia prowadzą do dłużej utrzymujących się knockdownów20.

Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że działa ona lepiej dla niektórych organizmów niż dla innych i wydaje się, że nie ma bezpośredniego sposobu na przewidzenie, jak dobrze będzie działać a priori. Niemniej jednak stwierdzono, że działa dobrze w przypadku wielu różnych organizmów. Wśród stawonogów obejmuje to pajęczaki26, skorupiaki27 i różne owady, ze szczególnie wysokimi wskaźnikami powodzenia u chrząszczy28. Kolejną komplikacją jest to, że różnice w nasileniu fenotypu często występują między osobnikami pomimo zastosowania tej samej ilości dsRNA. Jak pokazano na rysunku 2B, zmienność może wystąpić nawet w obrębie pojedynczej osoby. W naszych badaniach RNAi ukierunkowanych na różne geny zaangażowane w rozwój larwalnego oka T. marmoratus często stwierdzaliśmy, że niektóre oczy są dotknięte bardziej poważnie niż inne. Zjawisko to może być związane ze stosunkowo gęstą tkanką klastra oka, przy czym dsRNA jest w stanie lepiej dotrzeć do niektórych jednostek.

Dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów z RNAi kluczowe znaczenie ma optymalizacja kilku parametrów dla genu docelowego. Na przykład stężenie dsRNA i długość docelowego genu mogą silnie wpływać na wynik20. Innym krytycznym parametrem jest sposób wykonywania zastrzyków, ponieważ proces ten może znacznie wpłynąć na wskaźnik przeżycia. W przypadku zarodków najlepsze wyniki osiągnęliśmy, celując w środek zarodka. Dobrze rozłożona płytka pozwala na wstrzyknięcie 100 lub więcej zarodków podczas jednej sesji. W przypadku larw bardzo ważne jest wprowadzenie igły iniekcyjnej między segmenty. Te zastrzyki wymagają więcej dsRNA, a w oparciu o dostępność larw, nasze zestawy iniekcyjne zazwyczaj składały się tylko z kilku zwierząt na raz. W przypadku wszystkich wstrzyknięć bardzo ważne jest, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do organizmu.

W niektórych przypadkach pętle sprzężenia zwrotnego sieci regulacyjnej genów i redundancja genetyczna mogą wpływać na penetrację fenotypów RNAi, pomimo konsekwentnych knockdownów. Wydaje się, że tak jest w przypadku naszych obserwacji behawioralnych larw z bardzo udanym knockdownem wybitnego białka soczewki, Lens318. Chociaż zweryfikowaliśmy wysoką skuteczność tych knockdownów za pomocą qPCR, zaobserwowano znaczną zmienność w powiązanych fenotypach. Wynik ten podkreśla konieczność prawidłowego ilościowego określenia knockdownów RNAi (szczegółowe informacje na temat opcji znajdują się w22). Jeśli nie ma jasnych oczekiwań a priori w odniesieniu do otrzymanych fenotypów, dobrym sposobem kontrolowania efektów RNAi poza celem jest celowanie w ten sam gen z dwiema nienakładającymi się sekwencjami dsRNA i ocena wyników dla wspólnych fenotypów.

W przeciwieństwie do technik edycji genów, RNAi jest również potężnym narzędziem do badania genów letalnych, a można to zrobić na dwa sposoby. Na przykład, jeśli ktoś jest zainteresowany funkcjonalnym wkładem genu, o którym wiadomo, że utrata funkcji na wczesnym etapie rozwoju jest śmiertelna, funkcjonalne badanie takiego genu można osiągnąć, po prostu pozwalając zwierzęciu normalnie się rozwijać, a następnie niszcząc gen za pomocą RNAi w późniejszym okresie rozwoju (tj. u osoby dorosłej). Alternatywnie, gen, o którym wiadomo, że całkowita utrata funkcji jest śmiertelna, może być badany poprzez częściowe knockdown, które można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie szeregu stężeń dsRNA. Niektóre z naszych wyników wskazują na powalanie lac2, o którym wiadomo, że jest śmiertelne, jeśli naskórek owadów staje się zbyt miękki24. Nawet chrząszcz lac2 RNAi przedstawiony na rysunku 5 prawdopodobnie nie miałby szans na przetrwanie poza warunkami laboratoryjnymi. Inny śmiertelny gen zostaje wycięty, który koduje czynnik transkrypcyjny, który ma fundamentalne znaczenie dla specyfikacji losu komórki w różnych układach narządów u stawonogów i został powiązany z rozwojem gleju w układzie wzrokowym Drosophila 29. Opierając się na naszych doświadczeniach z ciętym RNAi w zarodkach T. marmoratus , możemy wywołać informacyjne fenotypy oka u zarodków, które są w stanie zakończyć swój embrionalny rozwój oka (obserwacje niepublikowane). W tym przypadku wyższe dawki wydają się prowadzić do wyższych wskaźników śmiertelności, podczas gdy niższe dawki skutkują obserwowalnymi i pouczającymi fenotypami.

Nasz protokół nie tylko wymienia niezbędne kroki, które badacz musi podjąć, aby przeprowadzić eksperymenty RNAi na T. marmoratus, jak pokazano na ilustracji, ale także ma ogólne zastosowanie do innych organizmów, zwłaszcza organizmów wodnych. Wśród organizmów wodnych istnieje już kilka przykładów wśród skorupiaków, takich jak rozwielitki Daphnia30 i krewetki (niedawny przegląd znajduje się w odnośniku31). Owady wodne mają wiele możliwości, ponieważ szacuje się, że stanowią one około 6% całej różnorodności owadów, z prawdopodobnymi ponad 200 000 gatunków32. Co więcej, RNAi zostało już przeprowadzone na wędrowcach wodnych, które mają tendencję do zamieszkiwania powierzchni środowisk wodnych33. Jeśli nie ma genomu, transkryptom może zostać złożony de novo. Tak długo, jak proces ten ujawnia kontigi kilkuset nukleotydów, można zaprojektować dsRNA przeciwko określonym genom. Nasz protokół unieruchamiania owadów w agarozie prawdopodobnie będzie również przydatny w innych procedurach, zwłaszcza w przypadku organizmów miękkich, plastycznych i wodnych. Podsumowując, RNAi pozostaje potężną techniką manipulowania ekspresją genów w zróżnicowanej grupie organizmów, nawet jeśli nie są dostępne żadne inne narzędzia molekularne i genetyczne.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Joshowi Benoit za pomoc w bioinformatyce, Hailey Tobler za pomoc w hodowli Sunburst Diving Beetles oraz Tamarze Pace za pomoc redakcyjną. Badania te były wspierane przez National Science Foundation w ramach grantów IOS-1456757 i IOS-1856341 dla EKB i IOS1557936 dla YT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Izolacja RNA i montaż transkryptomu de novo
ciekły azotMagazynZazwyczaj lokalnie dostępne w instytucjach badawczych
końcówki do pipetFisher Scientificzależne od rozmiaruProdukty od innych dostawców będą działać równie dobrze
Mini zestaw tkanki lipidowej RNeasy (zestaw do izolacji RNA)Qiagen74804Szczegółowy specyficzny protokół jest dostarczany z zestawem
spektrofotometru (NnanoDrop)Thermo Fisher9836674Inne modele będą działać równie dobrze
1.2. De novo transcriptom assembly.
BUSCO.v3https://busco.ezlab.org/Do oceny kompletności trasncriptomu można użyć dowolnego ogólnodostępnego oprogramowania.
Środowisko pracy CLC GenomicsQiagen832021Dostępne są również inne równoważne pakiety oprogramowania
Galaxy Workbenchhttps://usegalaxy.org/Internetowy potok montażu i adnotacji transkryptomu
NCBI BLASTxo otwartymInternetowy potok
open source2. synteza cDNA, klonowanie i Izolacja Miniprep
ampicillin sól sodowaGibco11593-027Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze
glicerolFisher ScientificG33-500Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze
Rosół LBFisher ScientificBP1426-500Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze
Zestaw Omniscript RT (odwrotna transnscencja)Qiagen205111Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
One Shot™ TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogenC404010Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
szalki PetriegoFisher Scientific FB0875713Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermoFischer771471Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
wytrząsarka-inkubatorLabnet211DSInne modele będą działać równie dobrze
spektrofotometr (NnanoDrop)Thermo Fisher9836674Inne modele będą działać równie dobrze
termocykler do PCRBioRadT100Inne modele będą działać równie dobrze
TOPO TA Zestaw do klonowaniaInvitrogen1845069Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
X-Gal SolutionThermo ScientificR0941Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze
2.2 PCR amplifikacja i synteza in vitro dsRNA
WirówkaFisher ScientificaccuSpin Micro 17RInne modele będą działać równie dobrze
etanolFisher ScientificA4094Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze
FastTaq DNA Polymerase, dNTPackRoche13873432Ten zestaw zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do
czyszczenia PCR MEGAclear TranscriiptionThermoFischerAM1908Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7ThermoFischerAM1334Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
wolna od nukleazFisher ScientificAM9932Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem
octan soduFisher ScientificBP333-500Zrób roztwór roboczy 3M
Spektrofotometr (NnanoDrop)Thermo Fisher9836674Inne modele będą działać równie dobrze
3. Pobieranie i przygotowanie zarodków T. marmoratus we wczesnym stadium do wstrzyknięć dsRNA
agarozaFisher Scientific9012-36-6Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze
destylowanaFisher Scientific9180Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze
kleszcze (Dumon #4 Biologia)Fine Science Tools11242-40Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze
naczynie ze szklaną wnęką (naczynie 3-dołkowe)Fisher Scientific50-243-43Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze
Kuchenka mikrofalowaGramofonWelbiltInne modele sprawdziłyby się równie dobrze
pędzel do włosów naturalnychAmazonKażdy cienki pędzel zrobi
P1000 mikropipeterGilsonF123602Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze
Szalki PetriegoFisher ScientificFB0875713Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze
Mikroskop stereoskopowy Centralna10446293Każdy dobry mikroskop stereoskopowy będzie działał
Pipety transferoweFisher Scientific21-200-109Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze
4. mikroiniekcje dsRNA we wczesnym stadium zarodków T. marmoratus
aparat cyfrowyOptyka Edmunda (Qimaging)Retiga 2000RInne modele sprawdziłyby się równie dobrze
etanolFisher ScientificA4094Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze barwnik
spożywczyKrogerKażdy dostępny barwnik spożywczy powinien praca
komorafine weź dowolne plastikowe pudełko z pokrywką, wysterylizuj je 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia
inkubatorLabline203Inne modele będą działać równie dobrze
buforPrzygotowany na 1 ml zgodnie z odniesieniem #22 : Wymieszaj 10 i mikro; L 0,1 M buforu fosforanu sodu, 100 &mikro; L 0,5 M roztworu chlorku potasu, 100 &mikro; L barwnika spożywczego i 790 &mikro; L wody podwójnie destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
wewnątrzkomórkowe systemy mikroiniekcyjne (Picospritzer)Parker052-0500-900Obecnie dostępny jest model III, ale w starszych modelach działa również
uchwyt na mikroigłySystemy A-M 672441Równie dobrze sprawdzą się inne produkty
igły do mikroiniekcji (1,2 mm x 0,68 mm, 4 cale)Systemy A-M603000Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze
mikromanipulatorDrummond Scientific Company3-000-024-RKażdy wysokiej jakości mikromanipulator będzie działał
fosforan soduFischer scientific7558-80-7Aby przygotować 10 ml 1 M roztworu roboczego: Dodaj 1,2 g proszku fosforanu sodu do 10 ml podwójnie destylowanej wody i mieszaj, aż do uzyskania klarownego roztworu
P-1000 Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP-1000Ustawienia ściągacza: Ciepło 575, Ciąg 60, Prędkość 75, Opóźnienie 110, Ciśnienie 700.
Mikropipeter P10GilsonF144802Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze
Mikropipeter P1000GilsonF123602Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze
Chlorek potasuFischer scientific7447-40-7Aby przygotować 100 ml 0,5 M roztworu chlorku potasu: Dodać 3,73 g kryształów chlorku potasu do 100 ml podwójnie destylowanej wody i mieszać do uzyskania klarownego roztworu.
Bufor fosforanu sodu (0,1 M)Aby przygotować 10 ml z 0,1 M tego buforu: Zmieszać 8,5 ml 1 M roztworu dwuzasadowego fosforanu sodu z 1,5 ml 1 M roztworu fosforanu monosodowego. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i dostosuj odpowiednio do pH 7,6 w temperaturze pokojowej.
fosforan sodu dwuzasadowyFischer scientific7558-79-4Aby przygotować 10 ml 1 M roztworu roboczego: Dodać 1,42 g dwuzasadowego fosforanu sodu w proszku do 10 ml podwójnie destylowanej wody i mieszać do uzyskania klarownego roztworu
stereoskopowy10446293Centralnydobry mikroskop stereoskopowy będzie działał
5. Przygotowanie larw T. marmoratus do wstrzyknięć dsRNA
agarozaFisher Scientific9012-36-6Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze
kleszcze (Dumon #4 Biology)Fine Science Tools11242-40Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze
szalki PetriegoFisher ScientificFB0875713Równie dobrze
6. Mikroiniekcje dsRNA w larwy T. marmoratus
bufor do iniekcji (10x)Patrz rozdział 4
igły do mikroiniekcji (1,2 mm x 0,68 mm, 4 cale)Systemy AM603000Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze
mikroiniekcja strzykawkaA-M Systems603000Inne modele będą działać równie dobrze
na mikroigłySystemy AM672441Inne produkty będą działać równie dobrze
P-1000 Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP-1000Ustawienia ściągacza: Heat 575, Pull 60, Velocity 75, Delay 110, Pressure 700.
mikroskop stereoskopowyMikroskop Centralny10446293Każdy dobry mikroskop stereoskopowy będzie działał
uniwersytecki kodzie źródłowym https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx wyrównywania i adnotacji typu woda woda wilgotności do wstrzykiwań mikroskop Każdy sprawdzą się produkty innych dostawców uchwyt

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
  2. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  3. Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469(2018).
  4. Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280(2016).
  5. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
  6. Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  9. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431, 338-342 (2004).
  10. Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657(2003).
  11. Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
  12. Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
  13. Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
  14. Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
  15. Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
  16. ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15(2011).
  17. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059(2014).
  18. Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
  19. Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
  20. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
  21. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
  22. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
  23. Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
  24. Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
  25. Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
  26. Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
  27. Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
  28. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
  29. Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184(2015).
  30. Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
  31. Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
  32. Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
  33. Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Developmental StagesDouble Stranded RNAMicroinjection TechniqueEmbryo InjectionLarval InjectionGene KnockdownPhenotypic AnalysisAquatic Beetle

Powiązane artykuły