Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61501

⸱

15 czerwca 2020

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu malformacji żylnej. Model ten opiera się na podskórnym wstrzyknięciu komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta zawierających hiperaktywujące mutacje genu TIE2 i/lub PIK3CA. Zmiany ksenoprzeszczepowe ściśle odwzorowują cechy histopatologiczne tkanki pacjenta z VM.

Streszczenie

Malformacja żylna (VM) to anomalia naczyniowa, która powstaje w wyniku upośledzonego rozwoju sieci żylnej, co skutkuje rozszerzonymi i często dysfunkcyjnymi żyłami. Celem tego artykułu jest dokładne opisanie procesu tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu, który naśladuje ludzką maszynę wirtualną i jest w stanie odzwierciedlić heterogeniczność pacjenta. Hiperaktywujące niedziedziczne (somatyczne) mutacje TEK (TIE2) i PIK3CA w komórkach śródbłonka (EC) zostały zidentyfikowane jako główne czynniki powodujące patologiczne powiększenie naczyń w VM. Poniższy protokół opisuje izolację, oczyszczanie i ekspansję pochodzącego od pacjenta mutanta EC wykazującego ekspresję TIE2 i/lub PIK3CA. Te EC są wstrzykiwane podskórnie w plecy myszy z niedoborem odporności w celu wytworzenia ektatycznych kanałów naczyniowych. Zmiany powstałe za pomocą EC z mutacją TIE2 lub PIK3CA ulegają widocznemu unaczynieniu w ciągu 7–9 dni od wstrzyknięcia i przypominają cechy histopatologiczne tkanki pacjenta VM. Ten model ksenoprzeszczepu VM stanowi niezawodną platformę do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych napędzających powstawanie i ekspansję VM. Ponadto model ten będzie miał zasadnicze znaczenie dla badań translacyjnych testujących skuteczność nowych kandydatów na leki w zapobieganiu nieprawidłowemu powiększeniu naczyń krwionośnych obserwowanemu u ludzi.

Wprowadzenie

Wady w rozwoju układu krwionośnego są podstawową przyczyną wielu chorób, w tym malformacji żylnej (VM). VM jest chorobą wrodzoną charakteryzującą się nieprawidłową morfogenezą i rozszerzaniem się żył1. Ważne badania nad tkankami VM i komórkami śródbłonka (EC) zidentyfikowały mutacje związane ze wzmocnieniem funkcji w dwóch genach: TEK, który koduje receptor kinazy tyrozynowej TIE2, oraz PIK3CA, który koduje izoformę p110α (podjednostka katalityczna) kinazy PI3 (PI3K)2,3,4,5. Te mutacje somatyczne powodują niezależną od ligandu hiperaktywację kluczowych szlaków sygnałowych angiogennych/wzrostu, w tym PI3K/AKT, co skutkuje rozszerzeniem żył ektatycznych 3. Pomimo tych ważnych odkryć genetycznych, późniejsze mechanizmy komórkowe i molekularne wywołujące nieprawidłową angiogenezę i powstawanie rozszerzonych kanałów naczyniowych nadal nie są w pełni poznane.

Podczas normalnej i patologicznej angiogenezy, nowe naczynia wyrastają z istniejącej wcześniej sieci naczyniowej, a EC przechodzi sekwencję ważnych procesów komórkowych, w tym proliferację, migrację, przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i tworzenie światła6. Dwu- i trójwymiarowe (2D/3D) hodowle in vitro EC są ważnymi narzędziami do indywidualnego badania każdej z tych właściwości komórkowych. Niemniej jednak istnieje wyraźne zapotrzebowanie na mysi model rekapitulujący patologiczne powiększenie naczyń krwionośnych w mikrośrodowisku gospodarza, zapewniając jednocześnie skuteczną platformę do oceny przedklinicznej leków celowanych do badań translacyjnych.

Do tej pory, transgeniczny mysi model VM związany z mutacjami TIE2 gain-of-function nie został zgłoszony. Obecne transgeniczne modele myszy VM opierają się na wszechobecnej lub ograniczonej tkankowo ekspresji mutacji aktywującej PIK3CA p.H1047R3,5. Te transgeniczne zwierzęta dostarczają istotnych informacji na temat skutków tej mutacji PIK3CA na całe ciało lub tkanki. Ograniczeniem tych modeli jest tworzenie się wysoce patologicznej sieci naczyniowej skutkującej wczesną śmiertelnością. W związku z tym te mysie modele nie odzwierciedlają w pełni sporadycznego występowania zdarzeń mutacyjnych i zlokalizowanego charakteru patologii VM.

Wręcz przeciwnie, modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów opierają się na przeszczepianiu lub wstrzykiwaniu patologicznej tkanki lub komórek pochodzących od pacjentów myszom z niedoborem odporności7. Modele ksenoprzeszczepów są potężnym narzędziem do poszerzania wiedzy na temat rozwoju chorób i odkrywania nowych środków terapeutycznych8. Ponadto wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów pozwala naukowcom na podsumowanie heterogeniczności mutacji w celu zbadania spektrum fenotypów pacjentów.

Tutaj opisujemy protokół, w którym pochodząca od pacjenta VM EC, która wyraża zmutowaną, konstytutywnie aktywną formę TIE2 i/lub PIK3CA, jest wstrzykiwana podskórnie w plecy atymicznym nagim myszom. Wstrzyknięte komórki naczyniowe są zawieszone w ramie ECM w celu promowania angiogenezy, jak opisano w poprzednich modelach ksenoprzeszczepów naczyniowych9,10,11. Te VM EC ulegają znaczącej morfogenezie i generują powiększone, perfundowane naczynia patologiczne przy braku komórek podporowych. Opisany model ksenoprzeszczepu VM stanowi wydajną platformę do przedklinicznej oceny leków celowanych pod kątem ich zdolności do hamowania niekontrolowanego rozszerzania się światła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki tkanek pacjentów zostały pobrane od uczestników po świadomej zgodzie z Collection and Repository of Tissue Samples and Data from Patients with Nowotwors and Vascular Anomalies (zatwierdzonej Institutional Review Board (IRB) zgodnie z polityką instytucjonalną w Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute oraz za zgodą Komitetu ds. Badań Klinicznych. Wszystkie opisane poniżej procedury na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt CCHMC.

1. Przygotowanie materiałów i roztworów podstawowych

  1. Przygotowanie kompletnego podłoża do wzrostu komórek śródbłonka (EGM)
    1. Uzupełnij śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM) w następujące czynniki wzrostu obecne w zestawie (patrz tabela materiałów): ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-beta (hFGF-β), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), długi insulinopodobny czynnik wzrostu Arg3 I (R3-IGF-I), kwas askorbinowy, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), siarczan gentamycyny i amfoterycyna-B oraz heparyna. Dodać 1% roztwór penicyliny/streptomycyny/L-glutaminy (PSG) i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
      UWAGA: Nie zalecamy dodawania hydrokortyzonu.
    2. Sterylnie przefiltrować roztwór pod okapem z przepływem laminarnym przez górny filtr butelkowy 0,2 μm do autoklawowanej szklanej butelki, a podwielokrotną pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia lub w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
  2. Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy A
    1. Przygotować 50 mg/ml roztworu podstawowego kolagenazy A w 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS).
    2. Sterylnie przefiltrować roztwór pod okapem z przepływem laminarnym z filtrem 0,2 μm i strzykawką i przechowywać 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować pożywkę do pobierania tkanek (bufor A)
    1. Przygotować roztwór podstawowyCa2+/Mg2+, dodając 0,927 g dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl 2,2H2O) i 1 g siedmiowodnego siarczanu magnezu (MgSO,4,7H2O) do 500 ml wody destylowanej. Sterylnie przefiltrować roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm do autoklawizowanej szklanej butelki i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Uzupełnij zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o 10% roztworu Ca2+/Mg2+ i 2% FBS.
    3. Sterylnie przefiltrować roztwór pod okapem z przepływem laminarnym z filtrem 0,2 μm i strzykawką i przechowywać porcje 5 ml w temperaturze -20 °C.
  4. Powłoka fibronektyny na płytkach do hodowli tkankowych
    1. Przygotować bufor powlekający (bufor B) rozpuszczając 5,3 g węglanu sodu (Na2CO3; 0,1 M) w 500 ml wody dejonizowanej. Doprowadzić pH buforu do 9,4 przy użyciu 1 M kwasu solnego (HCl). Przefiltrować pod okapem z przepływem laminarnym przez filtr butelkowy 0,2 μm do autoklawizowanej szklanej butelki i przechowywać w temperaturze RT.
    2. Do powlekania należy odpipetować odpowiednio 2 ml/5 ml/10 ml buforu B na płytkę do hodowli tkankowej 60 mm/100 mm/145 mm. Dodać 1 μg/cm2 oczyszczonego roztworu białka fibronektyny z ludzkiego osocza i delikatnie rozprowadzić płyn na płytce.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 min.
    4. Odessać bufor B i umyć płytkę PBS przed hodowlą komórek.

2. Izolacja komórek śródbłonka z tkanki pacjenta VM

  1. Izolacja EC z tkanki stałej VM
    UWAGA: Tkanka VM jest wycinana metodą chirurgii odciążającej12,13 zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB.
    1. Umyj tkankę VM (masa próbki tkanki zwykle waha się od 0,5 g do 1,5 g) w 5% PSG w PBS.
    2. Przenieś tkankę do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm, zmiel próbkę tkanki na małe kawałki za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych do preparacji i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Dodać 100 μl roztworu podstawowego kolagenazy A do 5 ml buforu A dla końcowego stężenia 1 mg/ml, następnie dodać do tkanki i trawić zmieloną tkankę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wstrząsając zawartością co 5 minut.
    4. Ostrożnie zmiel strawioną tkankę w temperaturze pokojowej za pomocą młynka o gładkiej powierzchni o średnicy 6 mm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    5. Kontynuuj ostrożne mielenie strawionej tkanki za pomocą tłuczka, dodając 5 ml zimnego PBS uzupełnionego 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2% PSG. Powtórz ten krok cztery razy.
    6. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia fragmentów tkanki.
    7. Zawiesinę komórek wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Przejść do kroku 2.3.
  2. Izolacja VM EC z krwi chorobowej uzyskanej ze skleroterapii pacjenta
    1. Pozyskanie ludzkiej krwi zmienionej VM ze skleroterapii zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB.
    2. Rozcieńczyć krew chorobową (objętość próbki zwykle waha się od 0,5 ml do 5 ml) w PBS do końcowej objętości 40 ml.
    3. Zawiesinę komórek wirowych przez 5 minut przy 200 x g przy temperaturze pokojowej.
  3. Wstępne posiewanie ogniw
    1. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić jednokomórkowy osad w 1 ml EGM.
    2. Dodać 9 ml kompletnego EGM na pokryte fibronektyną (1 μg/cm²) płytki o średnicy 100 mm i zasiać 1 ml zawiesiny komórkowej.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
    4. Co drugi dzień usuwaj 2 ml pożywki i dodawaj 2 ml sterylnego, przefiltrowanego FBS.
    5. Gdy hodowle komórkowe osiągną konfluencję 40–50%, zmień pożywkę, aby ukończyć EGM. Zazwyczaj potrzeba od 2 do 3 tygodni, aby komórki osiągnęły to zbieganie.
    6. Codziennie obserwować pojawienie się kolonii EC. Można je rozpoznać po typowej "brukowatej" morfologii (Rysunek 1A). W każdej próbce pojawia się od 3\u20125 kolonii EC.
    7. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień przez kolejne 5-7 dni, aż poszczególne kolonie EC zaczną się ze sobą stykać.
  4. Ręczna izolacja poszczególnych kolonii EC
    1. Aby zebrać kolonie EC, umyj płytkę 5 ml PBS i ręcznie odessaj pipetą serologiczną.
    2. Weź płytkę do mikroskopu i zakreśl lokalizacje wielu kolonii EC za pomocą pisaka do znakowania zarówno na pokrywie, jak i na dole, zanim włożysz ją z powrotem do okapu z przepływem laminarnym.
    3. Odłączyć kolonie EC, pipetując 50 μl 0,05% roztworu trypsyny-EDTA na zaznaczone obszary.
    4. Za pomocą skrobaka do małych komórek lub końcówki do pipety delikatnie zeskrob komórki z płytki.
    5. Przechylić płytkę do najbliższej krawędzi i spłukać 1 ml EGM na zaznaczony obszar i zebrać komórki.
    6. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    7. Zebrane kolonie EC należy poszczepić w gęstości 1 x 104 komórki/cm2 na pokrytych fibronektyną (1 μg/cm²) szalkach do hodowli komórkowych zawierających świeży EGM. Następnego dnia zmień medium, aby zakończyć NWZ.
    8. Zmieniaj pożywkę, aby ukończyć NWZ co drugi dzień przez 2–3 tygodnie, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
    9. Trypsynizować EC za pomocą 2 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA na 100 mm naczynie w temperaturze 37 °C przez 2 minuty i neutralizować trypsynę, dodając 4 ml EGM.
    10. Zebrać zawiesinę komórek do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml EGM.
    11. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Typowa liczba uzyskiwanych komórek to 1 x 106 komórek na 60 mm płytki do hodowli komórkowej lub 2 x 106 komórek na 100 mm płytki do hodowli tkankowej.
    12. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odsysać supernatant. Przejdź do kroku 3.2.1.

3. Selekcja i ekspansja komórek śródbłonka

  1. Przygotowanie koralików magnetycznych sprzężonych z anty-CD31
    1. Wirować fiolkę zawierającą kulki magnetyczne sprzężone z anty-CD31 przez 30 sekund. Wymagana liczba koralików to 8 x 106 koralików/2 x 106 komórek.
    2. Przemyć żądaną ilość kulek magnetycznych sprzężonych z anty-CD31 1 ml roztworu płuczącego zawierającego 0,1% BSA w PBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Umieść probówkę mikrowirówki w magnesie izolującym komórki na 1 minutę.
    4. Odessać supernatant i powtórzyć etap mycia.
  2. Oczyszczanie i powlekanie komórek śródbłonka
    1. Zawiesić osad komórkowy otrzymany w 2.4.12 w 500 μl roztworu płuczącego zawierającego 0,1% BSA w PBS.
    2. Dodać roztwór komórkowy do probówki mikrowirówkowej zawierającej kulki magnetyczne i dokładnie zawiesić.
    3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie przechylając.
    4. Dodaj 500 μl 0,1% BSA do PBS i dobrze wymieszaj.
    5. Umieść rurkę na magnesie izolującym komórki na 1 minutę.
    6. Delikatnie odessaj cały płyn, który zawiera CD31-ujemną frakcję komórek, nie dotykając kulek.
    7. Przemyć granulkę kulki zawierającą CD31-dodatnią frakcję komórkową 1 ml 0,1% BSA w PBS i powtórzyć separację magnetyczną.
    8. Powtórz etap mycia i separacji magnetycznej co najmniej 3 razy, aby oczyścić frakcję komórek CD31-dodatnich.
    9. Ponownie zawiesić oczyszczone komórki śródbłonka w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 400 x g przy wilgotności względnej.
    10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml EGM.
    11. Dodać 9 ml kompletnego EGM na pokryte fibronektyną (1 μg/cm²) płytki o średnicy 100 mm i zasiać 1 ml zawiesiny komórkowej. Zwróć uwagę, że niektóre kulki magnetyczne są nadal przymocowane do komórek w tym początkowym etapie wysiewu. Większość koralików zmywa się podczas ekspansji komórek, ale niewielka liczba koralików może utrzymywać się we wczesnych przejściach.
    12. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
    13. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 80% zbieżność (ryc. 1B).
  3. Ekspansja komórek śródbłonka
    1. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odłącz je od 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA na 100 mm naczynia w temperaturze 37 °C na 2 minuty.
    2. Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml EGM i zbierz komórki do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy 400 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 min.
    4. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 2 ml EGM i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego zliczania komórek.
    5. Komórki nasienne o gęstości 1 x 104 komórki/cm² na płytki do hodowli tkankowej o średnicy 145 mm pokryte fibronektyną (1 μg/cm²).
    6. Kontynuuj przechodzenie przez komórki, aż zostanie osiągnięta żądana liczba komórek. Weź pod uwagę, że zlewająca się płytka do hodowli tkankowej o średnicy 145 mm zawiera około 8\u20129 x 106 komórek, a liczba potrzebnych komórek wynosi 2,5 x 106 komórek na wstrzyknięcie. Do ksenoprzeszczepu należy brać pod uwagę tylko komórki między pasażem 3 i 8.

4. Protokół ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta VM

UWAGA: W tym protokole używamy 5\u20126 tygodniowych, męskich myszy z niedoborem odporności, atymicznych nagich myszy Foxn1nu.

Wszystkie procedury dla zwierząt muszą być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

  1. Przygotowanie materiałów na dzień przed wstrzyknięciem
    1. Strzykawki, igły i końcówki pipet schłodzić w zamrażarce w temperaturze -20°C przez noc.
    2. Powoli rozmrażaj macierz zewnątrzkomórkową błony podstawnej (BMEM) przez noc na wiadrze z lodem umieszczonym w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zwiększonej lepkości żelu.
  2. Przygotowanie zawiesiny komórek do wstrzykiwań
    1. Trypsynizuj EC za pomocą 5 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA na 145 mm naczynie w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    2. Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 ml EGM i zbierz komórki do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy 400 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 min.
    4. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 3 ml EGM i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    5. Określ całkowitą liczbę komórek, które są potrzebne do wszystkich planowanych wstrzyknięć.
      UWAGA: Zalecana liczba komórek to 2,5 x 106 komórek na wstrzyknięcie. W sumie w każdej myszy zwykle wykonuje się 2 wstrzyknięcia w przypadku duplikatów technicznych. Konieczne jest obliczenie 10% nadwyżki liczby komórek, aby uwzględnić stratę podczas transferu do strzykawki.
    6. Przenieść objętość zawierającą obliczoną liczbę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i kuwety osadu przez odwirowanie przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    7. Odessać supernatant, pozostawiając niewielką objętość (około 50\u201270 μl) w celu poluzowania osadu.
  3. Przygotowanie strzykawki
    1. Obliczyć nadmiar objętości wynoszący 20 μl/wstrzyknięcie, aby uwzględnić straty podczas przenoszenia do strzykawki. Zawiesić osad komórkowy z 220 μl BMEM na wstrzyknięcie na lód. Wstrzyknięta objętość zawiesiny komórkowej będzie wynosić 200 μl na zmianę.
    2. Zawiesinę komórkową dokładnie wymieszać na lodzie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek i uniknąć tworzenia pęcherzyków.
    3. Używając pipety o pojemności 1 ml i strzykawki o pojemności 1 ml, jednocześnie odpipetować mieszaninę komórek BMEM do otworu strzykawki za pomocą siły ssącej, jednocześnie pociągając za tłok strzykawki.
    4. Luer przymocować sterylną igłę o wymiarach 26G x 5/8 cala do strzykawki i trzymać przygotowane strzykawki płasko na lodzie przed wstrzyknięciem.
  4. Wstrzyknięcie podskórne myszowi
    1. Znieczulić myszy 5% mieszaniną izofluranu i tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min za pomocą parownika izofluranu. Zapewnij zwierzętom odpowiednie uspokojenie (np. brak reakcji na szczypanie palców). Utrzymuj znieczulenie poprzez ciągłe podawanie 1,5% izofluranu/tlenu dostarczanego przez stożek nosowy.
    2. Umieść myszy na brzuchu, odsłaniając tylny obszar, w którym nastąpi szczepienie, i zdezynfekuj obszar wstrzyknięcia 70% etanolem.
    3. Delikatnie zwinąć przygotowaną strzykawkę, aby ponownie zawiesić osiadłe komórki. Przesunąć pęcherzyki do końca igły strzykawki i usunąć niewielką objętość zawiesiny komórek, aby zapewnić usunięcie wszystkich pęcherzyków.
      UWAGA: Dla każdej myszy można wykonać dwa wstrzyknięcia – po lewej i prawej stronie pleców myszy.
    4. Uszczypnij i stwórz strukturę przypominającą namiot za pomocą kciuka i palca wskazującego, a następnie wbij igłę podskórnie tuż pod skórę. Upewnij się, że igła znajduje się tylko na głębokości skóry, uwalniając ściśniętą skórę, aby zapobiec wstrzyknięciu do tkanki mięśniowej.
    5. Trzymając igłę pod kątem 45°, ostrożnie wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórek, aby utworzyć małą kulistą masę (Rysunek 1C).
    6. Zapisz wagę myszy za pomocą wagi, przyłóż kolczyk do uszu myszy i wróć do klatki.
    7. Monitoruj myszy po sedacji, aby upewnić się, że wracają do normalnej aktywności.
  5. Monitorowanie wzrostu zmian chorobowych
    1. Za pomocą suwmiarki zmierz długość i szerokość każdej wtyczki (Rysunek 1D).
    2. Dokumentuj pomiary co drugi dzień, aż do pobrania zmian.

5. Pobieranie i przetwarzanie tkanek

  1. Eutanazja myszy 9 dni po implantacji w komorze CO2 i sprawdzenie parametrów życiowych w celu potwierdzenia śmierci. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy u myszy jako drugorzędną metodę eutanazji myszy.
  2. Pobrać zmianę/czop ksenoprzeszczepu z boku myszy przez preparację za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek.
    UWAGA: Aby zapobiec pękaniu naczyń krwionośnych w zatoce, ważne jest, aby unikać dotykania czopu zmian za pomocą narzędzi do preparowania i pozostawiać nadmierną ilość otaczających tkanek, takich jak skóra, przyczepionych do zatyczki.
  3. Zanurz wyciętą zmianę w PBS do umycia.
  4. Skonfiguruj scenę z kamerą z kamerą. Dopasuj zaślepki do deski do krojenia za pomocą linijki. Zrób zdjęcie wszystkich zatyczek, aby zarejestrować duże unaczynienie zmian (Rysunek 1E).
  5. Napraw zatyczki, zanurzając się w 10% formalinie na noc w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj korki w PBS następnego dnia i przenieś je do 70% etanolu.
  7. Procesowe korki zmian chorobowych do zatapiania parafiny (rdzeń patologiczny).

6. Sekcja zmian chorobowych

  1. Za pomocą mikrotomu wyciąć skrawki o grubości 5 μm z zebranych zmian mysich na dodatnio naładowane szkiełka.
    UWAGA: Dla późniejszej analizy znaczenie mają skrawki w środku czopa (około 50\u201270 μm w głąb tkanki).
  2. Rozpuść parafinę w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę przed barwieniem.
  3. Odparafinować i ponownie nawadniać tkankę sekwencyjnie pod okapem do odprowadzania oparów chemicznych. Dlatego inkubować szkiełko w ksylenie przez 10 minut, 100% etanolu (EtOH) przez 5 minut, 90% EtOH przez 3 minuty i 80% EtOH przez 3 minuty.
  4. Płukać szkiełko w wodzie dejonizowanej przez 5 min.

7. Hematoksylina i eozyna (H&E)

  1. Inkubować skrawki w Hematoxylinie przez 2 min.
  2. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia i spłucz w zlewie stałym strumieniem wody z kranu, aż woda będzie czysta
    3. .
  3. Odwodnić szkiełka poprzez sekwencyjną inkubację tkanek w 70% EtOH przez 1 min, 80% EtOH przez 1 min, 90% EtOH przez 1 min, 100% EtOH przez 1 min i świeżej 100% EtOH przez 1 min.
  4. Skrawki bejcowania w Eosin Y przez 30 s.
  5. Spłucz świeżym 100% EtOH, aż roztwór będzie klarowny.
  6. Inkubować szkiełko w ksylenach przez 2 minuty. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 5–10 minut pod wyciągiem.
  7. Naniec kroplę trwałego, niewodnego podłoża mocującego na skrawki ksenoprzeszczepów i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
  8. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem.

8. Immunohistochemia

  1. Przygotować bufor do odzyskiwania antygenu (Tris-EDTA), ważąc 0,6 g zasady Tris i 1 ml 0,5 M EDTA na 500 ml wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 9,0 za pomocą 1 M HCl. Dodaj 250 μl Tween-20.
  2. Inkubować odparafinizowane szkiełka tkankowe (jak uzyskano w kroku 6.2-6.3) w zlewce z buforem do pobierania antygenu, mieszając na bloku grzewczym, przez 20 minut w temperaturze 95 °C.
  3. Wyjąć zlewkę z bloku grzewczego, pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 35 °C, a następnie myć w PBS przez 3 minuty.
  4. Zablokuj skrawki tkanek w 5% normalnej surowicy końskiej w PBS przez 30 minut w RT.
  5. Przygotować biotynylowany roztwór roboczy Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I), rozcieńczając 20 μg/ml biotynylowanego UEA-I w 5% normalnej surowicy końskiej w PBS.
  6. Odpipetować 50\u2012100 μl roztworu roboczego UEA-I na sekcję i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w komorze nawilżającej.
  7. Umyj szkiełka dwa razy w PBS przez 3 minuty.
  8. Ugasić sekcje szkiełka w 3% nadtlenku wodoru przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Umyj szkiełka dwa razy w PBS przez 3 minuty.
  10. Przygotować 5 μg/ml peroksydazy chrzanowej streptawidyny sprzężonej z 5% normalną surowicą końską w PBS.
  11. Odpipetować 50\u2012100 μl na każde szkiełko tkankowe i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w komorze nawilżającej.
  12. Umyj szkiełka dwa razy w PBS przez 3 minuty.
  13. Przygotować roztwór 3,3'diaminobenzydyny (DAB) zgodnie z instrukcjami producenta i dodać 50\u2012100 μl na sekcję.
  14. Inkubuj sekcje przez 10–15 min, sprawdzając i monitorując rozwój plamy co 2–5 min.
  15. Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 3 minuty.
  16. Dodaj kroplę Hematoxyliny i inkubuj przez 3 minuty.
  17. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia i spłucz w zlewie stałym strumieniem wody z kranu, aż woda będzie czysta
    18. .
  18. Sekwencyjnie inkubować szkiełko w 80% EtOH przez 1 min, 90% EtOH przez 1 min, 100% EtOH przez 1 min i ksylenie przez 2 min.
  19. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 5–10 minut pod wyciągiem.
  20. Naniec kroplę trwałego, niewodnego podłoża mocującego na skrawki ksenoprzeszczepów i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
  21. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem.

9. Analiza kanałów naczyniowych pochodzenia ludzkiego

UWAGA: Unaczynienie zmian VM jest określane ilościowo poprzez pomiar powierzchni naczyniowej i gęstości naczyniowej. Do oceny ilościowej brane są pod uwagę tylko kanały naczyniowe UEA-I dodatnie i pochodzenia ludzkiego.

  1. Wykonaj od czterech do pięciu zdjęć na wycinek zmiany chorobowej za pomocą mikroskopu jasnego pola przy 20-krotnym powiększeniu (pola dużej mocy [HPF]). Wykonaj obrazy HPF w płaszczyźnie x w sekcji zmiany, aby uniknąć nakładania się (Rysunek 1F-H). Dołącz pasek skali do zrobionych zdjęć.
  2. Otwórz obrazy HPF na obrazie J (plik > Otwórz). Skalibruj piksele paska skali w następujący sposób. Użyj narzędzia linii prostej i przejdź przez pasek skali. Aby przeliczyć zmierzone piksele na mm, kliknij Analizuj > Ustaw skalę.
  3. Kliknij Analizuj > ustaw pomiary, a następnie wybierz Obszar i Dodaj do nakładki.
  4. Zmierz całkowitą powierzchnię pola w HPF za pomocą funkcji Analizuj > Mierz. Zapisz ten pomiar do oceny ilościowej w kroku 9.8.
  5. Korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, ręcznie obrysuj kanały naczyniowe UEA-I+.
    UWAGA: Kanał naczyniowy definiuje się jako dowolny obszar wyłożony UEA-I+ - EC, który może zawierać komórki krwi.
  6. Kliknij Analizuj > mierz, aby określić ilościowo zarysowany obszar naczyniowy UEA-I+ (mm2 / HPF).
  7. Powtórz ten pomiar dla wszystkich pięciu filtrów HPF pobranych w jednej wtyczce.
  8. Uśrednij całkowitą powierzchnię naczyniową wszystkich pięciu HPF. Uzyskany obszar naczyniowy na HPF jest następnie dzielony przez obszar pola HPF (w mm2, krok 9,5) i wyrażany w procentach (%).
  9. Aby określić ilościowo gęstość naczyń krwionośnych, policz liczbę kanałów naczyniowych UEA-I+ każdego pobranego HPF. Gęstość naczyniowa to średnia liczba kanałów naczyniowych UEA-I+ liczonych na obszar HPF (naczynia/mm2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje proces tworzenia mysiego modelu ksenograftu VM w oparciu o podskórne wstrzyknięcie EC pochodzących od pacjenta w grzbiet immunodeficyjnych myszy nago. Kolonie komórek śródbłonka można zebrać w ciągu 4 tygodni po wstępnej izolacji komórek z tkanki VM lub krwi z obszaru zmiany (Ryc. 1A,B). Dzień po wstrzyknięciu guzek ksenograftu obejmuje powierzchnię około 80‒10 mm2. W naszych badaniach guzki ksenograftów z EC z mutacją TIE2/PIK3CA ulegają widocznej waskularyzacji i u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano metodę generowania modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta VM. Ten mysi model stanowi doskonały system, który pozwala naukowcom lepiej zrozumieć patologiczne powiększenie światła i będzie miał zasadnicze znaczenie w opracowywaniu bardziej skutecznych i ukierunkowanych terapii w leczeniu VM. Można to łatwo dostosować do badania innych rodzajów anomalii naczyniowych, takich jak kapilarne malformacje żylnelimfatyczne 16. Istnieje kilka etapów, które są kluczowe dla pomy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Norze Lakes za korektę. Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi, w ramach nagrody o numerze R01 HL117952 (E.B.), będący częścią National Institutes of Health. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Atymiczne nagie myszy, (Foxn1-nu); 5-6 tygodni, samceEnvigo069(nu)/070(nu/+)Wstrzyknięcie podskórne
Biotynylowany Ulex europeaus Aglutynina-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Alaysis histologiczny
Filtr butelkowy (500 ml; 0,2 µ M)Thermo Fisher974106Hodowla komórkowa
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)BSAA7906-50MGHodowla komórkowa; Analiza histologiczna
Dwuwodny kloryd wapnia (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500GHodowla komórkowa
SuwmiarkaMikroskopia elektronowa Nauki50996491Pomiar czopa zmian chorobowych
Kulki magnetyczne sprzężone z CD31 (Dynabeads)Life Technologies11155DSeparacja
EC Sitko komórkowe (100 μ M)Greiner542000Hodowla komórkowa
Kolagenaza ARoche10103578001Hodowla komórkowa
Probówka stożkowa; polipropylen (15 mL)Greiner07 000 241Hodowla komórkowa
Probówka stożkowa; polipropylen (50 ml)Greiner07 000 239Słoik do barwienia kultur komórkowych
CoplinTed Pella21029Anlaysis
Szkło nakrywkowe (50 X 22 mm)Fisher Scientific12545EAnatomia histologiczna
DAB: Odczynnik 3,3'diaminobenzydyny (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Nakładka histologiczna
Modyfikacja pożywki Eagle's Fashion firmy Dulbecco (DMEM)Corning10-027-CVHodowla komórkowa
DynaMag-2Life Technologies12321DSeparacja EC
Dziurkacz do uszuVWR10806-286Wstrzyknięcie podskórne
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Life Technologies15575-020Nakładka histologiczna
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka-2 (EGM2) Bulletkit (podłoże podstawowe i suplementy)LonzaCC-3162Hodowla komórkowa
Eozyna Y (na bazie alkoholu)Thermo Scientific71211Nakładka
EtanolDecon Labs2716Nakładka histologiczna
Surowica bydlęca płodu (FBS) , HyCloneGE HealthcareSH30910.03Końcówka filtra do hodowli komórkowych
1,250 μ LMidSciAV1250-HWielostopniowa
końcówka filtra 20 μ LVWR10017-064Wielostopniowy
Końcówka filtra 200 μ LVWR10017-068Wieloetapowy
roztwór buforowany formaliną (10%)SigmaF04586Rozwarstwienie zatyczek lejnych
Hemacytometr (INCYTO; Jednorazowe)FOLIE SKCDHCN015Hodowla komórkowa
Wektor hematoksylinyHematoksylinaH-3401Nakładki histologiczne
Oczyszczone białko fibronektyny z ludzkiego osocza (1 mg / ml)SigmaFC010-10MGHodowla komórkowa
Roztwór nadtlenku wodoru (30% w/w)SigmaH1009Nakładka histologiczna
ImageJ OprogramowanieAnaliza
Izofluran, USPAkorn Animal Health59399-106-01iniekcji podskórnej
(MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500GHodowla komórkowa
Macierz błony podstawnej (bez czerwieni fenolu; Bez LDEV)Corning356237Wtrysk podskórny
Probówka do mikrowirówki (1,5 ml)VWR87003-294Separacja EC
Szkiełko mikroskopowe Superfrost (75mm X 25mm)Fisher Scientific1255015-CSIgły do anlayozy histologicznej
, sterylne igły 26G x 5/8 cala Sub-QBecton Dickinson (BD)BD305115Wstrzyknięcie podskórne
Normalny surowica końskaVector LaboratoriesS-2000Nakładka histologiczna
Penicylina-Streptomycyna-L-Glutamina (100X)Corning30-009-CIHodowla komórkowa
Trwałe podłoże montażowe (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Nakładka histologiczna
Rozmiar Tłuczka C, zwykłaThomas Scientific3431F55EC
izolacja buforowana fosforanem Sól fizjologiczna (PBS)Fisher ScientificBP3994Waga do hodowli komórkowych
VWR65500-202Wstrzykiwanie podskórne
Pipety serologiczne (10 ml)VWR89130-898do hodowli komórkowych
(5 ml)VWR89130-896Hodowla komórkowa
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma223530Hodowla
komórkowaStreptawidyna, Peroksydaza chrzanowa, Koncentrat, dla IHCVector LaboratoriesSA-5004hodowli komórkowych
(60ml)BD Biosciences309653Hodowla Cel
FILTR STRZYKAWKOWY (0,2 &mikro; M)Corning431219hodowli komórkowych
(1 ml z Luer Lock)Becton Dickinson (BD)BD-309628Wstrzyknięcie podskórne
Płytka poddana hodowli tkankowej (100 X 20 mm)Greiner664160Hodowla komórkowa
Płytka poddana kulturze tkankowej (145X20 mm)Greiner639160Hodowla komórkowa
Płytki poddane kulturze tkankowej (60 X 15) mmEppendorf30701119Hodowla komórkowa
Tris-base (Trizma base)SigmaT6066Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0,4 %)Life Technologies15250061Hodowla komórkowa
Trypsyna EDTA, 1X (0,05% Trypsyna/0,53 mM EDTA)Corning25-052-ClHodowla komórkowa
Tween-20Biorad170-6531Nakładka histologiczna
Butelka WheatonVWR16159-798Hodowla komórkowa
KsylenyFisher ScientificX3P-1GALAnatomia histologiczna
histologicznyhistologiczna Siarczan magnezu siedmiowodny do Pipety serologiczne Strzykawka do Strzykawki do

Bibliografia

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889(2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model malformacji żylnejizolacja komórek śródbłonkowychmutacja TIE2mutacja PIK3CAmyszy niedoboroweiniekcja podskórnaanaliza histologicznabarwienie UEA-1kwantyfikacja kanałów naczyniowych
Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.