Artykuł metodologiczny

Wykrywanie Phytophthora capsici w wodzie do nawadniania za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli

DOI:

10.3791/61478

⸱

25 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy metodę wykrywania zoospor Phytophthora capsici w źródłach wody za pomocą metody ekstrakcji DNA z bibuły filtracyjnej w połączeniu z testem amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), który może być analizowany w terenie lub w laboratorium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora capsici to niszczycielski patogen omięcia, który atakuje wiele ważnych upraw psiankowatych i dyniowatych, powodując znaczne straty ekonomiczne w produkcji warzyw rocznie. Phytophthora capsici jest przenoszona przez glebę i stanowi uporczywy problem na polach warzywnych ze względu na długotrwałe struktury przetrwania (oospory i chlamydospory), które są odporne na wietrzenie i degradację. Główną metodą dyspersji jest produkcja zoospor, które są jednokomórkowymi, wiciowymi zarodnikami, które mogą pływać w cienkich warstwach wody obecnych na powierzchni lub w porach glebowych wypełnionych wodą i mogą gromadzić się w kałużach i stawach. Dlatego stawy irygacyjne mogą być źródłem patogenu i początkowymi punktami ognisk choroby. Wykrycie P. capsici w wodzie do nawadniania jest trudne przy użyciu tradycyjnych metod opartych na kulturach, ponieważ inne mikroorganizmy obecne w środowisku, takie jak Pythium spp., zwykle przerastają P. capsici, czyniąc go niewykrywalnym. Aby określić obecność zarodników P. capsici w źródłach wody (woda do nawadniania, spływ itp.), Opracowaliśmy metodę bibuły filtracyjnej na bazie pompy ręcznej (8-10 μm), która wychwytuje zarodniki patogenu (zoospory), a następnie jest wykorzystywana do amplifikacji DNA patogenu za pomocą nowatorskiego testu amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) zaprojektowanego do specyficznej amplifikacji P. capsici. Ta metoda może amplifikować i wykrywać DNA od stężenia tak niskiego jak 1,2 x 102 zoospory/ml, które jest 40 razy bardziej czułe niż konwencjonalny PCR. Nie uzyskano amplifikacji krzyżowej podczas badania blisko spokrewnionych gatunków. Badanie LAMP wykonano również przy użyciu barwnika kolorymetrycznego LAMP master mixe, wyświetlając wyniki, które można było odczytać gołym okiem w celu szybkiego wykrycia na miejscu. Protokół ten można dostosować do innych patogenów, które przebywają, gromadzą się lub są rozpraszane przez zanieczyszczone systemy nawadniające.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recykling wody w gospodarstwach rolnych i szkółkach staje się coraz bardziej popularny ze względu na wzrost kosztów wody i troski o środowisko związane z zużyciem wody. Dla hodowców opracowano wiele metod nawadniania, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się i występowanie chorób roślin. Niezależnie od źródła wody (nawadnianie lub opady), generowany jest spływ, a wielu hodowców warzyw i szkółek ma staw do zbierania i recyklingu spływu1. Tworzy to rezerwuar dla możliwej akumulacji patogenów, sprzyjając rozprzestrzenianiu się patogenów, gdy woda z recyklingu jest używana do nawadniania upraw2,3,4. Patogeny roślin lęgniowców szczególnie korzystają z tej praktyki, ponieważ zoospory gromadzą się w wodzie, a główny zarodnik dyspersyjny jest samoruchliwy, ale wymaga wody powierzchniowej5,6,7. Phytophthora capsici jest patogenem lęgniowców, który w różny sposób atakuje znaczną liczbę roślin psiankowatych i dyniowatych8. Często objawami są zgorzel siewek, zgnilizna korzeni i korony; Jednak w przypadku upraw takich jak ogórek, dynia, melon, dynia, arbuz, bakłażan i pieprz, całe zbiory mogą zostać utracone z powodu zgnilizny owoców9. Chociaż znane są metody wykrywania tego patogenu roślinnego, większość z nich wymaga, aby infekcja już miała miejsce, co jest zbyt późne, aby jakiekolwiek zapobiegawcze fungicydy miały znaczący efekt10.

Tradycyjna metoda badania wody do nawadniania w celu wykrywania i diagnozowania docelowych mikroorganizmów jest przestarzałym podejściem, gdy szybkość i czułość są kluczowe dla sukcesu i opłacalnej produkcji roślinnej11,12. Tkanka roślinna podatna na docelowy patogen (np. bakłażan dla P. capsici) jest przymocowana do zmodyfikowanej pułapki, która jest zawieszona w stawie irygacyjnym przez dłuższy czas, zanim zostanie usunięta i sprawdzona pod kątem infekcji. Próbki z tkanki roślinnej są następnie siane na pożywkach półselektywnych (PARPH) i inkubowane w celu wzrostu kultur, a następnie identyfikacja morfologiczna jest przeprowadzana za pomocą mikroskopu złożonego13. Istnieją inne podobne metody wykrywania innych patogenów roślin, wykorzystujące selektywne podłoża i posiewanie niewielkich ilości skażonej wody przed podhodowlą14,15. Metody te wymagają od 2 do 6 tygodni, kilku rund hodowli w celu wyizolowania organizmu oraz doświadczenia w diagnostyce Phytophthora, aby móc rozpoznać kluczowe cechy morfologiczne każdego gatunku. Te tradycyjne metody nie sprawdzają się w wykrywaniu wody do nawadniania zanieczyszczonej P. capsici ze względu na takie czynniki, jak zakłócenia powodowane przez inne mikroorganizmy, które są również obecne w źródłach wody. Niektóre szybko rosnące mikroorganizmy, takie jak Pythium spp. i bakterie przenoszone przez wodę, mogą przerastać na płytce, powodując, że P. capsici jest niewykrywalny16,17.

Celem tego badania było opracowanie czułej i specyficznej metody molekularnej, która może być używana zarówno w warunkach polowych, jak i laboratoryjnych do wykrywania zoospor P. capsici w wodzie do nawadniania. Protokół obejmuje opracowanie nowatorskiego zestawu starterów do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), zdolnego do specyficznej amplifikacji P. capsici, w oparciu o fragment 1121-pary zasad (bp) P. capsici18,19. Wcześniej opracowany starter LAMP od Dong et al. (2015) został użyty w porównaniu z testem, który został opracowany na potrzeby tego badania20.

Test LAMP to stosunkowo nowa forma wykrywania molekularnego, która okazała się szybsza, bardziej czuła i specyficzna niż konwencjonalna reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)21. Ogólnie rzecz biorąc, konwencjonalne testy PCR nie mogą wykryć poniżej 500 kopii (1,25 pg/μl); Natomiast wcześniejsze badania wykazały, że czułość LAMP może być od 10 do 1000 razy wyższa niż konwencjonalnego PCR i może z łatwością wykryć nawet 1 fg/μL genomowego DNA22,23. Dodatkowo test można przeprowadzić szybko (często w ciągu 30 minut) i na miejscu (w terenie) przy użyciu przenośnego bloku grzewczego do amplifikacji i barwnika kolorymetrycznego, który zmienia kolor dla próbki dodatniej (eliminując potrzebę elektroforezy). W tym badaniu porównaliśmy czułość testów PCR i LAMP przy użyciu metody ekstrakcji filtracyjnej. Proponowana metoda wykrywania pozwala naukowcom i agentom przedłużającym łatwo wykryć obecność zarodników P. capsici z różnych źródeł wody w czasie krótszym niż dwie godziny. Udowodniono, że test jest bardziej czuły niż konwencjonalny PCR i został zwalidowany in situ poprzez wykrycie obecności patogenu w wodzie do nawadniania używanej przez hodowcę. Ta metoda wykrywania pozwoli hodowcom oszacować obecność i gęstość populacji patogenu w różnych źródłach wody, które są wykorzystywane do nawadniania, zapobiegając niszczycielskim epidemiom i stratom ekonomicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykrywanie Phytophthora capsici na miejscu w wodzie do nawadniania za pomocą przenośnego amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli

  1. Ustawianie pompy i filtra
    1. Podłączyć kolbę filtrującą do rurki, która jest podłączona do pompy ręcznej, tak aby po uruchomieniu pompy powietrze było wciągane przez otwór kolby filtrującej.
    2. Włożyć lejek Buchnera do gumowego korka do wylotu kolby filtrującej i włożyć kawałek bibuły filtracyjnej o odpowiedniej wielkości do lejka Buchnera tak, aby powietrze było wciągane przez bibułę filtracyjną. Bibuła filtracyjna powinna mieć wielkość retencji 15 μm.
      UWAGA: Bibuła filtracyjna musi pasować do krawędzi lejka Buchnera, aby minimalna ilość wody przepływała wokół bibuły filtracyjnej.
  2. Pobieranie próbek i filtrowanie wody
    1. Pobrać próbki wody z docelowego źródła. Woda może zawierać niewielkie ilości gruzu, ale nie znaczne osady lub glebę.
    2. Wlej do 1,000 ml (1 litr) wody testowej na bibułę filtracyjną umieszczoną w lejku Buchnera wystarczająco wolno, aby zapobiec przelaniu, podczas gdy pompa ręczna (lub odkurzacz) jest używana do wytworzenia ssania w celu przeciągnięcia wody.
      UWAGA: Nie ma minimalnej ilości wody, którą można przetestować tą metodą i chociaż sugerowane jest co najmniej 50 ml, 1000 ml to maksimum dla tej metody.
    3. Za pomocą kleszczy wyjmij bibułę filtracyjną z lejka Buchnera i pokrój ją na małe kawałki sterylnymi nożyczkami. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać tyle kawałków (8-12), ile można zanurzyć w ilości buforu ekstrakcyjnego (400 μl w przypadku ekstrakcji na bazie kulek magnetycznych) wymaganej przez protokół. Zachowaj pozostałe kawałki bibuły filtracyjnej do przetworzenia po wyjęciu pierwszego zestawu.
    4. Wirować lub w inny sposób mieszać kawałki bibuły filtracyjnej i buforu ekstrakcyjnego przez 10 s co minutę przez 5 minut. Następnie za pomocą kleszczy usuń bibułę filtracyjną, tracąc jak najmniej buforu ekstrakcyjnego. Powtórz ten krok z pozostałymi kawałkami bibuły filtracyjnej, aż wszystkie kawałki zostaną zawirowane/wymieszane i zanurzone w buforze ekstrakcyjnym.
  3. Magnetyczna ekstrakcja DNA z bibuły filtracyjnej
    1. Do probówki o pojemności 1,5 ml (która zawiera teraz około 200-300 μl buforu ekstrakcyjnego) dodaj 20 μl proteinazy K i 10 μl RNazy 10 ng/μl.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, wirować lub wstrząsać probówką co 3 minuty.
    3. Dodać 500 μl kulek magnetycznych z buforem wiążącym do próbki i dobrze wymieszać przez wstrząsanie. Następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umieść rurkę w stojaku separatora magnetycznego na 2 minuty, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte do magnesu. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    5. Wyjmij rurkę z separatora magnetycznego. Dodać 500 μl buforu do płukania 1 i ponownie zawiesić kulki, energicznie potrząsając tubką. Odczekaj 30 sekund, a następnie umieść rurkę z powrotem w separatorze magnetycznym. Odczekaj 2 minuty, aż wszystkie koraliki zostaną przyciągnięte w kierunku magnesu, zanim wyjmiesz i wyrzucisz supernatant.
      UWAGA: Czekając, aż kulki magnetyczne namagnesują się do separatora, zalecamy odwrócenie rurki, co może spowodować przemieszczenie kulek magnetycznych przyklejonych do nasadki i boków rurki i spowodować przyczepienie większej liczby koralików.
    6. Powtórz krok 1.3.5 z 500 μl buforu do przemywania 2.
    7. Powtórzyć krok 1.3.5 z 500 μl 80% etanolu.
    8. Suszyć granulat kulki magnetycznej na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (18-27 °C) przy otwartej pokrywie. Jeśli temperatura na to nie pozwala, inkubować w rękawiczce z otwartą nakrętką przez 15 minut.
    9. Wyjmij rurkę z separatora magnetycznego. Dodać 50 μl buforu elucyjnego i ponownie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół przez 1 minutę.
    10. Umieść probówkę z powrotem w separatorze magnetycznym. Odczekać 2 minuty przed przeniesieniem supernatantu bez naruszania kulek do oddzielnej probówki w celu przechowywania DNA.
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać przed przejściem dalej. Wyekstrahowane DNA należy przechowywać na lodzie lub w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  4. Zastosowanie nowo opracowanego testu LAMP
    1. Przygotować mieszankę starterów LAMP, używając 0,2 μM każdego startera F3 i B3, 0,8 μM każdego startera Loop-F i Loop-B oraz 1,6 μM każdego startera FIP i BIP (Tabela 2).
    2. Dodać następujący roztwór LAMP do pojedynczej probówki do PCR lub do każdej pojedynczej probówki w 8-probówkowym pasku: 2,5 μl mieszanki starterów (krok 1.4.1), 12,5 μl mieszanki wzorcowej LAVA LAMP, 1 μl wyekstrahowanego DNA i 9 μl ddH2O. Całkowita objętość wynosi 25 μL.
      UWAGA: W przypadku korzystania z przenośnego amplifikacyjny instrument (np. Genie III) z barwnikiem kolorymetrycznym (np. Warmstart), patrz rozdział 2.4.2-2.4.3.
    3. Oznaczyć dwie probówki jako kontrole dodatnie i ujemne. Do kontroli dodatniej należy użyć kontroli dostarczonej przez zestaw LAVA LAMP lub znanej dodatniej próbki DNA. Do kontroli ujemnej należy użyć ddH2O. W obu przypadkach 1 μl wyekstrahowanego DNA należy zastąpić 1 μl kontroli dodatniej lub ddH2O.
    4. Umieścić próbki w bloku grzewczym (lub przenośnym przyrządzie do amplifikacji) ustawionym na 64 °C na 45 min.
      UWAGA: Można tu zastosować inne metody ekstrakcji zamiast ekstrakcji opartej na kulkach magnetycznych. Zarówno CTAB, jak i komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA zostały pomyślnie przetestowane przy użyciu standardowych protokołów i zastępując kawałki bibuły filtracyjnej próbką roślinną24,25. Wyniki porównano w Tabeli 2. Jeśli stężenie DNA można określić ilościowo, należy użyć od 1 do 10 ng genomowego DNA.
  5. Wizualizacja wyników
    1. Jeśli jest to wykonywane w warunkach laboratoryjnych, obejrzyj produkty amplifikacji, ładując 5 μl każdej próbki do 1% żelu agarozowego, uruchamiając je w maszynie do elektroforezy żelowej i obrazując je w maszynie do obrazowania UV.
    2. Jeśli użyto barwnika kolorymetrycznego (np. Warmstart), view zmiana koloru, aby określić wyniki jako pozytywne lub negatywne.
    3. Jeśli użyto przenośnego przyrządu do amplifikacji (np. Genie III), view wykres wzmocnienia na ekranie, aby określić wyniki.
  6. Zastosowanie wcześniej opracowanego testu PCR
    UWAGA: W przypadku korzystania z konwencjonalnego testu PCR kroki 1-3 pozostają takie same, a zamiast kroków 1.4 i 1.5 należy zastosować następujące kroki.
    1. Dodać 1 μl każdej ekstrakcji DNA do pojedynczych probówek zawierających następujące składniki: 12,5 μl mieszanki głównej Green PCR, 9,5 μl ddH2O i 1 μl starterów do przodu i do tyłu (Tabela 2).
    2. Odwiruj każdą próbkę za pomocą mikrowirówki i umieść probówki w termocyklerze.
    3. Stosować następujące ustawienia termocyklera zgodnie z poprzednimi publikacjami: 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 54 °C przez 30 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
    4. Uruchom produkt w 1% żelu agarozowym. Obserwuj obecność pasm w świetle UV, w których pozytywne reakcje będą miały rozmiar pasma ~508 pz.
  7. Tradycyjna metoda wykrywania
    UWAGA: Istnieje wiele metod selektywnego powlekania w celu wykrywania patogenów, a poniżej znajduje się ogólny protokół dla P. capsici.
    1. Najpierw uzyskaj zdrowy owoc bakłażana (żywiciela podatnego na P. capsici) i wysterylizuj powierzchnię, myjąc powierzchnię owocu 70% alkoholem izopropylowym.
    2. Umieść owoce bakłażana w skrzynkach na mleko za pomocą urządzenia flotacyjnego (pianka polietylenowa lub inna) i wrzuć do stawów irygacyjnych. Przymocuj każdą pułapkę na przynętę do jednego punktu i pozostaw pułapki w zbiorniku wodnym (odzyskana woda do nawadniania) na co najmniej 7 dni lub do momentu zaobserwowania objawów zgnilizny owoców. Zbierz owoce i przewieź je do laboratorium.
    3. Opłucz i osusz owoce w sterylnym kapturze przed usunięciem małych kawałków zakażonych tkanek i umieść je na talerzu z podłożem PARPH wzbogaconym 25 mg/l pentachloronitrobenzenem, 0,0005% pimarycyną, 250 mg/l ampicyliną, 10 mg/l ryfampicyną i 50 mg/l hymeksazolem. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 5 dni.
    4. Obejrzyj płytki pod mikroskopem złożonym w celu tradycyjnej identyfikacji morfologicznej po 4 dniach od izolacji.

2. Określanie granicy wykrywalności stężenia zoospor

  1. Wytwarzanie zawiesiny zoospor
    1. Inkubować P. capsici na płytkach agaru V8 (100 ml soku V8, 900 ml ddH2O, 1 g CaCO3 ) przez 1 tydzień w temperaturze 26 °C. W celu uzyskania większej ilości zawiesiny zoospor można użyć wielu płytek.
    2. Inkubować płytki w ciągłym świetle w temperaturze pokojowej przez 3 dni, aby stymulować zarodnikowanie.
    3. Zalej talerze, dodając 15 ml ddH2O do każdej płytki i umieść je w lodówce o temperaturze 4 °C na 25 minut. Następnie wróć do temperatury pokojowej na 30 minut.
    4. Wymieszać płytki w celu usunięcia zoospor i odpipetować roztwór do jednej probówki o pojemności 50 ml ze wszystkich płytek.
    5. Aby uzyskać dokładne oszacowanie stężenia zoospor, dodaj 10 μl zawiesiny zarodników do hemocytometru i obserwuj pod mikroskopem, aby policzyć zoospory i oszacować średnie stężenie.
  2. Rozcieńczanie szeregowe
    1. Dodać 1 ml zawiesiny zarodników i 9 ml ddH2O do oddzielnej probówki. Powtórz ten krok dla tylu 10-krotnych rozcieńczeń, ile jest pożądane.
    2. Roztwory przetrwalników są następnie przekazywane do ekstrakcji DNA w oparciu o poprzedni protokół przy użyciu metody filtracji.
      UWAGA: Jeśli pożądana jest większa objętość zawiesiny, należy podwoić objętość: 2 ml zawiesiny zarodników i 18 ml ddH2O.
  3. Wykrywanie stężenia granicznego zoospor
    1. Ocenić granicę wykrywalności zarodników, przeprowadzając każde seryjne rozcieńczenie indywidualnie przez test, aż do momentu, gdy nie będą już obserwowane jednoznacznie dodatnie wyniki. Po uzyskaniu końcowego rozcieńczenia należy rozcieńczyć przez współczynnik 2 (w tym przykładzie od 4,8 do 2,4) i ponownie uruchomić test, aby uzyskać dokładniejszą granicę wykrywalności.
  4. Opracowanie i optymalizacja metody LAMP
    UWAGA: Startery LAMP zostały zaprojektowane w oparciu o fragment P. capsici z parą zasad 1121 (bp) (Li et al.19), jak pokazano na rysunku uzupełniającym 2.
    1. Jeśli stosowany jest barwnik kolorymetryczny (np. Warmstart), należy użyć następującego roztworu: 2,5 μl mieszanki podkładowej, 12,5 μl barwnika kolorymetrycznego, 0,5 μl zielonego barwnika fluorescencyjnego, 1 μl wyekstrahowanego DNA i 8,5 μl ddH2O. Całkowita objętość wynosi 25 μL.
    2. W przypadku korzystania z przenośnego urządzenia wzmacniającego z LAVALAMP mastermix, należy ustawić początkowy stopień 95 °C przez 3 minuty, zgodnie z zaleceniami producenta, ale nie jest to wymagane. Końcowy etap wyżarzania nie jest wymagany do obserwacji wykresu zmiany koloru lub wzmocnienia. Nie uruchamiaj kroku ciepłego startu, jeśli ma być używany komercyjny barwnik kolorymetryczny.
    3. Zobacz wyniki testu LAMP jedną z następujących metod: uruchom próbki na 1% żelu agarozowym lub obejrzyj gołym okiem za pomocą maszyny do obrazowania UV lub wyświetl na ekranie amplifikacji w czasie rzeczywistym Genie III.
    4. Zoptymalizuj temperaturę testu LAMP za pomocą przenośnego przyrządu do wzmacniania i analizuj go za pomocą wykresu wzmocnienia w czasie rzeczywistym pod kątem prędkości i poziomu czułości. Uruchamiaj próbki o unikalnych temperaturach, aby określić najszybsze wzmocnienie przy najwyższym poziomie czułości.
    5. Określić granicę wykrywalności testu opracowanego przez LAMP, wykonując seryjne rozcieńczenie wyekstrahowanego DNA (jak w przypadku zawiesiny przetrwalników w kroku 2.2.1) i utrzymując warunki reakcji zgodnie z wcześniejszym opisem dla reakcji LAMP dla każdego rozcieńczenia.
  5. Wyznaczanie granicy wykrywalności i porównywanie z konwencjonalną metodą PCR
    1. Należy użyć DNA wyekstrahowanego w krokach opisanych w sekcji 1.3 w celu porównania poziomu wykrywalności konwencjonalnego PCR z poziomem wykrywalności testu LAMP.
    2. Dodaj 1 μl DNA do probówki PCR, która zawierała 1 μl starterów PCR do przodu i do tyłu (tabela 2), 12,5 μl Green PCR Mastermix i 9,5 μl ddH2O, co daje w sumie 25 μl.
    3. Amplifikować próbki w termocyklerze w następujących warunkach: 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 54 °C przez 30 s, rozciąganie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowe rozciąganie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
    4. Uruchom próbki w maszynie do elektroforezy na 1% żelu agarozowym i wyświetl je na maszynie do obrazowania UV. Wyłączona wielkość pasma wynosiła 508 pz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja metody LAMP
W tym badaniu wykryliśmy obecność Phytophthora capsici w wodzie do nawadniania za pomocą przenośnego testu amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Po pierwsze, proponowany test LAMP został zoptymalizowany poprzez przetestowanie różnych stężeń starterów LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 μM każdy); LF, LB (0,5–1,0 μM każdy) i FIP, BIP (0,8–2,4 μM każdy)], czas trwania (30–70 min) i temperatury (55–70 °C). Ostateczna mieszanka starterów LAMP użyta w tym badaniu t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie wody do nawadniania pod kątem fitopatogenów jest kluczowym krokiem dla hodowców korzystających ze stawów irygacyjnych i wody pochodzącej z recyklingu27. Stawy irygacyjne stanowią zbiornik i pożywkę dla wielu fitopatogenów, ponieważ nadmiar wody do nawadniania jest kierowany z pola do stawu, przenosząc ze sobą wszelkie patogeny, które mogły być obecne16,27. Tradycyjna metoda wykrywania patogenów roślinnych w dużym źródle wody polega...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe od Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP00016659. Autorzy dziękują dr Pingsheng Ji z University of Georgia i dr Anne Dorrance z Ohio State University za dostarczenie czystych kultur Phytophthora spp. Dziękujemy również Li Wang i Deloris Veney za ich pomoc techniczną podczas całego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żel agarozowy w proszkuThomas ScientificC997J85
Lejek BuchneraSouthern LabwareJBF003
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Wirówka 5430Eppendorf22620509
ChloroformFischer ScientificC298-500
Roztwór CTABNauki biologiczne786-565
Zestaw do ekstrakcji DneasyQiagen69104
Kolba filtracyjnaUnitedFHFL1000
Bibuła filtracyjnaUnited Scientific SuppliesFPR009
Żel zielony 10000XThomas B003B68 Scientific(1/EA)
Genie IIIOptiGene
Pompa ręcznaThomas Scientific1163B06
Izoamylowy alkoholFischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP master mixLucigen30086-1
Magnetyczna ekstrakcja DNA z kulkami magnetycznymiSeparator magnetyczny GenesiggenesigEASY-EK
PoliwinylopirolidonSigma AldrichPVP40-500G
PodkładySigma Aldrich
Prism Mini wirówkaLabnetC1801
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Żel UV DocAnalytik Jena849-00502-2
Warmstart Barwnik kolorymetrycznyLucigenE1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT CellBio-Rad1704489EDU
70% izopropanolFischer ScientificA451-1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
  2. Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
  3. Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
  4. Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
  5. Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
  6. Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
  7. Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
  8. Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
  9. Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
  10. Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
  11. Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
  12. Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
  13. Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
  14. Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
  15. Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655(1990).
  16. Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
  17. Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
  18. Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
  19. Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
  20. Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
  21. Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089(2018).
  22. Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
  23. Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903(2019).
  24. Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
  25. Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
  26. Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
  27. Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
  28. Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50(2019).
  29. Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
  30. Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Irrigation Water DetectionFilter Paper MethodDNA ExtractionLAMP AssayZoospore DetectionColorimetric DetectionPathogen SpecificityWaterborne Pathogen

Powiązane artykuły