Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

DOI:

10.3791/61481

⸱

9 września 2020

 , 
1Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Texas A&M University Health Science Center, College of Medicine, 2Texas A&M Institute for Neuroscience

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest wyniszczającym zaburzeniem neurodegeneracyjnym spowodowanym degeneracją neuronów dopaminergicznych (DA). Nadmierny napływ Ca2+ spowodowany nieprawidłową aktywacją receptorów glutaminianu powoduje ekscytotoksyczność DA i został zidentyfikowany jako ważny mechanizm utraty neuronów DA. W tym badaniu izolujemy, dysocjujemy i hodujemy neurony śródmózgowia z brzusznego śródmózgowia myszy (VM) zarodków myszy ED14. Następnie zakażamy długoterminowe pierwotne hodowle śródmózgowia myszy wirusem związanym z adenowirusem (AAV) wyrażającym genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, GCaMP6f pod kontrolą swoistego dla ludzkich neuronów promotora synapsyny, hSyn. Korzystając z obrazowania konfokalnego na żywo, pokazujemy, że hodowane neurony śródmózgowia myszy wykazują spontaniczne strumienie Ca2 + wykryte przez AAV-hSyn-GCaMP6f. Kąpielowe stosowanie glutaminianu do kultur śródmózgowia powoduje nieprawidłowe podwyższenie wewnątrzkomórkowego Ca2 + w neuronach, czemu towarzyszy aktywacja kaspazy-3 w neuronach DA, jak wykazano za pomocą barwienia immunologicznego. Techniki identyfikacji apoptozy za pośrednictwem glutaminianu w pierwotnych neuronach DA myszy mają ważne zastosowania w badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości leków, które zachowują zdrowie neuronów DA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest drugą najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną na świecie, na którą nie ma lekarstwa. Szacunki sugerują, że częstość występowania PD będzie nadal rosła i przewiduje się, że do roku 2030 przekroczy 1 milion diagnoz w samych Stanach Zjednoczonych1. Ponieważ obecnie dostępnych jest niewiele skutecznych metod leczenia choroby Parkinsona, istnieje pilna potrzeba opracowania skuteczniejszych terapii. PD charakteryzuje się szybką i postępującą utratą neuronów dopaminy śródmózgowia (DA)2. Mechanizmy leżące u podstaw neurodegeneracji w chorobie Parkinsona są słabo poznane. Dowody wskazują na prawdopodobną zbieżność wielu mechanizmów, takich jak stres oksydacyjny i dysfunkcja mitochondriów itp., które przyczyniają się do inicjacji apoptotycznych kaskad sygnalizacyjnych i ostatecznej śmierci komórki3.

Jeden z takich zbieżnych mechanizmów, ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu, jest zamieszana w wiele chorób neurodegeneracyjnych, w tym PD4. Podczas gdy uważa się, że ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu działa głównie poprzez stymulację receptorów NMDA poprzez nadmierny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + i ostateczną inicjację apoptozy, receptory AMPA przepuszczalne dla Ca2 + są również zaangażowane w odpowiedź ekscytotoksyczną5,6,7. Dlatego interesujące jest określenie udziału receptorów AMPA w apoptozie za pośrednictwem glutaminianu w modelu PD. Można to osiągnąć za pomocą NBQX, blokera AMPA i kainianu, który przy stężeniach mikromolowych jest selektywny dla receptorów AMPA8. Ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu i kaskady sygnalizacji apoptotycznej są idealnym celem do pomiaru zakresu śmierci komórki i potencjalnym celem interwencji terapeutycznej. W związku z tym opracowanie metody o wysokiej zawartości do oceny modulacji aktywności wapnia za pośrednictwem glutaminianu i związanej z tym sygnalizacji w dół strumienia w pierwotnych neuronach brzusznego śródmózgowia (VM) byłoby cenne dla badań przesiewowych nowych metod leczenia ich zdolności do zachowania zdrowia neuronów.

Tutaj opracowaliśmy protokół, w którym wyrażamy genetycznie kodowany wskaźnik wapnia (GECI), GCaMP6f, używając AAV2/5 z promotorem ludzkiej synapsyny (hSyn) do pomiaru aktywności Ca2+ mysich pierwotnych neuronów VM w odpowiedzi na aplikację glutaminianu, który może być mierzony na poziomie fizjologicznym i molekularnym. To badanie przesiewowe o wysokiej zawartości można dostosować do odkrywania farmaceutyków lub metod leczenia, które modulują aktywność Ca2 + w celu zachowania zdrowia neuronów VM. Sugerujemy, że ten model hodowli pierwotnej jest skutecznym sposobem badań przesiewowych pod kątem nowych interwencji w chorobie Parkinsona, w oparciu o ich zdolność do zachowania zdrowia neuronów VM i łagodzenia progresji PD.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Texas A&M University Institutional Animal Care and Use Committee (25listopada 2019; AUP# 2019-0346).

UWAGA: Przygotowanie roztworów do hodowli komórkowych powinno odbywać się przy użyciu sterylnej procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego i filtrowane do 0,2 μm, aby zapobiec skażeniu.

1. Przygotowanie roztworów i pożywki hodowlanej

  1. Przygotować roztwór powlekający lamininę, rozcieńczając 20 μl wywaru z lamininy o stężeniu 1 mg/ml w 2 ml sterylnegodestylowanego H2O. Przygotować w dniu rozbioru
  2. Przygotuj 10% roztwór zatrzymujący surowicę końską (końską) (ES), dodając 5 ml ES do 45 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS). Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować 4% roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA), dodając 2 g proszku BSA do 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i doprowadzając do końcowej objętości 45 ml. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować roztwór podstawowy papainy, rozcieńczając papainę do 3 mg/ml w 1x HBSS. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotować roztwór dezoksyrybonukleazy (DNazy), dodając 20 mg proszku DNazy do sterylnegoH2Oi doprowadzając do końcowej objętości 20 ml. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować roztwór podstawowy kwasu askorbinowego, dodając 352 mg kwasu askorbinowego do sterylnego destylowanegoH2Oi doprowadzając do końcowej objętości 20 ml. Podgrzać w łaźni o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia, jeśli to konieczne. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, dodając do 50 ml pożywki Neurobasel: 500 μl Glutamax (100x), 500 μl surowicy końskiej, 1 ml B-27, 100 μl kwasu askorbinowego, 500 μl penicyliny-streptomycyny, 50 μl kanamycyny i 50 μl ampicyliny. Sterylny filtr wykorzystujący system filtrów 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotuj 0,01% roztwór Triton X-100, dodając 1 ml Triton X-100 do 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 10% roztwór. Ponieważ Triton X-100 jest lepki, pipetuj powoli, aby końcówka całkowicie się napełniła. Podgrzać w łaźni o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia, jeśli to konieczne. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Aby rozcieńczyć 10% bulion Triton X-100 do 0,01%, wykonaj 3 seryjne rozcieńczenia 1:10. Rozcieńczyć 1 ml 10% bulionu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 1% roztwór. Rozcieńczyć 1 ml 1% roztworu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 0,1% roztwór. Rozcieńczyć 1 ml 0,1% roztworu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 0,01% roztwór.
  10. Przygotuj 10% i 1% roztwór normalnej surowicy koziej (NGS), dodając 1 ml NGS do 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 10% roztwór. Dodaj 100 μl NGS do 9,9 ml 1x PBS, aby uzyskać 1% roztwór.
  11. Przygotować roztwór podstawowy glutaminianu (100 mM), dodając 735 mg kwasu L(+)-glutaminowego do sterylnego destylowanegoH2Oi doprowadzić do końcowej objętości 50 ml. Rozpuszczalność w tym stężeniu będzie problemem. Dodanie małych objętości (100 μl) 1 M kwasu solnego jest wystarczające do zwiększenia rozpuszczalności.
  12. Przygotować roztwór podstawowy NBQX (10 mM), dodając 50 mg NBQX do sterylnego destylowanegoH2Oi doprowadzić do końcowej objętości 13 ml.

2. Przygotowanie naczyń hodowlanych i szkiełek nakrywkowych (Wykonane dzień przed sekcją)

UWAGA: Odkryliśmy, że połączenie trzech środków powlekających, poli-L-lizyny, poli-L-ornityny i lamininy, pozwala na idealną adhezję i żywotność komórek.

  1. Umieść 10 szalek Petriego o średnicy 35 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść dwa okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w każdym naczyniu i wypełnij 70% EtOH przez 10 minut. Użyj linii próżniowej, aby zassać pozostały EtOH z każdej płytki, umożliwiając całkowite odparowanie EtOH.
  2. Odpipetować ~90-100 μL 0,1% roztworu poli-L-lizyny na każde szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że całe szkiełko nakrywkowe jest pokryte roztworem poli-L-lizyny. Przykryj naczynia pokrywkami i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  3. Odessać pozostały roztwór poli-L-lizyny z każdego szkiełka nakrywkowego i spłukać sterylnymH2O.
  4. Powtórz kroki 2.2 – 2.3 z 0,1% roztworem poli-L-ornityny.
  5. Ponownie powtórz kroki 2.2 – 2.3 z 0,01% roztworem lamininy. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 do momentu, gdy będą gotowe do posiewu komórek następnego dnia.

3. Sekcje embrionalne myszy

UWAGA: Używamy od 4 do 6 ciężarnych myszy na kulturę. Chociaż większość procesu preparacji odbywa się poza kabiną bezpieczeństwa biologicznego, nadal ważne jest utrzymanie sterylnej procedury. Idealne jest obfite stosowanie 70% EtOH na powierzchniach w pobliżu mikroskopu preparacyjnego i na narzędziach chirurgicznych. Podczas sekcji można również nosić maskę, aby jeszcze bardziej zapobiec zakażeniu. Dodatkowo w pożywce hodowlanej używamy 4 oddzielnych antybiotyków, więc zanieczyszczenie jest mało prawdopodobne. Jeśli jednak stosowanie antybiotyków jest problematyczne, ten zestaw do sekcji można przenieść do sterylnego kaptura. W celu zachowania żywotności komórek wszystkie roztwory preparacyjne powinny być wstępnie schłodzone w temperaturze 4 °C, a rozbiory powinny zostać zakończone tak szybko, jak to możliwe. Nie wykonujemy sekcji na lodzie. Metoda preparacji embrionalnych neuronów śródmózgowia myszy jest identyczna z poprzednio opisanymi metodami9,10.

  1. Przygotuj miejsce na ławce w pobliżu mikroskopu preparacyjnego za pomocą podkładki chłonnej i spryskaj obficie 70% EtOH.
  2. Spryskać dwie szklane szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i jedną szklaną szalkę Petriego o wymiarach 50 x 10 mm 70% EtOH i pozostawić EtOH do odparowania. Po odparowaniu umieść 50 ml sterylnego 1x HBSS na każdej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.
  3. Zanurz nożyczki chirurgiczne, kleszcze i ostrze mikrotomu w 70% EtOH na minimum 10 minut w celu sterylizacji. Umieść instrumenty na podkładce chłonnej do wyschnięcia.
  4. Używając CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy, poddaj eutanazji 2-3 miesięczne myszy w ciąży w 14 dniu embrionalnym.
  5. Spryskaj brzuch uśpionych myszy 70% EtOH. Za pomocą kleszczy chwyć dolną część brzucha i otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek chirurgicznych. Rozpocznij cięcie w pobliżu miejsca, w którym kleszcze trzymają brzuch, wykonując boczne nacięcia z każdej strony, aż ściana brzucha będzie mogła zostać odchylona do tyłu, a macica będzie wyraźnie widoczna.
  6. Za pomocą nożyczek chirurgicznych odetnij oba końce rogu macicy. Następnie wyjmij macicę i umieść na szalce Petriego z 1x HBSS.
  7. Za pomocą kleszczy z prostą końcówką ostrożnie usuń zarodki z macicy. Pozostaw zarodki w HBSS przez cały ten proces. Używając kleszczy lub ostrza do mikrotomu, szybko odetnij zarodki, przecinając je w pobliżu szyi. Wykonanie jak najbardziej równego cięcia.
  8. Pod mikroskopem preparacyjnym przenieś główkę zarodka na suchą szalkę Petriego o średnicy 50 mm i umieść ją po stronie brzusznej. Ustabilizuj głowę za pomocą kleszczy, umieszczając i penetrując w pobliżu oczu/pyska. Kleszcze powinny być ustawione pod kątem w dół pod kątem ~45°, aby uniknąć penetracji śródmózgowia.
  9. Używając kleszczy w drugiej ręce, ostrożnie usuń półprzezroczystą warstwę skóry i czaszki tuż przed wystającym grzbietem śródmózgowia. Zacznij w pobliżu linii środkowej i usuwaj skórę i czaszkę doogonowo, aż śródmózgowie zostanie całkowicie odsłonięte.
  10. Trzymaj kleszcze prostopadle do odsłoniętego śródmózgowia z jedną końcówką między korą a śródmózgowiem, a drugą w pobliżu móżdżku. Dociśnij i ściśnij kleszcze razem, aby usunąć całe śródmózgowie. Segment śródmózgowia powinien mieć grubość około 0,5 mm. Umieść segment śródmózgowia na drugiej szalce Petriego wypełnionej świeżym 1x HBSS. Powtórz ten proces dla każdego zarodka.
  11. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustaw segment mózgu brzuszną stroną skierowaną do góry. Jeśli opony mózgowe są nadal przyczepione, ostrożnie je usuń, chwytając kleszczami i podnosząc do góry i odsuwając od segmentu mózgu.
  12. Segment mózgu powinien mieć 4 widoczne ćwiartki. Umieść segment w taki sposób, aby dwie mniejsze ćwiartki znajdowały się wyżej niż dwie większe ćwiartki. Istnieje wyraźny grzbiet oddzielający dwa górne (małe) ćwiartki od dolnych dwóch (dużych) kwadrantów.
  13. Za pomocą kleszczy ściśnij i oddziel ćwiartki górne od kwadrantów dolnych, a następnie odrzuć ćwiartki górne. Pozostałe dolne ćwiartki będą miały nadmiar tkanki bocznie po stronie grzbietowej, tkanka ta będzie wyglądać na mniej nieprzezroczystą niż pozostała tkanka brzuszna. Usuń mniej gęstą tkankę grzbietową i wyrzuć. Pozostały segment powinien zawierać zarówno istotę czarną pars compacta (SNc), jak i brzuszny obszar nakrywki (VTA).
  14. Za pomocą kleszczy przetnij pozostały segment tkanki brzusznej na 4 mniejsze kawałki i za pomocą pipety o szerokim otworze 1 ml przenieś te segmenty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 1x HBSS. Utrzymuj stożkową rurkę z segmentami mózgu na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
  15. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych segmentów mózgu.

4. Dysocjacja komórek

  1. Trawienie enzymatyczne komórek
    1. Ostrożnie odessać HBSS ze stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej segmenty śródmózgowia, pozostawiając segmenty na dnie probówki.
    2. Dodać ~800 μl roztworu papainy do probówki i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 7 minut. Ponownie zawiesić komórki, przesuwając probówkę i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na dodatkowe 7 minut.
    3. Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 1 ml należy usunąć tylko segmenty śródmózgowia z podwielokrotności 1 ml DNazy. Pozwól segmentom dotrzeć do dna podwielokrotności lub około 1 minuty ekspozycji.
    4. Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 1 ml należy usunąć tylko segmenty śródmózgowia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml roztworu zatrzymującego. Pozwól, aby segmenty osiadły na dnie probówki i powtórz płukanie w dodatkowej stożkowej probówce wypełnionej roztworem zatrzymującym.
  2. Mechaniczne rozcieranie zawiesiny komórek
    1. W drugiej probówce do płukania roztworu, używając końcówki do pipety o szerokim otworze 1 ml, odpipetuj komórki w górę i w dół 10 razy, aż nie będą widoczne duże segmenty tkanki. Ważne jest, aby unikać nadmiernego rozcierania w celu zminimalizowania lizy komórek.
    2. Powoli odpipetować 300 μl 4% roztworu BSA na dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej segmenty mózgu. Ostrożnie zdejmij końcówkę pipety, aby utrzymać warstwę zawiesiny. Wirować przy 0,4 x g przez 3 min. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400 μl pożywki do hodowli komórkowych.

5. Powlekanie komórek

UWAGA: Bazując na doświadczeniu, pobiera się około 100 000 żywotnych komórek na zarodek. Ciężarne myszy w wieku 2-3 miesięcy zazwyczaj mają miot o wielkości 8-10 zarodków; dlatego przybliżone oszacowanie całkowitej wydajności komórek na ciężarną mysz wynosi około 1 miliona komórek.

  1. Za pomocą hemocytometru należy wstępnie przeformować liczbę komórek, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do 2,000 komórek/μl za pomocą pożywki do hodowli komórkowych. Krótko rozcierać, aby wymieszać.
  2. Usunąć z inkubatora szkiełka nakrywkowe z roztworem lamininy z etapu 2 i odessać pozostały roztwór lamininy z powlekanych szkiełek nakrywkowych za pomocą próżni. Płytkować szybko, aby uniknąć całkowitego wyschnięcia szkiełek nakrywkowych. Odpipetować 100 μl (2,0 x 105 komórek/szkiełko nakrywkowe) na każde szkiełko nakrywkowe i umieścić szalki Petriego w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  3. Ostrożnie dodać 3 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdego naczynia i umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Połówka podłoża zmienia się 2 razy w tygodniu przez 2 tygodnie.

6. Zakażenie hodowli komórkowej w 14 DIV wektorami wirusowymi (AAV) związanymi z adenowirusem

  1. Do każdej potrawy przygotuj 1 ml pożywki DMEM wolnej od surowicy z 1 μl hSyn-GCaMP6f AAV (miano 1,0 x10 13)
  2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej szalki i zastąpić 1 ml wolnego od surowicy DMEM zawierającego hSyn-GCaMP6f. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  3. Odessać pożywkę wolną od surowicy zawierającą AAV i zastąpić 3 ml pożywki do hodowli komórkowych. Umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odkryliśmy, że 5-7 dni infekcji AAV pozwala na uzyskanie idealnego poziomu ekspresji GCaMP. Kontynuuj zmianę pożywki co 2-3 dni przez cały okres infekcji wirusowej.

7. Obrazowanie konfokalne Ca2+ na żywo między 19-21 DIV

UWAGA: Jak wspomniano w kroku 6.3, obrazowanie można wykonać między 5-7 dniem po infekcji wirusowej. Jest to idealne okno do osiągnięcia widocznej ekspresji fluoroforu na poziomach, które pozwalają na wykrycie spontanicznej aktywności Ca2+.

  1. Przygotowanie zapisu
    1. Aby przygotować 1 l buforu rejestrującego HEPES, dodaj: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glukozy, 2,381 g HEPES, 2 ml 1 M roztworu podstawowego CaCl2 i 500 μl 1 M roztworu podstawowego MgCl2 do 800 ml sterylnegodestylowanego H 2O. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l.
    2. Aby uzyskać 200 ml 20 μM buforu rejestrującego glutaminianu, rozcieńczyć 40 μl 100 mM roztworu podstawowego glutaminianu w 200 ml buforu rejestrującego HEPES opisanego powyżej.
    3. Aby uzyskać 200 ml 10 μM buforu rejestrującego NBQX, rozcieńczyć 200 μl 10 mM roztworu podstawowego NBQX w 200 ml buforu rejestrującego HEPES.
  2. Obrazowanie konfokalne
    1. Napełnić sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 mm 3 ml buforu rejestrującego.
    2. Wyjąć z inkubatora w temperaturze 37 °C szalkę Petriego o średnicy 35 mm z zakażonymi kulturami. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie chwyć krawędź jednego szkiełka nakrywkowego i szybko przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną buforem nagrywającym. Umieścić pozostałe szkiełko nakrywkowe w podłożu z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 °C. Przetransportować szalkę z buforem rejestrującym do mikroskopu konfokalnego.
    3. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Przejdź do następnego kroku podczas inicjalizacji.
    4. Uruchom pompę perystaltyczną i umieść linię w buforze nagrywającym. Skalibruj prędkość przepływu na 2 ml/min.
    5. Przenieść zakażone szkiełko nakrywkowe z płytki Petriego o średnicy 35 mm do kąpieli rejestrującej.
    6. Korzystając z 10-krotnego zanurzenia w wodzie i światła BF, znajdź płaszczyznę ostrości i poszukaj obszaru o dużej gęstości ciał komórek neuronowych. Przełącz się na obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie i za pomocą światła BF ponownie ustaw ostrość próbki.
    7. W oknie "Lista barwników" w FluoView wybierz AlexaFluor 488 i zastosuj go.
    8. Ekspresja AAV może być zmienna, dlatego, aby zapobiec nadmiernej ekspozycji i fotowybielaniu fluoroforów, zacznij od niskich ustawień HV i mocy lasera. Dla kanału AlexaFluor 488 ustaw wysokie napięcie (HV) na 500, wzmocnienie na 1x i przesunięcie na 0. Dla linii laserowej 488 ustaw moc na 5%. Aby zwiększyć efektywną objętość obrazowaną w płaszczyźnie z, należy zwiększyć rozmiar otworka do 300 μm. Użyj opcji skanowania "focus x2", aby optymalnie dostosować sygnały emisji do poziomów niepełnego nasycenia. Z tego miejsca ustawienia można dostosowywać, aż do uzyskania idealnej widoczności każdego kanału.
      UWAGA: Aby dokładnie uchwycić pełny zakres strumieni Ca2+ za pomocą GCaMP, dostosuj podstawowe ustawienia HV i mocy lasera, aby umożliwić wzrost intensywności fluorescencji bez przesycenia detektora.
    9. Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu przesuń stolik, aby zlokalizować obszar z wieloma komórkami wykazującymi spontaniczne zmiany fluorescencji GCaMP6f i ustawić ostrość na żądanej płaszczyźnie obrazowania.
    10. Użyj narzędzia "Przytnij prosto", aby przyciąć ramkę obrazowania do rozmiaru, który pozwala osiągnąć odstęp między klatkami wynoszący nieco poniżej 1 sekundy. Jest to konieczne, aby ustawić interwał obrazowania na 1 klatkę na sekundę.
    11. Ustaw okno "Interwał" na wartość 1,0, a okno "Liczba" na 600,
      UWAGA: Aby dostarczyć różne nagrywające w żądanym punkcie czasowym (300 s), ważne jest, aby skalibrować opóźnienie pompy, aby dostarczyć nowy roztwór do kąpieli. Będzie to zależało od szybkości perfuzji roztworu (2 ml/min) i długości przewodu używanego do pompowania roztworu.
    12. Aby nagrać film z serii t, wybierz opcję "Czas", a następnie użyj opcji skanowania "XYt", aby rozpocząć obrazowanie.
    13. Obserwuj pasek postępu obrazowania i przesuń linię z bufora zapisu HEPES do bufora zapisu glutaminianu 20 μM w odpowiednim punkcie czasowym (np. jeśli opóźnienie pompy jest skalibrowane do dostarczania roztworu po 60 s, przesuń linię do bufora glutaminianu po 240 klatkach, aby dostarczyć glutaminian po 300 s).
    14. Po zakończeniu obrazowania wybierz przycisk Seria zakończona i zapisz gotowy film z serii t. Kontynuuj perfuzję 20 μM glutaminianu przez dodatkowe 5 minut, tak aby hodowane neurony były wystawione na działanie glutaminianu przez łącznie 10 minut. Powtórz ten proces dla każdego szkiełka nakrywkowego, które ma być zobrazowane.
    15. Po dodatkowych 5 minutach ekspozycji na glutaminian 20 μM, wyjąć szkiełko nakrywkowe z kąpieli i umieścić z powrotem na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej bufor rejestrujący do dnia zakończenia obrazowania. Po zakończeniu przejdź do kroku 8.
  3. Analiza śladowa Ca2+
    1. Wykonaj analizę obrazu w ImageJ. Zainstaluj wtyczkę BIO-FORMATS dla ImageJ, która pozwoli . Pliki obrazów OIB do otwarcia.
    2. Na pasku narzędzi ImageJ kliknij przycisk Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) i zaznacz pole Mean gray value (MGV) (Średnia wartość szarości).
    3. W ImageJ otwórz film z serii t jako hiperstos.
    4. Przeciągnij suwak filmu i zidentyfikuj klatkę z maksymalną reakcją glutaminianu, aby zobrazować wszystkie neurony, które reagują na glutaminian. Użyj narzędzia wielokątów, aby prześledzić wszystkie widoczne ciała komórek neuronów, dodając ich ROI do listy "Menedżer ROI".
    5. Po zakończeniu śledzenia i dodawania ROI wybierz wszystkie ROI w oknie ROI Manager i użyj opcji Wiele miar na liście opcji. Skopiuj te dane i wklej je do arkusza kalkulacyjnego. Wykonaj ten proces dla wszystkich filmów, które mają być analizowane.
    6. Dla każdego ROI przekonwertuj surowe dane MGV z każdej klatki na wartości ΔF/F0 za pomocą równania: ΔF/F0 = [F(t) – F0] / F0. Gdzie F(t) = MGV dowolnej ramki, a F0 = średnia bazowa MGV wynosząca ~10 ramek, w których nie występują strumienie Ca2+.
    7. Za pomocą oprogramowania statystycznego, takiego jak OriginPro 2020, przekonwertowane ślady ΔF/F0 można przekształcić w wykresy liniowe. Funkcja "Analizator pików" może być używana (lub podobna funkcja w przypadku korzystania z innego oprogramowania) do pomiaru amplitudy piku odpowiedzi glutaminianu, opóźnienia w odpowiedzi na glutaminian i pola pod krzywą.

8. Barwienie immunologiczne kultur

UWAGA: Po utrwaleniu formaliną, szkiełka nakrywkowe mogą być przechowywane w 1x PBS w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do przetworzenia do barwienia immunologicznego. Inkubację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych przeprowadzono w sposób seryjny, ponieważ taka inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-kaspazy-3 i jego komplementarnym przeciwciałem drugorzędowym poprzedzała inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-TH i jego komplementarnym przeciwciałem drugorzędowym.

  1. Natychmiast po ekspozycji na glutaminian umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem na szalce Petriego o średnicy 35 mm, odessaj bufor zapisowy i dodaj 3 ml 10% formaliny. Odstawić na 40 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Opłucz naczynie 3 razy za pomocą 1x PBS.
  3. Odessać PBS i przepuszczalność komórek w 1 ml 0,01% Triton X-100 w PBS przez 2 minuty.
  4. Opłucz naczynie 3 razy za pomocą 1x PBS.
  5. Odessać PBS i zablokować komórki w 1 ml 10% NGS w PBS przez 40 minut.
  6. Opłucz naczynie 3 razy za pomocą 1x PBS.
  7. Dodać 1 μl króliczego przeciwciała pierwszorzędowego anty-kaspazy-3 do 1 ml 1% NGS w PBS (rozcieńczenie 1:1000). Odessać PBS z naczynia i zastąpić go pierwszorzędowym roztworem przeciwciała. Umieścić na wytrząsarce i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Opłucz naczynie 3 razy za pomocą 1x PBS.
  9. Dodać 1 μl koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi AlexaFluor 488 do 1 ml 1% NGS w PBS (rozcieńczenie 1:1000). Odessać PBS z naczynia i zastąpić wtórnym roztworem przeciwciał. Umieścić na wytrząsarce i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przesuwając się naprzód, chronić próbki przed światłem.
  10. Opłucz naczynie 3 razy za pomocą 1x PBS.
  11. Powtórz kroki 8.7 – 8.10, ale używając pierwszorzędowego przeciwciała anty-TH przeciwko kurczakowi (1:1000) w kroku 8.7 i koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko kurczakowi AlexaFluor 594 (1:1000) w kroku 8.9.
  12. Po ostatnim płukaniu PBS umieść 30 μl podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą kleszczy chwyć szkiełko nakrywkowe z szalki Petriego o średnicy 35 mm i umieść szkiełko nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół w podłożu montażowym. Oba szkiełka nakrywkowe zmieszczą się na jednym szkiełku mikroskopowym, jeśli zostaną prawidłowo umieszczone. Umieść w suchym, ciemnym miejscu i pozwól medium montażowemu wyschnąć przez noc.

9. Obrazowanie konfokalne kultur barwionych immunologicznie

  1. Obrazowanie konfokalne
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu.
    2. Za pomocą okularów mikroskopowych, przy użyciu obiektywu o 20-krotnym powiększeniu i świetle epifluorescencyjnym z filtrem TRITC, ustaw ostrość próbkę i wyszukaj korpus komórki TH+.
    3. Po zlokalizowaniu korpusu komórki TH + wyśrodkuj go w polu widzenia, a następnie przejdź do obiektywu o powiększeniu 60x.
    4. Wybierz barwniki AlexaFluor 488 i AlexaFluor 594 w oknie "lista barwników".
    5. Podobnie jak w przypadku obrazowania na żywo, zacznij od ustawień niskiego HV, wzmocnienia, przesunięcia i mocy lasera, aby zapobiec fotowybielaniu. Użyj opcji skanowania "focus x2", aby ocenić intensywność fluorescencji każdego kanału i odpowiednio dostosować. Ponieważ obrazy te zostaną później określone ilościowo pod kątem intensywności fluorescencji, konieczne jest utrzymanie spójnych ustawień obrazowania we wszystkich polach widzenia. Dlatego najlepiej jest przyjrzeć się kilku przykładom każdego stanu, aby zorientować się w zakresie intensywności fluorescencji w próbkach.
    6. Po określeniu idealnych ustawień obrazowania wybierz opcję skanowania "ostrość x2" i przesuń interesującą komórkę do środka pola widzenia. Zwiększ zoom cyfrowy do 3x za pomocą suwaka "zoom".
    7. Za pomocą pokrętła ostrości znajdź płaszczyznę ostrości o najjaśniejszej fluorescencji i uchwyć obraz XY z pojedynczą płaszczyzną. Zapisz obraz, aby zakończyć.
    8. Przełącz się z powrotem na obiektyw z 20-krotnym powiększeniem, aby wyszukać inną komórkę TH+. Powtarzaj ten proces, aż zostanie pobrana żądana liczba komórek z każdego warunku.
  2. Analiza obrazu
    1. Na pasku narzędzi ImageJ kliknij przycisk Analizuj | Ustaw Pomiary i zaznacz pola Obszar, Gęstość zintegrowana i Średnia wartość szarości.
    2. Otwórz obraz jako hiperstos z każdym kanałem oddzielonym, przeciągając i upuszczając go na pasku narzędzi ImageJ lub wybierając obraz za pomocą menu plików.
    3. Użyj kanału TH (594 nm), aby narysować ROI wokół korpusu komórki. Korzystając z narzędzia do śledzenia wielokątów w programie ImageJ, dokładnie obrysuj zewnętrzną krawędź ciała komórki. Tam, gdzie odległość między błoną komórkową a jądrem komórkowym jest najmniejsza, prześledź linię prostą przez cytozol do krawędzi jądra, a następnie ściśle podążaj za konturem jądra, aby go wykluczyć. Następnie prześledź linię prostą z powrotem do błony zewnętrznej, granicząc z początkową linią tak blisko, jak to możliwe, i kontynuuj podążanie za konturem ciała komórki, aż zwrot z inwestycji zostanie zakończony.
    4. Za pomocą skrótu klawiaturowego "T" lub ścieżki menu paska narzędzi Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI, otwórz menedżera ROI i dodaj do listy ROI, który został właśnie narysowany.
    5. Wybierz okno kanału kaspazy-3 (488 nm), a następnie wybierz dodany ROI z listy "ROI Manager".
    6. W oknie Menedżer zwrotu z inwestycji wybierz przycisk Zmierz. Pojawi się okno wyników z wcześniej ustawionymi pomiarami. Skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego i powtórz ten proces dla każdej komórki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po wstępnym wyhodowaniu komórek, potraktowaliśmy płytki z kulturą VM w 14 DIV 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f i pozwoliliśmy na 5 dni ekspresji wirusa. W dniu obrazowania bufor zapisu HEPES został przygotowany na świeżo. Zastosowaliśmy dwa warunki; w jednym stanie zastosowano 20 μM glutaminianu przez 10 minut, podczas gdy w drugim stanie 5 minut aplikacji 10 μM NBQX poprzedziło 10-minutowe jednoczesne stosowanie 10 μM NBQX + 20 μM glutaminianu. W obu warunkach zaobserwowaliśmy heterogeniczne i spontaniczne zmiany we fluorescencji GCaMP6f, które wskazują na spontaniczne strumienie Ca2+, jak pokazano na reprezentatywnych śladach (Rysunek 1A,B, film uzupełniający 1-2). Zastosowanie glutaminianu 20 μM wygenerowało solidną i trwałą odpowiedź Ca2 + zarówno w spontanicznie aktywnych, jak i spoczynkowych neuronach (Rysunek 1A, film uzupełniający 1). Zastosowanie 10 μM NBQX zmniejszyło spontaniczną aktywność i częściowo zablokowało odpowiedź glutaminianu (Rysunek 1B, film uzupełniający 2). Stopień, w jakim aplikacja glutaminianu stymulowała odpowiedź Ca2+ w każdym stanie, określono ilościowo przy użyciu obszaru pod krzywą, amplitudy piku i opóźnienia w odpowiedzi. Zarówno obszar pod krzywą, jak i amplituda piku były podobne zarówno dla warunków traktowanych glutaminianem, jak i glutaminianem NBQX + (Rysunek 1C), podczas gdy opóźnienie do odpowiedzi było znacznie zwiększone w stanie NBQX + glutaminian (Rysunek 2A,B). Oprócz ilościowego określenia odpowiedzi Ca2 + na leczenie glutaminianem, utrwaliliśmy i wybarwiliśmy próbki przeciwciałem anty-kaspaza-3 jako miarą apoptozy za pośrednictwem glutaminianu. Zaobserwowaliśmy zakres aktywacji kaspazy-3 w różnych warunkach (Rysunek 3A, B). Aktywację kaspazy-3 określono ilościowo za pomocą obszaru pomiaru i średniej intensywności kaspazy-3. W porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi, średnia powierzchnia komórek z aktywacją kaspazy-3 w warunkach glutaminianu i glutaminianu NBQX + wykazywała tendencję do istotności (Figura 3B). Średnia intensywność kaspazy-3 była znacznie wyższa w warunkach glutaminianu i glutaminianu NBQX + w porównaniu z nieleczonymi kontrolami (Figura 3B). Łącznie wyniki te pokazują ramy o wysokiej zawartości, w których apoptoza neuronów może być mierzona poprzez ilościowe określanie odpowiedzi Ca2+ na czynniki ekscytotoksyczne, a następnie analizę dalszych zdarzeń apoptotycznych, takich jak aktywacja kaspazy-3 w tym samym zestawie kultur.

figure-results-1
Rycina 1: Hodowane brzuszne neurony śródmózgowia wykazują spontaniczną aktywność Ca2 + i są silnie stymulowane przez aplikację glutaminianu. (A) Reprezentatywne ślady spontanicznej aktywności Ca2 + w neuronach VM i ich odpowiedź na aplikację glutaminianu 20 μM. (B) Reprezentatywne ślady spontanicznej aktywności Ca2 + w neuronach VM i ich odpowiedź na aplikację 10 μM NBQX + 20 μM glutaminianu. (C) Dane dotyczące populacji pokazujące obszar pod krzywą i amplitudę piku śladówCa2+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Blokada AMPAR z NBQX opóźnia odpowiedź na aplikację glutaminianu w hodowanych brzusznych neuronach śródmózgowia. (A) Reprezentatywne ślady glutaminianu Ca2+ (szary) i NBQX + glutaminianu (niebieski) wywołują odpowiedzi. Średnie ślady Ca2+ glutaminianu () i glutaminianu NBQX + (czerwony) są pokazane na nałożeniu. (B) Dane populacyjne pokazujące opóźnienie odpowiedzi na glutaminian i wywołane glutaminian NBQX + glutaminian. Procentowa zmiana między warunkami glutaminianu i glutaminianu NBQX + jest wyświetlana w prawym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Zastosowanie glutaminianu zwiększa ekspresję kaspazy-3 w dodatnich brzusznych neuronach śródmózgowia z dodatnim hydrooksylazą tyrozyny (TH). (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne kultur VM barwionych immunologicznie dla kaspazy-3 (zielony) i TH (czerwony), pasek skali = 10 μm. (B) Dane populacyjne pokazujące obszar neuronu DA i średnią wartość szarości ekspresji kaspazy-3 w każdym stanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowy film 1: Spontaniczna aktywność Ca2+ i reakcja na aplikację glutaminianu.
Spontaniczne strumienie Ca2+ w obecności bufora rejestrującego HEPES (0-300 s), a następnie aplikacja 20 μM glutaminianu (301-600 s). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Spontaniczna aktywność Ca2+ i reakcja na aplikację glutaminianu NBQX +.
Spontaniczne strumienie Ca2+ w obecności buforu rejestrującego HEPES (0-300 s), a następnie zastosowanie 10 μM NBQX (301-600 s) i 10 μM NBQX + 20 μM glutaminianu (601-900 s). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy długoterminowy pierwotny system hodowli komórek śródmózgowia brzusznego (VM) do analizy wysokiej zawartości apoptozy za pośrednictwem glutaminianu w neuronach. W badaniach wykorzystano pierwotne kultury dopaminergiczne śródmózgowia w celu wyjaśnienia mechanizmów ekscytotoksycznych w kontekście modeli PD 11,12. W tym badaniu stosujemy podejście kombinatoryczne przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) do pomiaru aktywności Ca2 + i dalszego powiązania tej aktywności z dalszymi zmianami molekularnymi, takimi jak inicjacja apoptotycznych kaskad sygnalizacyjnych4. Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi podobnymi systemami hodowli komórkowych. Ponieważ jesteśmy szczególnie zainteresowani ekscytotoksycznością w kontekście choroby Parkinsona, stosowanie pierwotnych kultur komórkowych VM jest idealne. Stosując różne techniki relokacji pola, takie jak szkiełka nakrywkowe z siatką lub zmotoryzowany stolik mikroskopu XY w połączeniu z barwieniem immunologicznym TH, możemy bezpośrednio badać specyficzne dla typu komórki efekty apoptozy za pośrednictwem glutaminianu w neuronach brzusznej śródmózgowia. Dodatkowo, 3-tygodniowy model hodowli komórkowej pozwala neuronom rozwinąć ich pełny, dojrzały profil molekularny, odzwierciedlający dorosłe neurony DA9. Poprzednie metody koncentrowały się głównie na zmianach molekularnych zachodzących po ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu13,14. Model ten jest wyjątkowy ze względu na jego zdolność do korelowania ostrych zmian w fizjologii neuronów z dalszymi zdarzeniami molekularnymi w zidentyfikowanych typach komórek. Jednym z ograniczeń modelu hodowli pierwotnej jest to, że technika preparacji obejmuje całe brzuszne śródmózgowie, w tym neurony DA i GABA-ergiczne, a także neurony z SNc i VTA. Dowody sugerują, że neurony DA SNc mają selektywną podatność na wapń i ostateczną śmierć komórek w porównaniu z neuronami DA sąsiedniego VTA15. Niestety, odróżnienie SNc od neuronów VTA w kulturach embrionalnych okazało się trudne, ponieważ istnieje niewiele anatomicznych punktów orientacyjnych do zdefiniowania tych struktur w mózgu embrionalnym.

Pokazujemy, że technika hodowli pierwotnej pozwala na ilościowe określenie niejednorodnej spontanicznej aktywności Ca2 + (ryc. 1). Dlatego jest to idealny model systemu hodowli komórkowej do badania komórek aktywnych tonicznie, takich jak neurony dopaminergiczne śródmózgowia, neurony kory nowej i neurony GABA-ergiczne jądra nadskrzyżowaniowego (SCN)16,17. W większości zastosowań obrazowanieCa2+ nie osiąga takiej samej rozdzielczości czasowej jak elektrofizjologia. Dlatego jest prawdopodobne, że pojedyncze zdarzenie Ca2+ jest analogiczne do wybuchu neuronalnych potencjałów czynnościowych. Można to interpretować w ten sposób, że obrazowanie Ca2 + pozwala na stosunkowo dokładne pomiary nieprawidłowej aktywności pękania w komórkach stymulujących i dlatego jest odpowiednie do badania przesiewowego o wysokiej zawartości śmierci komórek ekscytotoksycznej za pośrednictwem Ca2 +.

Aby osiągnąć i utrzymać spontaniczną aktywnośćCa2+, ważne jest, aby zająć się dwoma kluczowymi punktami w protokole. Pierwszą z nich jest gęstość posiewu komórek po rozbiorze. W przypadku pierwotnych neuronów VM w poprzednich badaniach wykorzystano około 100 000 komórek/cm2 9,10. Dostosowaliśmy protokół do płytki o gęstości 200 000 komórek/cm2, co tworzy niejednorodny zakres spontanicznej aktywności i zwiększa liczbę dopaminergicznych neuronów VM obecnych na każdym szkiełku nakrywkowym. Ponieważ różne neurony stymulujące mają różne właściwości wypalania16, gęstość posiewu musi być dostosowana do badanego typu komórki i zoptymalizowana, aby osiągnąć idealny poziom spontanicznej aktywności. Drugi to czas inkubacji po zakażeniu wirusowym AAV. Podobnie jak gęstość posiewu, będzie to zależało od konkretnego kontekstu pytania badawczego i rodzaju użytego AAV. W przypadku zastosowanego tutaj specyficznego AAV, 5 dni inkubacji po infekcji wirusowej jest idealne do osiągnięcia pożądanych poziomów ekspresji białka, co pozwala na dynamiczne zmiany fluorescencji GCaMP w celu zarejestrowania aktywnościCa2+. Wiele czynników decyduje o tym, jak szybko i skutecznie AAV wyrazi swój ładunek, z których wiele wykracza poza zakres tej metody, ale pokrótce, ważne jest, aby wziąć pod uwagę aktywność promotora i tempo, w jakim białko ładunku dojrzewa i fałduje się.

Kolejną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na znaczną elastyczność w zakresie formatu, wektorów ekspresji, wykorzystania sprzętu do obrazowania oraz zakresu pytań naukowych, na które można odpowiedzieć. Ponadto metoda ta umożliwia badanie szerokiego zakresu szczegółowych pytań, które dotyczą ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu w PD i innych modelach dysfunkcji układu nerwowego. Na przykład ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu obejmuje wiele receptorów i kaskad sygnałowych5. Stosując tę metodę, jak wykazano w przypadku blokera AMPAR, NBQX na rycinie 1, możliwe jest wypreparowanie określonych składników odpowiedzi ekscytotoksycznego glutaminianu na poziomie fizjologicznym i molekularnym. Niewykluczone, że podobne podejście z wykorzystaniem inhibitorów systemów drugiego przekaźnika mogłoby zostać wykorzystane do określenia ich udziału w ekscytotoksyczności. Ponadto zastosowane tutaj AAV mogą być przystosowane do ekspresji GECI za pomocą promotorów specyficznych dla komórki lub czujników optogenetycznych wyrażonych przez AAV, które można wykorzystać do pomiaru innych parametrów, takich jak uwalnianie neuroprzekaźników.

Oprócz pierwotnych sekcji zarodków i obrazowania konfokalnego, większość protokołu wykorzystuje podstawowe umiejętności laboratoryjne, które nie wymagają specjalistycznego szkolenia. W związku z tym ograniczenia modelu obejmują trudność techniki preparacji embrionalnej, czas, w którym komórki muszą być hodowane, aby osiągnąć dojrzałość, oraz dostęp do mikroskopu konfokalnego lub podobnego aparatu do obrazowania. Wiele korzyści i elastyczność metody przeważają nad tymi ograniczeniami, co czyni ją idealnym modelem do badania roli ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu w zaburzeniach układu nerwowego. Wreszcie, model ten może być skutecznym narzędziem do badań przesiewowych nowych związków pod kątem działania antyapoptotycznego i ich zdolności do zachowania zdrowia neuronów DA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez granty z American Parkinson Disease Association (APDA) i NIH R01NS115809-01 dla RS. Dziękujemy Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) za zapewnienie ciężarnych myszy w czasie w celu wygenerowania pierwotnych kultur dopaminergicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% Formalina/PBSVWR100496-506
10X NA 0,3 Obiektyw zanurzeniowyw wodzie OlympusUMPLFLN10XW
12 mm okrągłe szkło osłonowe nr 1Phenix Research ProductsMS20-121
20X NA 0,85 Obiektyw zanurzeniowy w olejuOlympusUPLSAPO20XO
35 mm niepowlekane plastikowe naczynia do hodowli komórkowychVWR25382-348
40X NA 0,3 obiektyw zanurzeniowyw wodzie OlympusLUMPLFLN40XW
60X NA 1,35 obiektyw zanurzeniowy w olejuOlympusUPLSAPO60XO
Ampicylina (sód)Gold BioA-301-25
B-27 suplementThermoFisher1750404450x kolba
Mikroskop lornetkowyKent ScientificKSCXTS-1121
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7030
Chlorek wapnia (CaCl2), bezwodnySigma-Aldrich746495
Kurczak poliklonalny anty-tyrozynowy HydroksylazaAbcamab76442
Deoksyrybonukleaza I (DNaza)Sigma-AldrichDN25
D-glukoza, andydrowSigma-AldrichRDD016
DMEM + GlutaMAX mediumThermoFisher10569010500 ml
Surowica dla koniTermoaktywowany
iluminator światłowodowy 26050088 ThermoFisher, 100 VKent ScientificKSC5410
Filter System, PES 22UM 250MLVWR28199-764
Fluoview 1000Olympus
Fluoview 1200Suplement Olympus
GlutaMAXThermoFisher35050061
Koza poliklonalna anty-kurczak Alexa Fluor 594Abcamab150176
Kozia poliklonalna anty-królik Alexa Fluor 594Abcamab150077
Roztwór soli zrównoważony Hanksa (HBSS) 1xTermoFisher14175095500 mL
HEPESVWR101170-478
HeraCell 150 Inkubator CO2Heraeus (ThermoFisher)
ImageJ v1.52eNIH
IRIS-Drobne nożyczki (okrągłe)-S/S Str/31*8mm/13cmRWDS12014-13
Monosiarczan kanamycynyGold BioK-120-25
LamininSigma-AldrichL2020
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA7506
Kwas L-glutaminowyVWR97061-634
Chlorek magnezu (MgCl2), andydrousSigma-AldrichM8266
MPII Mini pompa perystaltyczna, 115/230 VAC, 50/60 HzAparaturaHarvarda70-2027
MULLER Micro Forceps-Str, końcówki 0,15 mm, 11 cmRWDF11014-11
NBQXHello BioHB0443
Podłoże neuropodstawoweThermoFisher21103049500 ml
Normalna surowica kozia (NGS)Abcamab7481
Pochodzenie 2020OriginLab
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40Addgene100837-AAV1Miano: 1,00E+13 gc/ml
PapainaWorthington Biomedical CorporationLS003126
Penicylina StreptomycynaThermoFisher1514012210 000 U/ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1xThermoFisher10010049500 mL
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP4832
Poli-L-ornitynaSigma-AldrichP4957
Chlorek potasu (KCl), bezwodnySigma-Aldrich746436
MPIIHarvard55-4148
Królik monoklonalny anty-kaspaza-3Abcamab32351
Chlorek sodu (NaCl), bezwodnySigma-Aldrich746398
SacharozaSigma-AldrichS7903BioXtra, ≥ 99,5% (GC)
Samica myszy C57BL/6 w ciążyw ciąży Texas A& M Instytut Medycyny
Triton X-100Sigma-AldrichX100500 mL
Niebieskie końcówki do pipet o szerokim otworze P1000VWR83007-380
Mikroskop konfokalny Mikroskop konfokalny Rurki głowicy pompy do aparatuGenomicznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marras, C., et al. Prevalence of Parkinson's disease across North America. NPJ Parkinson's Disease. 4, 21(2018).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  3. Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders. European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).
  4. Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).
  5. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  6. Vieira, M., et al. Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation. Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).
  7. Sebe, J. Y., et al. Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse. Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).
  8. Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism. Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).
  9. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  10. Henley, B. M., et al. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. Journal of Visualized Experiments. (120), e54981(2017).
  11. Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors. Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).
  12. Lavaur, J., et al. The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).
  13. Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91(2015).
  14. Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons. Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).
  15. Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).
  16. Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).
  17. Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spontaniczne przep ywy wapniapierwotne neurony mysieobrazowanie GCaMP6faplikacja glutaminianuaktywacja kaspazy 3mikroskopia konfokalnainfekcja AAVneurony dopaminergiczneapoptoza zale na od wapniawysokoprzepustowe badanie zawarto ci High Content Screening

Powiązane artykuły