Ten manuskrypt opisuje protokół minimalnej objętości witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów za pomocą laboratoryjnych pożywek na komercyjnych podłożach. Obejmuje każdy etap, od izolacji oocytów od gonad ex vivo po witryfikację i ocieplenie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W programach ochrony dzikich zwierząt, bankowanie gamet jest kluczowe dla ochrony zasobów genetycznych cennych osobników i rzadkich gatunków oraz dla promowania zachowania różnorodności biologicznej. U kotowatych większość gatunków jest zagrożona wyginięciem, a rasy domowe są wykorzystywane jako model zwiększający skuteczność protokołów bankowania plazmy zarodkowej. Wśród technik kriokonserwacji oocytów witryfikacja jest coraz bardziej popularna w rozrodzie wspomaganym przez ludzi i weterynarzy. Wykazano, że witryfikacja kriotopowa, która została pierwotnie opracowana dla ludzkich oocytów i zarodków, dobrze nadaje się do oocytów kotów. Metoda ta ma kilka zalet, takich jak wykonalność w warunkach polowych i szybkość procedury, co może być pomocne, gdy konieczne jest przetworzenie kilku próbek. Wydajność jest jednak silnie uzależniona od umiejętności operatora, potrzebna jest standaryzacja wewnątrz- i międzylaboratoryjna, a także szkolenie personelu. Protokół ten opisuje witryfikację niedojrzałych oocytów kotów o minimalnej objętości na komercyjnym podłożu w protokole przyjaznym dla pola krok po kroku, od pobrania oocytów do ocieplenia. Zgodnie z protokołem można oczekiwać zachowania integralności i żywotności oocytów w momencie ocieplenia (nawet do 90%), chociaż nadal istnieje możliwość poprawy wyników dojrzewania i rozwoju embrionalnego po ociepleniu.
Wprowadzenie
Kriokonserwacja stała się kluczowym krokiem technik wspomaganego rozrodu (ARTs). U ludzi pozwala na zachowanie płodności lub odroczenie rodzicielstwa z powodów medycznych lub osobistych. U zwierząt konieczne jest pokonywanie odległości i czasu w planowanych kryciach, zwłaszcza u zwierząt gospodarskich i domowych, lub zachowanie materiału genetycznego cennych podmiotów w programach ochrony, szczególnie u dzikich gatunków zagrożonych. Kriokonserwacja gamet jest najlepszym wyborem, gdy osobniki, które mają być hodowane, nie zostały jeszcze wybrane lub w celu uniknięcia problemów etycznych związanych z zamrażaniem zarodków, zwłaszcza w medycynie ludzkiej....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przedstawione tutaj procedury nie uzyskały aprobaty etycznej, ponieważ jajniki kotów były pobierane w klinikach weterynaryjnych jako produkty uboczne rutynowej wycięcia jajników lub owariohisterektomii, na życzenie właściciela.
1. Kolekcja oocytów
- Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przygotować roztwory do pobrania jajników i komórek jajowych. Przygotować roztwór do pobierania jajników z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z mieszaniną antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych (100 j.m./ml sodu penicyliny G, 0,1 mg/ml siarczanu streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B). Przygotować roztwór do pobierania oocytów (tj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po witryfikacji i rozmrażaniu oocytów kota zgodnie z niniejszym protokołem (Rysunek 1 i Rysunek dodatkowy 1), ogromna większość gamet przeżywa. Po witryfikacji, wśród innych technik, żywotność można ocenić pod mikroskopem optycznym jako integralność morfologiczną22 lub z użyciem barwników witalnych. Jednym z nich jest diacetan fluoresceiny/jodek propidyny (FDA/PI), który umożliwia identyfikację komórek żywych (intensywna zielona fluorescencja) i martw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kriokonserwacja oocytów jest kluczową techniką konserwacji plazmy zarodkowej, zwłaszcza w taksonach, w których wiele gatunków jest zagrożonych, takich jak rodzina kotowatych. W pracy przedstawiono prosty i przyjazny w praktyce protokół witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów. Pożywki laboratoryjne, środki wspomagające witryfikację o minimalnej objętości oraz przeszkolony personel są kluczowymi czynnikami sukcesu tej metody, która pozwala na konsekwentne i powtarzalne uzyskiwanie żywotnych oocytów, jak pokazują reprezent.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez EVSSAR (Europejskie Towarzystwo Weterynaryjne ds. Rozrodu Małych Zwierząt) Grant 2016 oraz przez Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Pragniemy również podziękować dr Marii Giorgii Morselli za jej wkład w przedstawione tu eksperymenty i pozyskiwanie obrazów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amfoterycyna B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Pipety i końcówki automatyczne | / | / | Potrzebne do pipetowania 20, 100, 240 i 300 &mikro; L |
| Skalpele chirurgiczne | / | / | Rozmiar 10 jest zwykle ok |
| Dziób Bunsena | / | / | / |
| Zaciski | / | / | Niektóre małe (zacisk na komary) do izolacji jajników, niektóre większe (zacisk Klemmera) do pracy w ciekłym azocie |
| Cryotop | Kitazato (dystrybutor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Dystrybutorzy i numer katalogowy mogą ulec zmianie w różnych krajach |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Glikol etylenowy (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Szklane pipety Pasteura | / | / | Zalecana długość 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | Zgodnie z kanistrami zbiornika magazynowego |
| Etap ogrzewania | / | / | Wszystkie etapy ogrzewania są w porządku, o ile mogą utrzymać 38º C |
| Ciekły azot/ | / | ||
| /Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicylina G sodu | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Alkohol poliwinylowy (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Płytka | reprograficznaKitazato (dystrybutor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Dystrybutorzy i numer katalogowy mogą ulec zmianie w różnych krajach |
| Mikroskop stereoskopowy | / | / | Tak długo, jak operator może wybrać oocyty, inne mikroskopy stereoskopowe są w porządku |
| Zbiornik magazynowy | / | / | Każdy regularnie napełniany zbiornik jest w porządku |
| Siarczan streptomycyny | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styropian/skrzynka odporna na azot | / | / | Wszystkie skrzynki, które mogą zawierać ciekły azot, są w porządku, o ile operator czuje się komfortowo. Pudełko Kitazato nazywa się "Stojak chłodzący" |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timery | / | / Wszystkie timery, które można ustawić na czasy, aż 9 minut będzie w porządku |
Bibliografia
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
