Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.
Artykuł metodologiczny
Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Amplituda fal mózgowych uzyskana z elektroencefalografii (EEG) została uznana za podstawę zdolności poznawczych, pamięci i uczenia się u zwierząt i ludzi. Mechanizm neurogenezy u dorosłych jest również związany z poprawą pamięci i uczenia się. Tradycyjnie, naukowcy używali do oceny parametrów uczenia się i pamięci w modelach gryzoni za pomocą zadań behawioralnych. Dlatego jednoczesne monitorowanie zmian behawioralnych i EEG jest szczególnie interesujące w korelacji danych między aktywnością mózgu a zachowaniami związanymi z zadaniami. Jednak większość sprzętu wymaganego do przeprowadzenia obu badań jest albo skomplikowana, kosztowna, albo wykorzystuje przewodową sieć, która utrudnia naturalne ruchy zwierząt. W tym badaniu EEG zostało zarejestrowane za pomocą bezprzewodowego urządzenia do elektrofizjologii wraz z wykonaniem nowego zadania rozpoznawania obiektów (NORT). Zachowanie zwierzęcia było jednocześnie monitorowane przez system śledzenia wideo. Oba nagrania zostały przeanalizowane offline za pomocą ich znaczników czasu, które zostały zsynchronizowane, aby powiązać sygnały EEG z działaniami zwierzęcia. Badani składają się z dorosłych szczurów rasy Wistar po średniotrwałym leczeniu wzbogacającym środowisko. Sześć elektrod śrubowych czaszki zamocowano parami na obu półkulach w obszarach czołowych, środkowych i ciemieniowych i odniesiono je do elektrody znajdującej się za kością nosową. Protokół NORT polega na wystawieniu zwierzęcia na działanie dwóch identycznych obiektów przez 10 minut. Po 2 h i 24 h jeden z obiektów został zastąpiony nowym. Czas eksploracji dla każdego obiektu był monitorowany przez oprogramowanie do śledzenia zachowań (BTS) i rejestrację danych EEG. Analiza EEG zsynchronizowana z danymi behawioralnymi składa się z oszacowań względnej mocy pasma alfa i beta oraz porównań między rozpoznawaniem nowych obiektów a eksploracją znanych obiektów, między trzema etapami eksperymentalnymi. W tym artykule omówiliśmy proces wytwarzania elektrod, chirurgię implantacji elektrod zewnątrzoponowych, protokół wzbogacania środowiska, protokół NOORT, konfigurację BTS, sprzężenie EEG – BTS do jednoczesnego monitorowania w czasie rzeczywistym oraz analizę danych EEG w oparciu o automatyczne wykrywanie zdarzeń.
Wprowadzenie
Test behawioralny jest kluczowy w badaniach neurobiologicznych dla dużej ilości informacji generowanych w kontekście in vivo. W związku z tym naukowcy szeroko stosują różne testy behawioralne do analizy funkcji sensoryczno-motorycznych, interakcji społecznych, zachowań lękowych i depresyjnych, uzależnienia od substancji i różnych form funkcji poznawczych1. Ręczne rejestrowanie testów behawioralnych może być trudne, wyczerpujące i niedokładne nawet dla większości doświadczonych obserwatorów. Mimo że podjęto pewne wysiłki w celu opracowania darmowego i otwartego oprogramowania do rejestracji zachowań (np. sexrat male2 aplikacja do zachowań seksualnych), kilka alternatyw pozwala na automatyczne rejestrowanie zachowań w czasie rzeczywistym różnych gatunków zwierząt, od fish3 do gryzoni4,5,6. Śledzenie wideo to cenna metoda szybkiego i dokładnego rejestrowania zachowań, używana w wielu różnych aplikacjach7. Bardziej potencjalną funkcją w obszarze nagrywania behawioralnego jest badanie aktywności neuronalnej podczas manifestacji behawioralnej. Jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronalnej (od pojedynczych komórek do głównych obszarów mózgu) i zadań behawioralnych może pokazać nam, w jaki sposób mózg generuje określone wzorce zachowań8. Zachowania to sekwencja drobnych elementów, które mogą ujawnić korelacje między aktywnością neuronalną a ruchami lub działaniami. Gdyby aktywność neuronalna i wzorce zachowań mogły być jednocześnie rejestrowane w wielu skalach czasowych, mogłyby wyjaśnić, w jaki sposób każdy stan mózgu koreluje z każdym konkretnym zachowaniem (bardziej dogłębne badanie zapisu behawioralnego można znaleźć w Datta et al., 2019 review8). Dlatego zsynchronizowane rejestrowanie aktywności behawioralnej i neuronalnej w pożądanej skali (od neuronów do dużych obszarów mózgu) jest uważane za niezwykle przydatne narzędzie. Istnieje kilka systemów mających na celu integrację nagrań behawioralnych z innymi pomiarami jako aktywność neuronalna4,5.
Chociaż elektroencefalografia jest uważana za jedną z najczęściej stosowanych technik w dziedzinie neuronauki klinicznej i badawczej, stosunkowo wysoka mobilność, jak również rozmiar urządzenia rejestrującego EEG, sprawiają, że technika ta jest wyjątkowa i trudna do wykrycia w przypadku modeli in vivo9. Opracowano pewne rozwiązania tego problemu, np. zastosowanie i urządzeń obrotowych, które pozwalają zwierzętom na swobodne poruszanie się po arenie. Niemniej jednak systemy oparte na często stwarzają problemy z prowadzeniem badań, np. podczas przenoszenia zwierzęcia z jednej klatki do drugiej obserwuje się utrudnienie lub zaplątanie się zwierzęcia w. Urządzenia telemetryczne zostały opracowane do bezprzewodowych zapisów elektrofizjologicznych, aby zwiększyć elastyczność sytuacji nagrywania10,11. Jednak takie systemy wykazały znaczne ograniczenia ze względu na małą liczbę kanałów nagrywania i niskie częstotliwości próbkowania11. W tym badaniu wykorzystaliśmy dostępny na rynku system bezprzewodowy, który wysyła sygnały EEG od zwierzęcia poprzez połączenie Wi-Fi z swobodnie poruszającym się systemem gryzoni12. Aparat waży 6 gramów i wytrzymuje do 16 kanałów nagranych z prędkością 1 kSps. System ten umożliwia rejestrację EEG lub skoków w środowisku zwierzęcym, przy zmniejszonych zakłóceniach, służąc jako ekonomiczne rozwiązanie w porównaniu z tradycyjnymi systemami elektrofizjologicznymi dostępnymi na rynku. Ponadto zsynchronizowaliśmy te dane za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo, aby zapewnić korelację między EEG a wzorcami zachowań. Ta synchronizacja odbywa się w trybie offline poprzez wyrównanie i interpolację danych i zdarzeń na podstawie znaczników czasu generowanych przez oba systemy i jest przetwarzana w programie MATLAB.
Neurogeneza dorosłych jest definiowana jako proliferacja, przeżycie i różnicowanie w neuronach nowo powstałych komórek w zakręcie zębatym zwierząt13,14. Wiadomo, że proces ten jest związany z poprawą pamięci i uczenia się, co zwiększa neurogenezę dorosłych gryzoni poprzez warunki wzbogaconego środowiska (EE)15. EE polega na trzymaniu gryzoni w małych grupach w dużej klatce wyposażonej w zabawki i rurki, gdzie zwierzęta mają nowe i złożone, ale nie mają znaczenia biologicznego15. Chociaż EE stymuluje neurogenezę hipokampa, różni się również wieloma czynnikami, takimi jak wiek, szczep zwierzęcia, określone warunki stymulacji lub procedura wykrywania neurogenezy. U myszy w średnim wieku wystawionych na trzymanie EE przez siedem dni odnotowano narodziny nowych komórek ziarnistych (GC) w zakręcie zębatym hipokampa (DG)16. Badania próbujące selektywnie ablować neurogenezę dorosłych u dorosłych szczurów sugerują, że nowe komórki ziarniste w wieku około 1-2 tygodni są wymagane w wyuczonej odpowiedzi17. Około 2 lub 3 tygodnie po urodzeniu GC u dorosłych DG zaczyna pojawiać się kilka charakterystycznych cech, takich jak kolce dendrytyczne, które są niezbędne do pobudzającego przekaźnictwa synaptycznego18. Zhao i wsp. przeprowadzili analizę ilościową, aby wykazać, że szczyt wzrostu kręgosłupa występuje w ciągu pierwszych 3 - 4 tygodni19. Kilka elektrofizjologicznych badań in vivo sugeruje, że tylko trzy tygodnie warunków przetrzymywania EE powodują zmiany w transmisji synaptycznej DG i zwiększają pobudliwość komórek20. Doniesiono również, że ekspozycja na wzbogacone środowisko po 1-4 tygodniach od wstrzyknięcia BrdU znacznie zwiększyła gęstość komórek BrdU/NeuN w warstwie ziarnistej DG u myszy21. Autorzy ci sugerują, że krytyczny okres istnieje od jednego do trzech tygodni po ekspozycji na EE, ponieważ zaobserwowano znaczny wzrost liczby nowych neuronów21. Badania nad neurogenezą hipokampa u dorosłych (AHN) u ludzi były kontrowersyjne, ponieważ nie było bezpośrednich dowodów. Jednak niedawny raport opisywał etapy rozwoju AHN w ludzkim dorosłym mózgu, identyfikując tysiące niedojrzałych neuronów w DG, a tym samym pokazując znaczenie AHN podczas starzenia się u ludzi22. Opierając się na wspomnianych wcześniej dowodach, badanie AHN w modelach zwierzęcych jest ważniejsze niż kiedykolwiek (bardziej dogłębne badanie AHN można znaleźć w Leal-Galicia et al., 2019 review15).
Jak wcześniej wspomniano, hipokamp został powiązany z podstawową funkcją zdolności uczenia się i pamięci. Tworzenie wspomnień przebiega przez trzy odrębne procesy: kodowanie (nabywanie pamięci), konsolidacja (przechowywanie pamięci) i odzyskiwanie (rozpoznawanie pamięci)23. Pamięć rozpoznawania u ludzi jest testowana za pomocą zadania porównań par wizualnych24. Podstawą ludzkich i zwierzęcych modeli pamięci i amnezji są testy behawioralne, które oceniają zdolność do rozpoznawania wcześniej prezentowanych bodźców25,26, tak jak robi to zadanie wizualnych porównań parami u ludzi. Dlatego jednym z najczęściej stosowanych testów behawioralnych do oceny zdolności gryzonia do rozpoznania wcześniej przedstawionego bodźca, czyli zdolności uczenia się i pamięci, jest spontaniczne zadanie rozpoznawania nowych obiektów (NORT)23,27. Protokół NORT składa się z dwóch identycznych nowych obiektów na znanej arenie przez 10 minut w próbie akwizycji. Po określonym czasie między 028 a 48 hours29 (zmienny czas w zależności od każdego protokołu), zwierzę wraca na tę samą arenę, na której znajduje się jeden z tych samych znanych obiektów i jeden nowy obiekt. Zwierzę spontanicznie eksploruje nowy obiekt, jeśli znajomy obiekt został zapamiętany26. Współczynnik preferencji jest powszechnie stosowany przy ocenie wyników poszukiwań. Określa się go, dzieląc całkowity czas eksploracji obiektu od czasu eksploracji nowego lub znanego obiektu. NORT ma pewne zalety w porównaniu z innymi testami pamięci rozpoznawania. Co najważniejsze, nie wymaga żadnej zewnętrznej motywacji, nagrody ani kary. Nie generuje warunków stresowych. Wreszcie, nie jest potrzebne żadne szkolenie, aby wywołać zachowanie podczas eksploracji obiektów (dla bardziej dogłębnego badania NORT, zobacz ref.23).
Dlatego jednoczesne rejestrowanie wielu modalności danych i ich integracja w badaniach nad uczeniem się i pamięcią, jako efekt neurogenezy dorosłego hipokampa, jest bardzo atrakcyjne i stanowi przekonujące rozwiązanie dla badaczy w tej dziedzinie. Prezentowane prace przedstawią wszystkie procesy związane z jednoczesną behawioralną oceną wideo-śledzenia (novel object recognition task) i bezprzewodową rejestracją elektroencefalograficzną. Tutaj dokonaliśmy przeglądu procesu produkcji elektrod, chirurgii implantacji elektrod zewnątrzoponowych (śruba czaszkowa), protokołu wzbogacania środowiska (do indukcji neurogenezy hipokampa), przestrzegania protokołu NOORT, konfiguracji BTS, sprzężenia EEG – BTS do jednoczesnego monitorowania w czasie rzeczywistym oraz analizy danych EEG i behawioralnych wykonywanych w środowisku obliczeniowym MATLAB.
Protokół
Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych (Publikacje NIH nr 8023, poprawione w 1978 roku) wdrożonym przez Narodowe Instytucje Zdrowia i lokalne meksykańskie przepisy mające na celu zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych do celów dobrostanu zwierząt i zakaz cierpienia zwierząt. Komitet ds. Etyki Universidad Iberoamericana zatwierdził protokoły eksperymentalne dotyczące wykorzystania zwierząt w tym badaniu.
1. Ogólne ustawienia
- Zainstaluj oprogramowanie do śledzenia zachowań na komputerze zgodnie z instrukcjami produkcyjnymi.
- Zamontuj kamerę bezpośrednio nad urządzeniem, tak aby była skierowana w dół. Aparat powinien być podłączony do komputera.
- Zainstaluj oprogramowanie sterownika wymagane przez aparat (postępując zgodnie z instrukcjami producenta).
- Jeśli aparat jest wyposażony w obiektyw zmiennoogniskowy, wyreguluj je tak, aby idealnie pasowały do wyświetlacza aparatu.
- Wyłącz tryb autofokusa (AF) aparatu, postępując zgodnie z oprogramowaniem produkcyjnym.
- Upewnij się, że kamera działa poprawnie w czasie rzeczywistym i przetestuj tryb przechwytywania wideo, aż będzie gotowy do użycia.
2. Protokół wzbogacania środowiska (patrz Rysunek 1)
UWAGA: Trzymiesięczne samce szczurów rasy Wistar zostały użyte do tego eksperymentu i były utrzymywane w naturalnych warunkach ciemnego światła.
- Umieść ściółkę z trocin na przezroczystej akrylowej kwadratowej arenie (500 x 500 x 500 mm).
- Umieść na arenie trzy różne rodzaje zabawek, z którymi gryzonie będą mogły wchodzić w interakcje (np. koła aktywności, podwójny pokład, schody itp.).
- Dodaj cztery 2-calowe i cztery zakrzywione szare nieprzezroczyste rurki PVC.
- Zapewnij dozownikom z jedzeniem i wodą dostęp ad libitum do zwierząt.
- Umieść trzy gryzonie w klatce w pomieszczeniu wiwarium w normalnych warunkach.
- Pozostaw zwierzęta na tym obszarze na czas wymagany zgodnie z odpowiednim protokołem. W tym eksperymencie zwierzęta powinny pozostać na arenie przez 20 dni.
UWAGA: Po operacji wszczepienia elektrody zwierzęta nie wracają do leczenia wzbogacającego środowisko. Zamiast tego umieszczono je w pojedynczych klatkach do czasu zakończenia testu rozpoznawania nowych obiektów.
3. Proces produkcji elektrod
- Wytnij kawałek drutu miedzianego na około 2 cm i użyj papieru ściernego, aby przetrzeć około 0,5 cm z każdego końca.
- Zwiń jeden koniec drutu miedzianego do łba małej (elektrod) i upewnij się, że jest mocno zamocowany, ponieważ jest to kluczowy krok. Należy zagwarantować prawidłowy kontakt między oboma materiałami, aby uniknąć artefaktów w sygnałach EEG.
- Włóż drugi koniec na końcówkę zacisku złącza i upewnij się, że jest prawidłowo zamocowany, wzmacniając go za pomocą drobnych kleszczyków. Ta końcówka powinna łączyć się z wzmacniacza.
- Zmierz odpowiednią przewodność od końcówki do za pomocą multimetru. Proces ten gwarantuje, że połączenie elektrody jest prawidłowo zainstalowane.
4. Chirurgia implantacji elektrod zewnątrzoponowych (śruba czaszkowa)
UWAGA: Po 20 dniach leczenia wzbogacającego środowisko, zwierzęta zostaną poddane operacji zgodnie z procedurą opisaną poniżej:
- Wstrzyknąć zwierzęciu koktajl ketaminy/ksylazyny (90/10 mg/kg, i.p.)
UWAGA: Aby uniknąć niedrożności dróg oddechowych, poczekaj, aż szczur przestanie się poruszać, a następnie wyjmij go z klatki i połóż zwierzę na płaskiej powierzchni. Wstrzyknąć niesteroidowy lek przeciwzapalny (meloksykam 1 mg/kg s.c.) i antybiotyk (enrofloksacyna 2,5 mg/kg mc., p.o.) jako środek przeciwbólowy zapobiegawczy. - Gdy szczur jest całkowicie znieczulony, ogol obszar głowy szczura.
UWAGA: Upewnij się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone przed kontynuowaniem operacji. Ostrożnie uszczypnij jedną z nóg lub ogon. Jeśli zwierzę zareaguje na bodziec, odczekaj jeszcze kilka minut i ponownie je uszczypnij. Jeśli zwierzę nie zareaguje na uszczypnięcie, przejdź do następnego kroku. Jeśli dostępny jest wymagany sprzęt, zdecydowanie zaleca się stosowanie znieczulenia gazowego (takiego jak izofluran), ponieważ ze względów bezpieczeństwa łatwiej go miareczkować. - Umieść zwierzę na aparacie stereotaktycznym, przymocowując najpierw oba uszy za pomocą pasków usznych (należy uważać, aby nie zranić ucha wewnętrznego zwierzęcia). Na koniec umieść przednie zęby nad prętem zgryzowym i zabezpiecz pasek na nos.
UWAGA: Zapewnij zwierzęciu poduszkę grzewczą na czas całej operacji, ponieważ znieczulenie stosowane w tej procedurze zwykle powoduje hipotermię i problemy z oddychaniem. - Oczyść górną część głowy za pomocą trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie chlorheksydyny lub jodu, a następnie spłucz solą fizjologiczną lub alkoholem.
- Lidokainę podawać podskórnie (20 mg/ml) pod skórę głowy (0,5 ml).
- Wkraplaj kroplę roztworu okulistycznego lub soli fizjologicznej do oczu każdego zwierzęcia co 5-10 minut, aby nie wyschły.
- Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie o długości około 2 cm od przodu do tyłu, aby prawidłowo odsłonić górną część czaszki.
- Wycofaj skórę za pomocą zacisków buldoga i zeskrob tkankę pokrywającą czaszkę.
- Zidentyfikuj i zapisz uzyskane współrzędne bregma.
- Zaczynając od Bregmy, korzystając ze stereotaktycznego Paxinos i Watson Atlas30, zlokalizuj i zaznacz położenie każdego z siedmiu punktów (współrzędnych), w których elektrody zostaną zamocowane.
UWAGA: W tym eksperymencie F3, F4 (+2,0 mm od Bregma, 2,25 mm z boku od linii środkowej); C3, C4 (−3,0 mm od Bregmy, 2,75 mm w bok od linii środkowej); oraz zamontowano P3, P4 (−7,0 mm od Bregmy, 2,75 mm bocznie od linii środkowej). Siódma śruba znajdowała się za kością nosową (NZ), jako odniesienie do podłoża (patrz Ryc. 2). - Za pomocą wiertarki o zmiennej prędkości wykonaj otwór końcówką o rozmiarze 2 (długość 44,5 mm) na każdym ze znaków, uważając, aby nie wbić się całkowicie w czaszkę.
- Włóż elektrodę do otworu i ostrożnie wkręć ją w czaszkę.
- Powtarzaj kroki 4.10 i 4.11, aż wszystkie siedem zostanie prawidłowo wkręconych.
- Przykręć wszystkie 7 pierwszą warstwą cementu dentystycznego. Włóż każdą elektrodę do złącza. Przykryj przewody całkowicie drugą warstwą cementu dentystycznego (zapobiegnie to odkręcaniu przez zwierzę) oraz dolną częścią złącza. W razie potrzeby przykryj trzecią warstwą cementu dentystycznego, pozostawiając złącze EEG czyste dla prawidłowego połączenia, tak aby urządzenie EEG mogło być prawidłowo podłączone (patrz Rysunek 3).
UWAGA: Po umieszczeniu każdej pary dwustronnych, można je przymocować za pomocą cementu dentystycznego (krok opcjonalny). - Pozostaw szczura na noc w opiece pooperacyjnej. Obserwuj zwierzę i zapewnij mu poduszkę grzewczą przez 1-2 godziny po zabiegu, ponieważ znieczulenie stosowane w tej procedurze zwykle powoduje hipotermię i problemy z oddychaniem.
- Podawać podskórnie 50 ml/kg/24 godziny (dawka podtrzymująca) roztworu soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu. Niesteroidowy lek przeciwzapalny (meloksykam 2 mg/kg mc. s.c.) i antybiotyk (enrofloksacyna 5 mg/kg, p.o.) należy wstrzykiwać po zabiegu chirurgicznym i przez następne 24 godziny.
- Po operacji trzymaj szczury w pojedynczych klatkach, aby w pełni wyzdrowieć przez siedem dni przed przeprowadzeniem testów behawioralnych.
- Delikatnie manipuluj zwierzęciem okresowo (co najmniej raz dziennie), aby zmniejszyć stres związany z przyszłymi manipulacjami. Trzymając szczura jedną ręką, delikatnie naciska się palcem na grzbiet zwierzęcia, przesuwając palce po futrze. Sprawdź ranę głowy, stan zdrowia, ogólne zachowanie i masę ciała przez okres jednego tygodnia po operacji.
UWAGA: W przypadku stwierdzenia jakichkolwiek nieprawidłowości lub oznak choroby/stresu u zwierzęcia należy powiadomić odpowiedzialnego lekarza weterynarii. Po tym okresie należy wykonać test rozpoznawania nowych obiektów i technikę zapisu EEG.
5. Test rozpoznawania nowych obiektów (NORT)
UWAGA: Siedem dni po zabiegu przejdź do testów behawioralnych. Wszystkie procedury behawioralne, w prezentowanym eksperymencie, zostały wykonane między 14 h 00 min a 16 h 00 min, co odpowiada cyklowi świetlnemu szczura.
- Umieść na szczurze kamizelkę wykonaną z miękkiego materiału (do której zostanie przymocowany aparat EEG podczas testu behawioralnego). Pozwól na przyzwyczajenie się przez 2-3 dni przed przeprowadzeniem testu behawioralnego.
- Umieść czarną akrylową kwadratową arenę (500 x 500 x 500 mm) w słabo oświetlonym pomieszczeniu nagraniowym.
- Przymocuj dwa identyczne nowe obiekty do środka podłogi areny za pomocą taśmy dwustronnej (aby zapobiec jego przemieszczeniu przez zwierzęta). Obiekty muszą znajdować się w równej odległości od siebie i od ścian areny.
- Dokładnie wyczyść każdy obiekt przed 50% etanolem, a także podłogę areny po każdej próbie (aby uniknąć sygnałów węchowych).
UWAGA: Zawsze przenoś zwierzęta do pomieszczeń inwentarskich (z sali wiwarium do sali eksperymentalnej) co najmniej pół godziny przed rozpoczęciem każdej sesji. Po zakończeniu sesji nagraniowej pozostaw zwierzęta w pomieszczeniu doświadczalnym na dodatkową godzinę. Ma to na celu uniknięcie stresu, który mógłby wpłynąć na wydajność tego testu. - Podłącz urządzenie EEG przed rozpoczęciem każdego badania. Delikatnie przytrzymuj zwierzę i mocno włóż do złącza na głowie zwierzęcia z zestawem EEG przymocowanym do grzbietu zwierzęcia (patrz Rysunek 4). Dozwolona jest tylko jedna pozycja.
UWAGA: Delikatna wcześniejsza manipulacja zwierzęciem może pomóc w zmniejszeniu stresu u zwierząt podczas procedury łączenia. W przeciwnym razie zwiększa się ryzyko uszkodzenia urządzenia lub zwierząt. W pełni naładuj baterię urządzenia za pomocą portu USB. - Fazy testów rozpoznawania nowych obiektów
- Przyzwyczajenie: Zajmij się zwierzęciem w 5-minutowych odstępach przez dwa kolejne dni, a zaraz po tym umieść zwierzę na arenie (bez żadnych przedmiotów) i pozwól mu swobodnie eksplorować przez 10 minut.
UWAGA: Przed wykonaniem jakichkolwiek sesji akwizycji i testów pamięci, szczury były starannie traktowane i podłączone do odpowiedniego urządzenia EEG, które zostało prawidłowo zamocowane przed rozpoczęciem testu. - Sesja przejmowania: Umieść zwierzę na arenie naprzeciwko jednej ze ścian przeciwległych do obiektów. Pozwól zwierzętom na swobodną eksplorację przez 10 minut. Przejdź do kroku 6.13, aby przeprowadzić test nagrywania przy użyciu oprogramowania do śledzenia zachowań.
UWAGA: Upewnij się, że aparat EEG prawidłowo trzyma kamizelkę przymocowaną do pleców szczura (aby zapewnić prawidłowe śledzenie zwierzęcia). Aby uzyskać dodatkowe wzmocnienie, użyj taśmy maskującej. - Test pamięci krótkotrwałej (SMT): Zamień jeden z obiektów na dowolny inny, zupełnie inny pod względem kształtu, koloru i tekstury. Umieść zwierzę, 2 godziny po sesji akwizycji, na arenie naprzeciwko jednej ze ścian przeciwległych do obiektów. Pozwól zwierzęciu na swobodną eksplorację przez 10 minut. Przejdź do kroku 6.13, aby przeprowadzić nagrywanie testowe przy użyciu oprogramowania do śledzenia zachowań.
- Test pamięci długotrwałej (LMT): Zamień używany przedmiot na dowolny inny, zupełnie inny pod względem kształtu, koloru i tekstury niż test pamięci krótkotrwałej. Umieść zwierzę 24 godziny po sesji akwizycji, na arenie naprzeciwko jednej ze ścian naprzeciwko obiektów. Pozwól zwierzęciu na swobodną eksplorację przez 10 minut Przejdź do kroku 6.13, aby przeprowadzić rejestrację testową przy użyciu oprogramowania do śledzenia zachowań.
- Przyzwyczajenie: Zajmij się zwierzęciem w 5-minutowych odstępach przez dwa kolejne dni, a zaraz po tym umieść zwierzę na arenie (bez żadnych przedmiotów) i pozwól mu swobodnie eksplorować przez 10 minut.
6. Konfiguracja oprogramowania do śledzenia zachowań
- Otwórz oprogramowanie do śledzenia zachowań.
- Zaloguj się na konto za pomocą użytkownika i hasła instytucji.
- Otwórz kran "Nowy pusty eksperyment" i wybierz nazwę protokołu (np. "NORT").
- Wybierz "Tryb śledzenia wideo"."
UWAGA: W tym eksperymencie kamera jest skonfigurowana do strumieniowego przesyłania śledzenia wideo na żywo. Istnieje jednak dodatkowa opcja wyboru wcześniej nagranych filmów. - Przejdź do "Aparatura." Zdefiniuj obszar areny, dostosowując pomarańczowy prostokąt do granic rzutowanej areny. Określ region obiektu, dopasowując pomarańczowe kółka na granicy obiektu wewnątrz areny wyświetlanej z kamery na ekranie.
- Ustaw ruchomą linię linijki skali w pozycji wzdłuż znanej długości obrazu (areny). Wprowadź długość obiektu w milimetrach w opcji "Długość linii linijki wynosi" w panelu Ustawienia. W tym przypadku arena ma wymiary 500 x 500 mm.
- Przejdź do sekcji "Śledzenie i zachowanie". Przejdź do sekcji "Strefy". Kliknij menu "Dodaj element" i wybierz "Nowa strefa". Wybierz obszar areny i nazwij nową strefę (np. "Pole").
- Powtórz poprzedni krok z obszarem obiektów i nazwij nową strefę (np. "Obiekty").
- Przejdź do "Kolor zwierzęcia" i wybierz opcję "Zwierzęta są jaśniejsze niż tło aparatu".
UWAGA: Do tego eksperymentu użyto białych szczurów (Wistar). Oprogramowanie ma jednak dodatkowe opcje dla badaczy, którzy używają szczurów czarnych i cętkowanych. Obie rasy zwierząt mogą być wykorzystane w tym samym eksperymencie. - Przejdź do "Śledzenie głowy i ogona zwierzęcia" i wybierz "Tak, chcę, aby głowa i ogon zwierzęcia były śledzone".
- Przejdź do zakładki "Testowanie" | "Etapy" i z menu "Dodaj element" wybierz "Nowy etap". Nazwij nowy etap "Akwizycja". Określ czas trwania etapu (np. 600 s).
- Powtórz poprzedni krok etapów "Test pamięci krótkotrwałej" i "Test pamięci długotrwałej".
UWAGA: W tym protokole wszystkie etapy mają ten sam czas trwania (10 minut). - Przejdź do sekcji "Procedury". Zdefiniuj zdarzenia, które mają być śledzone dla każdego etapu (akwizycja, test pamięci krótkotrwałej i test pamięci długotrwałej).
- Rozpocznij test (z każdym zwierzęciem). Przejdź do "Testy" (na górnym pasku menu) i wybierz "Dodaj test (+)". Przypisz numer zwierzęciu, które ma być badane (np. "1").
- Wybierz "Nagraj" i nazwij zwierzęta i sesję (np. "M1 Acq").
- Przed umieszczeniem zwierzęcia na arenie kliknij jeden raz na przycisk "Graj". Zostanie wyświetlony komunikat "oczekiwanie na rozpoczęcie".
- Po umieszczeniu zwierzęcia na arenie kliknij po raz drugi na przycisk "Graj". Test rozpocznie się i zakończy automatycznie.
- Powtórz kroki 6.13-6.16 dla testu pamięci krótkotrwałej (2 godziny po sesji akwizycji) i testu pamięci długotrwałej (24 godziny po sesji akwizycji).
7. Konfiguracja bezprzewodowego urządzenia do elektrofizjologii
- Podłącz modem do hosta komputera i włącz go. Wyłącz wszystkie inne urządzenia sieciowe na komputerze. Najlepiej wyciszyć wszelką inną komunikację bezprzewodową w pokoju rejestracyjnym, taką jak Bluetooth, telefony komórkowe, inne modemy, a nawet słuchawki bezprzewodowe.
- Przymocuj amplifier do grzbietu szczura, jak wspomniano w kroku 5.5.
- Włącz urządzenie EEG, podłączając baterię.
UWAGA: 2 s po podłączeniu urządzenia na wzmacniaczu EEG zacznie migać czerwona dioda LED, wskazująca, że komunikacja z modemem jest aktywna, a następnie zaświeci się zielona dioda. Jeśli komunikacja się powiedzie, diody LED na modemie zaczną migać w sposób ciągły. Wzmacniacz jest teraz gotowy do wysyłania informacji do modemu. - Uruchom oprogramowanie EEG i skonfiguruj je zgodnie z instrukcjami producenta, aby zintegrować je z bezprzewodowym urządzeniem do akwizycji EEG
- Naciśnij przycisk "Start Display". Oprogramowanie EEG wyświetli rzeczywistą akwizycję sygnału.
UWAGA: Użyj "Menedżera zadań systemu Windows", aby przypisać tryb priorytetu "w czasie rzeczywistym", aby uniknąć utraty informacji podczas eksperymentowania.
8. Rejestracja sygnału elektroencefalograficznego (EEG)
- Po sprawdzeniu, czy oprogramowanie EEG pozyskuje dane, uruchom oprogramowanie do śledzenia zachowań i ustaw protokół eksperymentalny, aby sprawdzić, czy zwierzę znajduje się w strefie obserwacji, a konfiguracja działa poprawnie.
- W tym momencie rozpocznij zapis w oprogramowaniu EEG, naciskając przycisk "Rozpocznij nagrywanie". Po sprawdzeniu, czy sygnał akwizycji jest uruchomiony, rozpocznij eksperymenty w BTS.
- Po zakończeniu eksperymentu wróć do oprogramowania EEG i zatrzymaj proces zapisu. Nagranie zostanie zapisane przy użyciu domyślnej nazwy składającej się z daty nagrania w formacie: "rrrr-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". Domyślnie wszystkie zapisy są zapisywane w folderze oprogramowania EEG (NeurophysData).
- Sprawdź, czy oba pliki danych zostały utworzone. Zapisz dziennik eksperymentu lub zmień nazwę, aby uniknąć nieporozumień.
9. Zadanie behawioralne i synchronizacja sygnału EEG
- Otwórz MATLAB i wykonaj polecenie: convert_plx2mat. Taka funkcja otworzy okno przeglądarki. Funkcje konwersji są dostarczane przez producenta i muszą zostać dodane do ścieżki programu MATLAB.
- Wybierz plik *.plx do konwersji i naciśnij "Enter" w wierszu poleceń MATLAB, aby przekonwertować go na parametry domyślne.
- Otwórz plik eksperymentacyjny BTS i przejdź do "Protokołu". Kliknij na opcję "Wyniki, raporty i dane" zaznacz wszystkie zdarzenia obu obiektów i kliknij "Wybierz format czasu dla raportu", wybierz trzecią opcję: "Pokaż czasy zdarzeń jako czas rzeczywisty w HH:MM:SS.sss - na przykład 13:20:14.791."
- Teraz przejdź do "Plik" i kliknij "Eksportuj" i "Eksportuj eksperyment jako XML", zaznacz "Data i godzina testu", a na koniec kliknij "Utwórz XML".
- Przejdź do "Eksportuj dane testowe" i kliknij "Zapisz dane". Zostanie utworzony plik .csv z czasami zdarzeń.
- Powtórz kroki od 9.1 do 9.5 dla każdego pliku. W naszym przypadku były to trzy eksperymenty: ACQ, STM i LTM.
- Po przekonwertowaniu plików EEG i zachowań zbierz je w jednym folderze. Folder musi zawierać odpowiednio sześć plików, trzy pliki .mat i trzy .csv. W naszym przypadku pliki nosiły nazwy: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv i PID_03_LTM_M.csv. ID odnosi się do numeru identyfikacyjnego zwierzęcia.
- Otwórz funkcję "procesa_sujeto.m" za pomocą MATLAB i dostosuj drugą linię do identyfikatora zwierzęcia.
- Teraz przenieś MATLAB do takiego folderu i wykonaj: "procesa_sujeto", aby utworzyć figury o paśmie względnym alfa i beta do mocy związanej z rozpoznawaniem obiektów na stolikach ACQ, STM i LTM.
UWAGA: "procesa_sujeto" to funkcja, która wykonuje/uruchamia kilka analiz przetwarzania sygnału. Analizy te są podsumowane w krokach od 9.10 do 9.15 w następujący sposób. - Przefiltruj każdy sygnał EEG za pomocą filtra pasmowo-przepustowego Butterwortha 4. rzędu przy [5-40] Hz, używając korekcji fazy.
- Sprawdź wzrokowo sygnały przed następną analizą, a te kanały, w których wystąpiły artefakty wynikające z wadliwego umieszczenia elektrod lub nieprawidłowego dostosowania przez ruchy zwierząt, zostały wyłączone z dalszej analizy.
- Odnieś sygnały do wspólnej średniej, aby złagodzić artefakty ruchu.
- Segmentuj sygnały EEG w celu utworzenia epok o długości 4 s zsynchronizowanych przez znaczniki czasu pochodzące z BTS. Zdarzenia docelowe polegały na eksploracji obiektu oznaczonego odległością zwierzęcia od granicy obiektów. Zdarzenia te są oznaczone na znacznikach czasu BTS i były używane jako identyfikatory ustalające pozycje okien. Tak więc epoki EEG są ograniczone o 1 s przed rozpoczęciem eksploracji do 3 s po. W tym momencie nie zastosowano walidacji długości eksploracji, ale będzie ona brana pod uwagę w przyszłych badaniach.
- Oszacuj widmową gęstość mocy w tych epokach za pomocą metody periodogramu Welcha przy użyciu długości okna 1 s, nakładania się 90%, okna Hanninga przed oszacowaniem transformaty Fouriera, przy tych parametrach osiągnięto rozdzielczość 1 Hz.
- Oceń widmo mocy w każdym paśmie, oceniając obszar pod periodogramem, a przedstawione wartości odpowiadają energii względnej, co oznacza, że energia każdego pasma EEG została podzielona przez całkowitą energię epoki. Procedura ta zmniejsza również błędne szacunki spowodowane artefaktami na sygnałach EEG.
Wyniki
Opisane powyżej metody zastosowano do jednoczesnego rejestrowania EEG i aktywności szczurów po zastosowaniu wzbogacenia środowiskowego. Samce szczurów Wistar w wieku trzech miesięcy poddano średnioterminowemu protokołowi wzbogacenia środowiskowego przez 20 dni; wykonano zabieg chirurgiczny w celu zamocowania sześciu śrubowych elektrod czaszkowych w parach w obszarach czołowych, centralnych i ciemieniowych, z referencją do siódmej elektrody umieszczonej w NZ. Zwierzęta utrzymywano w naturalnych warunkach cyklu światła i ciemności, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Niniejsza praca przedstawia integrację systemu EEG z oprogramowaniem do śledzenia behawioralnego w celu jednoczesnej rejestracji na żywo. Wykorzystano wyłącznie zwierzęta poddane protokołowi EE, ponieważ celem nie jest porównanie skuteczności zabiegu, lecz jedynie wykazanie zalet zastosowanego sprzętu. Jako dowód na to, że zastosowany 20-dniowy protokół zakwaterowania we wzbogaconym środowisku stymuluje neurogenezę u dorosłych, przedstawiamy dane dotyczące liczby komórek pozytywnych pod kątem BrdU u zwierząt w grupie EE oraz zwierząt utrzymywanych w standardowych warunkach, pochodzące z niepublikowanych danych z naszego laboratorium. Wykorzystano samce szczurów Wistar w wieku trzech miesięcy. Podano im trzy iniekcje BrdU w odstępach 12 h. Zwierzęta znieczulono (pentobarbital (50 mg/kg, i.p.)) i uśmiercono poprzez perfuzję transkardialną (patrz Rysunek 5). Aby upewnić się, że kamizelka przymocowana do urządzenia EEG nie ogranicza ruchów zwierząt, przeprowadzono test otwartego pola (OFT) w dwóch grupach: jedna grupa poddana była zabiegowi w trakcie noszenia sprzętu (kamizelki i wzmacniacza EEG), a druga grupa zwierząt pozostała nienaruszona i nie nosiła urządzeń. Nie stwierdzono istotnych różnic w dystansie pokonanym przez zwierzęta w ciągu 10 min testu (patrz Rysunek 5). Typowy protokół NORT składa się z prezentacji dwóch obiektów, a następnie zastąpienia jednego z nich nowym obiektem. Oprogramowanie do śledzenia behawioralnego monitorowało czas eksploracji.
Oprogramowanie do śledzenia behawioralnego zarejestrowało grupę zwierząt w celu oceny ich kluczowych parametrów wydajności. W związku z tym zastosowano trzy parametry do oceny efektywności eksploracji. Współczynnik preferencji obliczono na podstawie czasu przebywania głowy zwierząt w strefie obiektu, co określa całkowity czas, przez który głowa zwierzęcia znajdowała się przy każdym z obiektów. Obliczono również współczynnik preferencji dla czasu spędzonego na poruszaniu się w stronę obiektów, który wskazuje całkowity czas spędzony przez każde zwierzę na przemieszczaniu się w stronę każdej ze stref obiektów. Dodatkowo obliczono czas spędzony podczas każdej wizyty przy poszczególnych obiektach. Rycina 6 przedstawia wyniki dla trzech wspomnianych parametrów. W próbie nabywania nie stwierdzono różnic między obiektami w trzech ocenianych parametrach: czasie przebywania głowy w strefie obiektu w trzech próbach, czasie poruszania się w stronę obiektów w trzech próbach oraz czasie jednej wizyty przy każdym obiekcie. Nie odnotowano różnic w próbie STM. Tymczasem w próbie LTM zaobserwowano istotnie wyższy współczynnik preferencji eksploracji dla nowego obiektu. Ponadto w próbie LTM można było dostrzec preferencję nowego obiektu w czasie spędzonym podczas każdej wizyty (panel C). Wideo 1 przedstawia reprezentatywny przykład szczura zarejestrowanego podczas eksperymentu, natomiast Wideo 2 pokazuje reprezentatywny przykład jednoczesnego zapisu EEG i parametrów behawioralnych.
Dzięki zegarowi komputerowemu możliwe było zsynchronizowanie zdarzeń czasowych rejestrowanych przez oprogramowanie do śledzenia behawioralnego (Behavioral Tracking) oraz oprogramowanie do zapisu EEG. Rysunek 7 i Rysunek 8 przedstawiają zmiany względnej mocy EEG w pasmach alfa i beta. Są one powiązane z kontrolą motoryczną, koncentracją i pamięcią, co sugeruje, że eksploracja wiąże się z tymi funkcjami. Wyniki zwierzęcia 3 wykazują tendencję do spadku mocy alfa w STM w odniesieniu do ACQ i LTM, co sugeruje desynchronizację związaną z eksploracją lub przywoływaniem pamięci. Liczba rozpoznań obiektów (przetworzonych epok) była niska. Na tym etapie nie jest możliwe określenie, czy test statystyczny potwierdziłby, że taka różnica jest rzeczywista, czy też warunki eksperymentalne doprowadziły do powstania artefaktu. Niemniej jednak segmentacja, etykietowanie i analiza epok stały się możliwe dzięki osi czasu jednoczesnego znakowania zdarzeń u zwierząt i wyników EEG wygenerowanych dla przyszłych projektów badawczych. Połączenie tych systemów zapobiega błędnej identyfikacji zdarzeń podczas procesu ręcznego znakowania, co stało się istotnym problemem w badaniach na zwierzętach. Połączenie BTS i aktywności elektrofizjologicznej (EP) można było precyzyjnie powiązać z zachowaniem zwierzęcia; jednak warunki eksperymentalne wymagają zastosowania zaawansowanych technik przetwarzania sygnałów w celu wyeliminowania artefaktów ruchowych i skutecznego usprawnienia układu eksperymentalnego.
Rysunek 1: Przykłady klatki w warunkach środowiska wzbogaconego (EE). W miejscu bytowania zapewniono zabawki i rurki, w których zwierzęta znajdują nowości i złożoność, lecz nie mają one znaczenia biologicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Położenie elektrod znadtwardówkowych w czaszce szczura. Śruby służyły jednocześnie jako kotwice zestawu nagłownego oraz jako elektrody. F = czołowe; C = czołowo-ciemieniowe; P = ciemieniowe; 3 = lewa; 4 = prawa; NZ = jako odniesienie masy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy z operacji implantacji elektrod znadtwardówkowych (śruby czaszkowe). Obraz pokazujący implantowane śruby-elektrody wewnątrzczaszkowe u szczurów na różnych etapach operacji. Podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać zasad aseptyki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Reprezentatywne zdjęcia szczura wraz z ustawieniem eksperymentalnym. Szczur miał na sobie kamizelkę przymocowaną do urządzenia EEG z wbudowaną baterią, wewnątrz areny wykorzystywanej w protokole NORT. Na zdjęciu widoczna jest opaska na głowę oraz konektor kablowy zainstalowany na głowie szczura. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Dowody na zdolność do poruszania się oraz stymulację neurogenezy u dorosłych poprzez protokół EE. (A) Reprezentatywne obrazy aktywności zwierząt przez 10 min w teście otwartego pola (OFT) oraz średni dystans przebyty przez zwierzęta z wszczepionym sprzętem/po operacji oraz zwierzęta bez sprzętu/bez operacji. (B-E) Reprezentatywny przekrój zakrętu zębatego (DG) z komórkami znakowanymi BrdU (intensywna czerń) dla grup EE oraz standardowych warunków utrzymania. Panele B i D przedstawiają niskie powiększenie DG, a panele C i E pokazują obszar zaznaczony ramką przy wyższym powiększeniu. Panele B i C przedstawiają tkanki z grupy EE, a panele D i E z grupy standardnej. Wstawka ilustruje średnią liczbę komórek znakowanych w obu grupach. ML – warstwa molekularna; GCL – warstwa ziarnista; SGZ – strefa podziarnista; strzałki – komórki BrdU+. Wykresy przedstawiają średnią ± SEM. Do porównania grup zastosowano test t-Studenta. * p≤0.05. W teście otwartego pola nie stwierdzono istotnych różnic między grupami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Wyniki eksploracji w ocenie NORT. (A) Czas przebywania głowy w strefie obiektu w trzech próbach. (B) Czas poruszania się w kierunku obiektów w trzech próbach. (C) Czas pojedynczej wizyty przy każdym obiekcie. Wykresy przedstawiają średnią ± SEM. We wszystkich parametrach zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami (two-way repeated-measures ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Sidaka. * p≤0.05, ** p≤0.01 pomiędzy obiektami w danej próbie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Zmiany mocy w paśmie alfa EEG powiązane z eksploracją. Ten rysunek przedstawia zmiany względnej mocy pasma alfa od pół sekundy do 2,5 sekundy po rozpoczęciu eksploracji obiektów przez zwierzę. Sześć wykresów odpowiada elektrodom czołowym (frontal), centralnym i ciemieniowym (parietal) (od góry do dołu) oraz lewej i prawej stronie. Wykresy pudełkowe pokazują rozkład takich szeregów czasowych dla każdej kombinacji warunków obiektu: „znajomy” (familiar) i „nowy” (novel) oraz etapu: „ACQ”, „STM” i „LTM”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Zmiany mocy w paśmie beta EEG związane z eksploracją. Ta rycina przedstawia zmiany względnej mocy pasma beta w przedziale od 0,5 s do 2,5 s po rozpoczęciu eksploracji obiektów przez zwierzę. Sześć wykresów odpowiada elektrodom czołowym, centralnym i ciemieniowym (od góry do dołu) dla stron lewej i prawej. Wykresy pudełkowe przedstawiają rozkład takich szeregów czasowych dla każdej kombinacji warunków obiektu: „Znajomy” (Familiar) i „Nowy” (Novel) oraz etapu: „ACQ”, „STM” i „LTM”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wideo 1: Reprezentatywny materiał wideo przedstawiający szczura zarejestrowanego podczas eksperymentu. Szczur znajdował się wewnątrz areny wykorzystywanej w protokole NORT. Szczur miał na sobie kamizelkę przymocowaną do urządzenia EEG z wbudowaną baterią. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Wideo 2: Reprezentatywne nagranie przedstawiające jednoczesną rejestrację EEG i zachowania. Sygnał EEG wyświetlano po lewej stronie, natomiast test behawioralny (NORT) wyświetlano po prawej stronie nagrania. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Dyskusja
Badania behawioralne i elektroencefalograficzne są z natury trudne i wymagające. W związku z tym połączenie obu technik stanowi istotne kroki krytyczne. W związku z tym obie równoczesne techniki nie są powszechnie stosowane. W praktyce każda grupa na całym świecie wykonuje testy behawioralne ze specjalnymi warunkami, takimi jak zwierzęta, analizowane parametry czy zabiegi. Rodzi to istotne kontrowersje w tej dziedzinie i potrzebę wypracowania standardowych procedur dostępnych dla każdego. W tym miejscu przygotowaliśmy tę szczegółową procedurę ze wszystkimi krytycznymi krokami i rozważaniami metodologicznymi, które zwykle nie są opisane lub wymienione w większości opublikowanych artykułów. Zostały one omówione poniżej.
Produkcja potrzebnych materiałów jest podstawowym krokiem w kierunku sukcesu tej techniki. W związku z tym elektroda musi być zbudowana od podstaw przy użyciu ze stali nierdzewnej, kabli miedzianych i srebrnej spawarki. Materiały te są trudne do trwałego spawania, w taki sposób, że przewodność i wytrzymałość każdej elektrody muszą być sprawdzone przed użyciem. Możliwe jest użycie innego rodzaju drutu do montażu elektrody; Jednak miedź jest wystarczająco elastyczna, aby manipulować elektrodą, aby włożyć ją do złącza wzmacniacza. W związku z tym pożądane jest stosowanie elektrod komercyjnych, ale ich nabycie może być skomplikowane i kosztowne. Operacja jest jednym z najważniejszych kroków w tym protokole. Jest to wysoce zalecane, a nawet konieczne, aby mieć doświadczonego chirurga, szczególnie w przypadku implantacji elektrod. Ponieważ operacja często wymaga wydłużenia czasu znieczulenia, a czasami spawania podczas operacji, każde laboratorium musi wykonać niezbędne testy z odpowiednim znieczuleniem (można użyć różnych koktajli) dla każdego szczepu gryzoni, szczególnie w warunkach wiwariowych, różnic między miotami, a nawet indywidualnych różnic między zwierzętami. Właściwe planowanie i rozmyślanie może zapobiec utracie zwierząt podczas operacji. Wszczepienie elektrod to kolejny ważny krok. Wymaga dużej ostrożności, aby uniknąć uderzenia w czaszkę i uszkodzenia opon mózgowych lub tkanki mózgowej. powinny być prawidłowo umieszczone, to znaczy całkowicie osadzone w czaszce, w przeciwnym razie szumy i artefakty będą prezentowane na sygnałach, takich jak te związane z kiepską kolokacją lub ruchem, który nie wykorzystuje zapisu EEG. Leczenie i warunki przed- i pooperacyjne muszą być zawsze wykonywane i przestrzegane, aby uniknąć cierpienia gryzonia. Podskórną lidokainę można stosować na skórę głowy przed wykonaniem nacięcia skalpelem. Kropla soli fizjologicznej do oczu zwierzęcia pomoże zapobiec wysuszeniu. Do jamy ustnej należy również podać roztwór soli fizjologicznej, a po operacji 1 ml należy podać podskórnie lub dootrzewnowo, aby wyrównać równowagę płynów zwierzęcia i zapobiec odwodnieniu. Bezpośrednio po zabiegu należy podać leki przeciwzapalne (w celu zmniejszenia bólu), a także antybiotyki w postaci antybiotyków podskórnych lub miejscowych, bezpośrednio na obrzeża skóry głowy, gdzie znajduje się cementowa nasadka dentystyczna (w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa infekcji). Powyższy zabieg należy powtórzyć 24 godziny po zabiegu. Umiejscowienie wzmacniacza EEG na grzbiecie zwierzęcia jest główną trudnością w jednoczesnym nagrywaniu. Projekt i produkcja kamizelki są specjalnie oparte na wielkości zwierząt. Kamizelka musi umożliwiać naturalny ruch gryzonia (zob . rys. 5). To ostatnie zagwarantuje główną zaletę techniki, jaką jest rejestrowanie swobodnych ruchów. Ponieważ zwierzęta nie próbowały zdjąć kamizelki, łącznika głowy ani kabli po operacji i w kolejnych dniach, przypuszczano, że konfiguracja nie powodowała znacznego ograniczenia ruchu ani nie powodowała bólu lub dyskomfortu. Dla prawidłowej segmentacji EEG w epokach na podstawie zdarzeń oznaczonych przez BTS obowiązkowe jest zapisanie dobrze zdefiniowanego protokołu. Znaczniki tymczasowe mogą być scalane przez manipulację szeregami czasowymi, ponieważ oba systemy używają tego samego zegara do ustawiania swoich znaczników czasu. Powyższe rozszerza możliwości eksperymentów na zwierzętach z wykorzystaniem danych elektrofizjologicznych do analizy.
Przedstawiona tutaj technika może być stosowana w dowolnym obszarze badań neurobiologicznych i z najczęstszymi gatunkami myszy, a nawet innymi gatunkami. Wszechstronność oprogramowania do śledzenia zachowań jest jedną z najważniejszych zalet, ponieważ może być stosowana w dużej wszechstronności labiryntów, takich jak labirynt wodny Morrisa, otwarte pole, rozpoznawanie nowatorskich obiektów, uwarunkowane preferencje miejsca, tablica otworów, labirynt podwyższony plus, labirynt Y, labirynt promieniowego ramienia, labirynt Barnesa i inne. Może być używany do 16 kamer jednocześnie. Ponadto można podać setki różnych środków (bardziej szczegółowe informacje znajdują się w podręcznikach31,32). Weź pod uwagę, że ta praca opisuje eksperymenty z zapisami EEG, możliwe są inne techniki, takie jak potencjały pól lokalnych lub zapis pojedynczej jednostki. Użytkownicy muszą jednak wziąć pod uwagę, że ogólna konfiguracja i kilka kroków przygotowawczych muszą ulec zmianie w innych celach. Tak więc, gdy technika ta jest stosowana razem z zapisem EEG Wi-Fi, możliwości są rozszerzone, ponieważ dodaje nowe perspektywy do badań na zwierzętach, takich jak te przeprowadzane na ludziach, w celu oceny kilku cech integracji i dynamiki EEG, takich jak łączność, moc pasma EEG lub wywołane reakcje. W przeciwieństwie do ludzi, eksperymenty na zwierzętach są możliwe do oceny podawania leków, modyfikacji genów lub ekspresji, wśród wielu innych paradygmatów eksperymentalnych. W przypadku analizy EEG należy wziąć pod uwagę, że niektóre protokoły mają bardzo małą liczbę powtórzeń pożądanych zachowań, co ogranicza możliwość uśrednienia odpowiedzi i uzyskania wiarygodnych wyników. Dlatego należy zachować ostrożność, aby zaprojektować protokoły nagrywania i analizy, które uważa się za wykonane, przed rozpoczęciem eksperymentu. Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę, że praca w eksperymentach na zwierzętach nie jest możliwa, aby zapobiec ruchowi, co zwiększa złożoność protokołu eksperymentalnego i rozważań dotyczących analizy sygnałów i zadań behawioralnych. Obecnie sprzęt do pełnych systemów śledzenia i zapisów EEG nie jest ustandaryzowany ani modułowy, co oznacza, że ich konfiguracja jest przeznaczona do jednego protokołu i adaptacji do badania innych zadań behawioralnych, co implikuje/sugeruje wyższe koszty dla dużej liczby laboratoriów. Sytuację tę można rozwiązać, postępując zgodnie z opcjami opisanymi w tym badaniu. Niemniej jednak można wprowadzić kilka ulepszeń w celu uzyskania bardziej wiarygodnych eksperymentów. Pracę można usprawnić na kilku etapach, począwszy od produkcji elektrod, poprzez przetwarzanie behawioralne i sygnały. Niemniej jednak wykazano, że śledzenie zwierząt i pozyskiwanie EEG jest możliwe przy użyciu niedrogiego, zaawansowanego technologicznie, ale niedrogiego zestawu.
Podsumowując, niniejsza praca jest próbą pomocy naukowcom, szczególnie w dziedzinie neuronauk, w stosowaniu tych dwóch technik, które nie są powszechnie stosowane w połączeniu. Technika jednoczesnego rejestrowania EEG i testów behawioralnych przy użyciu oprogramowania do śledzenia zachowań ma wiele zalet i może być szczególnie przydatna w wielu dziedzinach neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci. Biorąc pod uwagę, że ten sprzęt ma inne możliwości, takie jak głębokie rejestrowanie struktur podkorowych, takich jak hipokamp, ale jak wspomniano, zmieni się kilka kroków przygotowawczych. Sprzęt bezprzewodowy rozwiązuje prawie wszystkie ograniczenia konwencjonalnego podejścia przewodowego, takie jak problemy z przemieszczaniem się zwierząt z jednej klatki do drugiej, utrudnione lub zaplątane zwierzęta w kable. Ta technika konfiguracji jest przyjazna dla użytkownika, jak opisano powyżej, a prawie nieprzeszkolona lub niewyspecjalizowana grupa ekspertów lub osób może korzystać z tego oprogramowania. Cena sprzętu EEG jest niższa niż zwykłego wzmacniacza EEG. Oprogramowanie do śledzenia zachowań jest również jednym z najbardziej przystępnych cenowo programów do śledzenia wideo na rynku. To oprogramowanie wymaga licencji rocznych. Sprzęt może być używany w więcej niż jednej konfiguracji eksperymentalnej, różnych zwierzętach i rodzaju wszechstronności. Mamy nadzieję, że ten wysiłek pomoże społeczności naukowej i zapewni łatwy dostęp do jednoczesnego badania zachowania i elektroencefalografii.
Oświadczenia
Dr Sylvia Ortega-Martinez pracuje jako pracownik Stoelting Co., firmy, która zapewniła i sponsorowała produkcję i otwarty dostęp do tego artykułu.
Podziękowania
Chcemy podziękować Panu Miguelowi Burgosowi i Panu Gustavo Lago za udzielenie pomocy technicznej. Jesteśmy wdzięczni firmie Stoelting Co. za pokrycie kosztów produkcji wideo, firmie Jinga-hi, Inc. za udzielenie pomocy technicznej oraz División de Investigación y Posgrado z Universidad Iberoamericana Ciudad de México za przyznanie funduszy na te prace.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #2 Obrotowa końcówka narzędziowa o zmiennej prędkości | Zmień kolejność #310048, Długość 44,5 mm | SS Biała | Do wykonywania otworów, w które zostaną wkręcone |
| #4 Skalpel i ostrze | |||
| 50 X 50 X 50 cm Open Field Mate Arena 8-pinowa obudowa gniazda | |||
| żeńska | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
| 8-pinowa obudowa gniazda męska | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
| Żywica akrylowa | MDC Dental | NicTone | Do mocowania do czaszki |
| Oprogramowanie do śledzenia wideo ANY-maze | Stoelting, Co. | wersja 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
| roztwór antyseptyczny chlorku benzalkoniowego | Zaciski | Benzal Benzal | |
| Bulldog | Cientifica VelaQuin | Do cofania skóry | |
| Aparat fotograficzny | Logitech | c920 | |
| Drut | |||
| Styk zaciskany | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
| Komputer Dell | |||
| Dell JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
| Ketamina | PiSA Agropecuaria | ANESKET | Do znieczulenia |
| MATLAB | R2020a | MathWorks | Script został opracowany we współpracy z Jinga-Hi, Inc. |
| Monomer | MDC Dental | NicTone | Do mocowania do czaszki |
| Oprogramowanie Neurophys | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
| Śruba | Do wkładania w czaszkę | ||
| wyposażone w elektrodę | |||
| Przyrząd | stereotaktycznyKOPF | Do zabiegu Narzędzie obrotowe | |
| o zmiennej prędkości | Dremel 3000 | Dremel | Do wykonywania otworów, w które zostaną wkręcone |
| Woltomierz | PROAM | MUL-040 | Do potwierdzenia, że elektroda przewodzi prąd |
| Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | Do znieczulenia |
Bibliografia
- Hånell, A., Marklund, N. Structured evaluation of rodent behavioral tests used in drug discovery research. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-13 (2014).
- Buenrostro-Jáuregui, M., et al. SEXRAT MALE: A smartphone and tablet application to annotate and process live sexual behavior in male rodents. Journal of Neuroscience Methods. 320, 9-15 (2019).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term behavioral tracking of freely swimming weakly electric fish. Journal of Visualized Experiments. (85), e50962(2014).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871(2014).
- Zheng, W., Ycu, E. A. A fully automated and highly versatile system for testing multi-cognitive functions and recording neuronal activities in rodents. Journal of Visualized Experiments. (63), e3685(2012).
- Melo-Thomas, L., et al. A wireless, bidirectional interface for in Vivo recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats. Journal of Visualized Experiments. (129), e56299(2017).
- Noldus, L. P. J. J., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. J. Ethovision Video Tracking System. Behavior Research Methods, Instruments, and Computers. 33 (3), 398-414 (2001).
- Datta, S. R., Anderson, D. J., Branson, K., Perona, P., Leifer, A. Computational Neuroethology: A Call to Action. Neuron. 104 (1), 11-24 (2019).
- Medlej, Y., et al. Enhanced setup for wired continuous long-term EEG monitoring in juvenile and adult rats: application for epilepsy and other disorders. BMC Neuroscience. 20, 8(2019).
- Weiergräber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
- Etholm, L., Arabadzisz, D., Lipp, H. P., Heggelund, P. Seizure logging: A new approach to synchronized cable-free EEG and video recordings of seizure activity in mice. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 254-260 (2010).
- Jinga-hi. JAGA16 Wireless Electrophysiology Recording Device. , Available from: https://www.jinga-hi.com/hardware-jaga16 1(2020).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Bruel-Jungerman, E., Laroche, S., Rampon, C. New neurons in the dentate gyrus are involved in the expression of enhanced long-term memory following environmental enrichment. European Journal of Neuroscience. 21 (2), 513-521 (2005).
- Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667(2019).
- Trinchero, M. F., Herrero, M., Monzón-Salinas, M. C., Schinder, A. F. Experience-Dependent Structural Plasticity of Adult-Born Neurons in the Aging Hippocampus. Frontiers in Neuroscience. 13, 739(2019).
- Shors, T. J., et al. Erratum: Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories (Nature (2001) 410 (372-376)). Nature. 414 (6866), 938(2001).
- Song, H., et al. New neurons in the adult mammalian brain: Synaptogenesis and functional integration. Journal of Neuroscience. 25 (45), 10366-10368 (2005).
- Zhao, C., Teng, E. M., Summers, R. G., Ming, G. L., Gage, F. H. Distinct morphological stages of dentate granule neuron maturation in the adult mouse hippocampus. Journal of Neuroscience. 26 (1), 3-11 (2006).
- Irvine, G. I., Logan, B., Ecket, M., Abraham, W. C. Enriched environment exposure regulates excitability, synaptic transmission, and LTP in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 16 (2), 149-160 (2006).
- Tashiro, A., Makino, H., Gage, F. H. Experience-specific functional modification of the dentate gyrus through adult neurogenesis: A critical period during an immature stage. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3252-3259 (2007).
- Moreno-Jiménez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavioural Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Fagan, J. Memory in the infant. Journal of Experimental Child Psychology. 9 (2), 217-226 (1970).
- Baxter, M. G., et al. I've seen it all before" Explaining age-related impairments in object recognition. Theoretical comment on Burke et al. Behavioral Neuroscience. 124 (5), 706-709 (2010).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: Neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 31 (1), 47-59 (1988).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Forwood, S. E., Winters, B. D., Bussey, T. J. Hippocampal lesions that abolish spatial maze performance spare object recognition memory at delays of up 48 hours. Hippocampus. 15 (3), 347-355 (2005).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Stoelting Co. Getting started with ANY-maze Setting up and starting work with ANY-maze. , Available from: https://www.braintreesci.com/images/ANYMaze.pdf (2006).
- Stoelting Co. A detailed description of the ANY-maze measures. , Available from: https://www.anymaze.co.uk/a-detailed-description-of-the-any-maze-measures.pdf (2010).
Przedruki i uprawnienia
