Przewidywanie amputacji przy użyciu miejscowo krążących jednojądrzastych komórek progenitorowych u pacjentów leczonych angioplastyką z krytycznym niedokrwieniem kończyn

Choroba tętnic obwodowych (PAD) charakteryzuje się przewlekłą i postępującą niedrożnością naczyń krwionośnych z ograniczeniem dopływu krwi¹. W skali globalnej PAD kończyn dolnych dotyka około 10% populacji osób starszych, podczas gdy do 7% takich przypadków jest zgłaszanych do amputacji kończyn^2,3.

Krytyczne niedokrwienie kończyn (CLI) reprezentuje najpoważniejszą prezentację PAD¹. Pacjenci zwykle odczuwają ból w spoczynku, owrzodzenia lub zgorzel związane z niedrożnymi tętnicami; Podczas gdy rokowanie kliniczne jest niekorzystne i charakteryzuje się 30% ryzykiem amputacji kończyny i śmiertelności w ciągu 1 roku^3,4,5.

Angioplastyka to minimalnie inwazyjny zabieg wewnątrznaczyniowy, który może przywrócić przepływ krwi do kończyny dolnej u pacjentów z CLI; jednak niektórzy pacjenci nieuchronnie będą wymagać poważnej amputacji kończyny, nawet po terapii angioplastyką1^,5. Wczesna identyfikacja niekorzystnych wyników po angioplastyce jest bardzo cenna ze względu na możliwość egzekwowania terapii.

Tradycyjne czynniki ryzyka mogą zapewnić ograniczoną zdolność przewidywania dużej amputacji kończyny u pacjentów z CLI poddawanych angioplastyce⁶. Biomarkery zorientowane na patofizjologię reprezentują nowatorskie metody o potencjalnych zastosowaniach klinicznych, które mogą okazać się szczególnie przydatne w chorobach związanych z uszkodzeniem naczyń krwionośnych⁷. W dzisiejszych czasach coraz częściej uznaje się udział populacji komórkowych posiadających właściwości naprawy śródbłonka w miejscu blaszki miażdżycowej^8,9.

Jednojądrzaste komórki progenitorowe (MPC) pochodzą ze szpiku kostnego i posiadają własne strukturalne i funkcjonalne cechy komórek macierzystych o zdolnościach regeneracyjnych naczyń krwionośnych. Ze względu na zdolność MPC do namnażania się, migracji i wykazywania przylegania naczyniowego; Komórki te stały się dobrymi kandydatami do odzwierciedlenia naprawy śródbłonka w odpowiedzi na niedokrwienie^10,11,12. Ponadto ciągłe zainteresowanie mechanizmami leżącymi u podstaw uszkodzeń naczyniowych zmotywowało do zbadania prognostycznej roli miejscowo występujących biomarkerów, ponieważ uważa się, że odzwierciedlają one uszkodzenia i naprawy naczyń krwionośnych^7,13,14.

Celem niniejszego badania jest opisanie, jak określić ilość MPC, które krążą w pobliżu niedrożności naczyniowej u pacjentów z CLI poddawanych angioplastyce; oraz jak ocenić związek między MPC a wskaźnikami dysfunkcji śródbłonka i amputacji kończyny.

W porównaniu do prognozy opartej na chorobach współistniejących i wewnętrznych cechach naczyniowych, ilość lokalnych MPC wykazuje specyficzną zdolność do przewidywania wyników klinicznych dotyczących dysfunkcji śródbłonka i amputacji kończyn. Konsekwentnie, niektóre badania opisywały prognostyczną rolę podobnych biomarkerów podczas oceny pacjentów z PAD^15,16.

Na podstawie poprzednich wyników⁷, opisana tutaj metoda może być przydatna do wczesnej identyfikacji populacji zagrożonej niekorzystnymi wynikami naczyniowymi w kilku warunkach klinicznych, takich jak niedokrwienie kończyn dolnych i naczyń wieńcowych, udar, zapalenie naczyń, zakrzepica żylna i inne związane z uszkodzeniem i naprawą naczyń krwionośnych.

Instytucjonalna komisja etyki badań z Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE zatwierdziła ten prospektywny protokół, wszyscy zapisani pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Ocena bloku naczyniowego kończyny dolnej, pobieranie krwi i angioplastyka balonowa

UWAGA: Próba badawcza użyta do tego eksperymentu składała się z 20 pacjentów z cukrzycą, w wieku 68 lat, a 10 z 20 było mężczyznami. Połowę próby stanowili palacze, a najczęstszymi chorobami współistniejącymi była cukrzyca typu 2, układowe nadciśnienie tętnicze i/lub dyslipidemia. Próbka miała być standaryzowana pod kątem wieku, płci i chorób współistniejących. Nie można wykluczyć możliwego błędu systematycznego wynikającego z kliniczno-demograficznego wpływu na związek między MPC a CLI.

1. Oceń kliniczne nasilenie niedokrwienia kończyn zgodnie z klasyfikacją Rutherforda¹³ (patrz Tabela uzupełniająca 1).
2. Wykonaj angiografię kończyn dolnych, pobranie krwi i angioplastykę balonową.
   1. Przed zabiegiem należy stosować leki przeciwzakrzepowe i znieczulające.
   2. Umieść igłę 18 G w naczyniu krwionośnym w wybranym miejscu pachwiny.
   3. Umieść wprowadzacz i przesuń elastyczny przewód doprowadzający. Następnie początkowy przewodnik jest dalej zmieniany na wprowadzający 6 Fr.
   4. Stosuj okresowe wstrzykiwanie środka kontrastowego lub CO₂ pod fluoroskopowym przewodnikiem, aby zidentyfikować trajektorię tętnicy i miejsca zablokowane naczyniowo (Rysunek 1).
      UWAGA: Użyj środka kontrastowego o pojemności 40 cm3, rozcieńczonego 1:1 w 0,9% soli fizjologicznej lub CO₂ w stężeniu od 10 do 20 ml na zastrzyk pod ciśnieniem 12 psi.
   5. Wprowadzić do statku dwa przewody prowadzące nawigację 0,014 Fr i dwa przewody prowadzące podporowe 0,014 Fr i przesunąć je do zablokowanego miejsca.
      UWAGA: Dwa druty prowadzące 0,014 Fr (o długości 260 cm) są używane do nawigacji, a dwa druty doprowadzające 0,014 Fr (o długości 260 cm) służą do podparcia, podczas jednego zabiegu.
   6. Wprowadzaj kolejno 5 cewników Fr i 3 Fr i pobieraj 10 ml krwi z najbliższego miejsca niedrożności naczyniowej. Utrzymuj próbki krwi na lodzie.
      UWAGA: Rozmiary cewników mogą wynosić 5 Fr i 3 Fr i są one zmieniane podczas zabiegu.
   7. Ponownie przesuń przewód doprowadzający. Następnie wprowadź cewnik balonowy do angioplastyki, który zawiera nadmuchiwany balon umieszczony na końcu cewnika. Przesuń cewnik balonowy do angioplastyki i umieść balon bezpośrednio w miejscu zmiany. Wykonaj angioplastykę, napompowując balon na płytkę blokującą znajdującą się na ścianie naczynia. Sprawdź przywrócenie przepływu krwi.
      UWAGA: W zablokowanym obszarze można umieścić stent, aby pomóc utrzymać tętnicę otwartą po zabiegu.
   8. Wprowadzić cewnik i przejść do najbliższego miejsca bloku naczyniowego. Zbierz 10 ml krwi w 30-minutowym odstępie czasu po angioplastyce. Utrzymuj próbki krwi na lodzie.
      UWAGA: Zaleca się pobranie próbek krwi przed i po angioplastyce w celu dalszej oceny wpływu angioplastyki na liczbę MPC.
   9. Usuń wszystkie druty pod kierunkiem fluoroskopowym.
   10. Zapewnij zabiegi opieki pooperacyjnej, w tym terapię przeciwzakrzepową z użyciem enoksaparyny w dawce 1 mg/kg podskórnie co 12 godzin, aspiryny 100 mg, statyny i środka przeciwbólowego. Kompresować w miejscu nakłucia naczyń krwionośnych przez 24 godziny.

2. Kwantyfikacja krążących jednojądrzastych komórek progenitorowych (MPC) (Rysunek 2)

1. Do świeżej probówki stożkowej o pojemności 15 ml przenieść 6 ml pobranej krwi i rozcieńczyć w stosunku 1:1 (v/v) za pomocą PBS.
   UWAGA: Krew należy przetworzyć w ciągu 1 godziny od pobrania.
2. Przygotuj się do separacji w gradimencie gęstości, dodając 2 ml pożywki o gradiencie gęstości do 3 probówek każda. Następnie dodaj 3 równe objętości porcji rozcieńczonej krwi do każdej probówki.
   UWAGA: Nie przekraczaj trzech czwartych maksymalnej pojemności probówki.
3. Wirować przy 1 800 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać warstwę graniczną obecną w postaci pierścienia za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki. Dodać 2 ml PBS i wirować w temperaturze 1 800 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zachowaj pastylkę, ponieważ będzie ona zawierała MPC.
4. Przepłukać osad zawierający MPC PBS przez odwirowanie, jak opisano w kroku 2.3. Do każdego prania należy używać świeżego PBS i wirować w temperaturze 1 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórz proces 6 razy.
5. Po ostatnim praniu użyj 1 ml PBS do ponownego zawieszenia osadu komórkowego. Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórek w 20 μl 0,4% błękitu trypanowego, 1:1 (v/v). Użyj 10 μl tej zawiesiny komórek do zliczania komórek za pomocą hemocytometru i mikroskopu świetlnego.
6. Podwielokrotność 1 x 10⁶ MPC w wcześniej oznaczonych probówkach do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml.
   UWAGA: Przygotować odpowiednie przeciwciała kontrolne dopasowane do izotypu.
7. Odwirować probówki o stężeniu 1 800 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant.
8. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 100 μl roztworu do inkubacji przeciwciał [1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] i dodać do probówki. Zawiesić na 10 s i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w ciemności.
   UWAGA: Końcowe stężenia przeciwciał pierwszorzędowych stosowanych w niniejszym protokole wynosiły CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Na tym etapie protokół można zatrzymać, wiążąc limfocyty w 4% paraformaldehydzie w PBS i przechowując próbki do 24 godzin w temperaturze 4 °C.
9. Wirować przy 1 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić w 500 μL 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
10. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej.
    1. Ustaw tło za pomocą przeciwciał kontrolnych dopasowanych do izotypu. Następnie na powierzchni FSC/SSC rozchodzą się wybrane limfocyty, starając się wykluczyć resztki komórkowe, resztkowe granulocyty i inne cząstki. Taki rozkład jest uważany za 100%.
       UWAGA: Limfocyty zwykle rozprzestrzeniają się w lewym dolnym obszarze wykresu.
    2. Użyj bramki o wspólnym immunofenotypie zawierającej dużą liczbę komórek CD45⁺ i CD34⁺. Następnie wybierz podwójnie dodatnie immunofenotypy, używając bramki, która wcześniej zidentyfikowała CD45 ⁺, CD34 ⁺ i dodając KDR (VEGFR-2) ⁺, CD133 ⁺ lub CD184 ⁺. Zidentyfikuj subpopulacje MPC na podstawie ich specyficznych markerów powierzchni komórek. Raportuj jako procent zdarzeń z bramką.
11. Zidentyfikuj główne subpopulacje MPC. W niniejszym badaniu analizowane immunofenotypy to CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ oraz CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    UWAGA: W badaniu wykorzystano następujące markery powierzchniowe komórek: CD45 (limfocyty), CD34 (komórki śródbłonka i/lub naczyń krwionośnych), KDR (VEGFR-2) (marker błonowy komórek śródbłonka), CD133 (śródbłonkowe komórki progenitorowe) i CD184 (hematopoetyczne komórki macierzyste i komórki śródbłonka).

3. Związek MPC z modyfikacją funkcji śródbłonka i testem hemodynamicznym (FMD)

1. Określ dylatację zależną od przepływu (FMD), przed i po angioplastyce.
   1. Użyj naczyniowego przetwornika liniowego, aby zmierzyć średnicę tętnicy ramiennej.
   2. Umieść mankiet ciśnieniomierza nad miejscem pomiaru na przedramieniu i wdmuchuj do 50 mmHg powyżej skurczowego ciśnienia krwi przez 5 minut i opróżnij.
   3. Ponownie określ średnicę tętnicy ramiennej w ciągu następnych 60 sekund. Użyj poniższego równania, aby oszacować FMD.
      UWAGA: Oblicz stopień dylatacji za pomocą równania (%) = (maksymalna średnica po przejściowym niedokrwieniu - średnica podstawowa) × 100 / średnica podstawowa.
2. Skoreluj liczbę MPC z wyjściową wartością FMD i deltą FMD po angioplastyce.

4. Zdolność prognostyczna MPC do amputacji kończyny

1. Zaplanuj okresowe wizyty lekarskie po angioplastyce balonowej i wypisie pacjenta, aby ocenić jakość przepływu krwi do kończyny dolnej.
2. Oceń nasilenie kliniczne niedokrwienia kończyn po 2 tygodniach od angioplastyki. Oceń rozwiązanie bólu spoczynkowego, dolnego niedokrwienia i zachowania funkcjonalnej stopy, zgodnie z klasyfikacją Rutherforda¹³.
3. Porównaj nasilenie kliniczne niedokrwienia kończyn na początku badania z obserwacją. Zidentyfikuj przypadki wymagające poważnej amputacji z powodu niekorzystnego wyniku.
4. Koreluj liczbę MPC z odsetkiem pacjentów wymagających dużej amputacji kończyny dolnej.

Próbki krwi z zablokowanych tętnic, w miejscu przeznaczonym do angioplastyki, pobrano od 20 pacjentów z cukrzycą, w wieku 68 lat, z czego 10 z 20 to mężczyźni. Połowę badanej populacji stanowili palacze. Zmiany naczyniowe oceniano głównie jako VI klasę Rutherforda; natomiast pacjenci wykazywali większą częstość występowania cukrzycy typu 2 (100%), nadciśnienia tętniczego (70%) i dyslipidemii (55%).

30-dniowa obserwacja kliniczna po przeprowadzeniu angioplastyki kończyn dolnych. Odsetek subpopulacji MPC na początku badania lub dynamika po angioplastyce był skorelowany (analiza Spearmana) ze stopniem dysfunkcji śródbłonka, ocenianym za pomocą FMD; a wyjściową liczbę MPC porównano między pacjentami poddawanymi lub niepoddawanym amputacji kończyny po angioplastyce (U-Mann Whitney). Badanie wykazało, że wyjściowa subpopulacja MPC CD45 + CD34 + KDR + ujemnie korelowała z FMD (Figura 3A, po lewej), podczas gdy zmiana MPC CD45 + CD34 + CD133 + CD184 + po angioplastyce istotnie korelowała z poprawą FMD (Figura 3B, po prawej). Ponadto u pacjentów, którzy ewoluowali do amputacji kończyny, zaobserwowano zwiększoną wyjściową liczbę subpopulacji MPC CD45 + CD34 + KDR+ (Ryc. 4A, B po lewej); a także redukcja subpopulacji MPC po angioplastyce CD45 + CD34 + CD133 + CD184 + (Rysunek 4A, C, po prawej).

Rycina 1: Angiografia kończyn dolnych i pobieranie krwi. (A) Trajektoria naczyniowa potwierdzona za pomocą środków kontrastowych pod wpływem fluoroskopii. (B) Niedrożność naczyń przed angioplastyką. (C) Niedrożność naczyniowa po angioplastyce. (D) Chirurg naczyniowy używa cewnika do pobrania krwi z najbliższego miejsca niedrożności naczyniowej i blaszki miażdżycowej, a badacz laboratoryjny jest gotowy do pobrania próbki krwi. Strzałki wskazują miejsce niedrożności naczyniowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie próbki krwi i oznaczanie jednojądrzastych komórek progenitorowych (MPC). (A) Przygotowanie gradientu gęstości. (B) Separacja pierścieni limfocytów po odwirowaniu krwi. (C) Pobranie fazy limfocytów. d) Wirowanie. (E) Tworzenie się osadów na dnie probówki. (F) Liczba zawiesin komórek. (G) Przygotowanie limfocytów do cytometrii przepływowej. (H) Oznaczanie subpopulacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Związek MPC ze wskaźnikami hemodynamicznymi. (A) Pozycja ultradźwięków w celu uzyskania FMD i reprezentatywnych wyników. (B) Zależność między wyjściowymi subpopulacjami %MPC (po lewej, CD45+CD34+KDR+; po prawej, CD45+CD34+CD133+CD184+) a wyjściowymi wartościami FMD; a także zależność (C)%MPC po angioplastyce z poprawą FMD po angioplastyce. Skróty: MPC, Mononuclear Progenitor Cells, Jednojądrzaste Komórki Progenitorowe; FMD, dylatacja zależna od przepływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: MPC i rokowanie amputacji kończyny dolnej po angioplastyce. (A) Reprezentatywne obrazy cytometrii przepływowej subpopulacji MPC. (B) Związek wyjściowych subpopulacji %MPCs (po lewej, CD45 + CD34 + KDR +; po prawej CD45 + CD34 + CD133 + CD184 +) lub (C) %MPC po angioplastyce, z amputacją kończyny dolnej po angioplastyce, podczas 30-dniowej obserwacji. Skróty: MPC, jednojądrzaste komórki progenitorowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Klasyfikacja Rutherforda ciężkości niedokrwienia kończyn. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.