Przewidywanie amputacji przy użyciu miejscowo krążących jednojądrzastych komórek progenitorowych u pacjentów leczonych angioplastyką z krytycznym niedokrwieniem kończyn

Podsumowanie

Amputacja kończyny dolnej może wystąpić nawet po angioplastyce niedrożnych naczyń w krytycznym niedokrwieniu kończyn (CLI). Jednojądrzaste komórki progenitorowe (MPC) odzwierciedlają naprawę naczyń krwionośnych. Niniejszy protokół opisuje kwantyfikację MPC z krążenia zbliżonego do angioplastyki oraz jej związek z dysfunkcją śródbłonka i przewidywaniem amputacji kończyny dolnej.

Streszczenie

Krytyczne niedokrwienie kończyn (CLI) reprezentuje zaawansowane stadium choroby tętnic obwodowych. Angioplastyka poprawia przepływ krwi do kończyny dolnej; Jednak u niektórych pacjentów nieodwracalnie dochodzi do amputacji kończyny. Stopień uszkodzenia naczyń krwionośnych i mechanizmy naprawy naczyń są czynnikami wpływającymi na wynik po angioplastyce. Jednojądrzaste komórki progenitorowe (MPC) reagują na uszkodzenia i naprawę naczyń krwionośnych, ze zdolnością do odzwierciedlania chorób naczyniowych. Niniejszy protokół opisuje ilościowe określenie MPC uzyskane z krążenia krwi z naczynia w pobliżu miejsca angioplastyki, a także jego związek z dysfunkcją śródbłonka i jego zdolność predykcyjną do amputacji kończyny w ciągu najbliższych 30 dni po angioplastyce u pacjentów z CLI.

Wprowadzenie

Choroba tętnic obwodowych (PAD) charakteryzuje się przewlekłą i postępującą niedrożnością naczyń krwionośnych z ograniczeniem dopływu krwi¹. W skali globalnej PAD kończyn dolnych dotyka około 10% populacji osób starszych, podczas gdy do 7% takich przypadków jest zgłaszanych do amputacji kończyn^2,3.

Krytyczne niedokrwienie kończyn (CLI) reprezentuje najpoważniejszą prezentację PAD¹. Pacjenci zwykle odczuwają ból w spoczynku, owrzodzenia lub zgorzel związane z niedrożnymi tętnicami; Podczas gdy rokowanie kliniczne jest niekorzystne i charakteryzuje się 30% ryzykiem amputacji kończyny i śmiertelności w ciągu 1 roku^3,4,5.

Angioplastyka to minimalnie inwazyjny zabieg wewnątrznaczyniowy, który może przywrócić przepływ krwi do kończyny dolnej u pacjentów z CLI; jednak niektórzy pacjenci nieuchronnie będą wymagać poważnej amputacji kończyny, nawet po terapii angioplastyką1^,5. Wczesna identyfikacja niekorzystnych wyników po angioplastyce jest bardzo cenna ze względu na możliwość egzekwowania terapii.

Tradycyjne czynniki ryzyka mogą zapewnić ograniczoną zdolność przewidywania dużej amputacji kończyny u pacjentów z CLI poddawanych angioplastyce⁶. Biomarkery zorientowane na patofizjologię reprezentują nowatorskie metody o potencjalnych zastosowaniach klinicznych, które mogą okazać się szczególnie przydatne w chorobach związanych z uszkodzeniem naczyń krwionośnych⁷. W dzisiejszych czasach coraz częściej uznaje się udział populacji komórkowych posiadających właściwości naprawy śródbłonka w miejscu blaszki miażdżycowej^8,9.

Jednojądrzaste komórki progenitorowe (MPC) pochodzą ze szpiku kostnego i posiadają własne strukturalne i funkcjonalne cechy komórek macierzystych o zdolnościach regeneracyjnych naczyń krwionośnych. Ze względu na zdolność MPC do namnażania się, migracji i wykazywania przylegania naczyniowego; Komórki te stały się dobrymi kandydatami do odzwierciedlenia naprawy śródbłonka w odpowiedzi na niedokrwienie^10,11,12. Ponadto ciągłe zainteresowanie mechanizmami leżącymi u podstaw uszkodzeń naczyniowych zmotywowało do zbadania prognostycznej roli miejscowo występujących biomarkerów, ponieważ uważa się, że odzwierciedlają one uszkodzenia i naprawy naczyń krwionośnych^7,13,14.

Celem niniejszego badania jest opisanie, jak określić ilość MPC, które krążą w pobliżu niedrożności naczyniowej u pacjentów z CLI poddawanych angioplastyce; oraz jak ocenić związek między MPC a wskaźnikami dysfunkcji śródbłonka i amputacji kończyny.

W porównaniu do prognozy opartej na chorobach współistniejących i wewnętrznych cechach naczyniowych, ilość lokalnych MPC wykazuje specyficzną zdolność do przewidywania wyników klinicznych dotyczących dysfunkcji śródbłonka i amputacji kończyn. Konsekwentnie, niektóre badania opisywały prognostyczną rolę podobnych biomarkerów podczas oceny pacjentów z PAD^15,16.

Na podstawie poprzednich wyników⁷, opisana tutaj metoda może być przydatna do wczesnej identyfikacji populacji zagrożonej niekorzystnymi wynikami naczyniowymi w kilku warunkach klinicznych, takich jak niedokrwienie kończyn dolnych i naczyń wieńcowych, udar, zapalenie naczyń, zakrzepica żylna i inne związane z uszkodzeniem i naprawą naczyń krwionośnych.

Protokół

Instytucjonalna komisja etyki badań z Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE zatwierdziła ten prospektywny protokół, wszyscy zapisani pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Ocena bloku naczyniowego kończyny dolnej, pobieranie krwi i angioplastyka balonowa

UWAGA: Próba badawcza użyta do tego eksperymentu składała się z 20 pacjentów z cukrzycą, w wieku 68 lat, a 10 z 20 było mężczyznami. Połowę próby stanowili palacze, a najczęstszymi chorobami współistniejącymi była cukrzyca typu 2, układowe nadciśnienie tętnicze i/lub dyslipidemia. Próbka miała być standaryzowana pod kątem wieku, płci i chorób współistniejących. Nie można wykluczyć możliwego błędu systematycznego wynikającego z kliniczno-demograficznego wpływu na związek między MPC a CLI.

1. Oceń kliniczne nasilenie niedokrwienia kończyn zgodnie z klasyfikacją Rutherforda¹³ (patrz Tabela uzupełniająca 1).
2. Wykonaj angiografię kończyn dolnych, pobranie krwi i angioplastykę balonową.
   1. Przed zabiegiem należy stosować leki przeciwzakrzepowe i znieczulające.
   2. Umieść igłę 18 G w naczyniu krwionośnym w wybranym miejscu pachwiny.
   3. Umieść wprowadzacz i przesuń elastyczny przewód doprowadzający. Następnie początkowy przewodnik jest dalej zmieniany na wprowadzający 6 Fr.
   4. Stosuj okresowe wstrzykiwanie środka kontrastowego lub CO₂ pod fluoroskopowym przewodnikiem, aby zidentyfikować trajektorię tętnicy i miejsca zablokowane naczyniowo (Rysunek 1).
      UWAGA: Użyj środka kontrastowego o pojemności 40 cm3, rozcieńczonego 1:1 w 0,9% soli fizjologicznej lub CO₂ w stężeniu od 10 do 20 ml na zastrzyk pod ciśnieniem 12 psi.
   5. Wprowadzić do statku dwa przewody prowadzące nawigację 0,014 Fr i dwa przewody prowadzące podporowe 0,014 Fr i przesunąć je do zablokowanego miejsca.
      UWAGA: Dwa druty prowadzące 0,014 Fr (o długości 260 cm) są używane do nawigacji, a dwa druty doprowadzające 0,014 Fr (o długości 260 cm) służą do podparcia, podczas jednego zabiegu.
   6. Wprowadzaj kolejno 5 cewników Fr i 3 Fr i pobieraj 10 ml krwi z najbliższego miejsca niedrożności naczyniowej. Utrzymuj próbki krwi na lodzie.
      UWAGA: Rozmiary cewników mogą wynosić 5 Fr i 3 Fr i są one zmieniane podczas zabiegu.
   7. Ponownie przesuń przewód doprowadzający. Następnie wprowadź cewnik balonowy do angioplastyki, który zawiera nadmuchiwany balon umieszczony na końcu cewnika. Przesuń cewnik balonowy do angioplastyki i umieść balon bezpośrednio w miejscu zmiany. Wykonaj angioplastykę, napompowując balon na płytkę blokującą znajdującą się na ścianie naczynia. Sprawdź przywrócenie przepływu krwi.
      UWAGA: W zablokowanym obszarze można umieścić stent, aby pomóc utrzymać tętnicę otwartą po zabiegu.
   8. Wprowadzić cewnik i przejść do najbliższego miejsca bloku naczyniowego. Zbierz 10 ml krwi w 30-minutowym odstępie czasu po angioplastyce. Utrzymuj próbki krwi na lodzie.
      UWAGA: Zaleca się pobranie próbek krwi przed i po angioplastyce w celu dalszej oceny wpływu angioplastyki na liczbę MPC.
   9. Usuń wszystkie druty pod kierunkiem fluoroskopowym.
   10. Zapewnij zabiegi opieki pooperacyjnej, w tym terapię przeciwzakrzepową z użyciem enoksaparyny w dawce 1 mg/kg podskórnie co 12 godzin, aspiryny 100 mg, statyny i środka przeciwbólowego. Kompresować w miejscu nakłucia naczyń krwionośnych przez 24 godziny.

2. Kwantyfikacja krążących jednojądrzastych komórek progenitorowych (MPC) (Rysunek 2)

1. Do świeżej probówki stożkowej o pojemności 15 ml przenieść 6 ml pobranej krwi i rozcieńczyć w stosunku 1:1 (v/v) za pomocą PBS.
   UWAGA: Krew należy przetworzyć w ciągu 1 godziny od pobrania.
2. Przygotuj się do separacji w gradimencie gęstości, dodając 2 ml pożywki o gradiencie gęstości do 3 probówek każda. Następnie dodaj 3 równe objętości porcji rozcieńczonej krwi do każdej probówki.
   UWAGA: Nie przekraczaj trzech czwartych maksymalnej pojemności probówki.
3. Wirować przy 1 800 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać warstwę graniczną obecną w postaci pierścienia za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki. Dodać 2 ml PBS i wirować w temperaturze 1 800 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zachowaj pastylkę, ponieważ będzie ona zawierała MPC.
4. Przepłukać osad zawierający MPC PBS przez odwirowanie, jak opisano w kroku 2.3. Do każdego prania należy używać świeżego PBS i wirować w temperaturze 1 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórz proces 6 razy.
5. Po ostatnim praniu użyj 1 ml PBS do ponownego zawieszenia osadu komórkowego. Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórek w 20 μl 0,4% błękitu trypanowego, 1:1 (v/v). Użyj 10 μl tej zawiesiny komórek do zliczania komórek za pomocą hemocytometru i mikroskopu świetlnego.
6. Podwielokrotność 1 x 10⁶ MPC w wcześniej oznaczonych probówkach do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml.
   UWAGA: Przygotować odpowiednie przeciwciała kontrolne dopasowane do izotypu.
7. Odwirować probówki o stężeniu 1 800 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant.
8. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 100 μl roztworu do inkubacji przeciwciał [1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] i dodać do probówki. Zawiesić na 10 s i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w ciemności.
   UWAGA: Końcowe stężenia przeciwciał pierwszorzędowych stosowanych w niniejszym protokole wynosiły CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Na tym etapie protokół można zatrzymać, wiążąc limfocyty w 4% paraformaldehydzie w PBS i przechowując próbki do 24 godzin w temperaturze 4 °C.
9. Wirować przy 1 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić w 500 μL 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
10. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej.
    1. Ustaw tło za pomocą przeciwciał kontrolnych dopasowanych do izotypu. Następnie na powierzchni FSC/SSC rozchodzą się wybrane limfocyty, starając się wykluczyć resztki komórkowe, resztkowe granulocyty i inne cząstki. Taki rozkład jest uważany za 100%.
       UWAGA: Limfocyty zwykle rozprzestrzeniają się w lewym dolnym obszarze wykresu.
    2. Użyj bramki o wspólnym immunofenotypie zawierającej dużą liczbę komórek CD45⁺ i CD34⁺. Następnie wybierz podwójnie dodatnie immunofenotypy, używając bramki, która wcześniej zidentyfikowała CD45 ⁺, CD34 ⁺ i dodając KDR (VEGFR-2) ⁺, CD133 ⁺ lub CD184 ⁺. Zidentyfikuj subpopulacje MPC na podstawie ich specyficznych markerów powierzchni komórek. Raportuj jako procent zdarzeń z bramką.
11. Zidentyfikuj główne subpopulacje MPC. W niniejszym badaniu analizowane immunofenotypy to CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ oraz CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    UWAGA: W badaniu wykorzystano następujące markery powierzchniowe komórek: CD45 (limfocyty), CD34 (komórki śródbłonka i/lub naczyń krwionośnych), KDR (VEGFR-2) (marker błonowy komórek śródbłonka), CD133 (śródbłonkowe komórki progenitorowe) i CD184 (hematopoetyczne komórki macierzyste i komórki śródbłonka).

3. Związek MPC z modyfikacją funkcji śródbłonka i testem hemodynamicznym (FMD)

1. Określ dylatację zależną od przepływu (FMD), przed i po angioplastyce.
   1. Użyj naczyniowego przetwornika liniowego, aby zmierzyć średnicę tętnicy ramiennej.
   2. Umieść mankiet ciśnieniomierza nad miejscem pomiaru na przedramieniu i wdmuchuj do 50 mmHg powyżej skurczowego ciśnienia krwi przez 5 minut i opróżnij.
   3. Ponownie określ średnicę tętnicy ramiennej w ciągu następnych 60 sekund. Użyj poniższego równania, aby oszacować FMD.
      UWAGA: Oblicz stopień dylatacji za pomocą równania (%) = (maksymalna średnica po przejściowym niedokrwieniu - średnica podstawowa) × 100 / średnica podstawowa.
2. Skoreluj liczbę MPC z wyjściową wartością FMD i deltą FMD po angioplastyce.

4. Zdolność prognostyczna MPC do amputacji kończyny

1. Zaplanuj okresowe wizyty lekarskie po angioplastyce balonowej i wypisie pacjenta, aby ocenić jakość przepływu krwi do kończyny dolnej.
2. Oceń nasilenie kliniczne niedokrwienia kończyn po 2 tygodniach od angioplastyki. Oceń rozwiązanie bólu spoczynkowego, dolnego niedokrwienia i zachowania funkcjonalnej stopy, zgodnie z klasyfikacją Rutherforda¹³.
3. Porównaj nasilenie kliniczne niedokrwienia kończyn na początku badania z obserwacją. Zidentyfikuj przypadki wymagające poważnej amputacji z powodu niekorzystnego wyniku.
4. Koreluj liczbę MPC z odsetkiem pacjentów wymagających dużej amputacji kończyny dolnej.

Wyniki

Próbki krwi z zablokowanych tętnic, pobrane w miejscu planowanej angioplastyki, zebrano od 20 pacjentów z cukrzycą w wieku 68 lat, z czego 10 z 20 stanowiły mężczyzny. Połowa populacji badanej była palaczami. Zmiany naczyniowe oceniono głównie jako klasę VI według skali Rutherforda; u pacjentów stwierdzono wysoką częstość występowania cukrzycy typu 2 (100%), nadciśnienia tętniczego (70%) oraz dyslipidemii (55%).

Przeprowadzono 30-dniową obserwację kliniczną po angioplastyce kończyn dolnych. Od...

Dyskusja

Pobranie krwi w dokładnym miejscu bloku naczyniowego może wykazywać trudności techniczne; W związku z tym przeprowadziliśmy pobranie krwi w pobliżu bloku naczyniowego. Podobnie, ilość MPC w pobliżu blaszki naczyniowej wydaje się być bardzo dynamiczna i może powodować zmiany przed i po angioplastyce. Zgodnie z naszymi obserwacjami zaleca się ocenę zmian liczby MPC po angioplastyce w okresie wyjściowym i 30 minut po angioplastyce, ponieważ mogą one odzwierciedlać kilka procesów patofizjologicznych zachodzących w obrębie us...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BSA	Roche	10735086001	albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jako środek buforujący, stabilizator, wzorzec i do mieszania.
Kulki kalibracyjne	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	Kulki kalibracyjne MACQuant są dostarczane w roztworze wodnym zawierającym 0,05% azydku sodu. 3,5 ml na maksymalnie 100 testów
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS#	130-080-801	Przeciwciało sprzężone z R-fikoerytryną w buforze PBS/EDTA
(CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS#	130-103-798	Monoklonalne, rekombinowane izotypowo ludzkie IgG1, sprzężone
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS#	130-093-601	Przeciwciało sprzężone z R-fikoerytryną w buforze PBS/
EDTA CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS#	130-081-001	Klon przeciwciała monoklonalnego AC136 wykrywa epitop klasy III CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS#	130-092-880	Przeciwciało monoklonalne CD45, ludzkie sprzężone
Probówki stożkowe	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml stożkowe probówki wirówkowe
Probówki cytometryczne	FALCON Corning Marka	#352052	5 ml probówka z okrągłym dnem z polistyrenu. Styl 12x75. Sterylny.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Metale ciężkie, (jako Pb) < 10ppm, Fe< 0,01%, As< 1ppm, Nierozpuszczalne< 0,005%
Ulepszony Neubauer	Bez marki	Bez numeru katalogowego	Hemocytometr do zliczania komórek. (zakres 0,1000mm, 0,0025mm2)
Probówki do pobierania krwi K2 EDTA	BD Vacutainer	#367863	Liliowa plastikowa rurka próżniowa (K2E) 10,8 mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterylne i sprawdzone na obecność endotoksyn. Gęstość: 1,077 plusmn; 0,001 g / ml
Paraformaldehyd	SIGMA-ALDRICH		Utrwalanie próbek biologicznych, (proszek, 95%)
Transfer pipetą 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	Pipeta transferowa to narzędzie, które ułatwia przenoszenie cieczy z większą dokładnością.
Probówki	KIMBLE CHASE	45060 13100	Probówki żaroodporne. ROZMIAR/NAKRĘTKA 13 x 100 mm

CD184#SZBF0920V