Izolacja egzosomów po terapii falą uderzeniową in vitro

Podsumowanie

Egzosomy są uwalniane po zastosowaniu fal uderzeniowych in vitro. Tutaj opisujemy, jak zastosować fale uderzeniowe na hodowanych komórkach śródbłonka, a następnie wyizolować egzosomy do dalszych badań.

Streszczenie

Terapia falą uderzeniową jest rutynowo stosowana we wskazaniach ortopedycznych, w tym w tendinopatiach, takich jak zapalenie nadkłykcia bocznego (łokieć tenisisty) i zapalenie ścięgna Achillesa (ostrogi piętowe), a także w niegojących się ranach i kościach. Pomimo różnych patologii, połączenie angiogennego i przeciwzapalnego działania terapii falą uderzeniową prowadzi do regeneracji tkanek miękkich i kości. W ciągu ponad 30 lat stosowania klinicznego nie zaobserwowano żadnych skutków ubocznych. Co więcej, badania podstawowe wykazały nawet regeneracyjny wpływ na niedokrwienny mięsień sercowy.

W poprzedniej pracy mogliśmy pokazać, że bodziec mechaniczny hodowanych komórek jest przekształcany poprzez uwolnienie egzosomu w odpowiedź biologiczną. Jednak dokładny mechanizm pozostaje do wyjaśnienia. Sprzężenie mechaniczne ma kluczowe znaczenie przy stosowaniu terapii falą uderzeniową, ponieważ nawet małe pęcherzyki powietrza mogą pochłaniać fale uderzeniowe. Opisana wcześniej metoda kąpieli wodnej jest ważną metodą gwarantującą odpowiednie i powtarzalne zastosowanie fali uderzeniowej in vitro.

Udało nam się opracować wykonalny i powtarzalny protokół izolowania egzosomów z hodowanych komórek po zastosowaniu fali uderzeniowej. W ten sposób pokazujemy możliwość zbadania podstawowych mechanizmów mechanotransdukcji, a także potencjału regeneracyjnego i angiogennego egzosomów uwalnianych przez falę uderzeniową.

Wprowadzenie

Fale uderzeniowe (SW) to fale ciśnienia akustycznego, które pojawiają się w naturze, gdy w krótkim czasie uwalniana jest duża ilość energii (np. grzmot z błyskawicą). W rutynowych praktykach klinicznych fale uderzeniowe są stosowane w litotrypsji do rozpadu kamieni nerkowych bez istotnych skutków ubocznych przez ponad 30 lat^1,2. Przypadkowo zaobserwowano pogrubienie kości biodrowej na zdjęciach rentgenowskich po rozpadzie kamicy nerkowej. Obserwacja ta stała się podstawą do badań nad zaburzeniami gojenia kości i doprowadziła do leczenia w przypadku niezrostów kości długich^3,4,5.

Wskazania do terapii falą uderzeniową zostały rozszerzone i dziś metoda ta jest w rutynowym użyciu klinicznym we wskazaniach ortopedycznych, w tym tendinopatiach, takich jak zapalenie nadkłykcia bocznego (łokieć tenisisty) i zapalenie ścięgna Achillesa (ostrogi piętowe)^6,7. Ponadto badania podstawowe wykazały wysoki potencjał angiogenny terapii falą uderzeniową (SWT). W tym badaniu wykazano wzrost angiogennych czynników wzrostu, takich jak VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego), PIGF (czynnik wzrostu łożyska) i FGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego) po SWT, a następnie angiogenezie⁸.

Aby zbadać możliwą korzystną rolę angiogenezy wywołanej falą uderzeniową w innych patologiach, zastosowaliśmy terapię SW na zwierzęcym modelu choroby niedokrwiennej serca9^,10. Po wykazaniu efektu regeneracyjnego w niedokrwiennym mięśniu sercowym, mogliśmy zidentyfikować nieodzowną rolę wrodzonego receptora immunologicznego TLR 3 (receptor podobny do Toll 3) w terapii falą uderzeniową^11,12. Dalsze badania wykazały, że bodziec mechaniczny terapii SW jest tłumaczony na sygnał biologiczny poprzez uwalnianie egzosomów. W porównaniu z egzosomami fizjologicznie uwalnianymi z komórek śródbłonka, egzosomy uwalniane podczas SWT zawierają zwiększony ładunek angiogennego mikroRNA. Wstrzyknięty do niedokrwionego mięśnia sercowego, SWT uwolnił egzosomy indukowane regeneracją¹³.

Ponieważ powietrze absorbuje SW, doskonałe połączenie między aplikatorem a kolbami do hodowli komórkowych jest kluczowe. Standaryzowana kąpiel wodna stanowi wykonalną metodę stosowania SWT in vitro i odtwarzalną konfigurację eksperymentalną. Aby uniknąć odbicia, a co za tym idzie interferencji fal, absorber w kształcie klina niszczy fale pierwotne biegnące do tylnej części kąpieli wodnej. Z tego powodu zalecamy stosowanie fal uderzeniowych in vitro wyłącznie przy użyciu opisanej kąpieli wodnej.

W tym protokole opisujemy zastosowanie fal uderzeniowych in vitro do uwalniania angiogennych egzosomów do supernatantu. Protokół ten daje możliwość zbadania roli egzosomów w mechanotransdukcji i stanowi podstawę do dalszych badań nad uwalnianiem egzosomów po SWT.

Protokół

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej uzyskano z cesarskich cięć na Wydziale Ginekologii. W związku z tym uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów. Zgodę uzyskała komisja etyczna Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku (nr UN4435).

UWAGA: Pracuj pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.

1. 24 godziny przed eksperymentem

1. Przygotować pożywkę wzrostową śródbłonka wolną od egzosomów przez ultra-odwirowanie płodowej surowicy bydlęcej (FCS) w temperaturze 4 °C i 120 000 x g przez noc.
2. Kolbę do hodowli komórkowych o powierzchni 75 cm² pokryć 10% żelatyną.
3. Wysiewać ludzkie komórki śródbłonka w kolbie do hodowli komórkowych przy użyciu śródbłonkowej pożywki wzrostowej.
   Dzień eksperymentu:
   UWAGA: Wstępnie podgrzej 4 l ddH₂O, FCS wolne od egzosomów, podłoże podstawowe do wzrostu komórek śródbłonka i PBS do 37 °C.

2. Przygotuj aplikację do terapii falą uderzeniową

1. Przygotuj pożywkę do wzrostu śródbłonka wolną od egzosomów, dodając suplementy z zestawu komercyjnego (np. Bullet Kit) i dodając ultrawirówkowany wolny od egzosomów FCS zamiast zwykłego FCS do pożywki wzrostu śródbłonka.
2. Napełnić łaźnię wodną około 3,5 l wstępnie ogrzanego ddH₂O o temperaturze 37 °C.
3. Podłączyć aplikator SW do łaźni wodnej.
4. Zdefiniuj parametry leczenia (energia, gęstość strumienia, częstotliwość impulsów) na urządzeniu programowym. Zalecamy 500 impulsów o gęstości strumienia energii 0,07 mJ/mm² i częstotliwości 5 Hz.

3. Aplikacja fali uderzeniowej

1. Zbadaj żywotność komórek na podstawie wyglądu morfologicznego i gęstości komórek śródbłonka za pomocą mikroskopu przy użyciu 100-krotnego powiększenia całkowitego. Używaj kolb o dużej konfluencji tylko dla zwiększonej ilości egzosomów.
2. Ostrożnie zastąpić pożywkę z komórek śródbłonka około 250 ml PBS, aby całkowicie napełnić kolbę i stłumić całe resztki powietrza.
3. Użyj parafilmu lub hermetycznych nasadek, aby uszczelnić kolbę.
4. Trzymać kolbę do hodowli komórkowych w pozycji pionowej wewnątrz łaźni wodnej tak, aby strona pokryta komórkami była przeciwna do urządzenia SW. Upewnij się, że odległość kolby od aplikatora jest zgodna ze wskazanym oznaczeniem. W przypadku urządzenia Orthowave 180c należy zachować odległość od 10 cm.
5. Wykorzystaj 250 impulsów terapii SW do dolnej połowy kolby do hodowli komórkowej.
6. Obrócić kolbę o 180° i użyć 250 impulsów do górnej połowy kolby do hodowli komórkowej.
7. Następnie usunąć uszczelkę kolby i zastąpić PBS 15 ml śródbłonkowej pożywki wzrostowej z FCS wolnym od egzosomów.
8. Hodowano komórki terapeutyczne w pożywce wolnej od egzosomów przez czas odpowiedni do konfiguracji eksperymentu. Największą ilość egzosomów można zebrać 4 godziny po terapii SW (Ryc. 1).
   UWAGA: W grupie operowanej pozorowanej, kolby do hodowli komórkowych poddano temu samemu leczeniu (patrz sekcja powyżej) bez stosowania terapii SW.

4. Izolacja egzosomów

1. Przenieść supernatant do probówki zbiorczej i odwirować w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 10 minut. Ten krok usuwa wszystkie komórki w supernatancie.
2. W celu usunięcia resztek komórkowych przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować w temperaturze 4 °C i 3 000 x g przez 20 minut.
3. Przecedzić supernatant przez filtr o długości fali 200 nm do rurki odśrodkowej w celu usunięcia ciał apoptotycznych.
4. Odwirować przefiltrowany supernatant w temperaturze 4 °C z 120 000 x g przez 70 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad egzosomu za pomocą 300 μl PBS.
   1. Ponieważ osad egzosomów nie jest widoczny po ultrawirowaniu, należy wirować probówkę ultrawirówki przez 30 sekund, aby upewnić się, że osad egzosomu jest ponownie zawieszony. Dostosuj głośność PBS do potrzeb eksperymentalnych i dalszych eksperymentów.
5. Przechowywać zawieszone egzosomy w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Protokół można wstrzymać po przeniesieniu supernatantu do probówki zbiorczej lub przed ultrawirowaniem poprzez zamrożenie supernatantu w temperaturze -80 °C.

5. Pułapki

1. Upewnij się, że aplikator SW jest szczelnie podłączony do łaźni wodnej. Niepełne połączenie może prowadzić do nieszczelnej kąpieli wodnej.
2. Upewnij się, że istnieje dokładna odległość od kolby do aplikatora, aby wykorzystać tę samą gęstość strumienia energii do różnych kolb.
3. Zaznaczyć kolby do hodowli komórkowych, które poddano terapii SW oraz kolby do hodowli komórkowych, które były próbkami kontrolnymi.
4. Wysuszyć kolby przed ponownym umieszczeniem ich w inkubatorze, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Wyniki

Korzystając z opisanego protokołu, poddaliśmy działanie ludzkich komórek śródbłonka (HUVEC) oraz ludzkich komórek śródbłonka tętnic wieńcowych (CAECs; PromoCell) do terapii falą uderzeniową (np. Orthowave 180c). Uwolnione pęcherzyki określono ilościowo za pomocą analizy nanośledzenia (NTA). W ten sposób mogliśmy zaobserwować wzrost uwalniania mikropęcherzyków po terapii SW (Rysunek 1A,B). Obrazowanie pęcherzyków uwolnionych przez HUVEC za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ...

Dyskusja

W wielu podstawowych pracach badawczych można wykazać regeneracyjny efekt terapii falą uderzeniową, który jest rutynowo stosowany we wskazaniach ortopedycznych ^3,4,5. W różnych modelach zwierzęcych można było wykazać regeneracyjny wpływ na niedokrwienny mięsień sercowyⁱ doprowadzić do rozpoczęcia badania CAST-HF ^9,10. To randomizowane, kontrolowane badanie ma na celu oce...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolby do hodowli komórkowych	Komórka	658170	75 cm2Probówki
zbiorcze – Falcon Tube Corning		352070
Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka	Lonza	CC-3121
Surowica bydlęca płodu	Sigma	F0804
Parafilm	Pechiney	PM996
Solanka buforowana fosforanami	gibco	14190-904
Aplikator fali uderzeniowej	MTS	em>Orthowave 180c