Artykuł metodologiczny

Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61483

⸱

9 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Neurociencias, Departamento de Psicología, Universidad Iberoamericana Ciudad de México, 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia cztery najpopularniejsze techniki wizualizacji komórek BrdU dodatnich do pomiaru neurogenezy u dorosłych szczurów. Praca ta zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników, podawania analogu tymidyny, perfuzji przezsercowej, przygotowania tkanek, reakcji immunohistochemicznej peroksydazy, immunofluorescencji, wzmocnienia sygnału, barwienia przeciwstawnego, obrazowania mikroskopowego i analizy komórek.

Streszczenie

Jedną z najważniejszych rzeczy w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych (AHN) jest identyfikacja nowo powstałych komórek. Immunodetekcja analogów tymidyny (takich jak 5-Bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU)) jest standardową techniką stosowaną do wizualizacji tych nowo wytworzonych komórek. Dlatego BrdU jest zwykle wstrzykiwany małym zwierzętom dootrzewnowo, więc analog tymidyny zostaje włączony do dzielących się komórek podczas syntezy DNA. Wykrywanie odbywa się za pomocą analizy immunohistochemicznej wycinków mózgu. Każda grupa badawcza, która stosowała tę technikę, może docenić, że wymaga ona szczególnej dbałości o najdrobniejsze szczegóły, aby uzyskać udane barwienie. Na przykład ważnym krokiem jest denaturacja DNA HCl, co pozwala mu dotrzeć do jądra komórkowego w celu jego wybarwienia. Jednak istniejące raporty naukowe szczegółowo opisują bardzo niewiele takich kroków. Dlatego standaryzacja techniki jest wyzwaniem dla nowych laboratoriów, ponieważ uzyskanie pozytywnych i pomyślnych wyników może zająć kilka miesięcy. Celem niniejszej pracy jest szczegółowe opisanie i opracowanie kroków prowadzących do uzyskania pozytywnych i pomyślnych wyników techniki barwienia immunologicznego podczas pracy z analogiem tymidyny BrdU. Protokół obejmuje przygotowanie i ustawienie odczynnika, podanie analogu tymidyny u gryzonia, perfuzję przezsercową, przygotowanie tkanki, reakcję immunohistochemiczną peroksydazy, zastosowanie kompleksu awidyna-biotyna, immunofluorescencję, barwienie przeciwstawne, obrazowanie mikroskopowe i analizę komórek.

Wprowadzenie

Koncepcja, według której w dorosłym ludzkim mózgu przez całe życie powstają nowe neurony, od dziesięcioleci fascynuje społeczność naukową. Wiedza o tym, że mózg generuje nowe neurony w ciągu całego swojego funkcjonowania, została zdobyta dzięki wykrywaniu komórek w trakcie podziału1,2. Nowo powstałe neurony w dorosłym mózgu zidentyfikowano po raz pierwszy poprzez dokraniowe wstrzykiwanie trytowanej tymidyny (tymidyny-H3) u szczurów i wykrywanie komórek w cyklu komórkowym za pomocą autoradiogramów1,2. Odnotowano podziały komórek gleju oraz obecność neuroblastów, co stanowiło pierwsze obiecujące dane na temat neurogenezy postnatalnej1. Niemniej jednak stosowanie i wykrywanie tymidyny-H3 wiązało się z wykorzystaniem radioaktywności, która może być szkodliwa dla osób ją obsługujących. Pierwsza próba zbadania przydatności immunohistochemii BrdU w badaniach nad proliferacją, migracją i pochodzeniem komórek w układach nerwowych pojawiła się w 1988 roku w pracy Millera i Nowakowskiego3. W 1998 roku w artykule opublikowanym przez Erikssona i współpracowników wykazano, że nowe neurony były widoczne pośmiertnie w dorosłym ludzkim mózgu pacjentów, którym podano 5-bromo-2′-deoksyurydynę (BrdU)4. Pacjenci ci otrzymali wstrzyknięcie BrdU (250 mg dożylnie) w celu oznakowania wzrostu guzów4. Technikę tę zaadaptowano w modelach zwierzęcych. Wprowadzenie tych metod stanowiło kamień milowy w tej dziedzinie, ponieważ umożliwiło wykrywanie nowo powstałych komórek bez użycia związków radioaktywnych. Procedura ta stała się złotym standardem w pomiarze proliferacji komórek w niszach dorosłego mózgu, co przyczyniło się do dalszego rozwoju badań w tej dziedzinie.

Ograniczeniem techniki z wykorzystaniem analogu tymidyny jest brak możliwości określenia tożsamości komórkowej nowo powstałych komórek. Jednak immunohistochemia pozwala na zastosowanie techniki podwójnego lub potrójnego znakowania tej samej komórki, co umożliwia walidację losu komórkowego nowo powstałych komórek, a nawet określenie ich etapów dojrzewania, co prowadzi do dalszego rozwoju tej dziedziny. Metoda ta została scharakteryzowana pod kątem różnicowania nowo powstałych komórek w glej, niedojrzałe neurony lub w pełni dojrzałe komórki ziarniste, a nawet określania, czy aktywnie uczestniczą one w obwodach neuronalnych. Kolejnym przełomem w tej dziedzinie było wykorzystanie modeli transgenicznych do identyfikacji niedojrzałych komórek w obrębie domeny nestyny. Transgeniczne myszy nestin-GFP wykazują ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), które znajduje się pod kontrolą promotora nestyny. Nestyna jest filamentem pośrednim charakterystycznym dla komórek progenitorowych5. Transgeniczne myszy nestin-GFP pozwoliły na ustalenie wczesnych etapów rozwojowych zaangażowanych w neurogenezę6. Istotnym ograniczeniem jest jednak konieczność utrzymywania kolonii transgenicznych myszy nestin-GFP w specjalnych warunkach w placówce laboratoryjnej, co może okazać się nieopłacalne dla niektórych grup naukowych, szczególnie tych z krajów rozwijających się.

Wymienione powyżej techniki mają swoje zalety i wady. Jednakże identyfikacja komórek proliferujących za pomocą immunohistochemii (IHC) oraz możliwość zastosowania techniki podwójnego lub potrójnego znakowania metodą immunofluorescencji w celu określenia stopnia dojrzewania komórek lub ich losu stanowią do tej pory najbardziej wykonalny sposób pomiaru neurogenezy u dorosłych. Proces identyfikacji z wykorzystaniem immunohistochemii polega na znakowaniu białek, domen białkowych lub nukleotydów za pomocą specyficznego przeciwciała rozpoznającego, zwanego przeciwciałem pierwotnym. Jest ono z kolei rozpoznawane przez przeciwciało wtórne, które jest znakowane chromogenem (np. peroksydazą chrzanową) lub fluorochromem (np. FITC) sprzężonym z przeciwciałem wtórnym. Mikroskopy mogą wykrywać sygnały pochodzące zarówno z chromogenów, jak i fluorochromów. Dzięki IHC możliwe jest zidentyfikowanie białek błonowych, białek cytoszkieletu lub komponentów jądrowych, takich jak BrdU. Z drugiej strony, BrdU można znaleźć w jądrze komórkowym, ponieważ jest ono włączane do DNA w fazie S w drodze konkurencji. Dlatego kluczowym krokiem jest denaturacja DNA za pomocą HCl, która rozrywa wiązania DNA, umożliwiając przeciwciału anty-BrdU dostęp do BrdU wewnątrz DNA. Należy pamiętać, że po podaniu domięśniowym BrdU występuje w stężeniu nasyconym w surowicy myszy i szczurów odpowiednio przez 15 i 60 min, a następnie szybko spada do poziomów niewykrywalnych odpowiednio w 60. i 120. minucie7.

W niniejszej pracy opisujemy cztery różne, lecz ściśle powiązane techniki IHC: chromogeniczną detekcję pośrednią z wykorzystaniem reakcji peroksydazy chrzanowej (HRP) z DAB (3,3'-diaminobenzydyną) bez wzmocnienia sygnału (krok 4.1), wzmocnienie za pomocą kompleksu awidyna-biotyna (ABC) (krok 4.1), pośrednią detekcję immunofluorescencyjną bez wzmocnienia sygnału (krok 4.4) oraz wzmocnienie za pomocą znakowanej streptawidyny i biotyny (LSAB) (krok 4.3). Każda z metod posiada zalety i wady i może być użyteczna w zależności od specyficznych wymagań tkanki (patrz Tabela 1). Zdecydowaliśmy się na zastosowanie pośrednich metod IHC ze względu na ich przystępność cenową oraz łatwość przejścia z metod detekcji chromogenicznej na fluorescencyjne przy użyciu niekonjugowanych przeciwciał pierwszorzędowych. Podejście z wykorzystaniem HRP jest powszechnie stosowaną metodą IHC ze względu na niski koszt, wysoką stabilność, wysoką szybkość obrotu oraz pełną dostępność substratów. Niemniej jednak zalecamy stosowanie kontroli pozytywnej w celu potwierdzenia prawidłowego działania metody barwienia oraz kontroli negatywnej do efektywnego sprawdzenia funkcji przeciwciał. Wielokrotne barwienia immunohistochemiczne lub metody multiplex IHC (patrz krok 6) są potężnymi narzędziami pozwalającymi na pozyskanie dużej ilości danych z jednego skrawka tkanki w ramach jednego eksperymentu. Technika ta jest szczególnie istotna w przypadku ograniczonej dostępności próbek. Inną zaletą jest możliwość jednoczesnej identyfikacji specyficznych białek koekspresjonowanych w tej samej przestrzeni komórkowej przy zachowaniu integralności tkanki. Metoda multiplex pozwala na barwienie różnych markerów ekspresjonowanych podczas specyficznych etapów proliferacji (np. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), co umożliwia bardziej szczegółowe badania nad proliferacją i różnicowaniem8. Kluczowe jest wybranie przeciwciał kompatybilnych z zastosowaną techniką utrwalania, aby uniknąć reaktywności krzyżowej. Zalecamy indywidualne testowanie każdego nowego przeciwciała (w tym BrdU) w celu dostosowania i dopracowania metody. Następnie należy wprowadzić podwójne barwienie sekwencyjne, a w końcowej fazie rozpocząć proces jednoczesnego barwienia immunohistochemicznego, gdy metoda sekwencyjna zostanie całkowicie opanowana. W tej metodzie kluczowy jest wybór odpowiednich przeciwciał wtórnych.

MetodaMetoda specyficznaZaletyWady
Metoda detekcji pośredniejReakcja peroksydazy z DAB1. Wyższa czułość niż w przypadku detekcji bezpośredniej oraz metody pośredniej fluorescencji.
2. Wyższa odporność na fotoblaknięcie niż w przypadku fluorochromów.
3. Niższy koszt niż w przypadku metody detekcji fluorescencyjnej		1. Trudności w przeprowadzaniu analizy multipleksowej z powodu ograniczonej liczby barwników fluorescencyjnych.
2. Skomplikowane w przypadku celów koekspresyjnych w tej samej przestrzeni komórkowej.
3. Zredukowany zakres dynamiczny dla jednoczesnego wykrywania rzadkich i wysokoobfitych celów w tej samej tkance.
Fluorescencja1. Najlepsza i najprostsza metoda do multipleksowania z wykorzystaniem większej liczby barwników kolorystycznych.
2. Najlepsze dla celów współwyrażanych w tej samej przestrzeni komórkowej.
3. Lepszy zakres dynamiczny dla jednoczesnego wykrywania rzadkich i wysokobobotnych celów w tej samej tkance.
4. Brak dodatkowych kroków.		1. Niższa czułość niż w przypadku metody pośredniej reakcji peroksydazy z DAB.
2. Słaba odporność na fotoblaknięcie w czasie.
3. Wyższy koszt.
Metoda amplifikacji sygnałuKompleks awidyna-biotyna (ABC)1. Wyższa czułość niż w przypadku metody detekcji bezpośredniej i pośredniej.
2. Redukcja tła		1. Kroki dodatkowe.
2. Wyższy koszt w porównaniu do metod bez amplifikacji.
Metoda Labeled Streptavidin-Biotin (LSAB)1. Wyższa czułość niż w przypadku metody detekcji bezpośredniej i pośredniej.
2. Głębsza penetracja tkanek niż w przypadku metody ABC.
3. Redukcja tła		1. Kroki dodatkowe.
2. Wyższy koszt niż w przypadku metody ABC.
Brak dodatkowej metody amplifikacji1. Niższy koszt.
2. Brak dodatkowych kroków.
3. Idealne dla celów o wysokiej liczebności.		1. Niższa czułość: problematyczna w przypadku braku obfitych celów.

Tabela 1: Zalety i wady technik IHC. Tabela ta przedstawia zalety i wady metod detekcji pośredniej: reakcji peroksydazy z (3,3'-diaminobenzydyną) DAB oraz fluorescencji; a także metod amplifikacji sygnału: kompleksu awidyna-biotyna (ABC), znakowanej streptawidyny-biotyny (LSAB) oraz braku dodatkowej metody amplifikacji.

Obraz o wysokiej rozdzielczości jest niezbędny do przeprowadzenia prawidłowej analizy i zaprezentowania wyników. Istnieją dwa podejścia do poprawy rozdzielczości: 1) zastosowanie lepszej konstrukcji mikroskopu (np. konfokalnego, wielofotonowego) lub 2) numeryczne odwrócenie procesu rozmycia w celu ulepszenia obrazów za pomocą dekonwolucji9. Niestety, mikroskopia konfokalna nie jest dostępna dla każdego ze względu na wysokie koszty sprzętu i jego serwisowania10. Mikroskop epifluorescencyjny w szerokim polu oraz następująca po nim dekonwolucja obrazów z serii z-stack stanowią odpowiednią, niskokosztową alternatywę dla mikroskopii konfokalnej8,9. Jak wspomniano powyżej, celem dekonwolucji jest przywrócenie oryginalnego sygnału, który uległ degradacji w systemie akwizycji9, poprzez redukcję rozmycia, mgiełki poza ogniskową i zniekształceń widocznych na obrazie uzyskanym za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z wykorzystaniem matematycznych algorytmów usuwania10. Uzyskany rozmyty obraz można zamodelować matematycznie jako wynik splotu obserwowanych obiektów z trójwymiarową funkcją rozproszenia punktu (PSF). PSF to teoretyczny wzór dyfrakcyjny punktów światła emitowanych przez próbkę tkanki i zbieranych przez mikroskop. Plik PSF jest tworzony przy uwzględnieniu specyficznych warunków każdego obrazu, takich jak odstępy między komórkami CCD kamery, współczynnik załamania światła użytych mediów, apertura numeryczna obiektywu, długość fali emisji fluoroforu, rozmiary obrazów, liczba obrazów w metodzie przetwarzania z-stack oraz odległość między nimi (patrz specyfikacja techniczna w Tabeli 2). Innymi słowy, plik PSF podsumowuje wpływ konfiguracji obrazowania na obserwacje mikroskopowe9. W naszej pracy wykorzystujemy wtyczkę Diffraction PSF 3D (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) do tworzenia własnego, specyficznego pliku PSF dla każdego obrazu z-stack. Obrazy z-stack to seria zdigitalizowanych przekrojów optycznych z określonych głębokości (oś z) w tej samej lokalizacji XY preparatu. Komputer kompiluje informacje uzyskane z płaszczyzny ogniskowania poprzez ponowne przypisanie sygnałów, które pochodziły z obiektów znajdujących się w innych płaszczyznach ogniskowych. Aby utworzyć obrazy z-stack, konieczne jest wykonanie zdjęć z różnych warstw ogniskowania preparatu (np. dziesięć różnych obrazów tego samego obszaru XY co 1 μm głębokości). Następnie używamy oprogramowania mikroskopowego dostarczonego przez producenta lub programu Fiji, aby stworzyć z-stack lub obraz 3D. Wynikiem będzie pojedynczy plik obrazu stosu (np. dziesięć obrazów z różnymi ogniskowaniem). Istnieje kilka specjalistycznych narzędzi i rozwiązań programowych, takich jak oprogramowanie open-source do mikroskopii dekonwolucyjnej. Przedstawimy wyniki procesu dekonwolucji przy użyciu DeconvolutionLab29, który jest wtyczką do programu Fiji11 (dystrybucja ImageJ12). Dekonwolucja pomoże poprawić rozdzielczość końcowych mikrografii (patrz Rycina 1B,C). W celu uzyskania dalszych informacji i instrukcji zdecydowanie zalecamy zapoznanie się z literaturą13.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek mózgu myszy, wykazująca markery BrdU, DAPI, GFAP; schemat opisowy.
Rysunek 1: Reprezentatywny obraz dekonwolucji 3D dla wielu kanałów kolorystycznych. (A) DG przy małym powiększeniu. (B) Oryginalne obrazy z serii z-stack dla każdego kanału oraz obraz połączony. (C) Obrazy z serii z-stack po dekonwolucji 3D dla każdego kanału oraz obraz połączony. Mózg pochodził od szczura z grupy aktywności fizycznej. Zastosowano metodę amplifikacji LSAB (labeled streptavidin-biotin). Wykazano przeciwciało sprzężone ze streptawidyną Cy3 dla oznaczenia BrdU (czerwony), DAPI jako barwienie przeciwstawne (niebieski) oraz kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP) jako marker astroglialny (zielony). ML = warstwa molekularna; GCL = warstwa komórek ziarnistych; SGZ = strefa podziarnista. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie szczegółowego opisu kroków prowadzących do uzyskania pozytywnych i pomyślnych wyników w immunobarwieniu oraz wymienienie powszechnie stosowanych etapów w badaniach opartych na BrdU, bez wykorzystania mikroskopu konfokalnego. Barwienie BrdU jest techniką wymagającą wykonania kilku etapów, których należy ściśle przestrzegać, aby uzyskać pomyślne barwienie. Standaryzacja tych technik barwienia zazwyczaj trwa miesiące i jest czasochłonna oraz zasobożerna. Przewidujemy, że niniejszy artykuł może dostarczyć informacji grupom rozpoczynającym pracę w tej dziedzinie, redukując czas oraz liczbę błędów.

Protokół

Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications N°. 8023, wersja z 1978 r.) oraz lokalnym prawem Meksyku, w celu zminimalizowania liczby wykorzystanych zwierząt i ich cierpienia. Komitet Etyki Universidad Iberoamericana zatwierdził protokoły eksperymentalne dotyczące wykorzystania zwierząt w niniejszym badaniu.

1. Przygotowanie odczynników i konfiguracja

UWAGA: Większość roztworów można przygotować na kilka dni przed użyciem, chyba że wskazano inaczej.

  1. Roztwór BrdU
    1. Wyjąć roztwór BrdU z zamrażarki w temperaturze -20 °C i pozwolić mu osiągnąć temperaturę pokojową (RT).
    2. Obliczyć masę BrdU potrzebną do uzyskania dawki 50 mg/kg zgodnie z masą ciała szczura. Obliczyć objętość 0,9% roztworu soli fizjologicznej (0,9 g NaCl w 100 mL sterylnej H2O) potrzebną do przygotowania roztworu roboczego o stężeniu 20 mg/mL. Przygotować nadwyżkę, aby zapewnić co najmniej 0,5 mL na szczura na jedną iniekcję.
      UWAGA: Dawka podawana zwierzętom doświadczalnym powinna być bezpieczna, skuteczna i wywoływać minimalne efekty uboczne. Wykazano, że czas trwania barwienia przy dawce 100 mg/kg BrdU nie przeważa nad potencjalnie wyższą toksycznością w porównaniu z dawką 50 mg/kg7. Nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie komórek znakowanych BrdU/mm3 dla dawek 50 i 100 mg/kg podawanych i.p. u szczurów7. Zaleca się wstrzykiwanie małej dawki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
    3. Odważyć roztwór BrdU i dodać go do roztworu soli fizjologicznej w probówce stożkowej, a następnie wymieszać za pomocą wiraka (vortex).
      UWAGA: W przypadku objętości większych niż 1 mL należy wstępnie podgrzać roztwór soli fizjologicznej do 45‒50 °C w łaźni wodnej.
    4. Umieścić probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C na 10‒15 min i mieszać wirakiem co 2‒3 min aż do całkowitego rozpuszczenia. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego w celu uzyskania sterylnej iniekcji. Owinąć probówkę folią aluminiową, schłodzić do temperatury pokojowej i użyć natychmiast.
      OSTROŻNIE: Roztwór BrdU jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Przygotowywać go w dygestorium. Z roztworem BrdU należy pracować w odpowiednich środkach ochrony indywidualnej (PPE). Zaleca się przygotowanie roztworu bezpośrednio przed użyciem. Roztwór jest jednak stabilny przez 24 h w temperaturze RT. Należy chronić go przed światłem.
  2. Aby przygotować 1 L 0,1 M fosforanowego buforu solnego (PBS) o pH 7,4, dodać 240 mg fosforanu potasu jednopodstawowego (KH2PO4), 1,44 g fosforanu sodu dwupodstawowego (Na2HPO4), 200 mg chlorku potasu (KCl) i 8 g chlorku sodu (NaCl) do 800 mL wody podwójnie destylowanej (ddH2O) przy ciągłym mieszaniu. Dostosować pH do 7,4 i dopełnić wodą podwójnie destylowaną H2O do całkowitej objętości 1 L. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
  3. Aby przygotować 100 mL PBS+, dodać 3% (3 mL) normalnej surowicy końskiej i 0,3% (300 µL) Triton X-100 do 0,1 M PBS (pH 7,4). Przechowywać w alikwotach 20‒50 mL w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.
    UWAGA: Alternatywnie zamiast PBS można zastosować TBS. Odpowiednia będzie każda inna surowica, różna od przeciwciał gospodarza i tkanki eksperymentalnej.
  4. Aby przygotować 100 mL PBS++, dodać 10% (10 mL) normalnej surowicy końskiej i 0,3% (300 µL) Triton X-100 do 0,1 M PBS pH 7,4. Przechowywać w alikwotach 20‒50 mL w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.
  5. Aby przygotować 1 L roztworu krioprotekcyjnego, wymieszać 250 mL glikolu etylenowego i 250 mL glicerolu, mieszając ciągle aż do połączenia. Powoli dopełnić do 1 L za pomocą PBS. Przefiltrować papierem filtrującym klasy 4 (20‒25 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C lub RT do 1 roku.
  6. Przygotować 4% paraformaldehyd w 0,1 M PBS (roztwór PFA) w następujący sposób. Aby uzyskać 1 L roztworu, powoli dodać 40 g proszku paraformaldehydu do 800 mL 0,1 M PBS o temperaturze 60‒65 °C przy ciągłym mieszaniu. Mieszać, aż paraformaldehyd całkowicie się rozpuści, kontrolując temperaturę (60‒65 °C). W razie potrzeby dodać kilka kropli 1 M NaOH, aby wyklarować roztwór. Po osiągnięciu przez roztwór temperatury pokojowej przefiltrować go papierem filtrującym klasy 4 (20-25 μm).
    OSTROŻNIE: Paraformaldehyd jest toksyczny i podejrzewany o działanie rakotwórcze, przygotowywać w dygestorium. Przechowywać w temperaturze 4 °C i najlepiej zużyć w ciągu 2 dni. Gotowy do użycia roztwór PFA jest dostępny w sprzedaży.
  7. Aby przygotować 1 L 10 mM buforu cytrynianu sodu (SCB) o pH 6, dodać 1,204 g cytrynianu sodu (dwuwodnika) i 1,134 g kwasu cytrynowego do 800 mL podwójnie destylowanej H2O przy ciągłym mieszaniu. Dostosować pH do 6,0 i dopełnić ddH2O do 1 L. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  8. Przygotować 50 mL 2 N HCl, powoli dodając 8,25 mL 12 N HCl (stężony roztwór zapasowy) do 41,75 mL ddH2O przy ciągłym mieszaniu.
    OSTROŻNIE: Przygotowywać w dygestorium. Roztwór musi być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
    UWAGA: 2 N HCl zostanie użyty do denaturacji DNA, co jest kluczowym etapem. Ponieważ BrdU zostaje wbudowany w DNA, HCl jest używany do rozrywania wiązań DNA, co umożliwia przeciwciałom BrdU dostęp do BrdU w obrębie DNA.
  9. Przygotować roztwór blokujący endogenną peroksydazę w następujący sposób. Przygotować 100 mL 0,6% nadtlenku wodoru, mieszając 2 mL 30% nadtlenku wodoru z 98 mL ddH2O przy ciągłym mieszaniu.
    UWAGA: Roztwór musi być przygotowany bezpośrednio przed użyciem. Przechowywać w ciemności, ponieważ H2O2 jest światłoczuły. Zamiast wody można użyć PBS lub TBS.
  10. Przygotować roztwór kompleksu awidyna-biotyna (ABC) zgodnie z instrukcjami producenta. Aby otrzymać 5 mL ABC w 0,1 M PBS, dodać 2 krople (≈100 µL) odczynnika A i wymieszać, a następnie dodać 2 krople (≈100 µL) odczynnika B i wymieszać.
    UWAGA: Roztwór musi zostać przygotowany i poddany rotacji (tumble-roll) przez 20‒30 min przed użyciem.
  11. Przygotować substrat peroksydazy (HRP) DAB (diaminobenzydyny) za pomocą zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Do 5 mL ddH2O dodać 2 krople (≈ 84 µL) odczynnika 1 i wymieszać, dodać 4 krople (≈ 100 µL) odczynnika 2 i wymieszać, a następnie dodać 2 krople (≈ 80 µL) odczynnika 3 i wymieszać. Na koniec, jeśli jest to pożądane, dodać 2 krople (≈ 80 µL) odczynnika 4 (nikiel) i wymieszać.
    UWAGA: Roztwór musi być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
    OSTROŻNIE: DAB jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Należy z nim obchodzić się ostrożnie i utylizować zgodnie z przepisami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych obowiązującymi w danej instytucji. Aby zneutralizować DAB, dodać kilka kropli wybielacza (podchlorynu sodu); roztwór zmieni kolor na czarny.
  12. Przygotować 100 mL roztworu fioletu krezylowego, dodając 100 mg octanu fioletu krezylowego i 250 μL kwasu octowego do 80 mL ddH2O w temperaturze 55‒60 °C. Dostosować objętość do 100 mL, przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnym naczyniu.
    UWAGA: Użytkownikowi zaleca się przetestowanie różnych stężeń roztworu fioletu krezylowego przed zastosowaniem go na cennych próbkach tkanek. W przypadku niektórych tkanek wynik barwienia kontrastowego może być ciemniejszy, co może zmniejszyć możliwość dokładnego zliczenia komórek BrdU-dodatnich.

2. Podanie analogu tymidyny BrdU

  1. Unieruchom zwierzę doświadczalne (np. 90-dniowego samca szczura Wistar o masie 350 g), stabilizując dolną część jamy brzusznej.
  2. Podaj roztwór BrdU (50 mg/kg) drogą dosytroniczną (i.p.) za pomocą igły 23 G i strzykawki 1 mL.
    UWAGA: Dostosuj objętość iniekcji do masy zwierzęcia. W przypadku dorosłych szczurów stosuj igłę 23‒27 G i strzykawkę 1‒5 mL. Maksymalna tolerowana objętość iniekcji dosytronicznej u dorosłego szczura wynosi 10 mL. Do podania roztworu BrdU można zastosować różne drogi podania14, na przykład iniekcję dosytroniczną lub podanie doustne wraz z wodą pitną.

3. Przygotowanie tkanki

UWAGA: Trzymiesięczne szczury miały zapewniony dostęp ad libitum do aktywności fizycznej (kołowrotek) przez siedem dni. W 6. dniu szczurom wstrzyknięto BrdU (krok 2) 3 razy w odstępach 12 h. Kroki opisane w sekcji 3 należy wykonać po 8 h od ostatniego wstrzyknięcia BrdU.

  1. Wstrzyknąć pentobarbital (50 mg/kg i.p.) i odczekać kilka minut, aż zwierzę zostanie głęboko znieczulone.
    UWAGA: Przed kontynuacją należy upewnić się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Należy ostrożnie uszczypnąć jedną z łap lub ogon. Jeśli zwierzę reaguje na bodziec, należy odczekać jeszcze kilka minut. Jeśli zwierzę nie reaguje na uszczypnięcie, przejść do następnego kroku.
  2. Odsłonić serce poprzez nacięcie skóry jamy brzusznej poniżej mostka, rozszerzenie żeber i przecięcie przepony.
  3. Fiksacja poprzez perfuzję transkardialną
    1. Wprowadzić igłę do lewej komory i wykonać niewielkie nacięcie w prawym przedsionku. Używając pompy lub grawitacji, przeprowadzić perfuzję (przepływ 5‒7 mL/min) roztworem 0.1 M PBS aż do całkowitego wypłukania krwi i uzyskania przejrzystego roztworu.
    2. Używając pompy lub grawitacji, przeprowadzić zimną perfuzję (przepływ 5‒7 mL/min) roztworem PFA w celu utrwalenia tkanki, aż ogon stanie się sztywny.
      UWAGA: Zazwyczaj szczur o masie 300 g wymaga około 100‒150 mL roztworu PFA. Fiksacja tkanki jest opcjonalna. Dzięki temu mózg może zostać wyjęty do wykorzystania w różnych procesach, aby zminimalizować liczbę zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach.
  4. Disekcja i postfixacja
    1. Dokonać dekapitacji zwierzęcia i delikatnie wyjąć mózg z czaszki. Zanurzyć mózg w probówce stożkowej zawierającej roztwór PFA (~40 mL dla szczura 250 mg) na 1‒2 dni w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie należy doprowadzić do nadmiernej fiksacji (powyżej 48 h), ponieważ może to osłabić barwienie tkanki z powodu niedostępności antygenów.
    2. Przygotować 100 mL 30% roztworu sacharozy, dodając 30 g sacharozy do 70 mL roztworu 0.1 M PBS przy ciągłym mieszaniu. Dopełnić roztworem 0.1 M PBS do objętości 100 mL. Zanurzyć mózg w probówce stożkowej z 30% roztworem sacharozy (35 mL) na około 1‒2 dni w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno probówki.
  5. Wycinanie koronalnych przekrojów mózgu
    UWAGA: Obsługa kriotomu wymaga instruktażu i przeszkolenia. Szczegółowe instrukcje znajdują się w referencji15.
    1. Zanurzyć cały mózg w izopentanie w temperaturze -80 °C i trzymać w -80 °C przez 10 min. Umieścić mózg w matrycy zatapiającej na płytce kriotomu.
      UWAGA: W określonych warunkach szybkie mrożenie mózgu w -80 °C może spowodować pęknięcia lub uszkodzenia tkanki. Użytkownik powinien być świadomy tego problemu. W takim przypadku należy użyć izopentanu w -20 °C do zamrożenia mózgu.
    2. Używając kriotomu (temperatura od -25 do -20 °C), wyciąć przekroje koronalne o grubości 40 μm. Przenieść sekwencyjnie przekroje do 24-dołkowej płytki hodowlanej z roztworem krioprotekcyjnym zgodnie z instrukcją na Rysunku 2. Przechowywać w -20 °C do momentu użycia, maksymalnie przez kilka miesięcy.
      UWAGA: Następnie przetwarzać wszystkie tkanki w postaci wolno pływających seryjnych przekrojów o grubości 40 µm w płytkach 12-dołkowych z wkładkami siatkowymi przy łagodnym i ciągłym mieszaniu (10 rpm). W odpowiednich warunkach przekroje mózgu można przechowywać przez lata.

Schemat przepływu pracy w czytniku mikropłytek; sekwencyjna ścieżka, proces przenoszenia cieczy z dołka do dołka.
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie sekwencyjnego przenoszenia przekrojów z kriotomu do 24-dołkowej płytki hodowlanej z roztworem krioprotekcyjnym. Należy rozpocząć od dołka A1 i umieszczać kolejne przekroje w rzędzie A; po dołku A6 przejść do następnego rzędu B i tak dalej. Po dotarciu do D6 powrócić do A1 i kontynuować proces. Taki układ umożliwia kwantyfikację N-tego (np. szóstego dla neurogenezy, co odpowiada zawartości jednej kolumny) przekroju całego obszaru mózgu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Immunobarwienie

UWAGA: Podsumowanie zalet i wad każdej z technik znajduje się w Tabeli 1.

  1. Detekcja BrdU za pomocą reakcji peroksydazy z DAB
    UWAGA: Kroki od 4.1.1 do 4.1.5 należy wykonać w dniu 1.
    1. Przenieść skrawki z roztworu do krioprotekcji do 0.1 M PBS w temperaturze pokojowej. Płukać trzy razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    2. Inkubować skrawki przez 30 min w roztworze blokującym peroksydazę endogenną, aby dezaktywować peroksydazę endogenną. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS. Opcjonalnie przeprowadzić odsłanianie antygenu (patrz sekcja 5). Inkubować skrawki przez 20 min w 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0.1 M buforze boratowym (pH 8.5) przez 10 min. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając lodowatego 0.1 M PBS.
    3. Inkubować skrawki przez 2 h w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący). Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-BrdU (pochodzenia mysiego) w stężeniu 1:250 w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. W dniu 2 płukać skrawki 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    5. Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP (anty-mysie) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez 2‒4 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    6. Przenieść skrawki do roztworu substratu peroksydazy (HRP) DAB i inkubować przez 2‒10 min. Gdy skrawki przybiorą ciemnoszary kolor, ocenić tkankę za pomocą lupy lub mikroskopu. Jeśli obecne są komórki pozytywne, płukać 3 razy (po 15 min każdy) wodą z kranu (aby zmniejszyć tło). Przemyć 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    7. Ostrożnie nanieść skrawki na zżelatynizowane szkiełka za pomocą miękkiego pędzla, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej. Wykonać przeciwbarwienie (patrz sekcja 7.1), dodać trwałe medium montażowe i nałożyć szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  2. Detekcja BrdU za pomocą reakcji peroksydazy z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza
    UWAGA: Kroki od 4.2.1 do 4.2.5 należy wykonać w dniu 1.
    1. Przenieść skrawki z roztworu do krioprotekcji do 0.1 M PBS, aby osiągnęły temperaturę pokojową. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    2. Inkubować przez 30 min z roztworem blokującym peroksydazę endogenną, aby dezaktywować peroksydazę endogenną. Płukać 3 razy po 10 min każdy w 0.1 M PBS. Opcjonalnie przeprowadzić odsłanianie antygenu (patrz sekcja 5).
    3. Inkubować przez 20 min w 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0.1 M buforze boratowym (pH 8.5) przez 10 min. Przemyć 3 razy po 10 min każdy, używając lodowatego 0.1 M PBS.
    4. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący).
    5. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-BrdU (pochodzenia mysiego) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez noc w temperaturze 4°C.
    6. W dniu 2 płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    7. Inkubować z biotynilowanym przeciwciałem wtórnym (anty-mysie) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez 2‒4 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    8. Inkubować w roztworze ABC przez 1 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    9. Przenieść skrawki do roztworu substratu peroksydazy (HRP) DAB i inkubować przez 2‒10 min. Gdy skrawki przybiorą ciemnoszary kolor, ocenić tkankę za pomocą lupy lub mikroskopu. Jeśli obecne są komórki pozytywne, płukać 3 razy (po 15 min każdy) wodą z kranu (aby zmniejszyć tło), a następnie przemyć 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
      UWAGA: Roztwór musi zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem. Należy zachować ostrożność, aby skrawki mózgu nie przykleiły się do siebie z powodu nieregularnych ciemnych plam w tkance.
    10. Ostrożnie nanieść skrawki na zżelatynizowane szkiełka za pomocą miękkiego pędzla, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.
    11. W razie potrzeby wykonać przeciwbarwienie (patrz krok 7.1), dodać trwałe medium montażowe i nałożyć szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  3. Detekcja BrdU metodą immunofluorescencji z wykorzystaniem amplifikacji znakowaną streptawidyną-biotyną (LSAB)
    UWAGA: Kroki od 4.3.1 do 4.3.4 należy wykonać w dniu 1.
    1. Przenieść skrawki z roztworu do krioprotekcji do 0.1 M PBS w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS. Opcjonalnie przeprowadzić odsłanianie antygenu (patrz sekcja 5).
    2. Inkubować przez 20 min w 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0.1 M buforze boratowym (pH 8.5) przez 10 min. Płukać 3 razy po 10 min każdy w lodowatym 0.1 M PBS.
    3. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący). Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-BrdU (pochodzenia mysiego) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. W dniu 2 płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    5. Inkubować z biotynilowanym przeciwciałem wtórnym (anty-mysie) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez 2‒4 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS. Inkubować ze streptawidyną sprzężoną z fluorochromem (Cy3) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS (nie używać surowicy) przez 1‒2 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
      UWAGA: Surowica może zawierać biotynę i nie powinna być dodawana do rozcieńczalników. Zamiast tego należy użyć PBS zawierającego 0.3% Triton X-100.
    6. Ostrożnie nanieść skrawki na zżelatynizowane szkiełka za pomocą miękkiego pędzla, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej lub zamontować natychmiast przy użyciu odpowiedniego medium montażowego. Wykonać przeciwbarwienie (patrz krok 7.2), dodać trwałe medium montażowe i nałożyć szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  4. Detekcja BrdU metodą pośredniej immunofluorescencji
    UWAGA: Kroki od 4.4.1 do 4.4.4 należy wykonać w dniu 1.
    1. Przenieść skrawki z roztworu do krioprotekcji do 0.1 M PBS, aż osiągną temperaturę pokojową. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS. W razie potrzeby przeprowadzić odsłanianie antygenu (opcjonalnie, patrz sekcja 5).
    2. Inkubować przez 20 min w 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0.1 M buforze boratowym (pH 8.5) przez 10 min. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając lodowatego 0.1 M PBS. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący). Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-BrdU (pochodzenia mysiego) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. W dniu 2 płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    4. Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluorochromem (anty-mysie) w rozcieńczeniu 1:250 w PBS+ przez 2‒4 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 min każdy, używając 0.1 M PBS.
    5. Ostrożnie nanieść skrawki na zżelatynizowane szkiełka za pomocą miękkiego pędzla, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej lub zamontować natychmiast przy użyciu odpowiedniego medium montażowego. Wykonać przeciwbarwienie (patrz krok 7.2), dodać trwałe medium montażowe i nałożyć szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.

5. Odmaskowywanie antygenów (opcjonalnie)

UWAGA: Odmaskowanie antygenów jest opcjonalnym krokiem mającym na celu przywrócenie antygenowości utraconej w wyniku fiksacji, która modyfikuje strukturę trzeciorzędową i czwartorzędową wielu antygenów, czyniąc je niewykrywalnymi dla przeciwciał. Krok ten można dodać do oryginalnego protokołu.

  1. W mikrofalówce lub kąpieli wodnej wstępnie podgrzać roztwór 10 mM buforu cytrynianu sodu (SCB) o pH 6 do 90‒95 °C (w zależności od wysokości nad poziomem morza, roztwór zaczyna wrzeć w okolicach tej temperatury). Wypełnić stożkową probówkę o pojemności 50 mL w 80% (40 mL) podgrzanym SCB. Przenieść skrawki do wkładek siatkowych, a następnie umieścić je w probówce z SCB. Zamknąć probówkę zakrętką, w której wykonano otwory za pomocą igły 18‒20 G.
  2. Inkubować skrawki przez 30 min w SCB w temperaturze 80‒85 °C, stosując naprzemienne cykle podgrzewania w mikrofalówce na minimalnym poziomie mocy. W razie potrzeby uzupełnić poziom SCB w probówce stożkowej. Bezpośrednio po zakończeniu inkubacji przenieść skrawki wraz z wkładkami siatkowymi do lodowatego 0,1 M PBS i płukać 3 razy po 10 min.

6. Wielokrotne immunostainingi (opcjonalnie)

UWAGA: Uzasadnienie tego etapu znajduje się w sekcji wstępnej.

  1. Jednoczesne wielokrotne barwienia immunohistochemiczne
    1. Przygotować koktajl z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko celom (np. mysie anty-BrdU oraz królicze anty-GFAP) w PBS+. Dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego należy zastosować inny gatunek zwierzęcia, z którego pochodzi przeciwciało. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie postępować zgodnie z kolejnymi krokami każdego protokołu.
    2. Przygotować koktajl z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego (np. kozie anty-mysie FITC, kozie anty-królicze TRITC) w tym samym roztworze rozcieńczającym dla każdego protokołu. Następnie postępować zgodnie z kolejnymi krokami każdego protokołu. W celu uniknięcia reakcji krzyżowych zaleca się stosowanie przeciwciał drugorzędowych pochodzących z tego samego gatunku.
  2. Sekwencyjne wielokrotne barwienia immunohistochemiczne.
    1. Postępować zgodnie z protokołem dla pierwszego celu przeciwciała (np. mysie anty-BrdU), przerywając proces przed montowaniem skrawków. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący).
    2. Inkubować drugie przeciwciało pierwszorzędowe (np. królicze anty-GFAP) w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C. Postępować zgodnie z kolejnymi krokami każdego protokołu, w tym z inkubacją drugiego przeciwciała drugorzędowego (np. kozie anty-królicze TRITC). Kontynuować kolejne kroki każdego protokołu aż do końca.

7. Kontrastowanie (opcjonalnie)

  1. W przypadku protokołów wykorzystujących reakcję peroksydazy, uprzednio podgrzać roztwór fioletu krezolowego do 60 °C. Nawodnić preparaty w ddH2O przez 1 min. Inkubować preparaty w gorącym roztworze fioletu krezolowego przez 5‒20 min.
    1. Płukać preparaty w ddH2O przez 1 min. Płukać preparaty w alkoholu etylowym o stężeniu 70%, 80%, 90% i 100% przez 1‒3 min każdy. Płukać preparaty w ksylenie przez 1‒3 min.
    2. Dodać trwałe hydrofobowe medium montażowe i nałożyć szkiełka zakrywkowe.
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. Można zastosować własnoręcznie przygotowane medium montażowe zawierające PVA (alkohol poliwinylowy)-DABCO.
  2. W przypadku protokołów wykorzystujących immunofluorescencję, dodać niewielką objętość (25‒50 μL) hydrofilowego medium montażowego z DAPI, jodkiem propidyny lub substancją podobną. Uszczelnić obwód lakierem do paznokci lub plastikowym uszczelniaczem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.

8. Obrazowanie i analiza

UWAGA: Specyfikacje konfiguracji mikroskopu znajdują się w Tabeli 2. Zazwyczaj liczenie barwionych nowych komórek przeprowadza się na skrawkach barwionych metodą reakcji peroksydazy (metoda tańsza), jednak można to również wykonać z wykorzystaniem immunofluorescencji.

  1. Aby przeprowadzić kwantyfikację komórek, najpierw należy prawidłowo zidentyfikować zakręt zębaty, używając obiektywu o powiększeniu 4x (dalsze instrukcje dotyczące szczegółów anatomicznych DG znajdują się w pracy Amaral et al.16).
    1. W warstwie ziarnistej zakrętu zębatego należy wyszukać jądra znakowane BrdU (używając obiektywu o powiększeniu 40x). Przeszukiwanie komórek należy przeprowadzić wyczerpująco wzdłuż osi z, ponieważ nowe komórki mogą być rozłożone w różnych warstwach (patrz Video 1).
    2. Należy wybrać interwał sekcji do wyszukiwania komórek w całym zakręcie zębatym (np. co 6. sekcja tkanki, co odpowiada każdemu 240 μm).
    3. Należy policzyć wszystkie komórki BrdU-dodatnie. Morfologia znakowanego jądra może się zmieniać w zależności od tego, ile BrdU włączyła komórka (jako pomoc posłużyć się może Figure 3). Należy powoli przesuwać się wzdłuż osi z, aby skwantyfikować wszystkie jądra tworzące skupisko (patrz Video 2).
    4. Całkowitą liczbę policzonych komórek należy pomnożyć przez wybrany interwał sekcji (np. 6), aby oszacować całkowitą liczbę nowych komórek znakowanych BrdU.
    5. W standardowym eksperymencie idealnie jest policzyć co najmniej dziesięć sekcji na zwierzę i co najmniej pięć zwierząt w grupie.
  2. Dekonwolucja obrazu (opcjonalnie)
    UWAGA: Ważne informacje dotyczące tego kroku znajdują się w sekcji wstępnej. Procedura ta wymaga obrazów monochromatycznych (skali szarości). Obrazy kolorowe należy przekształcić w skalę szarości. Jeśli obrazy stanowią kompozyt RGB, należy najpierw rozdzielić kanały i połączyć je w jeden obraz (nie kompozyt), a następnie przekształcić w 8-bitową skalę szarości.
    1. Utworzyć plik z-stack z mikrografii.
    2. Utworzyć plik funkcji rozproszenia punktowego (PSF), otwierając wtyczkę Diffraction PSF 3D (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) z menu Plugins. Wypełnić wszystkie wymagane dane (patrz Table 2). Nacisnąć OK i zapisać plik.
    3. Otworzyć wtyczkę DeconvolutionLab29 z menu Plugins (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). Przeciągnąć dopasowany obraz z-stack oraz plik PDF do odpowiednich slotów okna.
    4. Wybrać algorytm dekonwolucji (np. Richardson-Lucy) oraz liczbę iteracji (np. 20). Nacisnąć RUN.
    5. Połączyć zdekonwolucjonowane obrazy w jeden obraz z-stack, wybierając Stacks z menu Image u góry. Następnie kliknąć Z Project. Z menu rozwijanego Projection Type wybrać Max Intensity, nacisnąć OK i zapisać plik.
    6. Utworzyć obraz RGB, używając pojedynczego pliku obrazu z-stack stworzonego w poprzednim kroku, z pożądanym pseudokolorem, wybierając Color z menu Image u góry. Następnie kliknąć Merge Channels. Przypisać odpowiedni obraz do pożądanego kanału kolorów z menu rozwijanego. Odznaczyć pole Create Composite, nacisnąć OK i zapisać plik (patrz Figure 4).
    7. Jeśli istnieje więcej niż jeden obraz kanału, powtórzyć kroki 8.2.1‒8.2.5. Utworzyć plik obrazu RGB zgodnie z krokiem 8.2.6, otwierając co najmniej dwa pliki obrazów i wybierając różne kanały kolorów dla każdego pliku obrazu (patrz Figure 4).

Wyniki

Opisane powyżej metody zastosowano w celu ilościowego oznaczenia nowo powstałych komórek w hipokampie dorosłych szczurów po dobrowolnej aktywności fizycznej, w porównaniu z grupą kontrolną bez dodatkowej aktywności fizycznej. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano hipokamp szczura postnatalnego. Samce szczurów w wieku 3 miesięcy poddano protokołowi dobrowolnej aktywności fizycznej (kołowrotek) przez siedem dni. W 6. dniu szczurom wstrzyknięto BrdU (sekcja 2), a następnie powtarzano zabieg co 12 h, aż do wykonania trzech pełnych iniekcji. Aby umożliwić przejście trzech podziałów cyklu komórkowego, zwierzęta poddano perfuzji transkardialnej (sekcja 3) 8 h po ostatniej iniekcji BrdU. Tę samą procedurę zastosowano u trzymiesięcznych szczurów, które nie podejmowały aktywności fizycznej, w celu uzyskania kontroli porównawczej. Jako kontrolę pozytywną jednodniowym szczurzętom (1. dzień postnatalny) wstrzyknięto jednorazowo BrdU, zgodnie z opisem w sekcji 2 powyżej. Dzień po iniekcji (2. dzień postnatalny) szczurzęta zostały uśmiercone, a ich głowy zanurzono w roztworze PFA, zgodnie z opisem w kroku 3.4. Dorosłe szczury zostały poddane głębokiej anestezji (krok 3.1) i perfuzji transkardialnej, zgodnie z opisem w kroku 3.2. Mózgowia zostały wypreparowane i poddane postfixacji (krok 3.4). Mózgowia pocięto na koronalne sekcje o grubości 40 μm (krok 3.5). Sekcje przetworzono w celu przeprowadzenia immunohistochemii BrdU, zgodnie z opisem w kroku 4.

Do barwienia (krok 4.1) i zliczania komórek BrdU-dodatnich w DG wykorzystaliśmy reakcję peroksydazy chrzanowej z DAB IHC. Rysunek 5 przedstawia przekrój DG z komórkami znakowanymi BrdU. Rysunek 5C,D pokazuje reprezentatywną część przekroju DG przy większym powiększeniu. Komórki znakowane wykazywały intensywne, ciemne barwienie i zostały oznaczone strzałkami. Wstawka przedstawia średnią liczbę komórek znakowanych w grupach eksperymentalnej i kontrolnej (liczba zliczonych komórek dodatnich pomnożona przez sześć, zgodnie z opisem w kroku 8.1). Test t Studenta wykazał istotne różnice w liczbie komórek BrdU-dodatnich (t(10) = 2.704, p = 0.0222). Grupa kontrolna, która nie podejmowała aktywności fizycznej, wykazała 2 040 ± 314 komórek (n = 6 szczurów). W porównaniu z nią, grupa z aktywnością fizyczną wykazała średnio 3 606 ± 486 (n = 6 szczurów) komórek BrdU-dodatnich. Jak zaobserwowano, ekspozycja na aktywność fizyczną zwiększa liczbę komórek BrdU-dodatnich. Wyniki te są zatem zgodne z innymi raportowanymi danymi, które wskazują, że aktywność fizyczna zwiększa proliferację komórkową w zakręcie zębatym u osobników dorosłych17.

Równowaga statyczna, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; rozkład komórkowy, porównanie próbek, skala 10 µm.
Rycina 3: Przykłady różnej morfologii jąder komórkowych znakowanych BrdU.BrdU jest markerem syntezy DNA, który znakuje jądro komórkowe. W obszarze hipokampa jądra BrdU-dodatnie miały kształt półowalny i znajdowały się w strefie podziarnistej zakrętu zębatego. Ponieważ BrdU jest wbudowywane konkurencyjnie, ilość wbudowana w każdą komórkę będzie się różnić, co później odzwierciedli się w sposobie wizualizacji jądra. (A) Obraz immunofluorescencyjny. (B) Przedstawiono obraz z wykorzystaniem reakcji peroksydazy bez dodatkowej metody amplifikacji. Żółte strzałki wskazują artefakty i sygnały nieswoiste. Czarne lub białe strzałki wskazują komórki BrdU+. 1 – Jądro w pełni wypełnione, jądra półowalne silnie zabarwione. 2 – Jądra z kropkami; obrys jądra jest zaznaczony, a wewnątrz znajduje się kilka kropek. 3 – Jądra z niewielką liczbą kropek; obrysy jąder są zaznaczone, a wewnątrz znajduje się mała liczba kropek. 4 – Małe jądro; możliwe komórki w innym stadium różnicowania, ale wciąż będące częścią niszy. 5 – Klastry to komórki prekursorowe w trakcie podziału, dlatego można zaobserwować kilka komórek razem w zagęszczonych grupach. W obrębie tych grup liczenie musi być przeprowadzone szczególnie uważnie, aby uniknąć błędnego oznakowania komórek dodatnich. Czerwone strzałki wskazują jądra w trakcie podziału, które mogą zostać pomylone z pojedynczą komórką. Każda komórka jest zamknięta w ramce i może zostać rozróżniona w płaszczyźnie osi Z w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza neurogenezy, mikroskopia konfokalna, BrdU, DAPI, GFAP, warstwy komórkowe hipokampa, skala 50 µm.
Rycina 4: Reprezentatywny obraz RGB dla pojedynczych i połączonych kanałów. Górny obraz przedstawia oryginalny obraz z serii z-stack, a dolny obraz przedstawia obraz z serii z-stack po dekonwolucji 3D. (A) Małe powiększenie zakrętu zębatego (DG). (B) Obraz RGB dla każdego kanału oraz (C) połączony obraz RGB. Próbka pochodziła z mózgu grupy kontrolnej. Zastosowano immunofluorescencję bez dodatkowej metody amplifikacji. BrdU (czerwony), DAPI jako barwienie przeciwkostkowe (niebieski) oraz GFAP (kwaśne białko włókienkowe gleju) jako marker astroglialny (zielony). ML = warstwa molekularna; GCL = warstwa komórek ziarnistych; SGZ = strefa podziarnista. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histologia przekroju mózgu, analiza porównawcza, neurogeneza, mikroskopia, wpływ aktywności fizycznej.
Rysunek 5: Reprezentacyjny przekrój DG z komórkami znakowanymi BrdU (intensywny ciemny kolor) dla każdej grupy eksperymentalnej. Do reakcji peroksydazy wykorzystano metodę wzmocnienia z użyciem kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza. (A, B) Przedstawiają DG przy małym powiększeniu, a (C, D) pokazują obszar zaznaczony ramką przy większym powiększeniu. Panele A i C to tkanki z grupy aktywności fizycznej, a panele B i D z grupy kontrolnej. Wstawka przedstawia średnią liczbę znakowanych komórek w grupie aktywności fizycznej i grupie kontrolnej (liczba policzonych komórek dodatnich pomnożona przez sześć, zgodnie z opisem w kroku 8.1). ML = warstwa molekularna; GCL = warstwa komórek ziarnistych; SGZ = strefa podziarnista; strzałki wskazują komórki BrdU+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1: Film pokazujący różną płaszczyznę ostrości komórek pozytywnych wzdłuż osi z, rozmieszczonych w różnych warstwach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Film przedstawiający inną płaszczyznę ogniskowania klastrów komórek pozytywnych wzdłuż osi z, rozmieszczonych w różnych warstwach. Przesuwaj się powoli wzdłuż osi z, aby skwantyfikować wszystkie jądra wchodzące w skład klastra. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Typ mikroskopu:Mikroskop epifluorescencyjny Olympus BX53
Źródło światła:Lampy wysokociśnieniowej rtęciowej 130 W (U-HGLGPS)
Oprogramowanie do akwizycji danych:CellSens Standard
Zestawy filtrów:Numer katalogowyZakres wzbudzeniaLustro dichroiczneZakres supresji
U-FUW340–490 nm410 nm420 nm
U-FBW460–495 nm505 nm510 nm
U-FGW530–550 nm570 nm575 nm
Kamera:Model:kamera CCD UC50
Zakres widmowy:290 – 1000 nm
Rozmiar matrycy CCD:2/3 cala, 2588 (Szerokość *7) X 1960 (Wysokość *8) pikseli
Rozmiar piksela:3.4 X 3.4 µm
Fluorochrom:NazwaDługość fali wzbudzenia (nm)Emisja *3 długość fali (nm)Kolor emisji
chlorowodorek 4, 6-diamidyno-2-fenylo-indolu (DAPI)345455Niebieski
izotiocyjanian tetrametylorodaminy (TRITC)541572Czerwony
izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)494519Zielony
Cy3552565Czerwony
Medium montażowe i olej immersyjny:NazwaWspółczynnik załamania światła ośrodków *1
Powietrze (brak medium między szkiełkiem a obiektywem)1.00029
Medium montażowe antyblaknące z DAPI1.45
Medium montażowe Permount1.519
Olej immersyjny o niskiej autofluorescencji (MOIL-30 Type F)1.518
Soczewka powiększająca (planfluorytowa)PowiększenieApertura numeryczna (NA) *2Rozdzielczość (µm)Odstępy między pikselami obrazu (nm) *5Odstęp między przekrojami w osi Z (nm) *6
4X0.132.128503000
10X0.30.923403000
20X0.50.551702000
40x0.750.37851000
100X1.30.21341000

Tabela 2: Specyfikacje konfiguracji mikroskopu i wymagania dotyczące tworzenia pliku funkcji rozproszenia punktu (PSF). W oknie wtyczki diffraction PSF 3D znajduje się 11 pól służących do utworzenia pliku PSF. Każde pole opisano w następujący sposób: *1 – Współczynnik załamania światła ośrodka: współczynnik załamania światła dla ośrodka znajdującego się między preparatem a obiektywem (np. powietrze = 1,00029). *2 – Apertura numeryczna: NA użytego obiektywu (musi zostać skorygowana w przypadku zastosowania innego medium immersyjnego niż to, dla którego obiektyw został zaprojektowany). *3 – Długość fali: Maksymalna długość fali emisji fluorochromu (nm). *4 – Podłużna aberracja sferyczna: 0,00. *5 – Odstępy między pikselami obrazu: rozmiar piksela CCD (nm)/powiększenie (np. 3,4 µm i obiektyw 100X, 3400/100 = 34 nm). *6 – Odległość między obrazami w osi Z. *7 – Szerokość: Wprowadź szerokość obrazu do dekonwolucji w pikselach. *8 – Wysokość: Wprowadź wysokość obrazu do dekonwolucji w pikselach. *9 – Głębokość, przekroje: liczba obrazów w stosie z (z-stack). *10 – Normalizacja: Suma wartości pikseli = 1. *11 – Tytuł: Pożądana nazwa pliku PSF. Plik powinien odpowiadać konkretnemu, unikalnemu obrazowi stosu z.

Dyskusja

Neurogeneza dorosłych to proces, który zachodzi najczęściej w niszach dorosłych nerwowych komórek prekursorowych, które mają potencjał do generowania nowych neuronów przez całe życie. Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) jest szeroko stosowane w immunologii do charakteryzowania liczby nowo wytworzonych komórek w dorosłym mózgu. BrdU będzie wbudowywany głównie do komórek dyskretnych obszarów mózgu (strefy neurogenne). Komórki te znajdują się w strefie podkomorowej (SVZ), zakręcie zębatym hipokampa - między wnęką a komórkami ziarnistymi znanymi jako strefa subziarnista (SGZ)1,2,18. Co więcej, istnieją różne regiony mózgu charakteryzujące się niższą zdolnością proliferacyjną w wieku dorosłym, w tym podwzgórze, prążkowie, kora nowa i ciało migdałowate19. Jak wspomniano wcześniej, barwienie BrdU jest powszechnie stosowaną metodą badań neurogenezy dorosłych w celu wykrycia proliferacji komórek. Jednak użycie BrdU jako markera ma ograniczenia i pułapki. Pierwszym z nich jest to, że BrdU jest markerem cyklu komórkowego. Dlatego należy przeprowadzić podwójne lub potrójne barwienie w celu zidentyfikowania losu komórki i uwzględnienia markerów komórkowych w celu wykrycia określonego etapu rozwoju znakowanych komórek. Jeszcze jedną obawą związaną z BrdU jest to, że jest to toksyczny i mutagenny roztwór, który modyfikuje stabilność DNA, może zmieniać funkcje komórkowe i cykle komórkowe. Podejmując decyzję o przestrzeganiu protokołu podawania i dawek (50\u2012600 mg/kg), należy wziąć pod uwagę powyższe informacje. Inną istotną cechą jest to, że BrdU jest markerem syntezy DNA, a nie markerem proliferacji komórek14. Dlatego ważne jest, aby odróżnić proliferację komórek od innych zdarzeń, takich jak naprawa DNA, ponowne wejście w nieudany cykl komórkowy i duplikacja genów. Badacze muszą przestrzegać odpowiednich środków kontroli, aby zapewnić właściwe stosowanie BrdU. W celu bardziej szczegółowego omówienia tych problemów i ograniczeń zalecamy zapoznanie się z pracą Taupina14. Proces standaryzacji protokołu immunohistochemicznego może być powolny i trudny. W tej pracy przedstawiliśmy wszystkie ogólne kroki do zarządzania udanym protokołem IHC. Zalecamy jednak, aby każda grupa badawcza wcześniej przetestowała i oceniła tkanki, przeciwciała i warunki. Testy i oceny muszą być przeprowadzane z co najmniej trzema różnymi poziomami inkubacji, etapami płukania i mocami dla każdego badanego przeciwciała i tkanki. Zalecamy również, aby badacze przejrzeli dodatkowe protokoły, aby móc wybrać najlepszy, który spełnia określone potrzeby i wymagania 20,21,22,23,24,25.

Jak wspomniano wcześniej, procedura obejmuje kilka etapów i rozważań metodologicznych, które są powszechnie stosowane i wspominane w artykułach naukowych, które zostaną omówione w dalszej części. Zalecamy, aby badacze starannie i prawidłowo dobierali przeciwciała pod względem techniki, budżetu, sprzętu, konfiguracji i głównego celu badawczego. Przeciwciała muszą być testowane na tym samym typie tkanki, który zostanie później przetestowany w eksperymencie. Zalecamy również stosowanie przeciwciała, które zostało przetestowane w tym samym celu (IHC) (tj. nie tylko w technikach western blot lub cytometrii przepływowej) w celu sprawdzenia jego zgodności z techniką fiksacji. Do barwienia BrdU można zastosować różne drogi, takie jak wstrzyknięcie dootrzewnowe, wlew dootrzewnowy, spożycie doustne lub wlew dokomorowy (bardziej szczegółowy opis każdej techniki znajduje się w piśmiennictwie26). W przypadku wyboru wstrzyknięcia dootrzewnowego należy upewnić się, że BrdU jest podawany do jamy otrzewnej, omijając okolice jelita. Ponieważ jelito ma kilka zduplikowanych komórek, które mogą wyczerpać BrdU, zanim dostanie się do mózgu, co wpłynie na liczbę znakowanych komórek. Bardzo ważne jest, aby uzyskać cienkie przekroje, ponieważ pozwalają one na lepszą penetrację roztworów. Plastry koronalne o grubości 40 μm zostały przecięte doogonowo i przeniesione na 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zgodnie z procedurą stereologiczną zaproponowaną przez Kempermanna i wsp.27. Immunohistochemię można przeprowadzić z tkanką zamontowaną na szkiełkach lub jako swobodnie pływające sekcje. Ponieważ BrdU znajduje się głęboko w jądrach komórkowych, umożliwia przenikanie roztworów w swobodnie pływających sekcjach, co zapewnia lepsze wyniki i lepszy dostęp do obszaru zainteresowania. Ważne jest, aby otworzyć wiązania DNA (denaturacja DNA), aby umożliwić dostęp pierwotnemu przeciwciału anty-BrdU. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy te specyficzne procedury z wykorzystaniem inkubacji HCI. Z drugiej strony, proces blokowania niespecyficznych epitopów pozwolił na dokładniejszą identyfikację sygnału komórkowego.

Dobra przepuszczalność błony pozwala przeciwciałom prawidłowo przenikać do obszaru zainteresowania. Dodanie permeabilizatora, takiego jak Triton X-100, do roztworów PBS++ i PBS+ poprawia przepuszczalność membrany. W tym protokole można stosować zarówno odczynniki PBS, jak i sól fizjologiczną buforowaną trisem (TBS). Pod względem budżetowym TBS mógłby być względnie tańszy niż PBS. Jednak PBS może zakłócać przeciwciała antyfosforanowe i hamować przeciwciała sprzężone z fosfatazą alkaliczną, więc unikaj stosowania PBS, jeśli cel jest zmodyfikowany potranslacyjnie przez fosforylację (tj. Fosforylowany). Do tej pracy użyliśmy PBS i odkryliśmy, że etapy mycia tkanek dawały bardziej konkretny sygnał. Zalecamy również badaczom przeprowadzenie co najmniej trzech cykli prania przy użyciu TBS lub PBS. Roztwory muszą być świeżo przygotowane. Pobieranie antygenu (AR) jest metodą mającą na celu zmniejszenie utraty antygenowości spowodowanej fiksacją, która modyfikuje strukturę antygenów trzeciorzędowych i czwartorzędowych. Ta redukcja sprawia, że antygeny są niewykrywalne przez przeciwciała28,29. Indukowane ciepłem odzyskiwanie epitopów (HIER) zastosowane w tym protokole próbowało odwrócić reakcje chemiczne między formaldehydem a białkami poprzez hydrolizę wysokotemperaturową lub silną hydrolizę alkaliczną (z innymi roztworami buforowymi, takimi jak EDTA pH 8,5 lub Tris pH 9,5). Niezbędne jest testowanie nowych przeciwciał z różnymi protokołami AR, aby porównać wyniki i wybrać najlepsze dla protokołu. Ten ostatni krok może być opcjonalny w zwykłym protokole; Jednak potraktowaliśmy tkanki protokołem odzyskiwania antygenu, aby zapewnić lepsze wyniki dla tego protokołu.

Bardzo ważne jest, aby wybrać właściwy końcowy kolor kontrastowy i technikę przeciwbarwienia, biorąc pod uwagę podstawowy kolor barwienia i metodę zastosowaną w celu uwidocznienia nieplamiącej struktury i uniknięcia maskowania pierwotnego koloru barwienia przed reakcją immunologiczną. W mikroskopii fluorescencyjnej DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) jest bardzo popularnym barwnikiem jądrowym i chromosomowym, który emituje niebieską fluorescencję (absorpcja: 360 nm, emisja: 460 nm) po związaniu się z regionami AT DNA. Nośnik montażowy zawierający DAPI jest dostępny i łatwy w użyciu; Zapewnia to doskonałe zatrzymywanie sygnału podczas akwizycji obrazu. W przypadku reakcji nadtlenkowej IHC był dostępny w różnych opcjach, takich jak fiolet krezylowy, hematoksylina, barwienie czerwienią obojętną lub zielenią metylową. W przypadku wielu technik barwienia immunologicznego ważne jest, aby wybrać przeciwciało zgodne z techniką wiązania zastosowaną w celu uniknięcia reaktywności krzyżowej30. Kiedy problemy i komplikacje związane z pojedynczym barwieniem zostaną rozwiązane, zastosuj kolejne barwienie kolorem, jeśli uznasz to za konieczne. Kluczowe znaczenie ma kontrolowanie nieswoistego wiązania między przeciwciałami drugorzędowymi. Można to osiągnąć poprzez nasycenie przeciwciał pierwszorzędowych przed użyciem przeciwciała drugorzędowego wytwarzanego w tym samym gatunku gospodarza co przeciwciała pierwszorzędowe. Na przykład, w przypadku stosowania przeciwciał przeciw myszom wytwarzanych u królików i przeciwciał anty-króliczych wytwarzanych w kozich przeciwciałach drugorzędowych, przeciwciało anty-królicze wytwarzane w przeciwciałie kozim musi być użyte przed przeciwciałem przeciwko myszom wytwarzanym w przeciwciałie królika. Gdy metoda sekwencyjna jest całkowicie zdominowana, można rozpocząć jednoczesny proces barwienia immunologicznego. W tej metodzie konieczne jest odpowiednie dobranie przeciwciał drugorzędowych. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie te przeciwciała pochodziły od tego samego zwierzęcia gospodarza, aby uniknąć reaktywności krzyżowej. Zalecamy przeprowadzenie kontroli pozytywnej w celu potwierdzenia, że metoda barwienia działa dokładnie w pourodzeniowej tkance hipokampa (obfita neurogeneza w tym wieku). Jeśli tkanka kontroli pozytywnej wykazuje problemy z barwieniem, należy dokonać przeglądu i przeglądu procedury, wprowadzić poprawki i regulacje, a następnie powtarzać, aż uzyska się dobre barwienie. Następnie przeprowadź kontrolę ujemną, aby sprawdzić, czy przeciwciało działa prawidłowo, pomijając lub zastępując określone przeciwciało pierwszorzędowe normalną surowicą (ten sam gatunek co przeciwciało pierwszorzędowe). Jak wspomniano we wstępie, dekonwolucja obrazu jest potężnym narzędziem i stanowi alternatywę, gdy mikroskop konfokalny nie jest dostępny. Może zastosować dekonwolucję obrazu do wszystkich obrazów uzyskanych przy użyciu jasnego pola przechodzącego, fluorescencji szerokiego pola i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznym celem dekonwolucji obrazu jest odtworzenie oryginalnego sygnału, że system akwizycji ulega pogorszeniu10.

Podsumowując, identyfikacja nowo wygenerowanych komórek uwidocznionych przez immunodetekcję analogu tymidyny BrdU jest skomplikowaną, ale potężną techniką. Praca ta jest próbą pomocy naukowcom, szczególnie w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych, w dokładniejszym ilościowym określaniu nowych komórek. Mamy nadzieję, że ten wysiłek był pomocny dla społeczności naukowej i ułatwi dopracowanie badań nad proliferacją komórek za pomocą techniki immunohistochemicznej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Panu Miguelowi Burgosowi i Gustavo Lago za pomoc techniczną. Pragniemy również podziękować dr Clorindy Arias, dr Karli Hernandez i dr Oscarowi Galicii za ich życzliwe wsparcie w dostarczeniu odczynników i materiałów. Dziękujemy również División de Investigación y Posgrado z Universidad Iberoamericana Ciudad de México za zapewnienie funduszy na wykonanie tej pracy oraz pokrycie kosztów produkcji wideo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PRZYGOTOWANIE I KONFIGURACJA ODCZYNNIKÓW
Dawca Surowicy końskiejBioWestS0900Roztwory blokujące i inkubacyjne w PBS
Odczynnik paraformaldehydowy, krystaliczny (PFA)Sigma-AldrichP6148toksyczny, łatwopalny
Chlorek potasuSigma-Aldrich746436-500G
Fosforan potasu, monobasicJ.T Bker3246-01
SacaroseJ.T Baker4072-01
Chlorek soduMeyer2365-500G
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881-500GKoryzujący, do kalibracji pH
Phophate sodu DibasicSigma-AldrichS9763-5KG
Triton-x 100Sigma-AldrichT8787
ANALOG TYMIDYNY PODANIE BRDU
5-Bromo-2′-deoksyurydyna, BrdUSigma-AldrichB9285toksyczny (mutagenny, teratogenny)
23– Igła podskórna 27GBD PrecisionGlide
roztwór soli fizjologicznejPiSA
1 mlNIPRO
em>PREPARAT TKANKOWY
15-ml polipropylenowa tubka stożkowaThermo Scientific339650
50-ml polipropylenowa rurka stożkowaThermo Scientific
Narzędzia
GilotynaStoelting
Microtome CryostatMICROMHM525
Netwell 15 mm wkładki membranowe z siatki poliestrowejCorning3477wstępnie załadowane 12-dołkowe płytki hodowlane
Plastikowy zestaw nośny Netwell 12-dołkowyCorning3520do siatki poliestrowej 15 mm wkładki membranowe
Plastikowy zestaw nośny 6-dołkowy NetwellCorning3521
Pompa perfuzyjnaCole-Parmer7553-70
WytrząsarkaIKAROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violetSigma-AldrichC50421%, Światłoczuły
Zestaw substratów peroksydazy DAB (HRP) (z niklem), 3,3'-diaminobenzydynaVector LaboratoriesSK-4100rakotwórczy, światłoczuły
kwas hidochlorowyJ.T.Baker9535-05, do kalibracji pH
Nadtlenek wodoru, 50%Meyer5375-1LToksyczny, utleniający
Podłoże montażowe PermountFisher ChemicalSP15-500
VECTASHIELD Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPIVector LaboratoriesH-1200Światłoczuły
VECTASTAIN® Elite® Zestaw ABC Peroksydaza (HRP)Vector LaboratoriesPK-6100enzymatyczny system amplifikacji na bazie awidyny/biotyny
Przeciwciała pierwotne
Przeciwciało anty-GFAP wytwarzane w królikuSigma-AldrichHPA0560301:500
Przeciwciało monoklonalne anty-BrdU wytwarzane w myszySigma-AldrichB25311:250
Przeciwciała drugorzędowe
Biotin-SP (długi dystans) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-065-1511:250
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, HRPInvitrogenG-210401:1000
Kozia IgG Anty-Mysz (cała cząsteczka), TRITCSigma-AldrichT53931:250
Kozia anty-królicza IgG (H+L) adsorbowana krzyżowo, FITCInvitrogenF-27651:250
Streptawidyna, Cy3Vector LaboratoriesSA-13001:250
OBRAZOWANIE I ANALIZA
KomputerDell Computer CompanyT8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHBDo sterowania i monitorowania procesów protokołów
Kamera CCDOprogramowanie OlympusUC50
CellSens StandardOprogramowanie do akwizycjiOlympuscellSens Standard Edition
Mikroskop epifluorescencyjnyOlympusBX53
Wysokociśnieniowa lampa łukowa rtęciowa 130 WOlejek immersyjny OlympusU-HGLGPS
o niskiej autofluorescencjiOlympusMOIL-30 Typ F
Mikro okulary nakrywkowe (VWR, nr kat. 48404 454; 24  60 mm)
Szkiełka mikroskopowe (VWR, nr kat. 48323-185; 76  26 mm)
Kostka filtracyjna U-FBWOlympusU-FBWwzbudzenie 460 - 495 nm, zwierciadło dichroiczne 505 nm, tłumienie 510 nm
Kostka filtra U-FGWOlympusU-FGWwzbudzenie 530 - 550 nm, zwierciadło dichroiczne 570 nm, tłumienie 575 nm
Kostka filtra U-FUWOlympusU-FUWwzbudzenie 340 - 490 nm, zwierciadło dichroiczne 410 nm, tłumienie 420 nm
Strzykawki 30130032 <339652preparacyjne

Bibliografia

  1. Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals. Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Miller, M. W., Nowakowski, R. S. Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system. Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).
  4. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  5. Filippov, V., et al. Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).
  6. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).
  7. Matiašová, A., et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).
  8. Von Bohlen Und Halbach, O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).
  9. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  10. Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue. Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with imageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).
  13. Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p (2016).
  14. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  15. Revilla, V., Jones, A. Cryostat sectioning of brains. International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).
  16. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).
  17. Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density. Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).
  18. Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667(2019).
  19. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).
  20. Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).
  21. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).
  22. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. Journal of Visualized Experiments. (46), e2166(2010).
  23. Tischler, A. S. Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).
  24. Taupin, P. Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments. Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).
  25. Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).
  26. Magavi, S. S., MacKlis, J. D. Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo. Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).
  27. Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. , 391-399 (2003).
  28. Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).
  29. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  30. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunohistochemia BrdUanaliza neurogenezydenaturacja DNAreakcja peroksydazykompleks awidyna biotynaobrazowanie mikroskopoweliczenie kom rekprzygotowanie tkanekinkubacja z przeciwcia ami
Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.