Artykuł metodologiczny

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61515

⸱

2 września 2020

1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Streszczenie

Narzędzia do obrazowania biomedycznego pozwalają na badanie mechanizmów molekularnych w różnych skalach przestrzennych, od genów po organizmy. Drosophila melanogaster, dobrze scharakteryzowany organizm modelowy, skorzystał z zastosowania mikroskopii świetlnej i elektronowej w celu zrozumienia funkcji genów na poziomie komórek i tkanek. Zastosowanie platform obrazowania, które pozwalają na zrozumienie funkcji genów na poziomie całego nienaruszonego organizmu, jeszcze bardziej poszerzyłoby naszą wiedzę na temat mechanizmów genetycznych. Przedstawiono tutaj metodę obrazowania całego zwierzęcia, która przedstawia kroki potrzebne do wizualizacji Drosophila na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej (μ-CT). Zalety μ-CT obejmują dostępne na rynku oprzyrządowanie i minimalny czas potrzebny na uzyskanie dokładnych informacji 3D w rozdzielczości na poziomie mikronów bez konieczności stosowania metod sekcji tkanek lub oczyszczania. W połączeniu z oprogramowaniem, które przyspiesza analizę obrazu i renderowanie 3D, można przeprowadzić szczegółową analizę morfometryczną dowolnej tkanki lub układu narządów, aby lepiej zrozumieć mechanizmy rozwoju, fizjologii i anatomii zarówno w badaniach opisowych, jak i testujących hipotezy. Wykorzystując proces obrazowania, który obejmuje wykorzystanie mikroskopii elektronowej, mikroskopii świetlnej i tomografii komputerowej μ, można przeprowadzić dokładną ocenę funkcji genów, zwiększając w ten sposób użyteczność tego potężnego organizmu modelowego.

Wprowadzenie

Metody obrazowania, które pozwalają na szczegółowe badanie wewnętrznych struktur obiektu bez niszczenia jego ogólnej architektury 3D, okazały się bardzo korzystne dla wielu różnych dyscyplin, w tym fizyki, inżynierii, materiałoznawstwa, archeologii, paleontologii, geologii i biologii1,2,3,4,5,6,7,8,9. Wśród tych nieniszczących metod obrazowania, platformy oparte na promieniowaniu rentgenowskim są szczególnie przydatne ze względu na zdolność wysokoenergetycznych promieni rentgenowskich do przenikania przez wiele różnych typów próbek i materiałów przy minimalnym rozpraszaniu w porównaniu z falami światła widzialnego. Tomografia komputerowa (CT), mikrotomografia komputerowa (μ-CT), nanotomografia komputerowa (Nano-CT) i mikrotomografia synchrotronowa stały się zatem podstawowymi technologiami obrazowania rentgenowskiego próbek o rozmiarach od metrów do mikronów, z rozdzielczością od milimetra do submikrona10,11,12,13,14.

Chociaż te platformy różnią się konstrukcją, geometrią promieniowania rentgenowskiego i komponentami w celu zrównoważenia wielkości próbki i rozdzielczości, wszystkie opierają się na tej samej podstawowej zasadzie przechwytywania obrazu: źródło promieni rentgenowskich, które przechodzą przez obiekt i są rejestrowane przez detektor. Zróżnicowane tłumienie wiązki promieniowania rentgenowskiego przechodzącej przez różne gęstości w obiekcie generuje kontrast obrazu. Dane 3D uzyskuje się poprzez obracanie próbki lub detektora, zbierając serię obrazów projekcyjnych 2D, które są następnie rekonstruowane za pomocą algorytmów w tomogramy zawierające informacje 3D, których rozdzielczość jest izotropowa w x,y,z15. W przypadku wielu stacjonarnych tomografów komputerowych μ, które wykorzystują geometrię promieniowania rentgenowskiego wiązki stożkowej do rzutowania promieni rentgenowskich na obrazowany obiekt, algorytm Feldkampa jest używany do dokładnej rekonstrukcji obiektu z minimalnymi błędami16.

Rozdzielczość danej platformy zależy przede wszystkim od parametrów systemu, takich jak rozmiar wiązki promieniowania rentgenowskiego (rozmiar plamki), geometria skanera (odległość od obiektu do źródła promieniowania rentgenowskiego), rozmiar pikseli na detektorze oraz zastosowany algorytm rekonstrukcji. Dodatkowe czynniki, takie jak drgania skanera, fluktuacje wiązki promieniowania rentgenowskiego, ruch próbki oraz rodzaj materiału lub plama chemiczna użyta do wizualizacji obiektu, mogą również znacząco wpływać na rozdzielczość przestrzenną w warunkach obrazowania w świecie rzeczywistym15.

Dla zastosowań biomedycznych, CT i μ-CT odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia anatomii, fizjologii, rozwoju i mechanizmów chorobowych, służąc zarówno jako narzędzie do diagnozowania pacjentów, jak i jako platforma obrazowania przedklinicznego dla organizmów modelowych17,18. Na przykład Mouse International Phenotyping Consortium, którego celem jest zidentyfikowanie funkcji każdego genu w genomie myszy, wykorzystuje μ-CT jako część swojego potoku fenotypowania19. Ich wyniki miały kluczowe znaczenie dla zrozumienia genów zaangażowanych w rozwój i procesy chorobowe, a jednocześnie służyły jako atlas anatomii i rozwoju myszy20. Inne organizmy modelowe, takie jak danio pręgowany i szczury, również w pełni przyjęły wykorzystanie μ-CT do przeprowadzania fenotypowania wielu mutantów genów u całych zwierząt17,21,22,23.

Zaletą połączenia obrazowania całych zwierząt z organizmami modelowymi jest to, że mechanistyczne zrozumienie funkcji genów dla danego procesu biologicznego może być w pełni zbadane. Jest to możliwe dzięki dobrze scharakteryzowanym genomom i wielu narzędziom genetycznym dostępnym w organizmach modelowych, które pozwalają na precyzyjną manipulację funkcją genów w różnych punktach czasowych rozwoju, określonych tkankach, pojedynczych komórkach, a nawet organellach subkomórkowych. Należą do nich systemy wyrażeń binarnych, takie jak system UAS/GAL4 (i jego wiele pochodnych), CRISPR/Cas9 i RNAi24,25,26. Kiedy te narzędzia genetyczne są używane w połączeniu z potężnym procesem obrazowania składającym się z mikroskopii elektronowej, mikroskopii świetlnej (fluorescencyjnej i niefluorescencyjnej) oraz obrazowania całych zwierząt, takich jak μ-CT, można uzyskać dokładną ocenę cząsteczek, komórek, tkanek, narządów i całego organizmu, co pozwala na znacznie głębsze zrozumienie funkcji genów.

Ten protokół skupia się na użyciu μ-CT w niessakowym organizmie modelowym Drosophila melanogaster, którego niezliczone narzędzia genetyczne pomogły wyjaśnić liczne mechanizmy molekularne26,27. Został zaadoptowany z poprzednich protokołów u owadów niebędących modelami1,28,29,30,31,32, i opiera się na poprzednich badaniach μ-CT na Drosophila, aby ustanowić ustandaryzowany protokół do jego stosowania u tego zwierzęcia33,34,35,36,37,38,39,40,41. Przedstawiono etapy skutecznego przygotowania próbki, obrazowania i analizy zestawów danych μ-CT przy użyciu dostępnych na rynku skanerów. Dzięki temu protokołowi wszystkie etapy rozwojowe muchy mogą być wizualizowane w wysokiej rozdzielczości zarówno dla badań opisowych, jak i testujących hipotezy, w tym taksonomii, anatomii, rozwoju, fizjologii i choroby27. Protokół ten będzie również przydatny do obrazowania praktycznie wszystkich owadów, a nawet materiałów nieożywionych, które wymagają barwienia chemicznego w celu kontrastu obrazu, aby poprawić wizualizację za pomocą μ-CT.

Protokół

1. Wybór próbki i przygotowanie skórek

  1. Wybierz odpowiedni punkt czasowy rozwoju (zarodek, larwa, poczwarka lub osoba dorosła) do obrazowania.
    1. W stadiach embrionalnych samice umieszcza się w klatkach na płytkach agarowych z sokiem winogronowym posmarowanych pastą drożdżową i zbiera jaja co 30-60 minut. Pozostawić te zarodki do rozwoju w temperaturze 25 °C, aż do osiągnięcia właściwego etapu.
    2. W przypadku stadiów larwalnych należy pobrać pierwsze i drugie stadium z eksperymentów z czasowym pobieraniem zarodków. Bezpośrednio podnieś wędrujące 3 gwiazdki z boku fiolki z jedzeniem w warunkach bez zatłoczenia.
    3. Aby określić czas poczwarki, zbierz białe przetchlinki (odwrócone przetchlinki) i zanotuj czas, w którym naskórek zaczyna brązowieć. Zwierzęta przechodzą przez 15 etapów rozwoju poczwarki w określonych punktach czasowych po brązowieniu naskórka i mogą być odpowiednio zbierane42.
    4. Dorosłe osobniki należy zebrać jako dziewice po eklozji i pozostawić do leżakowania w fiolce z jedzeniem przez wymagany czas (np. 5 dni dla pełnego rozwoju jelit).
  2. Przenieś 5-50 zwierząt do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,5% Triton X-100 w 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (0,5% PBST). Okresowo stukając rurką o blat stołu, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby pomóc w usunięciu powłoki hydrofobowej i umożliwić zwierzętom całkowite zanurzenie.
    1. W stadiach embrionalnych, larwalnych i poczwarkowych należy zatrzymać dalszy rozwój, umieszczając probówkę w bloku grzewczym ustawionym na 100 °C na 20 s, a następnie schładzając w temperaturze pokojowej przez 5 minut
      UWAGA: Zwierzęta mogą być również błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie37.

2. Utrwalanie i barwienie

  1. Usuń 0,5% PBST i dodaj 1 ml roztworu Bouina. Dotknij rurki, aby upewnić się, że zwierzęta są całkowicie zanurzone.
    UWAGA: Roztwór Bouina zawiera formaldehyd. Rozlany może powodować ostrą toksyczność dla skóry i oczu, a połknięcie może być śmiertelne. Podczas obchodzenia się z materiałem należy nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.
    UWAGA: Można również zastosować dodatkowe techniki utrwalania, takie jak użycie etanolu. Zalety innych utrwalaczy są szczegółowo opisane w ref.1,30.
    1. W przypadku próbek z zarodków i osobników dorosłych inkubować na stole przez 16–20 godzin w temperaturze pokojowej.
    2. W przypadku próbek larw i poczwarek należy utrwalać zwierzęta przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór Bouina należy wyrzucić i trzykrotnie przemyć 1x PBS przez 5 minut. Przenieś do wielodołkowej miski preparacyjnej zawierającej 1x PBS i użyj małej szpilki przymocowanej do uchwytu, aby zrobić otwór w przednim i tylnym naskórku, uważając, aby nie naruszyć żadnej leżącej pod spodem tkanki miękkiej.
    3. Przenieś próbki larw i poczwarek z powrotem do probówki do mikrofuge i dodaj 1 ml świeżego roztworu Bouina. Inkubować na stole przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć roztwór Bouina i przemywać próbkę przez 30 minut 1 ml buforu do płukania μ-CT (0,1 M Na2HPO4, 1,8% sacharozy) lub trzykrotnie 1x PBS.
  3. Dodać 1 ml odpowiedniego roztworu barwiącego i inkubować na stole przez 2-7 dni.
    UWAGA: Wybór bejcy będzie zależał od wielu czynników, ale generalnie jest to równowaga między penetracją, czasem inkubacji i rozdzielczością. Ogólnie rzecz biorąc, kwas fosfowolframowy (PTA) zapewnia lepszy kontrast i rozdzielczość tkanek miękkich, ale wymaga mechanicznego uszkodzenia naskórka i dłuższego czasu inkubacji. Zalety różnych rodzajów bejc są szczegółowo opisane w ref.1.
    1. Do barwienia jodem użyj 1 ml 0,1 N I2KI (płyn Lugola). Inkubować przez 2 dni. Nie jest konieczne dalsze naruszanie naskórka osoby dorosłej.
    2. Do barwienia kwasem fosfotungstycznym (PTA) należy użyć 1 ml 0,5% (w/v) roztworu rozcieńczonego w wodzie. Zarąb naskórek dorosłego człowieka, usuwając aparat gębowy lub robiąc w klatce piersiowej lub naskórku brzucha za pomocą małej szpilki przymocowanej do uchwytu. Inkubować przez 5-7 dni lub dłużej, jeśli barwienie tkanek wydaje się niejednorodne.
  4. Myć 1 ml ultraczystej wody lub 1x PBS przez 30 min. Powtórzyć krok prania. Przechowuj zwierzęta w RT w ultraczystej wodzie lub 1x PBS przez okres do jednego miesiąca.
  5. Jeśli zwierzęta mają być skanowane w stanie nawodnienia, należy przejść bezpośrednio do sekcji 4. Jeżeli konieczne jest dłuższe przechowywanie próbki, należy przejść do sekcji 3 protokołu.

3. Suszenie w punkcie krytycznym (opcjonalnie)

  1. Wykonać serię dehydratacji etanolu (EtOH) na próbce: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Dodać 1 ml roztworu EtOH i inkubować na stole przez 1 godzinę dla każdego stężenia w podanej kolejności.
  2. Po ostatnim 100% namoczeniu EtOH zastąp go świeżym 100% EtOH i pozostaw próbkę do inkubacji na stole przez noc.
  3. Przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym próbek zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Urządzenia do mikroskopii elektronowej zazwyczaj są wyposażone w maszynę do suszenia w punkcie krytycznym (patrz Tabela materiałów), która przeprowadzi suszenie próbki po odwodnieniu EtOH.

4. Przykładowy montaż

  1. W przypadku próbek suszonych w krytycznym punkcie, gorące próbki klej do szpilki przeciw owadom lub innego uchwytu zaprojektowanego tak, aby pasował do uchwytu obrotowego stolika lub umieścić go w plastikowej lub szklanej rurce kapilarnej (średnica wewnętrzna ~1,0-1,25 mm).
  2. W przypadku próbek uwodnionych napełnij końcówkę pipety P10 wodą i zabezpiecz wąski koniec zgrzewaniem lub folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.
    UWAGA: Pamiętaj, aby szczelnie owinąć wszystkie połączenia, aby woda nie dostała się do skanera i nie spowodowała uszkodzenia.
    1. Przenieś pojedynczą próbkę na końcówkę pipety za pomocą kleszczy. Używając długiego, smukłego przedmiotu, takiego jak stępiona igła 20 G lub inna końcówka do pipety, ostrożnie wepchnij próbkę w dół końcówki, aż dotknie ona ścianki końcówki pipety, aby utrzymać ją na miejscu.
    2. Zakryj otwór końcówki pipety folią parafinową, aby zapobiec parowaniu wody podczas długich skanów.
    3. Zamontuj pipetę P10 za pomocą uchwytu zaprojektowanego tak, aby pasował do uchwytu obrotowego stolika (Rysunek 1A-C).

5. Skanowanie

  1. Wykonaj wszelkie niezbędne kalibracje urządzenia przed obrazowaniem na dzień.
    UWAGA: Będą się one różnić w zależności od producenta i zaleca się skonsultowanie się ze specjalistą ds. aplikacji w celu ustalenia właściwych kroków. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji i oprogramowania używanego w tym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, kalibracje, takie jak wyrównanie osi stolika w celu usunięcia wszelkich "chybotań" związanych z przesunięciem uchwytu w stosunku do obracającego się stolika i wykonywanie korekcji płaskiego pola w celu zapewnienia jednolitej intensywności pikseli tła w kamerze, zapewniają optymalne warunki obrazowania dla najlepszej rozdzielczości i zestawów danych, które są porównywalne z wieloma skanami.
  2. Otwórz drzwiczki skanera, aby uzyskać dostęp do obrotowego uchwytu scenicznego, klikając ikonę "Otwórz drzwi" w lewym górnym rogu oprogramowania. Przymocuj próbkę, zaciskając kołnierz wokół podstawy uchwytu próbki.
    UWAGA: Używaj delikatnego nacisku podczas mocowania próbki do obracającego się uchwytu, aby utrzymać wyrównanie skanera.
  3. Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu sterującym skanerem, aby uzyskać optymalną rozdzielczość i kontrast.
    UWAGA: Będą one musiały zostać określone empirycznie, ponieważ źródło promieniowania rentgenowskiego, kamera/detektor i geometria każdego skanera będą się różnić w zależności od producenta. Dodatkowe informacje dotyczące wyboru najlepszych parametrów można również znaleźć tutaj43, a także u specjalisty ds. aplikacji producenta.
    1. Otwórz układ sterowania zasilaniem źródła promieniowania rentgenowskiego (punkt menu Opcje | Źródło promieniowania rentgenowskiego). Użyj suwaków, aby ustawić napięcie promieniowania rentgenowskiego na 30-40 kV i prąd na 100-110 μA, aby wytworzyć wiązkę promieniowania rentgenowskiego o mocy 3-4 W i małym rozmiarze plamki dla lepszej rozdzielczości.
    2. Użyj okna dialogowego Tryby akwizycji (punkt menu Opcje | File Mode (Tryby akwizycji), aby ustawić czas ekspozycji aparatu na 500-800 ms.
    3. Użyj suwaka znajdującego się obok ikony lupy na dole oprogramowania, aby ustawić żądany rozmiar piksela obrazu (od ~700 nm do 4 μm), w zależności od ustawień i położenia kamery. Określa to liczbę obrazów projekcyjnych, które są rejestrowane podczas skanowania, przy czym więcej projekcji prowadzi do zwiększonej rozdzielczości, ale dłuższego czasu skanowania (patrz Reprezentatywne wyniki).
    4. Kliknij i przeciągnij suwak znajdujący się obok obracającej się strzałki u dołu oprogramowania, aby przesunąć próbkę wzdłuż ścieżki obrotu o 360°. Upewnij się, że próbka pozostaje w polu widzenia.
  4. Kliknij ikonę "Rozpocznij pobieranie" (ikona niebieskiego kółka ze strzałką) w górnej części oprogramowania. Pojawi się okno dialogowe, w którym można ustawić dodatkowe parametry skanowania oraz określić plik i folder wyjściowy, w którym zostanie zapisane skanowanie.
    1. Ustaw losowy ruch na 10 i średnio 4-6 klatek. Krok obrotu jest obliczany automatycznie w zależności od używanych ustawień kamery.
  5. Rozpocznij skanowanie, klikając przycisk "OK" w oknie dialogowym Pobieranie. Pojawi się drugie okno dialogowe paska postępu, które pokazuje czas skanowania. Skaner uzyska teraz serię obrazów projekcyjnych (Rysunek 1D) próbki wzdłuż ścieżki obrotu i nie musi być monitorowana.

6. Rekonstrukcja

  1. Aby wygenerować tomogramy, należy przeprowadzić rekonstrukcję obrazu za pomocą obrazów projekcyjnych.
    UWAGA: Podczas gdy prawie wszystkie rekonstrukcje obrazów ze skanerów geometrii wiązki stożkowej opierają się na algorytmie Feldkampa16, indywidualne parametry będą się różnić w zależności od implementacji oprogramowania i powinny być określone empirycznie. Poniższe ustawienia, specyficzne dla oprogramowania dostępnego na rynku (patrz Spis materiałów), mogą służyć jako przewodnik. Parametry, takie jak kompensacja niewspółosiowości, redukcja artefaktów pierścieniowych i korekcja utwardzenia wiązki (0% dla większości próbek much) są wykonywane w sposób iteracyjny, aby wybrać najlepsze wartości dla końcowej rekonstrukcji. Dla zaawansowanych użytkowników, którzy chcieliby mieć większą kontrolę nad procesem rekonstrukcji, zobacz interfejs MATLAB tutaj44.
  2. Wykonaj wstępne wyrównanie obrazu, wykorzystując algorytm korekcji przesunięcia oparty na skanach referencyjnych45 (Działania | Wyrównanie X/Y ze skanem referencyjnym).
  3. Dostosuj każdy parametr rekonstrukcji (Start | Dostrajanie). Spowoduje to uaktywnienie okna dialogowego "Dostrajanie parametrów".
    1. Dostosuj wyrównanie, klikając "Dalej" do "Po wyrównaniu". Ustaw liczbę iteracji na pięć, a krok parametru na 1,0. Kliknij przycisk Start, aby wygenerować serię podglądów. Wybierz obraz, który jest prawidłowo wyrównany.
      UWAGA: Prawidłowo wyrównany obraz nie będzie rozmyty ani nie będzie wyświetlał artefaktów "ścinania", gdy ciągła struktura (taka jak naskórek) wydaje się podzielona.
    2. Dostosuj redukcję artefaktu pierścienia, klikając obok niego. Ustaw liczbę iteracji na pięć, a krok parametru na 1,0. Kliknij przycisk Start, aby wygenerować serię podglądów. Wybierz obraz, który zawiera najmniejszą liczbę pierścieni.
  4. Po zoptymalizowaniu powyższych parametrów w celu uzyskania najlepszego obrazu, upewnij się, że wybrane wartości są prawidłowo odwzorowane w zakładce Ustawienia (Ustawienia).
  5. Dostosuj dowolne końcowe wartości jasności i kontrastu za pomocą histogramu, parametrów pliku, takich jak głębia bitowa i typ, oraz wykorzystaj obszar zainteresowania (ROI) obejmujący tylko interesujące struktury (np. cały rozporek lub tylko głowę), aby skrócić czas obliczeń (wyjście).
  6. Rozpocznij odbudowę (punkt menu Start | Początek). Jeśli wymagane są wielokrotne rekonstrukcje, dodaj bieżący obraz do menedżera wsadów (punkt menu Start | Dodaj do partii) i powtórz kroki 6.2-6.5 dla pozostałych obrazów.

7. Analiza obrazu

  1. Wizualizuj tomogramy w dwóch i trzech wymiarach i wykonuj dalszą analizę morfometryczną za pomocą darmowego lub komercyjnego oprogramowania.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat oprogramowania używanego w tym protokole są dostępne w Tabeli materiałów. Inne pakiety oprogramowania, które są w stanie ocenić zestawy danych μ-CT, obejmują opcje freeware, takie jak FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47 i ITK-SNAP48, a także oprogramowanie komercyjne (np. AMIRA). Inne aplikacje, które wykorzystują algorytmy oparte na uczeniu maszynowym do częściowej automatyzacji procesu segmentacji, mogą pomóc przyspieszyć przepływy pracy i zmniejszyć stronniczość człowieka (np. Biomedisa49).
  2. Zaimportuj plik tomogramu do oprogramowania (Plik | Importuj pliki obrazów). Metadane skojarzone z plikiem powinny zostać automatycznie załadowane do okna, ale można je również ustawić ręcznie, aby odpowiadały właściwościom obrazu.
  3. Aby podzielić interesującą Cię strukturę na segmenty, kliknij zakładkę Segment po lewej stronie ekranu. Tworzenie nowego obszaru zainteresowania (ROI) (Podstawowe | Nowy), nadaj mu nazwę i wybierz odpowiedni kolor.
  4. Zdefiniuj zakres progowy, który obejmuje strukturę zainteresowania (punkt menu Zakres | Zdefiniuj zakres) za pomocą suwaka.
  5. Wybierz odpowiedni tryb narzędzia do malowania ROI 2D lub 3D (ROI Painter | Opcja pędzla).
  6. Aby namalować obszar zdefiniowany przez próg, naciśnij i przytrzymaj Ctrl, przytrzymując jednocześnie lewy myszy. Aby usunąć obszar, naciśnij i przytrzymaj Shift, przytrzymując jednocześnie lewy myszy.
    UWAGA: Aby zmienić rozmiar okrągłego lub kwadratowego pędzla, po prostu przewiń kółko myszy, przytrzymując Ctrl lub Shift.
  7. Kontynuuj malowanie interesującej Cię struktury przez cały tom Z.
  8. Przekształć ROI w siatkę (punkt menu Eksport | Do siatki | Normalny).
  9. Podświetl nakładkę siatki, klikając ją w panelu Właściwości i ustawienia danych w prawym górnym rogu.
  10. Wygładź siatkę za pomocą odpowiedniej liczby iteracji (Gładka siatka | Iteracje).
    UWAGA: Użyj tej samej wartości iteracji wygładzania siatki dla wszystkich obrazów, które mają być porównywane.
  11. Upewnij się, że pomiary ROI siatki (powierzchnia, objętość i średnica Feret) są wyświetlane w panelu informacyjnym po prawej stronie ekranu w celu przeprowadzenia podstawowej analizy morfometrycznej. Dodatkową analizę można przeprowadzić za pomocą Modułu Analizy Obiektowej.
  12. Renderuj obiekt siatki i cały obraz tomogramu i wizualizuj go w 3D. Użyj wbudowanego programu Movie Maker, aby wygenerować wideo obiektu (Prawy przycisk myszy | Pokaż program Movie Maker) przy użyciu pojedynczych klatek z poziomu przeglądarki (Dodaj klucz).
    UWAGA: Do filmu można również zastosować kilka ulepszeń wizualnych za pomocą karty efektów wizualnych w panelu po prawej stronie, aby wyróżnić niektóre funkcje itp.
  13. Wyeksportuj wideo do wyświetlenia za pomocą przycisku Eksportuj animację w programie Movie Maker.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia obrazy embrionu, larw 3rd stadium, poczwarek w stadium pharate (P7) oraz dorosłej samicy muchy, zabarwionych jodem i obrazowanych w stanie uwodnienia w wodzie przy użyciu komercyjnego skanera blatowego. Widoczna jest doskonała konserwacja i równomierne barwienie delikatnych tkanek, co pozwala na łatwą identyfikację wszystkich głównych organów i ich wykorzystanie do analizy morfometrycznej oraz wizualizacji 3D.

Zazwyczaj skany pozyskujące mniejszą liczbę obrazów projekcyjnych preparatu zapewniają niższą rozdzielczość niż skany pozyskujące więcej obrazów projekcyjnych, a kompromisem jest czas poświęcony na skanowanie. Choć czas skanowania różni się w zależności od urządzenia i innych parametrów obrazowania, skanowanie obejmujące kilkaset projekcji (rozmiar piksela obrazu ~3 µm) trwa około 30 min na preparat, podczas gdy skanowanie składające się z tysięcy obrazów projekcyjnych (rozmiar piksela obrazu 700 nm-1,25 µm) może trwać od 8 do 16 h. Porównanie tej samej głowy dorosłej muchy wykonane w trybie skanowania „wolnym” (tysiące projekcji) oraz „szybkim” (setki projekcji) przedstawiono na Rysunku 3. Co ważne, analizy morfometryczne nie różnią się między skanami „wolnymi” a „szybkimi” (Rysunek 3C)40. Nasz schemat obrazowania wykorzystuje zatem szybkie skanowanie w celu uzyskania wystarczająco dużej liczby próbek do analizy morfometrycznej oraz wolne skanowanie do wizualizacji wszelkich wad morfologicznych lub anatomicznych w wyższej rozdzielczości. Przy użyciu oprogramowania (Krok 7) dowolną tkankę lub układ organów można wysegmentować i wykorzystać do analizy morfometrycznej oraz zwizualizować w 3D za pomocą narzędzia do tworzenia filmów (Film 1).

Rysunek 4 przedstawia przykład odwłoka muchy barwionego PTA i obrazowanego w stanie uwodnionym (w wodzie) lub po suszeniu w punkcie krytycznym (CPD) za pomocą mikroskopu rentgenowskiego (Tabela materiałów). Szczegółowość zapewniona przez połączenie PTA i możliwości tej platformy jest wyraźnie widoczna na obrazach, dzięki czemu łatwo można rozróżnić poszczególne komórki nabłonka jelita środkowego oraz pęczki plemników w jądrach. Chociaż obraz po CPD wykazuje nieznacznie wyższą rozdzielczość w porównaniu z próbką uwodnioną, lepsza konserwacja ultrastruktury delikatnych tkanek (takich jak komórki tłuszczowe w pobliżu kutykuli) jest osiągana w próbkach uwodnionych (Film 2).

figure-results-1
Rycina 1: Przegląd konstrukcji skanera i montażu próbki do µ-CT. (A) Komercyjny laboratoryjny skaner µ-CT. (B) Widok wnętrza skanera. Źródło promieni rentgenowskich (po prawej) emituje promienie X, które przechodzą przez próbkę umieszczoną na obrotowym stole (żółta strzałka). Osłabienie tych promieni generuje kontrast obrazu podczas przechodzenia przez próbkę na detektor, który składa się z ekranu scyntylacyjnego przekształcającego promieniowanie rentgenowskie w fotony oraz standardowej kamery CCD (po lewej). (C) Montaż dorosłej muszki owocowej do obrazowania w stanie uwodnionym w wodzie. Punkty połączenia między końcówką pipety a mosiężnym uchwytem są owinięte folią parafinową, aby zapobiec wyciekom i potencjalnemu uszkodzeniu skanera. Zaznaczono również uchwyt stołu. Należy zauważyć, że końcówka pipety została ustawiona lekko poza osią, co doprowadziło do wydłużenia czasu skanowania i zmniejszenia rozdzielczości w końcowej rekonstrukcji. (D) Pojedynczy obraz projekcji 2D dorosłej samicy muszki; setki lub tysiące takich projekcji są pozyskiwane podczas skanowania wzdłuż osi obrotu i wykorzystywane do rekonstrukcji w celu wygenerowania tomogramów o izotropowej rozdzielczości i dokładnych informacjach 3D. Pasek skali (C) = 2 mm. P, tylny (posterior); V, brzuszny (ventral). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Schoborg et al.40. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Wszystkie stadia cyklu życiowego Drosophila melanogaster, obrazowane za pomocą µ-CT. Próbki barwione jodem i obrazowane w stanie uwodnionym w wodzie. Przedstawiono pojedynczy przekrój 2D. (A) Embrion po zakończeniu wczesnych etapów gastrulacji (gwiazdka). (B) Larwa trzeciego stadium. (C) P7 pharate adult podczas metamorfozy. (D) Dorosła samica. Wyróżniono różne organy: BWM, mięśnie ściany ciała; Br, mózg; Cd, cardia; Cr, wole; DLMs, grzbietowe mięśnie podłużne; DVM, mięśnie grzbietowo-brzuszne; E-AD, tarczka oka i anteny; Em, embrion; FB, ciała tłuszczowe; FBCs, komórki ciała tłuszczowego; H, serce; Hg, jelito tylne; La, lamina; L, noga; Mg, jelito środkowe; OL, płat optyczny mózgu; Ov, wywijak; PC, kutykula poczwarki; SG, gruczoły ślinowe; VNC, brzuszny sznur nerwowy; W, skrzydło; WD, tarczka skrzydłowa. Paski skali (A) = 100 µm; (B)-(D) = 500 µm. D, grzbietowo (Dorsal); A, przednio (Anterior); L, lewo (Left). Parametry skanowania: Odległość źródła od próbki (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Odległość źródła od kamery (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Rozmiar piksela kamery (µm): (A-D) 11.6. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Parametry skanowania i rozdzielczość obrazu nie zmieniają analiz morfometrycznych. Głowa dorosłego osobnika zeskanowana przy użyciu zarówno (A, A’) „szybkich” ustawień skanera (setki projekcji), jak i (B, B’) „wolnych” ustawień skanera (tysiące projekcji). Mózg jest obrysowany na żółto. (C) Pomiary objętości mózgu z wolnych i szybkich skanów. Wyróżnione struktury: AL, płat antenowy; CB, centralny mózg; FB, ciało wachlarzowate; FCs, komórki tłuszczowe; La, lamina; Lo, lobula; LoP, płyta lobuli; Me, medula; Re, siatkówka. n = 5, test t Welcha. ns = brak istotności statystycznej. Paski skali = 100 µm. Parametry skanowania: Odległość od źródła do próbki (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Odległość od źródła do kamery (mm): (A) 348 (B) 350. Rozmiar piksela kamery (µm): (A-B) 11.6. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A) 2.95, (B) 1.2. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Schoborg et al.40. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Brzuch Drosophila melanogaster obrazowany za pomocą mikroskopii rentgenowskiej. Brzuchy barwiono 0,5% PTA i obrazowano w stanie uwodnionym (woda) lub po suszeniu w punkcie krytycznym (CPD). (A) Brzuch suszony w punkcie krytycznym, przedstawiony w perspektywie YZ oraz (A’) w perspektywie XZ. (B) Brzuch uwodniony, przedstawiony w perspektywie YZ oraz (B’) w perspektywie XZ. Wyróżniono różne organy: FC, komórki tłuszczowe; Hg, jelito tylne; Mg, jelito środkowe; SP, pompa plemników; Te, jądra. Paski skali (A) = 250 µm. D, grzbietowy; A, przedni; L, lewy. Parametry skanowania: odległość od źródła do próbki (mm): (A) 6,7, (B) 7. Odległość od źródła do kamery (mm): (A) 28 (B) 29,5. Obiektyw: (A-B) 4X. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A-B) 0,65. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film 1: Larwa trzeciego stadium rozwojowego, przedstawiona w 3D przy użyciu Movie Maker w programie Dragonfly. Wyróżnione organy obejmują mózg (żółty), krążki imaginalne oka i czułka (czerwone), ciało tłuszczowe (niebieskie) oraz mięśnie ściany ciała (zielone). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Porównanie próbek obrazowanych w wodzie lub po suszeniu w punkcie krytycznym. Przedstawiono odwłoki barwione 0,5% PTA. Oba odwłoki zostały przeskanowane przy identycznych ustawieniach rozmiaru piksela obrazu (0,65 µm). Seria przekrojów 2D jest pokazana w formacie „Z-stack” (YZ), zaczynając od powierzchni grzbietowej, a kończąc na powierzchni brzusznej odwłoka. Wyróżnione organy: FC, komórki tłuszczowe; Mg, jelito środkowe; SP, pompa plemników; Te, jądra. Parametry skanowania: Odległość źródła od próbki (mm): (A) 6,7, (B) 7. Odległość źródła od kamery (mm): (A) 28 (B) 29,5. Obiektyw: (A-B) 4X. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A-B) 0,65. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Wizualizacja nienaruszonego Drosophila melanogaster na wszystkich etapach rozwoju pozostała wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na niezgodność mikroskopii świetlnej z grubym, pigmentowanym naskórkiem znajdującym się u tego zwierzęcia. Podczas gdy inne metody obrazowania całych zwierząt, takie jak rezonans magnetyczny (MRI), optyczna tomografia koherentna (OCT) i ultramikroskopia w połączeniu z oczyszczaniem tkanek były z powodzeniem stosowane u muszek 50,51,52,53,54, μ-CT ma szereg zalet, które czynią go idealnym do obrazowania całego organizmu u całych zwierząt 13,15,30. Promienie rentgenowskie z łatwością przenikają przez pigmentowany naskórek, a ich mała długość fali pozwala na obrazowanie submikronowe. Etykietowanie wymaga minimalnych inwestycji w powszechnie dostępne chemikalia i nie wymaga specjalistycznych umiejętności laboratoryjnych13. Skanery μ-CT są również dostępne na rynku, a ich koszty są porównywalne z platformami do mikroskopii świetlnej, a jednocześnie są bardziej atrakcyjne dla szerszego zakresu dyscyplin (geologia, paleontologia, inżynieria itp.), które również mogą skorzystać z ich dostępności w instytucji. Synchrotronowe źródła promieniowania rentgenowskiego mogą być również wykorzystywane do obrazowania μ-CT o wysokiej rozdzielczości owadów stacjonarnych i żywych31,55,56, ale są mniej dostępne niż komercyjne skanery stacjonarne.

Protokół ten zapewnia skuteczny sposób uzyskiwania obrazów μ-CT dorosłych much, poczwarek, larw i zarodków komórkowych. Należy pamiętać, że w przypadku wielu kroków opisanych powyżej można również zastosować alternatywne metody w celu przygotowania próbek do obrazowania. Inne badania dostarczyły szczegółowego porównania różnych etapów utrwalania, etykietowania i suszenia do stosowania u owadów, a osoby zainteresowane zastosowaniem tej techniki są zachęcane do oceny zalet każdego podejścia 1,4,13,29,30,57. Chociaż ten protokół jest stosunkowo prosty, przedstawiono kilka pomocnych sugestii.

Po pierwsze, należy zachować ostrożność podczas naruszania naskórka nienaruszonych próbek, tak aby leżące pod nimi tkanki miękkie nie zostały znacząco naruszone. Ważne jest, aby przed szturchnięciem pozostawić larwy i wczesne stadia poczwarki na utrwalenie przez 2 godziny w roztworze Bouina. Spowoduje to usztywnienie tkanki i ograniczenie ilości hemolimfy, która będzie wyciekać z otworów naskórka, co może zmienić architekturę narządów. Poszczególne segmenty ciała (głowa, klatka piersiowa i brzuch) osoby dorosłej mogą być oddzielone, jeśli znajdują się tam interesujące struktury. Zaleca się użycie skalpela do czystego przecięcia tych segmentów, zamiast rozrywania ich kleszczami, co może zakłócić architekturę 3D na przykład jelit lub ośrodkowego układu nerwowego. Jeśli chodzi o czas, dorośli zazwyczaj potrzebują tylko 16 godzin. do całkowitego utrwalenia, natomiast stadia larwalne i poczwarkowe potrzebują 24 godzin. Ponadto, jeśli barwienie jodem lub PTA wydaje się nierówne, próbkę można ponownie umieścić w roztworze, aby inkubować dłużej, aż do uzyskania równomiernego barwienia. Wreszcie, uwodnionych próbek nie należy umieszczać w temperaturze 4 °C, ponieważ wydaje się, że powoduje to tworzenie się pęcherzyków powietrza w jamie ciała po ogrzaniu do temperatury pokojowej.

Po drugie, mocowanie próbki będzie się różnić w zależności od urządzenia, typu etapu i tego, czy próbka musi pozostać uwodniona, czy też została wysuszona w punkcie krytycznym. W przypadku uwodnienia upewnij się, że próbka nie przecieka i nie może zniszczyć skanera. Podczas umieszczania próbki w końcówce pipety należy pamiętać o delikatnym dociskaniu stępionym przedmiotem, aż próbka napotka niewielki opór i nie będzie mogła się poruszać. Zbyt mocne naciskanie może prowadzić do deformacji naskórka i leżących u jego podstaw wad strukturalnych. Upewnij się również, że próbka jest wyrównana w uchwycie jak najbliżej osi obrotu. Każde chybotanie wydłuży czas skanowania ze względu na większe pole widzenia i zmniejszy rozdzielczość końcowego tomogramu po rekonstrukcji.

Po trzecie, ustawienia skanera do pozyskiwania obrazów projekcyjnych również będą się różnić w zależności od instrumentu. Aby zmaksymalizować możliwości rozdzielcze skanera, rozmiar plamki wiązki promieniowania rentgenowskiego powinien być jak najmniejszy (5-10 μm). Można to osiągnąć poprzez zrównoważenie ustawień napięcia i prądu rentgenowskiego tak, aby całkowita moc wynosiła 3-4 W. Dzięki tym ustawieniom i odpowiedniemu czasowi naświetlania w aparacie można uzyskać odpowiednie tłumienie wiązki promieniowania rentgenowskiego przez próbkę i optymalny kontrast obrazu. Zastosowanie aluminiowych lub miedzianych filtrów między obiektem a źródłem promieniowania rentgenowskiego może być wykorzystane do precyzyjnego dostrojenia optymalnych ustawień energii promieniowania rentgenowskiego w celu uzyskania najlepszego kontrastu obrazu lub wystarczającego tłumienia wiązki, aby można było zastosować źródła o większej mocy. Jeśli chodzi o rozdzielczość obrazu, będzie ona zależeć od wielu różnych zmiennych, w tym rodzaju plamy, liczby obrazów projekcyjnych, rozmiaru pikseli obrazu, pozycji kamery, ruchu próbki, drgań skanera i parametrów rekonstrukcji. Fantom wzoru pręta (QRM GmbH) zawierający znaczniki o znanym rozmiarze może pomóc w ocenie rozdzielczości przestrzennej dla danego ustawienia skanera i kamery.

Warto również ocenić zalety obrazowania próbek wysuszonych lub uwodnionych w punkcie krytycznym. Sombke i in. przeprowadzili ocenę porównawczą obu metod i stwierdzili, że suszenie w punkcie krytycznym jest lepsze w przypadku zastosowań μ-CT z udziałem stawonogów30. Jednak zaletą uwodnionych próbek jest to, że zwierzęta są poddawane mniejszemu narażeniu chemicznemu i mechanicznemu, co może prowadzić zarówno do artefaktów ilościowych, jak i morfologicznych. Ma to również tendencję do lepszej ochrony delikatnych tkanek niż CPD. Jednak uwodnione próbki mają znacznie krótszy okres trwałości i powinny być obrazowane nie później niż miesiąc po utrwaleniu, ponieważ degradacja tkanek i obniżona jakość obrazu stają się oczywiste w tym momencie. Ponadto rozdzielczość uwodnionych próbek będzie nieco mniejsza niż w przypadku próbki wysuszonej w punkcie krytycznym, ponieważ promienie rentgenowskie muszą również przenikać zarówno przez plastikową końcówkę pipety, jak i przez otaczającą ciecz (wodę lub bufor). Próbki suszone w punkcie krytycznym mogą być przechowywane przez znacznie dłuższy czas, zwłaszcza gdy są przechowywane na Drierite. Można je również umieścić bezpośrednio na ścieżce wiązki promieniowania rentgenowskiego, po prostu przyklejając skrzydła lub nogi do szpilki przeciw owadom i umieszczając ją w uchwycie scenicznym, upraszczając proces montażu. Jednak znaczne odwodnienie etanolem w tych próbkach może prowadzić do kurczenia się tkanek i utraty delikatnej architektury tkanek, dlatego ważne jest, aby wykonać szereg zwiększających się stężeń EtOH w celu zminimalizowania tych skutków. Niemniej jednak należy zauważyć, że wszystkie formy obróbki chemicznej, w tym utrwalanie paraformaldehydu, a nawet barwienie jodem, mogą powodować kurczenie się tkanek58,59. Chociaż żadna z tych metod nie dostarczy pomiarów "rzeczywistej wielkości narządu" u żywej muchy, pomiary morfometryczne są nadal ważne przy porównywaniu zwierząt zmutowanych i dzikich typów, o ile etapy utrwalania, barwienia i suszenia są przeprowadzane identycznie dla obu zestawów próbek - najlepiej równolegle.

Podsumowując, μ-CT zapewnia użyteczne narzędzie do obrazowania całych zwierząt dla Drosophila 33,34,35,36,37,38,39,40,41. Wiele innych badań wykazało moc tej technologii w zrozumieniu różnych aspektów taksonomii, ekologii, fizjologii, rozwoju i anatomii owadów, które mogą pomóc w przyszłych badaniach na muchach 1,28,30,31,32,55,56,57 . W połączeniu z narzędziami do mikroskopii genetycznej i świetlnej, które są już szeroko stosowane w tym organizmie, μ-CT może pozycjonować się w procesie eksperymentalnym, który pozwala na głębsze zrozumienie genotypu i fenotypu.

Oświadczenia

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów lub interesów finansowych.

Podziękowania

Nic z tego nie byłoby możliwe bez wsparcia Nassera Rusana. Chciałbym podziękować H. Dougowi Morrisowi, Danielle Donahue i Brendzie Klaunberg z NIH Mouse Imaging Facility oraz Benowi Ache z Micro Photonics za szkolenie i pomocną dyskusję. Dziękuję również Mansourehowi Norouzi Rad z firmy Zeiss za skanowanie próbek z jamy brzusznej za pomocą aparatu Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith i Rachel Ng również pomagały w skanowaniu. Mike Marsh z Object Research Systems zapewnił wsparcie techniczne dla Dragonfly. Jestem również wdzięczny za wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (1K22HL137902-01) oraz funduszy na rozpoczęcie działalności z University of Wyoming. Dziękuję również anonimowym recenzentom za ich pomocne sugestie i komentarze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% etanolDo suszenia w punktach krytycznych
Rozwiązanie BouinaSigma-AldrichHT10132Do fiksacji zwierząt
SuszarkaSuszenie próbek metodą punktu krytycznego; dostępnych jest wiele opcji (Balzers CPD 020 lub Leica EMCPD300)
Oprogramowanie DragonflySystemydo badań obiektowychDo wizualizacji i segmentacji zbiorów danych mikro-CT;
https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html BlokDo probówek mikrofuge
StacjaPowinna zawierać wystarczającą ilość pamięci RAM i wysokiej jakości kartę graficzną do renderowania 3D
Roztwór jodu (I2KI)Fisher ScientificSI86-1Do barwienia
Skaner tomografii mikrokomputerowejBrukerSkyscan 1172Geometria promieniowania rentgenowskiego w kształcie stożka; detektor to kamera Hamamatsu 10 MP z 11,54 &mikro; m rozmiar piksela.
Oprogramowanie do tomografii mikrokomputerowejBrukerDo sterowania samym skanerem (np. Wykonywanie poprawek płaskiego pola, mocy lampy rentgenowskiej, czasów wygaśnięcia kamery, akwizycji itp.)
Minutien PinsFine Science Tools26002-15Do wybijania w naskórku
Oprogramowanie do rekonstrukcji obrazu NReconBrukerSłuży do rekonstrukcji obrazów przekrojów poprzecznych z obrazów projekcyjnych 2D wykonanych za pomocą geometrii rentgenowskiej wiązki stożkowej
Końcówki do pipet P10Genesee Scientific24-120Montaż próbki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemResarch Products InternationalP32060-4000.0Rozcieńczyć do 1X wodą przed użyciem
Hydrat kwasu fosfatungstycznegoSigma-Aldrich79690-25gDo barwienia
uchwytu na szpilkiFine Science Tools26018-17Do szpilek Minutien
Triton X-100Research Products International111036Do usuwania woskowego nalotu z dorosłych much (jako 0,5% PBST)
Mikroskop rentgenowskiZeissXradia 520 Geometria promieniowaniarentgenowskiego Versa Cone-beam z soczewkami obiektywowymi ze strefą Fresnela do Resoluton na odległość (RaaD™)
do punktów krytycznych grzewczy robocza do analizy obrazu

Bibliografia

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686(2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144(2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21(2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2(2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612(1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531(2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898(2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768(2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380(2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087(2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817(2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557(2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213(2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1(2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6(2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa analiza morfometrycznaskanowanie rentgenowskiesuszenie w punkcie krytycznymbarwienie roztworem Bouinamikroskopia elektronowamikroskopia wietlnarekonstrukcja obrazu

Powiązane artykuły