Artykuł metodologiczny

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

DOI:

10.3791/61527

⸱

30 czerwca 2020

 , 
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest kluczowym elementem zarówno w zdarzeniach fizjologicznych, jak i patologicznych. Normalna migracja komórek jest wymagana do podstawowych funkcji, takich jak rozwój i narastanie odpowiedzi immunologicznej. Kiedy w procesie migracji komórek dochodzi do defektu lub zmiany, może to mieć szkodliwe skutki (np. przerzuty raka, gojenie się ran i tworzenie blizn). Ze względu na znaczenie migracji komórek konieczne jest posiadanie dostępu do testu migracji komórek, który jest niedrogi, elastyczny i powtarzalny. Wykorzystując powszechny test migracji zarysowującej, opracowaliśmy nowe podejście do analizy migracji komórek, które wykorzystuje ogólny sprzęt laboratoryjny. Opisana metoda wykorzystuje markery wizualne, które pozwalają na ponowne uchwycenie określonych obszarów zainteresowania bez użycia mikroskopii poklatkowej. Ponadto zapewnia elastyczność w projektowaniu eksperymentu, począwszy od zmiany substratu macierzy migracyjnej, a skończywszy na dodaniu modyfikatorów farmakologicznych. Ponadto protokół ten nakreśla sposób uwzględnienia obszaru migracji komórek, który nie jest brany pod uwagę przez kilka metod podczas badania migracji komórek. To nowe podejście oferuje szerszej publiczności test migracji zarysowej i zapewni naukowcom większe możliwości zbadania fizjologicznego i patofizjologicznego wpływu migracji komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest kluczowa dla wielu fizjologicznych i patologicznych zdarzeń. Jest wymagany podczas rozwoju, do wywołania odpowiedzi immunologicznej i do prawidłowego gojenia się ran1,2,3. Wiele z tych zdarzeń migracji komórek może być wywołanych przez sygnały fizyczne lub chemiczne. Na przykład podczas odpowiedzi immunologicznej leukocyty migrują w kierunku miejsca urazu w odpowiedzi na chemoatraktant2. Dodatkowo leukocyty będą również uwalniać cytokiny w celu wywołania migracji dodatkowych komórek odpornościowych, a także innych typów komórek, t....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólna hodowla komórkowa

  1. Hodowla fibroblastów serca w zmodyfikowanej pożywce Eagles (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 1 g/l glukozy, pirogronian sodu, L-glutaminę i uzupełniona 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2% L-glutaminy i 0,02% odczynnika przeciwdrobnoustrojowego (patrz tabela materiałów) i utrzymywane w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Hodowla fibroblastów serca do osiągnięcia 90-95% zbiegu w pasażu 0 (P0). W tym momencie fibroblasty są gotowe do rozszczepienia na 48-dołkową płytkę, która jest używana do testu migracji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura dokumentuje nowe podejście do badania migracji komórek, które jest zarówno opłacalne, jak i łatwe do dostosowania dla większości laboratoriów. W wielu badaniach wykorzystano mikroskopię poklatkową do oceny migracji komórek, ale sprzęt wymagany do tej metody nie jest łatwo dostępny dla wielu laboratoriów. Natomiast wykorzystanie linii i kresek do rozgraniczenia pozwala na ponowne uchwycenie określonych obszarów zainteresowania w różnych punktach czasowych bez użycia drogiego sprzętu ( Rysu.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To nowe podejście do testu migracji zarysowania zapewnia naukowcom bardziej dostępną metodę badania zmian w migracji komórek. Chociaż test ten jest zgodny z tą samą procedurą podawania zadrapania, podobną do innych testów zadrapań, zapewnia nową metodę obrazowania i dokładnej analizy migracji komórek10. Zamiast korzystać z metod mikroskopii poklatkowej i komór do obrazowania żywych komórek, metoda ta szczegółowo opisuje użycie powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego. Korzystając z ogólnego .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Nagrodę Badań Medycznych Armii Stanów Zjednoczonych #81XWH-16-1-0710, Szkołę Farmacji Uniwersytetu Mississippi oraz Wydział Nauk Biomolekularnych.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adobe Wszystkie aplikacjeAdobeObejmuje to Adobe Photoshop, który jest oprogramowaniem do obrazowania używanym z tym protokołem
Avant Pipette Tips 200ul Binding niesterylneMIDSCIAVR1Końcówki są autoklawowane w celu sterylizacji
AxioCam Erc 5s CameraZeiss426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250Fisher ScientificBP101-25
Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem 48 dołkówFisher Scientific07-200-86
DMEM z L-glutaminą, glukozą 1 g / l i pirogronianem soduFisher ScientificMT10014CM
Obraz JNIHJest to darmowe oprogramowanie oferowane przez rząd USA i jest oprogramowaniem analitycznym używanym z tym protokołem
ParaformaldehydFisher ScientificAC416785000
Najwyższej jakości płodowa surowica bydlęca pochodzenia amerykańskiegoInnowacyjne badaniaIFBS-HU
PrimocinInvivoGENant-pm-2Jest to środek przeciwdrobnoustrojowy stosowany z tym prokotolem do hodowli fibroblastów serca
Mikroskop Zeiss PrimovertOprogramowanie Zeiss491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3Oprogramowanie Zeissjest dostarczane z zakupem aparatu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza migracji kom rekfibroblasty sercaprzygotowanie p ytki do migracjimikroskopia odwr conaoprogramowanie do analizy obrazukwantyfikacja w programie Photoshoppomiar obszaru migracjimodyfikatory farmakologicznepod o e z nisk zawarto ci surowicy

Powiązane artykuły