Artykuł metodologiczny

Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

DOI:

10.3791/61483

⸱

9 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Neurociencias, Departamento de Psicología, Universidad Iberoamericana Ciudad de México, 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia cztery najpopularniejsze techniki wizualizacji komórek BrdU dodatnich do pomiaru neurogenezy u dorosłych szczurów. Praca ta zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników, podawania analogu tymidyny, perfuzji przezsercowej, przygotowania tkanek, reakcji immunohistochemicznej peroksydazy, immunofluorescencji, wzmocnienia sygnału, barwienia przeciwstawnego, obrazowania mikroskopowego i analizy komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z najważniejszych rzeczy w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych (AHN) jest identyfikacja nowo powstałych komórek. Immunodetekcja analogów tymidyny (takich jak 5-Bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU)) jest standardową techniką stosowaną do wizualizacji tych nowo wytworzonych komórek. Dlatego BrdU jest zwykle wstrzykiwany małym zwierzętom dootrzewnowo, więc analog tymidyny zostaje włączony do dzielących się komórek podczas syntezy DNA. Wykrywanie odbywa się za pomocą analizy immunohistochemicznej wycinków mózgu. Każda grupa badawcza, która stosowała tę technikę, może docenić, że wymaga ona szczególnej dbałości o najdrobniejsze szczegóły, aby uzyskać udane barwienie. Na przykład ważnym krokiem jest denaturacja DNA HCl, co pozwala mu dotrzeć do jądra komórkowego w celu jego wybarwienia. Jednak istniejące raporty naukowe szczegółowo opisują bardzo niewiele takich kroków. Dlatego standaryzacja techniki jest wyzwaniem dla nowych laboratoriów, ponieważ uzyskanie pozytywnych i pomyślnych wyników może zająć kilka miesięcy. Celem niniejszej pracy jest szczegółowe opisanie i opracowanie kroków prowadzących do uzyskania pozytywnych i pomyślnych wyników techniki barwienia immunologicznego podczas pracy z analogiem tymidyny BrdU. Protokół obejmuje przygotowanie i ustawienie odczynnika, podanie analogu tymidyny u gryzonia, perfuzję przezsercową, przygotowanie tkanki, reakcję immunohistochemiczną peroksydazy, zastosowanie kompleksu awidyna-biotyna, immunofluorescencję, barwienie przeciwstawne, obrazowanie mikroskopowe i analizę komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomysł, że nowe neurony są generowane w mózgu dorosłego człowieka przez całe życie, fascynuje społeczność naukową od dziesięcioleci. Wiedza o tym, że mózg generuje nowe neurony przez całe życie, została zdobyta dzięki wykryciu komórek w podziale1,2. Wykrywanie nowo wygenerowanych neuronów w dorosłym mózgu zostało po raz pierwszy zidentyfikowane przez doczaszkowe wstrzyknięcie trytiowanej tymidyny (tymidyny-H3) u szczurów i wykrycie komórek w cyklu komórkowym za pomocą autoradiogramów1,2. Opisano podział komórek gleju i obecność neuroblastów, co było pierwszymi obiecującymi danymi na temat neurogenezy postnatalnej1. Niemniej jednak stosowanie i wykrywanie tymidyny-H3 oznaczało stosowanie radioaktywności, która może być szkodliwa dla ludzi, którzy sobie z nią radzą. Pierwsza próba zbadania przydatności immunohistochemii BrdU w badaniach nad proliferacją, migracją i pochodzeniem komórek w układach nerwowych pojawiła się w 1988 roku przez Millera i Nowakowskiego3. W 1998 roku artykuł opublikowany przez Erikssona i współpracowników wykazał, że nowe neurony zostały uwidocznione post mortem w ludzkim dorosłym mózgu pacjentów, którym wstrzyknięto 5-bromo-2′-deoksyurydynę (BrdU)4. Pacjenci ci otrzymali zastrzyk BrdU (250 mg dożylnie) w celu oznaczenia wzrostu guzów4. Technika ta została zaadaptowana w modelach zwierzęcych. Wprowadzenie tych metod było kamieniem milowym w tej dziedzinie, ponieważ umożliwiło wykrywanie nowo wygenerowanych komórek bez użycia związków radioaktywnych. Procedura ta stała się złotym standardem w pomiarze proliferacji komórek w niszach mózgowych dorosłych w celu promowania dalszych badań w tej dziedzinie.

Ograniczeniem techniki analogu tymidyny jest to, że nie pozwala ona na określenie tożsamości komórkowej nowo wygenerowanych komórek. Jednak immunohistochemia pozwala nam na przeprowadzenie techniki podwójnego lub potrójnego znakowania tej samej komórki, co potwierdza los komórkowy nowo powstałych komórek, a nawet etapy ich dojrzewania, co prowadzi do dalszej ewolucji tej dziedziny. Metoda ta została scharakteryzowana w celu różnicowania nowo wygenerowanych komórek w komórki glejowe, niezróżnicowane neurony lub w pełni dojrzałą komórkę ziarnistą, a nawet w celu określenia, czy aktywnie uczestniczą one w obwodach. Kolejnym przełomem w tej dziedzinie było wykorzystanie modeli transgenicznych do identyfikacji niezróżnicowanych komórek w domenie nestyny. Transgeniczne myszy nestyna-GFP wyrażają wzmocnione białko zielonej fluorescencji (GFP), które jest pod kontrolą promotora nestyny. Nestin jest filamentem pośrednim charakteryzującym się komórkami progenitorowymi5. Transgeniczne myszy nestin-GFP pozwoliły na ustalenie wczesnych etapów rozwojowych zaangażowanych w neurogenezę6. Jednak istotnym ograniczeniem jest możliwość utrzymania kolonii myszy transgenicznych typu nestin-GFP w specjalnych warunkach w obiekcie laboratoryjnym, który staje się opłacalny dla niektórych grup naukowych, zwłaszcza tych z krajów rozwijających się.

Techniki wymienione powyżej mają zalety i wady. Jednak identyfikacja proliferujących komórek za pomocą immunohistochemii (IHC) i możliwość przeprowadzenia techniki podwójnego lub potrójnego znakowania za pomocą immunofluorescencji w celu zidentyfikowania etapu dojrzewania komórki lub losu komórki stanowi jak dotąd najbardziej realny sposób pomiaru neurogenezy dorosłych. Proces identyfikacji za pomocą immunohistochemii polega na znakowaniu białek, domeny białkowej lub nukleotydów specyficznym przeciwciałem, które umożliwia ich rozpoznanie, znanym jako przeciwciało pierwotne. Ten ostatni jest rozpoznawany przez przeciwciało drugorzędowe, które jest oznaczone chromegenem (np. Peroksydazą chrzanową) lub fluorochromem (np. FITC) sprzężonym z przeciwciałem drugorzędowym. Mikroskopy mogą wykrywać zarówno sygnały chromogenów, jak i fluorochromów. Za pomocą IHC możliwa jest identyfikacja białek błonowych, białek cytoszkieletu lub komponentów jądrowych, takich jak BrdU. Z drugiej strony, BrdU można znaleźć w jądrze komórkowym, ponieważ jest on włączany do DNA podczas fazy S przez konkurencję. Dlatego kluczowym krokiem jest denaturacja DNA HCl, która otwiera wiązania DNA, aby umożliwić przeciwciału BrdU dostęp do BrdU w DNA. Ważne jest, aby wiedzieć, że BrdU jest obecny w nasyconym stężeniu w surowicy myszy i szczurów odpowiednio przez 15 i 60 minut, po podaniu dootrzewnowym, a następnie gwałtownie spada do niewykrywalnych poziomów odpowiednio po 60 i 120 minutach7.

Tutaj opisujemy cztery różne, ale ściśle powiązane techniki IHC: chromogenne wykrywanie pośrednie za pomocą reakcji peroksydazy chrzanowej (HRP) z DAB (3,3'-diaminobenzydyną) bez wzmocnienia sygnału (krok 4.1), amplifikacja kompleksu awidyna-biotyna (ABC) (krok 4.1), pośrednia detekcja immunofluorescencji bez wzmocnienia sygnału (krok 4.4) i znakowana amplifikacja streptawidyny-biotyny (LSAB) (krok 4.3). Każda metoda ma zalety i wady i może być przydatna w przypadku określonych wymagań dotyczących tkanek (patrz Tabela 1). Zdecydowaliśmy się na pośrednie metody ICH ze względu na ich przystępność cenową i prostotę, aby wprowadzić zmiany z metod wykrywania chromogennego na fluorescencyjne przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych. Podejście HRP jest powszechnie stosowaną metodą IHC ze względu na jej przystępną cenę, wysoką stabilność, wysoki wskaźnik rotacji i pełną dostępność podłoży. Niemniej jednak zalecamy stosowanie kontroli dodatniej w celu potwierdzenia, że metoda barwienia działa prawidłowo, oraz zastosowanie kontroli ujemnej w celu skutecznego zbadania funkcji przeciwciał. Wielokrotne barwienie immunologiczne lub metody multipleksowe IHC (patrz krok 6) są skutecznymi narzędziami do pozyskiwania dużych ilości danych z sekcji tkanki w jednym eksperymencie. Technika ta jest szczególnie ważna, gdy dostępność próbek jest ograniczona. Kolejną zaletą jest możliwość jednoczesnej identyfikacji określonych białek ulegających koekspresji w tej samej przestrzeni komórkowej przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki. Multiplex pozwala na barwienie różnych markerów wyrażanych podczas określonych etapów proliferacji (np. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), co pozwala nam na bardziej szczegółowe badania nad proliferacją i różnicowaniem8. Bardzo ważne jest, aby wybrać przeciwciała zgodne z zastosowaną techniką utrwalania, aby uniknąć reaktywności krzyżowej. Zalecamy testowanie każdego nowego przeciwciała (w tym BrdU) indywidualnie w celu dostosowania i udoskonalenia metody. Następnie wprowadź podwójne barwienie sekwencyjne i na koniec rozpocznij jednoczesny proces barwienia immunologicznego, gdy metoda sekwencyjna jest całkowicie zdominowana. Kluczowe znaczenie ma dobór odpowiednich przeciwciał drugorzędowych do tej metody.

metodaSpecyficzna metodaZaletyWady
Metoda wykrywania pośredniegoReakcja peroksydazy z DAB1. Wyższa czułość niż metoda bezpośredniego wykrywania i fluorescencji pośredniej.
2. Wyższa odporność na fotowybielanie niż fluorochromy.
3. Niższy koszt niż metoda wykrywania fluorescencji		1. Trudne do multipleksowania z mniejszą liczbą barwników kolorowych.
2. Skomplikowane dla celów o współekspresji w tej samej przestrzeni komórkowej.
3. Zmniejszony zakres dynamiki dla jednoczesnych rzadkich i bardzo obfitych celów na tej samej tkance.
fluorescencja1. Najlepszy i najłatwiejszy do multipleksowania z większą liczbą barwników kolorowych.
2. Najlepsze dla celów o koekspresji w tej samej przestrzeni komórkowej.
3. Lepszy zakres dynamiki dla jednoczesnych rzadkich i bardzo obfitych celów na tej samej tkance.
4. Brak dodatkowych kroków.		1. Niższa czułość niż pośrednia reakcja peroksydazy metodą DAB.
2. Słaba odporność na fotowybielanie w czasie.
3. Droższe.
Metoda wzmacniania sygnałuKompleks awidyny-biotyny (ABC)1. Wyższa czułość niż metoda wykrywania bezpośredniego i pośredniego.
2. Zmniejsz tło		1. Dodatkowe kroki.
2. Droższe niż brak wzmocnienia.
znakowana streptawidyna-biotyna (LSAB)1. Wyższa czułość niż metoda wykrywania bezpośredniego i pośredniego.
2. Bardziej znacząca penetracja tkanki niż metoda ABC.
3. Zmniejsz tło		1. Dodatkowe kroki.
2. Droższa niż metoda ABC.
Nie jest to dodatkowa metoda amplifikacji1. Niższy koszt.
2. Brak dodatkowych kroków.
3. Idealny do obfitych celów.		1. Niższa czułość: problematyczna bez obfitych celów.

Tabela 1: Zalety/wady technik IHC. Poniższa tabela przedstawia zalety i wady metod wykrywania pośredniego: reakcja peroksydazy z (3,3'-diaminobenzydyną) DAB i fluorescencja; oraz metody wzmacniania sygnału: kompleks awidyna-biotyna (ABC), znakowany streptawidyna-biotyna (LSAB), a nie dodatkowa metoda amplifikacji.

Obraz o wysokiej rozdzielczości jest niezbędny do przeprowadzenia prawidłowej analizy i przedstawienia wyników. Istnieją dwa podejścia do poprawy rozdzielczości: 1) użycie lepszej konstrukcji mikroskopu (np. konfokalnego, wielofotonowego) lub 2) numeryczne odwrócenie procesu rozmycia w celu ulepszenia obrazów za pomocą deconvolution9. Niestety, mikroskopia konfokalna nie jest dostępna ze względu na wysokie koszty sprzętu i jego serwisowania10. Mikroskop epifluorescencyjny o szerokim polu widzenia i późniejsza dekonwolucja obrazów ze stosu z stanowią odpowiednią, tanią alternatywę dla mikroskopii konfokalnej8,9. Jak wspomniano powyżej, celem dekonwolucji jest przywrócenie oryginalnego sygnału, który został zdegradowany przez system akwizycji9, poprzez redukcję rozmycia, nieostrego zamglenia i zniekształceń widocznych na obrazie uzyskanym przez mikroskop epifluorescencyjny lub konfokalny przy użyciu matematycznych algorytmów usuwania10. Uzyskany rozmyty obraz może być modelowany matematycznie w wyniku obracania obserwowanych obiektów za pomocą funkcji rozproszenia punktowego 3D (PSF). PSF to teoretyczny wzór dyfrakcyjny punktów świetlnych emitowanych przez próbkę tkanki i zbieranych przez mikroskop. Plik PSF jest tworzony ze specyficznymi warunkami każdego obrazu, takimi jak odstępy między komórkami CCD w kamerze, współczynnik załamania światła użytych mediów, apertura numeryczna soczewki obiektywu, długość fali emisji fluoroforu, rozmiary obrazu, liczba obrazów w metodzie przetwarzania z-stack oraz przestrzeń między nimi (patrz specyfikacja techniczna w tabeli 2). Innymi słowy, plik PSF podsumowuje wpływ ustawień obrazowania na obserwacje mikroskopowe9. Używamy jednak wtyczki dyfrakcyjnej PSF 3D (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D), aby utworzyć własny plik PSF dla każdego obrazu z-stack. Obrazy Z-stack to seria zdigitalizowanych przekrojów optycznych z określonych głębokości (oś z) w tym samym położeniu XY szkiełka. Komputer kompiluje informacje uzyskane z płaszczyzny ostrości poprzez ponowne przypisanie sygnałów, które pochodzą z obiektów znajdujących się w innych płaszczyznach ogniskowych. Aby utworzyć obrazy z-stack, konieczne jest wykonanie obrazów z różnych zogniskowanych warstw szkiełek (np. dziesięć różnych obrazów tego samego obszaru XY co 1 μm głębokości). Następnie używamy oprogramowania mikroskopowego dostarczonego przez producenta lub Fidżi, aby stworzyć z-stack lub obraz 3D. Rezultatem będzie pojedynczy plik obrazu stosu (np. dziesięć obrazów o różnych fokusach). Istnieje kilka narzędzi i rozwiązań programowych dostosowanych do potrzeb klienta, takich jak oprogramowanie typu open source do mikroskopii dekonwolucyjnej. Pokażemy dane wyjściowe procesu dekonwolucji za pomocą DeconvolutionLab29, który jest wtyczką Fiji11 (dystrybucja ImageJ12). Dekonwolucja pomoże poprawić rozdzielczość końcowych mikrofotografii (patrz Rysunek 1B,C ). Aby uzyskać więcej informacji i instrukcji, zdecydowanie zalecamy przeczytanie reference13.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Reprezentatywny obraz dekonwolucji 3D dla wielu kanałów kolorów. (A) DG przy małym powiększeniu. (B) Oryginalne obrazy z-stack dla każdego kanału i scalony obraz. (C) 3D zdekonwolucyjne obrazy z-stack dla każdego kanału i scalonego obrazu. Ten mózg pochodził od szczura, który był częścią grupy aktywności fizycznej. Zastosowano znakowaną metodę amplifikacji streptawidyny-biotyny (LSAB). Wykazano przeciwciało sprzężone ze streptawidyną Cy3 wskazujące BrdU (czerwony), DAPI jako przeciwbarwienie (niebieski) i kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) jako marker astroglejowy (zielony). ML = warstwa molekularna; GCL = ziarnista warstwa komórkowa; SGZ = strefa subkrystaliczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Celem tej pracy jest szczegółowe przedstawienie kroków prowadzących do uzyskania pozytywnych i pomyślnych wyników z barwieniem immunologicznym oraz wymienienie najczęściej stosowanych kroków w badaniach opartych na BrdU, bez użycia mikroskopu konfokalnego. Barwienie BrdU to technika, która wymaga kilku kroków, które należy dokładnie wykonać, aby uzyskać udane barwienie. Standaryzacja tych technik barwienia zwykle trwa miesiące, jest czasochłonna i zasobożerna. Spodziewaliśmy się, że ten artykuł może dostarczyć informacji grupom rozpoczynającym działalność w tej dziedzinie, skracając czas i zmniejszając liczbę błędów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury są zgodne z przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications N°. 8023, poprawione w 1978 roku) oraz lokalnymi meksykańskimi przepisami mającymi na celu zminimalizowanie liczby wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienia. Komisja Bioetyczna Universidad Iberoamericana zatwierdziła protokoły eksperymentalne dotyczące wykorzystania zwierząt w tym badaniu.

1. Przygotowanie i ustawienie odczynnika

UWAGA: Większość roztworów można przygotować na kilka dni przed użyciem, chyba że określono inaczej.

  1. Rozwiązanie BrdU
    1. Pobrać roztwór BrdU z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozostawić do osiągnięcia równowagi w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Obliczyć masę BrdU potrzebną do podania dawki 50 mg/kg w zależności od masy ciała szczura. Obliczyć objętość 0,9% roztworu soli fizjologicznej (0,9 g NaCl w 100 ml sterylnegoH2O) potrzebną do uzyskania roztworu roboczego 20 mg/ml. Przygotować nadmiar, aby zapewnić co najmniej 0,5 ml na szczura na wstrzyknięcie.
      UWAGA: Dawka podawana zwierzętom doświadczalnym powinna być bezpieczna, z minimalnymi skutkami ubocznymi i skuteczna. Doniesiono, że czas barwienia preparatem BrdU w dawce 100 mg/kg mc. nie przeważa nad potencjalnie większą toksycznością w porównaniu z dawką 50 mg/kg mc. 7. Nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie komórek znakowanych BrdU/mm3 dla 50 i 100 mg/kg i.p. u szczurów7. Zaleca się wstrzykiwanie małej dawki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
    3. Odważyć roztwór BrdU i dodać go do roztworu soli fizjologicznej w stożkowej probówce i wirować.
      UWAGA: Podgrzej roztwór soli w temperaturze 45–50 °C w łaźni wodnej dla objętości większych niż 1 ml.
    4. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 10\u201215 min i wirować co 2\u20123 min, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego do jałowego wstrzykiwania. Przykryj tubę folią aluminiową, ostudź ją w temperaturze pokojowej i natychmiast zużyj.
      UWAGA: Roztwór BrdU jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Przygotuj go w dygestorium. Z roztworem BrdU należy obchodzić się przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego (PPE). Zaleca się przygotowanie roztworu bezpośrednio przed użyciem. Jednak rozwiązanie jest stabilne przez 24 godziny pod RT. Proszę chronić go przed światłem.
  2. Aby przygotować 1 l 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4, dodać 240 mg jednozasadowego fosforanu potasu (KH2PO4), 1,44 g dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4), 200 mg chlorku potasu (KCl) i 8 g chlorku sodu (NaCl) do 800 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) pod ciągłym mieszaniem. Doprowadzić pH do 7,4 i dodać podwójnie destylowanyH2Odo całkowitej objętości 1 l. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  3. Na 100 ml PBS+ dodaj 3% (3 ml) normalnej surowicy końskiej i 0,3% (300 μl) Triton X-100 do 0,1 M PBS (pH 7,4). Przechowywać w 20\u201250 ml porcji w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.
    UWAGA: Alternatywnie zamiast PBS można użyć TBS. Odpowiednia jest każda inna surowica inna niż przeciwciała gospodarza i tkanka doświadczalna.
  4. Na 100 ml PBS++ dodaj 10% (10 ml) normalnej surowicy końskiej i 0,3% (300 μl) Triton X-100 do 0,1 M PBS pH 7,4. Przechowywać w 20\u201250 ml porcji w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
  5. Na 1 l roztworu krioprotektantu wymieszaj 250 ml glikolu etylenowego i 250 ml glicerolu, ciągle mieszaj, aż się wymieszają. Powoli doprowadzić do 1 l za pomocą PBS. Filtr z bibułą filtracyjną klasy 4 (20\u201225 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C lub RT przez okres do 1 roku.
  6. Przygotować 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (roztwór PFA) w następujący sposób. Na 1 l roztworu powoli dodawać 40 g proszku paraformaldehydu do 800 ml 60\u201265 °C 0,1 M PBS pod ciągłym mieszaniem. Mieszaj, aż paraformaldehyd całkowicie się rozpuści, kontrolując temperaturę (60\u201265 °C). W razie potrzeby dodać kilka kropli 1 M NaOH w celu sklarowania roztworu. Gdy roztwór osiągnie temperaturę pokojową, przefiltruj go bibułą filtracyjną klasy 4 (20-25 μm).
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy, należy przygotować w wyciągu. Przechowywać w temperaturze 4 °C i najlepiej zużyć w ciągu 2 dni. Gotowy do użycia roztwór PFA jest dostępny na rynku.
  7. Na 1 l 10 mM buforu cytrynianu sodu (SCB) o pH 6 dodać 1,204 g cytrynianu sodu (dwuwodnego) i 1,134 g kwasu cytrynowego do 800 ml podwójnie destylowanegoH2Oprzy ciągłym mieszaniu. Doprowadzić pH do 6,0 i dodać ddH2O do 1 L. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  8. Przygotować 50 ml 2 N HCl, powoli dodając 8,25 ml 12 N HCl (stężony roztwór podstawowy) do 41,75 ml ddH2O pod ciągłym mieszaniem.
    UWAGA: Przygotować w dygestorium. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    UWAGA: 2 N HCl zostanie użyty do denaturacji DNA, kluczowego kroku. Ponieważ BrdU jest wbudowywany w DNA, HCl jest używany do otwierania wiązań DNA, umożliwiając przeciwciałom BrdU dostęp do BrdU w DNA.
  9. Przygotować endogenny roztwór blokujący peroksydazę w następujący sposób. Przygotować 100 ml 0,6% nadtlenku wodoru, mieszając 2 ml 30% nadtlenku wodoru z 98 ml ddH2O pod ciągłym mieszaniem.
    UWAGA: Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Trzymaj go w ciemności, ponieważH2O2jest wrażliwy na światło. Zamiast wody można stosować PBS lub TBS.
  10. Przygotować roztwór kompleksu awidyna-biotyna (ABC) zgodnie z instrukcją producenta. Na 5 ml ABC w 0,1 M PBS dodać 2 krople (≈100 μl) odczynnika A i wymieszać, a następnie dodać 2 krople (≈100 μl) odczynnika B i wymieszać.
    UWAGA: Roztwór należy przygotować i pozostawić do przetoczenia przez 20-30 minut przed użyciem.
  11. Przygotuj substrat peroksydazy DAB (diaminobenzydyny) (HRP) za pomocą zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Do 5 ml ddH2O dodać 2 krople (≈ 84 μL) odczynnika 1 i wymieszać, dodać 4 krople (≈ 100 μl) odczynnika 2 i wymieszać, a następnie dodać 2 krople (≈ 80 μl) odczynnika 3 i wymieszać. Na koniec, w razie potrzeby, dodaj 2 krople (≈ 80 μl) odczynnika 4 (nikiel) i wymieszaj.
    UWAGA: Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    UWAGA: DAB jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Należy obchodzić się z nim ostrożnie i wyrzucać zgodnie z rozporządzeniem w sprawie odpadów niebezpiecznych w każdej instytucji. Aby dezaktywować DAB, dodaj kilka kropli wybielacza (podchloryn sodu); Roztwór zmieni kolor na.
  12. Przygotować 100 ml roztworu fioletu krezylowego, dodając 100 mg octanu fioletu krezylowego i 250 μl kwasu octowego do 80 ml ddH2O w temperaturze 55\u201260 °C. Dostosować objętość do 100 ml, przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnym naczyniu.
    UWAGA: Zachęca się użytkownika do przetestowania różnych stężeń roztworu fioletu krezylowego przed użyciem go na cennych próbkach tkanek. Wynik może być ciemniejszy w przypadku barwienia przeciwstawnego niektórymi próbkami tkanek, co może zmniejszyć zdolność do dokładnego liczenia komórek BrdU dodatnich.

2. Podawanie analogu tymidyny BrdU

  1. Unieruchomić zwierzę doświadczalne (np. 90-dniowego samca szczura rasy Wistar o masie ciała 350 g) poprzez unieruchomienie dolnej części jamy brzusznej.
  2. Roztwór BrdU (50 mg/kg) podawać dootrzewnowo (i.p.) za pomocą igły 23 G i strzykawki 1 ml.
    UWAGA: Objętość wstrzykniętej dawki należy dostosować do masy ciała zwierzęcia. W przypadku dorosłych szczurów należy użyć igły 23\u201227 G i strzykawki o pojemności 1\u20125 ml. Maksymalna tolerowana objętość wstrzyknięcia dootrzewnowego u dorosłego szczura wynosi 10 ml. Do administrowania rozwiązaniem BrdU można używać różnych tras14. Na przykład wstrzyknięcie dootrzewnowe lub podanie doustne z wodą pitną.

3. Przygotowanie tkanek

UWAGA: Trzymiesięczne szczury miały dostęp ad libitum do aktywności fizycznej (niekończące się koło) przez siedem dni. W 6. dniu szczurom wstrzyknięto BrdU (krok 2) 3 razy w odstępach 12 godzin. Czynności opisane w punkcie 3 należy wykonać po upływie 8 godzin od ostatniego wstrzyknięcia produktu BrdU.

  1. Wstrzyknąć pentobarbital (50 mg/kg i.p.) i odczekać kilka minut, aż zwierzę będzie głęboko znieczulone.
    UWAGA: Przed kontynuowaniem upewnij się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Ostrożnie uszczypnij jedną z nóg lub ogon. Jeśli zwierzę zareaguje na bodziec, odczekaj jeszcze kilka minut. Jeśli zwierzę nie zareaguje na uszczypnięcie, przejdź do następnego kroku.
  2. Odsłoń serce, przecinając skórę jamy brzusznej poniżej mostka, rozbierając żebra i przecinając przeponę.
  3. Zespolenie perfuzji przezsercowej
    1. Włóż igłę do lewej komory i wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Za pomocą pompy lub grawitacyjnie wykonuj (natężenie przepływu 5\u20127 ml/min.) 0,1 M PBS, aż cała krew zostanie odsączona, a roztwór stanie się klarowny.
    2. Za pomocą pompy lub grawitacyjnie wykonaj zimną perfuzję (natężenie przepływu 5\u20127 ml/min) roztworem PFA, aby utrwalić tkankę, aż ogon stanie się sztywny.
      UWAGA: Zwykle szczur o wadze 300 g wymaga około 100\u2012150 ml roztworu PFA. Utrwalenie tkanki jest opcjonalne. W ten sposób mózg może zostać wyekstrahowany do wykorzystania w różnych procesach, aby zminimalizować wykorzystanie zwierząt w eksperymentach.
  4. Rozwarstwienie i utrwalenie
    1. Odetnij głowę zwierzęcia i delikatnie wyjmij mózg z czaszki. Zanurz mózg w stożkowej probówce zawierającej roztwór PFA (~40 ml dla szczura 250 mg) na 1-2 dni w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie należy nadmiernie utrwalać (dłużej niż 48 godzin), ponieważ może to spowodować wyczerpanie barwienia tkanek z powodu niedostępności antygenów.
    2. Przygotować 100 ml 30% roztworu sacharozy, dodając 30 g sacharozy do 70 ml 0,1 M PBS roztworu pod ciągłym mieszaniem. Dodać 0,1 M PBS roztwór do 100 ml. Zanurz mózg w stożkowej probówce z 30% roztworem sacharozy (35 ml) na około 1-2 dni w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno rurki.
  5. Cięcie koronalnych odcinków mózgu
    UWAGA: Korzystanie z mikrotomu kriostatu wymaga wskazówek i szkolenia. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w pliku reference15.
    1. Zanurz cały mózg w izopentanie w temperaturze -80 °C i utrzymuj go w temperaturze -80 °C przez 10 minut. Umieść mózg w matrycy osadzającej na płytce kriostatu z mikrotomem.
      UWAGA: W pewnych warunkach szybkie zamrożenie mózgu w temperaturze -80 °C może spowodować pęknięcie lub uszkodzenie tkanki. Użytkownik powinien zdawać sobie sprawę z tego problemu. W takim przypadku użyj izopentanu o temperaturze -20 °C, aby zamrozić mózg.
    2. Za pomocą mikrotomu kriostatu (temperatura od -25 do -20 °C) należy ciąć odcinki koronalne o grubości 40 μm. Sekwencyjnie przenieś skrawki na 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z roztworem krioprotekcji, postępując zgodnie z przewodnikiem w Rysunek 2. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia przez okres do kilku miesięcy.
      UWAGA: Następnie przetwarzaj wszystkie tkanki w swobodnie pływających odcinkach seryjnych 40 μm na 12-dołkowych płytkach z wkładkami siatkowymi w delikatnym i ciągłym mieszaniu (10 obr./min). W odpowiednich warunkach możliwe jest przechowywanie skrawków mózgu przez lata.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schematyczna ilustracja sekwencyjnego przenoszenia skrawków z mikrotomu kriostatu do 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z roztworem krioprotekcji. Zacznij od dołka A1 i umieść następne plastry w rzędzie A; po dołku A6 przejdź do następnego rzędu B i tak dalej. Po dotarciu do D6 wróć do A1 i kontynuuj. Taki układ pozwala na N-tą (np. szóstą dla neurogenezy, równoważną zawartości jednej kolumny) kwantyfikację całego obszaru mózgu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z podsumowaniem zalet i wad każdej techniki.

  1. Wykrywanie BrdU za pomocą reakcji peroksydazy z DAB
    UWAGA: Wykonaj kroki od 4.1.1 do 4.1.5 w dniu 1.
    1. Przenieść plastry z roztworu krioprotekcji do 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej. Płukać trzy razy przez 10 minut każdy, za pomocą 0,1 M PBS.
    2. Inkubować plastry przez 30 minut w endogennym roztworze blokującym peroksydazę w celu inaktywacji endogennej peroksydazy. Spłucz 3 razy po 10 minut za pomocą 0,1 M PBS. Opcjonalnie należy pobrać antygen (patrz punkt 5). Inkubować plastry przez 20 minut z 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0,1 M buforze boranowym (8,5 pH) przez 10 minut. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy, lodowatym 0,1 M PBS.
    3. Inkubować plastry przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z PBS++ (roztwór blokujący). Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-BrdU (gospodarzem myszy) w stężeniu 1:250 w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. W dniu 2 opłucz plastry 3 razy po 10 minut za pomocą 0,1 M PBS.
    5. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (anty-myszem) sprzężonym z HRP w 1:250 HRP w PBS+ przez 2\u20124 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    6. Przenieść plastry do roztworu substratu peroksydazy DAB (HRP) i inkubować przez 2\u201210 min. Gdy plastry staną się ciemnoszare, zwizualizuj tkankę za pomocą szkła powiększającego lub mikroskopu. Jeśli obecne są komórki dodatnie, spłucz 3 razy (po 15 minut) wodą z kranu (w celu zmniejszenia tła). Umyć 3 razy po 10 minut 0,1 M PBS.
    7. Ostrożnie zamontuj plastry na żelowatych szkiełkach za pomocą miękkiej szczotki, wysusz na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej. Przeciwbarwić (patrz sekcja 7.1), dodać trwałe podłoże montażowe i umieścić szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  2. Wykrywanie BrdU za pomocą reakcji peroksydazy z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza
    UWAGA: Wykonaj kroki od 4.2.1 do 4.2.5 w dniu 1.
    1. Przenieś plastry z roztworu do krioprotekcji do 0,1 M PBS, aby osiągnąć temperaturę pokojową. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    2. Inkubować przez 30 minut z endogennym roztworem blokującym peroksydazę w celu inaktywacji endogennej peroksydazy. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy w 0,1 M PBS. Opcjonalnie należy pobrać antygen (patrz punkt 5).
    3. Inkubować przez 20 minut z 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0,1 M buforze boranowym (pH 8,5) przez 10 minut. Myć 3 razy przez 10 minut każdy lodowatym 0,1 M PBS.
    4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący).
    5. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-BrdU (gospodarzem myszy) w stosunku 1:250 w PBS+ przez noc w temperaturze 4°C.
    6. W dniu 2 płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    7. Inkubować z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (anty-mysz) w 1:250 w PBS+ przez 2\u20124 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    8. Inkubować w roztworze ABC przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    9. Przenieść plastry do roztworu substratu peroksydazy DAB (HRP) i inkubować przez 2\u201210 min. Gdy plastry staną się ciemnoszare, zwizualizuj tkankę za pomocą szkła powiększającego lub mikroskopu. Jeśli obecne są komórki dodatnie, spłucz 3 razy (po 15 minut) wodą z kranu (w celu zmniejszenia tła), a następnie 3 razy myj 0,1 M PBS przez 10 minut każde.
      UWAGA: Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Należy zachować ostrożność, aby plasterki mózgu nie sklejały się ze sobą z powodu nieregularnych ciemnych plam w tkance.
    10. Ostrożnie ułóż plastry na żelowatych szkiełkach za pomocą miękkiej szczotki, a następnie wysusz na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.
    11. W razie potrzeby zaimpregnować (patrz krok 7.1), dodać trwałe podłoże montażowe i umieścić szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  3. Wykrywanie BrdU metodą immunofluorescencji przy użyciu znakowanej amplifikacji Streptawidyny-Biotyny (LSAB)
    UWAGA: Wykonaj kroki od 4.3.1 do 4.3.4 w dniu 1.
    1. Przenieść plastry z roztworu krioprotekcji do 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS. Opcjonalnie należy pobrać antygen (patrz punkt 5).
    2. Inkubować przez 20 minut w 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0,1 M buforze boranowym (8,5 pH) przez 10 minut. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy w lodowatym 0,1 M PBS.
    3. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w PBS++ (roztwór blokujący). Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-BrdU w stosunku 1:250 (gospodarz myszy) w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. W dniu 2 płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    5. Inkubować z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (anty-mysz) w 1:250 w PBS+ przez 2\u20124 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS. Inkubować ze streptawidyną (Cy3) sprzężoną z fluorochromem w stosunku 1:250 w PBS (nie stosować surowicy) przez 1-20122 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy po 10 minut za pomocą 0,1 M PBS.
      UWAGA: Surowica może zawierać biotynę i nie należy jej dodawać do rozcieńczalników. Zamiast tego należy użyć PBS zawierającego 0,3% Triton X-100.
    6. Ostrożnie zamontuj plastry na żelowatych szkiełkach za pomocą miękkiej szczotki, wysusz na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej lub natychmiast zamontuj za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego. Przeciwbarwić (patrz krok 7.2), dodać trwałe podłoże montażowe i umieścić szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  4. Wykrywanie BrdU metodą immunofluorescencji pośredniej
    UWAGA: Wykonaj kroki od 4.4.1 do 4.4.4 w dniu 1.
    1. Przenieś plastry z roztworu krioprotekcji do 0,1 M PBS, aż osiągnie temperaturę pokojową. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS. W razie potrzeby należy pobrać antygen (opcjonalnie, patrz punkt 5).
    2. Inkubować przez 20 minut w 2 N HCl w temperaturze 37 °C. Płukać w 0,1 M buforze boranowym (8,5 pH) przez 10 minut. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy lodowatym 0,1 M PBS. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z PBS++ (roztwór blokujący). Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-BrdU w stosunku 1:250 (gospodarz myszy) w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. W dniu 2 płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    4. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem w stosunku 1:250 (anty-mysz) w PBS+ przez 2\u20124 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy przez 10 minut każdy 0,1 M PBS.
    5. Ostrożnie zamontuj plastry na żelowatych szkiełkach za pomocą miękkiej szczotki, wysusz na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej lub natychmiast zamontuj za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego. Przeciwbarwić (patrz krok 7.2), dodać trwałe podłoże montażowe i umieścić szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.

5. Pobieranie antygenu (opcjonalnie)

UWAGA: Pobieranie antygenu jest opcjonalnym krokiem mającym na celu skorygowanie utraty antygenowości spowodowanej fiksacją, która modyfikuje trzeciorzędową i czwartorzędową strukturę wielu antygenów, czyniąc je niewykrywalnymi przez przeciwciała. Ten krok można dodać do oryginalnego protokołu.

  1. W kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej podgrzej 10 mM roztworu buforu cytrynianu sodu (SCB) o pH 6 do 90\u201295 °C (w zależności od wysokości roztwór zaczyna wrzeć w okolicach tej temperatury). Napełnij 80% stożkowej probówki o pojemności 50 ml (40 ml) wstępnie podgrzanym SCB. Przenieś plastry na wkładki siatkowe do stożkowej rurki za pomocą SCB. Przykryj rurkę nakrętką z otworami wykonanymi igłą 18\u201220 G.
  2. Trzymaj plastry przez 30 minut w SCB w temperaturze 80\u201285 °C, naprzemiennie podgrzewając w kuchence mikrofalowej na minimalnym poziomie mocy. W razie potrzeby napełnij stożkową rurkę SCB. Natychmiast po tym przenieś plastry wraz z wkładkami siatkowymi do lodowatego 0,1 M PBS i płucz 3 razy przez 10 minut każdy.

6. Wielokrotne barwienie immunologiczne (opcjonalnie)

UWAGA: Zobacz sekcję wprowadzającą, aby poznać uzasadnienie tego kroku.

  1. Jednoczesne wielokrotne barwienie immunologiczne
    1. Przygotuj koktajl z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko celowi (np. mysim anty-BrdU i króliczym anty-GFAP) w PBS+. Użyj różnych gospodarzy dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Kontynuować te same kolejne kroki dla każdego protokołu.
    2. Przygotować koktajl z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego (np. kozi anty-mysi FITC, kozioł anty-królik TRITC) w tym samym roztworze rozcieńczalnika dla każdego protokołu. Kontynuuj te same następne kroki dla każdego protokołu. Najlepiej używać przeciwciał drugorzędowych, które pochodzą od tych samych gospodarzy, aby uniknąć reakcji krzyżowej.
  2. Sekwencyjne mnogie barwienia immunologiczne.
    1. Postępuj zgodnie z protokołem dla pierwszego docelowego przeciwciała (np. mysiego anty-BrdU) i zatrzymaj się przed zamontowaniem plasterków. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z PBS++ (roztwór blokujący).
    2. Drugie przeciwciało pierwszorzędowe (np. anty-GFAP królika) należy inkubować w PBS+ przez noc w temperaturze 4 °C. Postępować zgodnie z kolejnymi krokami dla każdego protokołu, w tym inkubacją drugiego przeciwciała drugorzędowego (np. koziego przeciwciała anty-króliczego TRITC). Kontynuuj kolejne kroki dla każdego protokołu do końca.

7. Barwienie przeciwstawne (opcjonalnie)

  1. W przypadku protokołów wykorzystujących reakcję peroksydazy, podgrzej wstępnie roztwór fioletu krezylowego do 60 °C. Uwodnij szkiełka za pomocą ddH2O przez 1 min. Inkubuj szkiełka w gorącym roztworze fioletu krezylowego przez 5\u201220 min.
    1. Płukać szkiełka preparatem ddH2O przez 1 minutę. Płukać szkiełka alkoholem etylowym o stężeniu 70%, 80%, 90% i 100% przez 1–3 min każde. Płukać szkiełka ksylenem przez 1\u20123 min.
    2. Dodaj trwałe hydrofobowe podłoże montażowe i umieść szkiełka nakrywkowe.
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. Można zastosować samodzielnie wykonane medium montażowe zawierające PVA (alkohol poliwinylowy)-DABCO.
  2. W przypadku protokołów wykorzystujących immunofluorescencję należy dodać niewielką objętość (25\u201250 μl) hydrofilowego podłoża montażowego z DAPI, jodkiem propidyny lub podobnym. Uszczelnij na obwodzie lakierem do paznokci lub plastikowym uszczelniaczem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.

8. Obrazowanie i analiza

UWAGA: Zobacz Tabelę 2, aby zapoznać się ze specyfikacją ustawień mikroskopu. Zwykle liczenie barwionych nowych komórek odbywa się za pomocą wycinków barwionych reakcją peroksydazy (tańsza metoda), ale można to również przeprowadzić za pomocą immunofluorescencji.

  1. Aby określić ilościowo komórki, najpierw prawidłowo zidentyfikuj zakręt zębaty za pomocą soczewki o 4-krotnym powiększeniu (dalsze instrukcje dotyczące szczegółów anatomicznych DG można znaleźć w Amaral et al.16).
    1. Przeszukaj ziarnistą warstwę komórkową zakrętu zębatego w poszukiwaniu jąder znakowanych BrdU (przy użyciu soczewki o powiększeniu 40x). Przeprowadź dokładne wyszukiwanie komórek wzdłuż osi z, ponieważ nowe komórki mogą być rozmieszczone w różnych warstwach (patrz Wideo 1).
    2. Wybierz sekcję interwału do przeszukiwania komórek w całym zakręcie zębatym (np. co 6 sekcja tkanki, co odpowiada co 240 μm).
    3. Policz wszystkie komórki BrdU dodatnie. Morfologia znakowanego jądra może się zmieniać w zależności od tego, ile BrdU zawiera komórka (patrz Rysunek 3 jako przewodnik). Przesuwaj się powoli po osi z, aby określić ilościowo wszystkie kilka jąder, które integrują gromadę (patrz Wideo 2).
    4. Pomnóż łączną liczbę zliczonych komórek z wybraną sekcją interwału (np. 6), aby oszacować łączną liczbę nowych komórek oznaczonych znakiem BrdU.
    5. Idealnie byłoby, gdyby w regularnym eksperymencie policzono co najmniej dziesięć sekcji na zwierzę i co najmniej pięć zwierząt na grupę.
  2. Dekonwolucja obrazu (opcjonalnie)
    UWAGA: Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać ważne informacje na temat tego kroku. Ta procedura wymaga obrazów monochromatycznych (skala szarości). Przekształcanie kolorowych obrazów w skalę szarości. Jeśli obrazy są kompozytem RGB, najpierw podziel kanały i połącz je w pojedynczy obraz (nie kompozyt), a następnie przekształć do 8-bitowej skali szarości.
    1. Utwórz plik z-stack z mikrofotografii.
    2. Utwórz plik funkcji rozproszenia punktowego (PSF) otwierający wtyczkę Diffraction PSF 3D (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) z menu opcji Wtyczki. Proszę podać wszystkie wymagane dane (zob. tabela 2). Naciśnij OK i zapisz plik.
    3. Otwórz wtyczkę DeconvolutionLab29 z menu opcji Wtyczki (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). Przeciągnij dopasowany obraz stosu osi z i plik PDF do odpowiedniego miejsca w oknie.
    4. Wybierz algorytm dekonwolucji (np. Richardson-Lucy) i liczbę iteracji (np. 20). Naciśnij przycisk URUCHOM.
    5. Połącz zdekonwolucyjne obrazy w jeden obraz z-stack, wybierając opcję Stosy z menu Obraz u góry. Następnie kliknij przycisk Z Project. Wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność) z menu rozwijanego Projection Type (Typ projekcji), naciśnij OKi zapisz plik.
    6. Utwórz obraz RGB za pomocą pojedynczego pliku obrazu z-stack utworzonego w powyższym kroku z żądanym pseudokolorem, wybierając Kolor z menu Obraz u góry. Następnie kliknij Scal kanały. Ustaw odpowiedni obraz na żądany kanał koloru z menu rozwijanego. Odznacz pole Utwórz kompozyt, naciśnij OK i zapisz plik (patrz Rysunek 4).
    7. Jeśli istnieje więcej niż jeden obraz kanału, powtórz kroki 8.2.1\u20128.2.5. Utwórz plik obrazu RGB postępując zgodnie z krokiem 8.2.6, otwierając co najmniej dwa pliki obrazu i wybierając różne kanały kolorów dla każdego pliku obrazu (patrz Rysunek 4).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody opisane powyżej zostały zastosowane do ilościowego określenia komórek nowonarodzonych w hipokampie dorosłego szczura po dobrowolnej aktywności fizycznej, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej bez dodatkowej aktywności fizycznej. Użyliśmy hipokampa szczura po urodzeniu jako kontroli pozytywnej. Samce szczurów w wieku 3 miesięcy były objęte dobrowolnym protokołem aktywności fizycznej (niekończące się koło) przez siedem dni. W 6 dniu szczurom wstrzykiwano BrdU (sekcja 2), a następnie co 12 godzin aż do trzech pełnych wstrzyknięć. Aby zakończyć trzy podziały cyklu komórkowego, zwierzęta poddano perfuzji przezsercowej (sekcja 3) 8 godzin po ostatnim wstrzyknięciu BrdU. Ta sama procedura została zastosowana na trzymiesięcznych szczurach, które nie były poddawane aktywności fizycznej, aby można je było zastosować jako kontrolę porównawczą. Jako kontrolę pozytywną, jednodniowym szczeniętom szczurów (w 1. dniu po urodzeniu) wstrzyknięto jednorazowo BrdU, jak opisano w sekcji 2 powyżej. Jednego dnia po wstrzyknięciu (2. dzień po urodzeniu) młode zostały poddane eutanazji, a ich głowy zanurzono w roztworze PFA, jak opisano w kroku 3.4. Dorosłe szczury poddano głębokiemu znieczuleniu (krok 3.1), perfuzji przezsercowej, jak opisano w kroku 3.2. Mózgi zostały wypreparowane i ponownie zafiksowane (krok 3.4). Mózgi pocięto na skrawki koronalne o wielkości 40 μm (krok 3.5). Skrawki poddano analizie immunologicznej BrdU, zgodnie z opisem w kroku 4.

Użyliśmy reakcji peroksydazy chrzanowej z DAB IHC do barwienia (krok 4.1) i liczenia komórek BrdU-dodatnich w DG. Rysunek 5 pokazuje sekcję DG z komórkami oznaczonymi jako BrdU. Rysunek 5C,D pokazuje reprezentatywną część sekcji DG w większym powiększeniu. Oznaczone komórki wykazywały intensywne ciemne zabarwienie, które było oznaczone strzałkami. Wstawka pokazuje średnią liczbę oznakowanych komórek w grupie eksperymentalnej i kontrolnej (policzone komórki dodatnie pomnożone przez sześć, jak opisano w kroku 8.1). Test t-Studenta ujawnił różnice istotności między liczbą komórek BrdU-dodatnich (t(10) = 2,704, p = 0,0222). Grupa kontrolna, która nie była poddawana aktywności fizycznej, miała od 2040 ± 314 komórek (n = 6 szczurów). Dla porównania, grupa aktywności fizycznej wykazała średnio 3 606 ± 486 (n = 6 szczurów) komórek BrdU-dodatnich. Jak zaobserwowano, ekspozycja na aktywność fizyczną zwiększa liczbę komórek BrdU-dodatnich. Dlatego wyniki te są zgodne z innymi zgłoszonymi wynikami, które pokazują, że aktywność fizyczna zwiększa proliferację komórek w dorosłym zakręcie zębatym17.

figure-results-1
Rycina 3: Przykłady różnej morfologii jądra komórkowego znakowanego BrdU. BrdU jest markerem syntezy DNA, który znakuje jądro. W okolicy hipokampa jądra BrdU-dodatnie miały kształt półowalny zlokalizowany w strefie subziarnistej zakrętu zębatego. Ponieważ BrdU jest włączane przez konkurencję, ilość włączona dla każdej komórki będzie miała różnicę, która później znajdzie odzwierciedlenie w tym, jak jądro zostanie zobrazowane. (A) Obraz immunofluorescencyjny. (B) Przedstawiono obraz wykorzystujący reakcję peroksydazy bez dodatkowej metody amplifikacji. Żółte strzałki pokazują artefakty i niespecyficzne sygnały. Czarne lub białe strzałki pokazują komórki BrdU+. 1 – W pełni spiłowane jądro, półowalne jądra silnie zabarwione. 2 – Jądra z kropkami, granica jąder jest zaznaczona i ma wewnątrz kilka kropek. 3 – Jądra z kilkoma kropkami, granica jąder jest zaznaczona i ma niewielką liczbę kropek w środku. 4 – Małe jądro to możliwe komórki na innym etapie różnicowania, ale nadal będące częścią niszy. 5 – Klastry są komórkami prekursorowymi w trakcie podziału, dlatego można zaobserwować kilka komórek razem w skondensowanych grupach. W tych grupach liczenie musi być wykonywane szczególnie ostrożnie, aby uniknąć błędnego oznaczenia komórek dodatnich. Czerwone strzałki pokazują jądro pod podziałem, które można pomylić z pojedynczą komórką. Każda komórka jest zamknięta w pudełku i można ją rozróżnić w płaszczyźnie osi Z w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Reprezentatywny obraz RGB dla pojedynczych i połączonych kanałów. Górny obraz przedstawia oryginalny obraz stosu z, a dolny obraz przedstawia zdekonwoluowany obraz stosu z 3D. (A) Małe powiększenie DG. (B) obraz RGB dla każdego kanału i (C) scalony obraz RGB. To był mózg z grupy kontrolnej. Immunofluorescencję zastosowano bez dodatkowej metody amplifikacji. BrdU (czerwony), DAPI jako przeciwbarwienie (niebieski) i GFAP (kwaśne białko fibrylarne gleju) jako marker astrogleju (zielony). ML = warstwa molekularna; GCL = ziarnista warstwa komórkowa; SGZ = strefa subkrystaliczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 5: Reprezentatywna sekcja DG z komórkami znakowanymi BrdU (intensywnie ciemne) dla każdej grupy eksperymentalnej. Reakcję peroksydazy wykorzystano metodą amplifikacji kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza. (A, B) Pokaż małe powiększenie DG, a (C, D) pokaż obszar pudełka przy większym powiększeniu. Panele A i C to tkanki z grupy aktywności fizycznej, panele B i D to tkanki z grupy kontrolnej. Wstawka pokazuje średnią liczbę oznaczonych komórek w grupie aktywności fizycznej i grupie kontrolnej (policzone komórki dodatnie pomnożone przez sześć, jak opisano w kroku 8.1). ML = warstwa molekularna; GCL = ziarnista warstwa komórkowa; SGZ = strefa subziarnista; strzałki wskazują komórki BrdU+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Wideo pokazujące różne ognisko dodatnich komórek wzdłuż osi z rozmieszczonych w różnych warstwach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Wideo pokazujące różne ogniska dodatnich klastrów komórek wzdłuż osi z rozmieszczonych w różnych warstwach. Przesuwaj się powoli po osi z, aby określić ilościowo wszystkie jądra, które integrują klaster. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

szt. TGL TGL szt. LAT TGL TGL SZT. szt. szt. wzrost pkt. szt. szt. wzrost pkt. szt. wzrost pkt. pkt. szt. pkt. szt.
Typ mikroskopu:Mikroskop epifluorescencyjny Olympus BX53
Źródło światła:Wysokoprężna lampa łukowa 130 W (U-HGLGPS)
Oprogramowanie do akwizycji:CellSens Standard
Zestawy filtrów:Numer katalogowyZakres wzbudzeniaLustro dwuchromatyczneZakres tłumienia
U-FUW340 - 490 nm410 nm420 nm
U-FBW460 - 495 nm505 nm510 nm
U-FGW530 - 550 nm570 nm575 nm
Kamera:Model:Kamera CCD UC50
Zakres spektralny:290 – 1000 nm
Rozmiar układu CCD:2/3 cala, 2588 (szerokość *7) x 1960 (wysokość *8) pikseli
Rozmiar piksela:3.4 X 3.4 μm
Fluorochrom:NazwaDługość fali wzbudzenia (nm)Emisja *3 Długość fali (nm)Kolor emisji
4, 6-diamidino-2-fenylo-indolowy HCI (DAPI)345Okręg wyborczy 455niebieski
Izotyocyjanian tetrametylorodaminy (TRITC)Okręg wyborczy 541572czerwony
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)Z dnia 494Lokal mieszkalny 519zielony
Cy3Lokal mieszkalny 552565czerwony
Medium montażowe i olejek immersyjny:NazwaIndeks załamania światła ośrodka *1
Air (nic między szkiełkiem a obiektywem)1.00029
Medium do montażu Antifade z DAPI1.45
Średni montaż Permount1.519
Olejek immersyjny o niskiej autofluorescencji (MOIL-30 Typ F)1.518
Soczewka powiększająca (planuj fluoryt)PowiększeniePrzysłona numeryczna (NA) *2Rozdzielczość (μm)Odstępy między pikselami obrazu (nm) *5Odstępy między warstwami Oś Z (nm) *6
4-krotnie0,132.128503000
10-krotny0,30,923403000
20-krotny0,50,55170Rok 2000
40-krotny0,750,37Rozdział 851000
100-krotny1.30,21Rozdział 341000

Tabela 2: Specyfikacje ustawień mikroskopu i wymagania dotyczące tworzenia plików z funkcją rozproszenia punktowego (PSF). W oknie wtyczki dyfrakcyjnej PSF 3D znajduje się 11 slotów do tworzenia pliku PSF. Każda szczelina jest opisana w następujący sposób: *1 - Współczynnik załamania ośrodka: współczynnik załamania dla ośrodka między szkiełkiem a soczewką (np. powietrze = 1,00029). *2 - Przysłona numeryczna: NA użytego obiektywu (należy ją skorygować, gdy używany jest inny nośnik zanurzeniowy i obiektyw został przypisany). *3 - Długość fali: Maksymalna długość fali emisji fluorochromu (nm). *4 - Aberracja sferyczna podłużna: 0,00. *5 - Odstępy między pikselami obrazu: rozmiar piksela CCD (nm)/powiększenie (np. 3,4 μm i obiektyw 100X, 3400/100 = 34 nm). *6 - Odległość między obrazami w osi Z. *7 - Szerokość: Wprowadź szerokość obrazu, który ma zostać zdekonwoluowany, w pikselach. *8 - Wysokość: Wprowadź wysokość obrazu, który ma zostać zdekonwoluowany, w pikselach. *9 - Głębokość, wycinki: liczba obrazów w stosie z. *10 - Normalizacja: Suma wartości pikseli = 1. *11 - Tytuł: Żądana nazwa pliku PSF. Plik powinien być zgodny z unikalnym podanym obrazem z-stack.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogeneza dorosłych to proces, który zachodzi najczęściej w niszach dorosłych nerwowych komórek prekursorowych, które mają potencjał do generowania nowych neuronów przez całe życie. Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) jest szeroko stosowane w immunologii do charakteryzowania liczby nowo wytworzonych komórek w dorosłym mózgu. BrdU będzie wbudowywany głównie do komórek dyskretnych obszarów mózgu (strefy neurogenne). Komórki te znajdują się w strefie podkomorowej (SVZ), zakręcie zębatym hipokampa - między wnęką a komórkami ziarnistymi znanymi jako strefa subziarnista (SGZ)1,2,18. Co więcej, istnieją różne regiony mózgu charakteryzujące się niższą zdolnością proliferacyjną w wieku dorosłym, w tym podwzgórze, prążkowie, kora nowa i ciało migdałowate19. Jak wspomniano wcześniej, barwienie BrdU jest powszechnie stosowaną metodą badań neurogenezy dorosłych w celu wykrycia proliferacji komórek. Jednak użycie BrdU jako markera ma ograniczenia i pułapki. Pierwszym z nich jest to, że BrdU jest markerem cyklu komórkowego. Dlatego należy przeprowadzić podwójne lub potrójne barwienie w celu zidentyfikowania losu komórki i uwzględnienia markerów komórkowych w celu wykrycia określonego etapu rozwoju znakowanych komórek. Jeszcze jedną obawą związaną z BrdU jest to, że jest to toksyczny i mutagenny roztwór, który modyfikuje stabilność DNA, może zmieniać funkcje komórkowe i cykle komórkowe. Podejmując decyzję o przestrzeganiu protokołu podawania i dawek (50\u2012600 mg/kg), należy wziąć pod uwagę powyższe informacje. Inną istotną cechą jest to, że BrdU jest markerem syntezy DNA, a nie markerem proliferacji komórek14. Dlatego ważne jest, aby odróżnić proliferację komórek od innych zdarzeń, takich jak naprawa DNA, ponowne wejście w nieudany cykl komórkowy i duplikacja genów. Badacze muszą przestrzegać odpowiednich środków kontroli, aby zapewnić właściwe stosowanie BrdU. W celu bardziej szczegółowego omówienia tych problemów i ograniczeń zalecamy zapoznanie się z pracą Taupina14. Proces standaryzacji protokołu immunohistochemicznego może być powolny i trudny. W tej pracy przedstawiliśmy wszystkie ogólne kroki do zarządzania udanym protokołem IHC. Zalecamy jednak, aby każda grupa badawcza wcześniej przetestowała i oceniła tkanki, przeciwciała i warunki. Testy i oceny muszą być przeprowadzane z co najmniej trzema różnymi poziomami inkubacji, etapami płukania i mocami dla każdego badanego przeciwciała i tkanki. Zalecamy również, aby badacze przejrzeli dodatkowe protokoły, aby móc wybrać najlepszy, który spełnia określone potrzeby i wymagania 20,21,22,23,24,25.

Jak wspomniano wcześniej, procedura obejmuje kilka etapów i rozważań metodologicznych, które są powszechnie stosowane i wspominane w artykułach naukowych, które zostaną omówione w dalszej części. Zalecamy, aby badacze starannie i prawidłowo dobierali przeciwciała pod względem techniki, budżetu, sprzętu, konfiguracji i głównego celu badawczego. Przeciwciała muszą być testowane na tym samym typie tkanki, który zostanie później przetestowany w eksperymencie. Zalecamy również stosowanie przeciwciała, które zostało przetestowane w tym samym celu (IHC) (tj. nie tylko w technikach western blot lub cytometrii przepływowej) w celu sprawdzenia jego zgodności z techniką fiksacji. Do barwienia BrdU można zastosować różne drogi, takie jak wstrzyknięcie dootrzewnowe, wlew dootrzewnowy, spożycie doustne lub wlew dokomorowy (bardziej szczegółowy opis każdej techniki znajduje się w piśmiennictwie26). W przypadku wyboru wstrzyknięcia dootrzewnowego należy upewnić się, że BrdU jest podawany do jamy otrzewnej, omijając okolice jelita. Ponieważ jelito ma kilka zduplikowanych komórek, które mogą wyczerpać BrdU, zanim dostanie się do mózgu, co wpłynie na liczbę znakowanych komórek. Bardzo ważne jest, aby uzyskać cienkie przekroje, ponieważ pozwalają one na lepszą penetrację roztworów. Plastry koronalne o grubości 40 μm zostały przecięte doogonowo i przeniesione na 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zgodnie z procedurą stereologiczną zaproponowaną przez Kempermanna i wsp.27. Immunohistochemię można przeprowadzić z tkanką zamontowaną na szkiełkach lub jako swobodnie pływające sekcje. Ponieważ BrdU znajduje się głęboko w jądrach komórkowych, umożliwia przenikanie roztworów w swobodnie pływających sekcjach, co zapewnia lepsze wyniki i lepszy dostęp do obszaru zainteresowania. Ważne jest, aby otworzyć wiązania DNA (denaturacja DNA), aby umożliwić dostęp pierwotnemu przeciwciału anty-BrdU. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy te specyficzne procedury z wykorzystaniem inkubacji HCI. Z drugiej strony, proces blokowania niespecyficznych epitopów pozwolił na dokładniejszą identyfikację sygnału komórkowego.

Dobra przepuszczalność błony pozwala przeciwciałom prawidłowo przenikać do obszaru zainteresowania. Dodanie permeabilizatora, takiego jak Triton X-100, do roztworów PBS++ i PBS+ poprawia przepuszczalność membrany. W tym protokole można stosować zarówno odczynniki PBS, jak i sól fizjologiczną buforowaną trisem (TBS). Pod względem budżetowym TBS mógłby być względnie tańszy niż PBS. Jednak PBS może zakłócać przeciwciała antyfosforanowe i hamować przeciwciała sprzężone z fosfatazą alkaliczną, więc unikaj stosowania PBS, jeśli cel jest zmodyfikowany potranslacyjnie przez fosforylację (tj. Fosforylowany). Do tej pracy użyliśmy PBS i odkryliśmy, że etapy mycia tkanek dawały bardziej konkretny sygnał. Zalecamy również badaczom przeprowadzenie co najmniej trzech cykli prania przy użyciu TBS lub PBS. Roztwory muszą być świeżo przygotowane. Pobieranie antygenu (AR) jest metodą mającą na celu zmniejszenie utraty antygenowości spowodowanej fiksacją, która modyfikuje strukturę antygenów trzeciorzędowych i czwartorzędowych. Ta redukcja sprawia, że antygeny są niewykrywalne przez przeciwciała28,29. Indukowane ciepłem odzyskiwanie epitopów (HIER) zastosowane w tym protokole próbowało odwrócić reakcje chemiczne między formaldehydem a białkami poprzez hydrolizę wysokotemperaturową lub silną hydrolizę alkaliczną (z innymi roztworami buforowymi, takimi jak EDTA pH 8,5 lub Tris pH 9,5). Niezbędne jest testowanie nowych przeciwciał z różnymi protokołami AR, aby porównać wyniki i wybrać najlepsze dla protokołu. Ten ostatni krok może być opcjonalny w zwykłym protokole; Jednak potraktowaliśmy tkanki protokołem odzyskiwania antygenu, aby zapewnić lepsze wyniki dla tego protokołu.

Bardzo ważne jest, aby wybrać właściwy końcowy kolor kontrastowy i technikę przeciwbarwienia, biorąc pod uwagę podstawowy kolor barwienia i metodę zastosowaną w celu uwidocznienia nieplamiącej struktury i uniknięcia maskowania pierwotnego koloru barwienia przed reakcją immunologiczną. W mikroskopii fluorescencyjnej DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) jest bardzo popularnym barwnikiem jądrowym i chromosomowym, który emituje niebieską fluorescencję (absorpcja: 360 nm, emisja: 460 nm) po związaniu się z regionami AT DNA. Nośnik montażowy zawierający DAPI jest dostępny i łatwy w użyciu; Zapewnia to doskonałe zatrzymywanie sygnału podczas akwizycji obrazu. W przypadku reakcji nadtlenkowej IHC był dostępny w różnych opcjach, takich jak fiolet krezylowy, hematoksylina, barwienie czerwienią obojętną lub zielenią metylową. W przypadku wielu technik barwienia immunologicznego ważne jest, aby wybrać przeciwciało zgodne z techniką wiązania zastosowaną w celu uniknięcia reaktywności krzyżowej30. Kiedy problemy i komplikacje związane z pojedynczym barwieniem zostaną rozwiązane, zastosuj kolejne barwienie kolorem, jeśli uznasz to za konieczne. Kluczowe znaczenie ma kontrolowanie nieswoistego wiązania między przeciwciałami drugorzędowymi. Można to osiągnąć poprzez nasycenie przeciwciał pierwszorzędowych przed użyciem przeciwciała drugorzędowego wytwarzanego w tym samym gatunku gospodarza co przeciwciała pierwszorzędowe. Na przykład, w przypadku stosowania przeciwciał przeciw myszom wytwarzanych u królików i przeciwciał anty-króliczych wytwarzanych w kozich przeciwciałach drugorzędowych, przeciwciało anty-królicze wytwarzane w przeciwciałie kozim musi być użyte przed przeciwciałem przeciwko myszom wytwarzanym w przeciwciałie królika. Gdy metoda sekwencyjna jest całkowicie zdominowana, można rozpocząć jednoczesny proces barwienia immunologicznego. W tej metodzie konieczne jest odpowiednie dobranie przeciwciał drugorzędowych. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie te przeciwciała pochodziły od tego samego zwierzęcia gospodarza, aby uniknąć reaktywności krzyżowej. Zalecamy przeprowadzenie kontroli pozytywnej w celu potwierdzenia, że metoda barwienia działa dokładnie w pourodzeniowej tkance hipokampa (obfita neurogeneza w tym wieku). Jeśli tkanka kontroli pozytywnej wykazuje problemy z barwieniem, należy dokonać przeglądu i przeglądu procedury, wprowadzić poprawki i regulacje, a następnie powtarzać, aż uzyska się dobre barwienie. Następnie przeprowadź kontrolę ujemną, aby sprawdzić, czy przeciwciało działa prawidłowo, pomijając lub zastępując określone przeciwciało pierwszorzędowe normalną surowicą (ten sam gatunek co przeciwciało pierwszorzędowe). Jak wspomniano we wstępie, dekonwolucja obrazu jest potężnym narzędziem i stanowi alternatywę, gdy mikroskop konfokalny nie jest dostępny. Może zastosować dekonwolucję obrazu do wszystkich obrazów uzyskanych przy użyciu jasnego pola przechodzącego, fluorescencji szerokiego pola i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznym celem dekonwolucji obrazu jest odtworzenie oryginalnego sygnału, że system akwizycji ulega pogorszeniu10.

Podsumowując, identyfikacja nowo wygenerowanych komórek uwidocznionych przez immunodetekcję analogu tymidyny BrdU jest skomplikowaną, ale potężną techniką. Praca ta jest próbą pomocy naukowcom, szczególnie w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych, w dokładniejszym ilościowym określaniu nowych komórek. Mamy nadzieję, że ten wysiłek był pomocny dla społeczności naukowej i ułatwi dopracowanie badań nad proliferacją komórek za pomocą techniki immunohistochemicznej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Panu Miguelowi Burgosowi i Gustavo Lago za pomoc techniczną. Pragniemy również podziękować dr Clorindy Arias, dr Karli Hernandez i dr Oscarowi Galicii za ich życzliwe wsparcie w dostarczeniu odczynników i materiałów. Dziękujemy również División de Investigación y Posgrado z Universidad Iberoamericana Ciudad de México za zapewnienie funduszy na wykonanie tej pracy oraz pokrycie kosztów produkcji wideo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PRZYGOTOWANIE I KONFIGURACJA ODCZYNNIKÓW
Dawca Surowicy końskiejBioWestS0900Roztwory blokujące i inkubacyjne w PBS
Odczynnik paraformaldehydowy, krystaliczny (PFA)Sigma-AldrichP6148toksyczny, łatwopalny
Chlorek potasuSigma-Aldrich746436-500G
Fosforan potasu, monobasicJ.T Bker3246-01
SacaroseJ.T Baker4072-01
Chlorek soduMeyer2365-500G
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881-500GKoryzujący, do kalibracji pH
Phophate sodu DibasicSigma-AldrichS9763-5KG
Triton-x 100Sigma-AldrichT8787
ANALOG TYMIDYNY PODANIE BRDU
5-Bromo-2′-deoksyurydyna, BrdUSigma-AldrichB9285toksyczny (mutagenny, teratogenny)
23– Igła podskórna 27GBD PrecisionGlide
roztwór soli fizjologicznejPiSA
1 mlNIPRO
em>PREPARAT TKANKOWY
15-ml polipropylenowa tubka stożkowaThermo Scientific339650
50-ml polipropylenowa rurka stożkowaThermo Scientific
Narzędzia
GilotynaStoelting
Microtome CryostatMICROMHM525
Netwell 15 mm wkładki membranowe z siatki poliestrowejCorning3477wstępnie załadowane 12-dołkowe płytki hodowlane
Plastikowy zestaw nośny Netwell 12-dołkowyCorning3520do siatki poliestrowej 15 mm wkładki membranowe
Plastikowy zestaw nośny 6-dołkowy NetwellCorning3521
Pompa perfuzyjnaCole-Parmer7553-70
WytrząsarkaIKAROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violetSigma-AldrichC50421%, Światłoczuły
Zestaw substratów peroksydazy DAB (HRP) (z niklem), 3,3'-diaminobenzydynaVector LaboratoriesSK-4100rakotwórczy, światłoczuły
kwas hidochlorowyJ.T.Baker9535-05, do kalibracji pH
Nadtlenek wodoru, 50%Meyer5375-1LToksyczny, utleniający
Podłoże montażowe PermountFisher ChemicalSP15-500
VECTASHIELD Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPIVector LaboratoriesH-1200Światłoczuły
VECTASTAIN® Elite® Zestaw ABC Peroksydaza (HRP)Vector LaboratoriesPK-6100enzymatyczny system amplifikacji na bazie awidyny/biotyny
Przeciwciała pierwotne
Przeciwciało anty-GFAP wytwarzane w królikuSigma-AldrichHPA0560301:500
Przeciwciało monoklonalne anty-BrdU wytwarzane w myszySigma-AldrichB25311:250
Przeciwciała drugorzędowe
Biotin-SP (długi dystans) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-065-1511:250
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, HRPInvitrogenG-210401:1000
Kozia IgG Anty-Mysz (cała cząsteczka), TRITCSigma-AldrichT53931:250
Kozia anty-królicza IgG (H+L) adsorbowana krzyżowo, FITCInvitrogenF-27651:250
Streptawidyna, Cy3Vector LaboratoriesSA-13001:250
OBRAZOWANIE I ANALIZA
KomputerDell Computer CompanyT8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHBDo sterowania i monitorowania procesów protokołów
Kamera CCDOprogramowanie OlympusUC50
CellSens StandardOprogramowanie do akwizycjiOlympuscellSens Standard Edition
Mikroskop epifluorescencyjnyOlympusBX53
Wysokociśnieniowa lampa łukowa rtęciowa 130 WOlejek immersyjny OlympusU-HGLGPS
o niskiej autofluorescencjiOlympusMOIL-30 Typ F
Mikro okulary nakrywkowe (VWR, nr kat. 48404 454; 24  60 mm)
Szkiełka mikroskopowe (VWR, nr kat. 48323-185; 76  26 mm)
Kostka filtracyjna U-FBWOlympusU-FBWwzbudzenie 460 - 495 nm, zwierciadło dichroiczne 505 nm, tłumienie 510 nm
Kostka filtra U-FGWOlympusU-FGWwzbudzenie 530 - 550 nm, zwierciadło dichroiczne 570 nm, tłumienie 575 nm
Kostka filtra U-FUWOlympusU-FUWwzbudzenie 340 - 490 nm, zwierciadło dichroiczne 410 nm, tłumienie 420 nm
Strzykawki 30130032 <339652preparacyjne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals. Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Miller, M. W., Nowakowski, R. S. Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system. Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).
  4. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  5. Filippov, V., et al. Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).
  6. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).
  7. Matiašová, A., et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).
  8. Von Bohlen Und Halbach, O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).
  9. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  10. Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue. Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with imageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).
  13. Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p (2016).
  14. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  15. Revilla, V., Jones, A. Cryostat sectioning of brains. International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).
  16. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).
  17. Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density. Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).
  18. Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667(2019).
  19. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).
  20. Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).
  21. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).
  22. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. Journal of Visualized Experiments. (46), e2166(2010).
  23. Tischler, A. S. Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).
  24. Taupin, P. Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments. Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).
  25. Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).
  26. Magavi, S. S., MacKlis, J. D. Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo. Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).
  27. Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. , 391-399 (2003).
  28. Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).
  29. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  30. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunohistochemia BrdUanaliza neurogenezydenaturacja DNAreakcja peroksydazykompleks awidyna biotynaobrazowanie mikroskopoweliczenie kom rekprzygotowanie tkanekinkubacja z przeciwcia ami

Powiązane artykuły