Chromatograficzne odciski palców poprzez dopasowanie szablonu do danych zebranych za pomocą kompleksowej dwuwymiarowej chromatografii gazowej

Podsumowanie

Ten protokół prezentuje podejście do odcisku palca i eksploracji wielowymiarowych danych zebranych przez wszechstronną dwuwymiarową chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas. Dedykowane algorytmy rozpoznawania wzorców (dopasowywanie szablonów) są stosowane do badania informacji chemicznych zaszyfrowanych we frakcji lotnej oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia (tj. lotatylomie).

Streszczenie

Przetwarzanie i ocena danych są kluczowymi etapami kompleksowej dwuwymiarowej chromatografii gazowej (GCxGC), szczególnie w połączeniu ze spektrometrią mas. Bogate informacje zaszyfrowane w danych mogą być bardzo cenne, ale trudno jest uzyskać do nich efektywny dostęp. Gęstość i złożoność danych może prowadzić do długiego czasu opracowywania i wymagać pracochłonnych procedur zależnych od analityków. Skuteczne, a jednocześnie dostępne narzędzia do przetwarzania danych są zatem kluczem do umożliwienia rozpowszechnienia i akceptacji tej zaawansowanej wielowymiarowej techniki w laboratoriach do codziennego użytku. Protokół analizy danych przedstawiony w tej pracy wykorzystuje chromatograficzny odcisk palca i dopasowywanie szablonów, aby osiągnąć cel, jakim jest wysoce zautomatyzowana dekonstrukcja złożonych dwuwymiarowych chromatogramów na indywidualne cechy chemiczne w celu zaawansowanego rozpoznawania wzorców informacyjnych w poszczególnych chromatogramach i w zestawach chromatogramów. Protokół zapewnia wysoką spójność i niezawodność przy niewielkiej interwencji. Jednocześnie nadzór analityków jest możliwy w różnych ustawieniach i funkcjach ograniczeń, które można dostosować, aby zapewnić elastyczność i zdolność do dostosowywania się do różnych potrzeb i celów. Pokazano tutaj, że dopasowywanie szablonów jest potężnym podejściem do badania volatilome oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia. Wyrównanie krzyżowe pików jest przeprowadzane nie tylko dla znanych celów, ale także dla związków niedocelowych, co znacznie zwiększa moc charakteryzowania w szerokim zakresie zastosowań. Przedstawiono przykłady w celu udowodnienia wydajności klasyfikacji i porównania wzorców chromatograficznych z zestawów próbek analizowanych w podobnych warunkach.

Wprowadzenie

Kompleksowa dwuwymiarowa chromatografia gazowa w połączeniu z detekcją metodą spektrometrii mas czasu przelotu (GC×GC-TOF MS) jest obecnie najbardziej pouczającym podejściem analitycznym do chemicznej charakterystyki złożonych próbek1^,2,3,4,5. W GC×GC kolumny są połączone szeregowo i połączone za pomocą modulatora (np. interfejsu ogniskowania opartego na termice lub zaworze), który wychwytuje składniki eluujące z kolumny pierwszego wymiaru (¹D) przed ich ponownym wstrzyknięciem do kolumny drugiego wymiaru (²D). Ta operacja jest wykonywana w ustalonym okresie modulacji (P_M), zwykle w zakresie od 0,5 do 8 s. Dzięki modulacji termicznej proces obejmuje kriopułapkowanie i skupianie pasma eluującego, co przynosi pewne korzyści dla ogólnej mocy separacji.

Chociaż GC×GC jest techniką dwuwymiarowej separacji, proces ten generuje sekwencyjne wartości danych. Przetwornik analogowo-cyfrowy (A/D) detektora uzyskuje sygnał chromatograficzny wyjściowy o określonej częstotliwości. Następnie dane są przechowywane w określonych zastrzeżonych formatach, które zawierają nie tylko zdigitalizowane dane, ale także powiązane metadane (informacje o danych). Przetwornik A/C stosowany w systemach GC×GC pomaga w odwzorowaniu natężenia sygnału chromatograficznego na liczbę cyfrową (DN) w funkcji czasu w dwóch wymiarach analitycznych. Detektory jednokanałowe (np. detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID), detektor wychwytu elektronów (ECD), detektor chemiluminescencji siarki (SCD) itp.) generują pojedyncze wartości na czas próbkowania, podczas gdy detektory wielokanałowe (np. detektor spektrometryczny mas (MS)) wytwarzają wiele wartości (zwykle w zakresie spektralnym) na czas próbkowania w całym przebiegu analitycznym.

Aby zobrazować dane ^2D, opracowanie rozpoczyna się od rasteryzacji pojedynczych wartości danych okresu (lub cyklu) modulacji jako kolumny pikseli (elementów obrazu odpowiadających zdarzeniom detektora). Wzdłuż rzędnej (oś Y, od dołu do góry) wizualizowany jest czas separacji ²D. Kolumny pikseli są przetwarzane sekwencyjnie, tak aby odcięte (oś X, od lewej do prawej) zgłaszały czas separacji ¹D. Ta kolejność przedstawia dane ^2Dw prawoskrętnym kartezjańskim układzie współrzędnych, z porządkowym ^{przechowywania 1}D jako pierwszym indeksem w tablicy.

Przetwarzanie danych z chromatogramów ²D daje dostęp do wyższego poziomu informacji niż dane surowe, umożliwiając wykrywanie pików ^2D, identyfikację pików, ekstrakcję danych odpowiedzi do analizy ilościowej i analizę porównawczą.

Wzorce pików ²D mogą być traktowane jako unikalny odcisk palca próbki, a wykryte związki jako cechy drobiazgowe do efektywnej analizy porównawczej. To podejście, znane jako odcisk palca oparty na szablonie^6,7, zostało zainspirowane biometrycznym odciskiem palca⁶. Automatyczne biometryczne systemy weryfikacji odcisków palców opierają się w rzeczywistości na unikalnych cechach opuszków palców: rozwidleniach i końcach grzbietów, zlokalizowanych i wyodrębnionych z odcisków atramentu lub szczegółowych obrazów. Te cechy, nazwane cechami minucji, są następnie dopasowywane krzyżowo do dostępnych przechowywanych szablonów^8,9.

Jak wspomniano powyżej, każdy wzór separacji GC×GC składa się z ²pików D racjonalnie rozmieszczonych na dwuwymiarowej płaszczyźnie. Każdy pik odpowiada pojedynczemu analitowi, ma swój potencjał informacyjny i może być traktowany jako pojedyncza cecha do porównawczej analizy wzorców.

Tutaj prezentujemy skuteczne podejście do chemicznego odcisku palca metodą GC×GC-TOF MS z tandemową jonizacją. Celem jest kompleksowe i ilościowe skatalogowanie cech z zestawu chromatogramów.

W porównaniu z istniejącym oprogramowaniem komercyjnym lub wewnętrznymi procedurami^10,11, które wykorzystują podejście oparte na cechach szczytowych, odcisk palca oparty na szablonach charakteryzuje się wysoką specyficznością, wydajnością i ograniczonym czasem obliczeniowym. Ponadto ma wewnętrzną elastyczność, która umożliwia wyrównanie krzyżowe cech minucji (tj. pików ²D) między poważnie niewspółosiowymi chromatogramami, takimi jak te uzyskane przez różne oprzyrządowanie lub w badaniach długoterminowych^12,13,14.

Podstawowe operacje proponowanej metody są krótko opisane, aby przybliżyć czytelnikowi dobre zrozumienie złożoności wzorca ^2Di mocy informacyjnej. Następnie, badając matrycę danych wyjściowych instrumentu, przeprowadzana jest identyfikacja chemiczna i znane docelowe anality są umieszczane w przestrzeni dwuwymiarowej. Matryca docelowych pików jest następnie budowana i stosowana do serii chromatogramów uzyskanych w tej samej partii analitycznej. Metadane związane z czasami retencji, sygnaturami spektralnymi i odpowiedziami (bezwzględnymi i względnymi) są wyodrębniane z ponownie wyrównanych wzorców docelowych pików i przyjmowane w celu ujawnienia różnic kompozycyjnych w zestawie próbek.

Jako dodatkowy, unikalny etap procesu, na wcześniej ukierunkowanych chromatogramach przeprowadza się również połączone nieukierunkowane i ukierunkowane (UT) pobieranie odcisków palców, aby rozszerzyć potencjał odcisków palców zarówno na znane, jak i nieznane anality. W wyniku tego procesu powstaje szablon UT do naprawdę kompleksowej analizy porównawczej, którą można w dużej mierze zautomatyzować.

Jako końcowy krok, metoda przeprowadza krzyżowe wyrównanie cech w dwóch równoległych sygnałach detektora wytwarzanych przy wysokich i niskich energiach jonizacji elektronów (70 i 12 eV).

Protokół jest dość elastyczny w obsłudze analiz pojedynczego chromatogramu lub zestawu chromatogramów oraz z chromatografią zmienną i/lub wieloma detektorami. W tym przypadku protokół jest demonstrowany za pomocą dostępnego na rynku pakietu oprogramowania GC×GC (patrz Spis materiałów) połączonego z biblioteką MS i oprogramowaniem do wyszukiwania (patrz Spis materiałów). Niektóre z niezbędnych narzędzi są dostępne w innych programach, a podobne narzędzia mogą być zaimplementowane niezależnie od opisów w literaturze autorstwa Reichenbacha i współpracowników^{15,16,17,18,19}. Surowe dane do demonstracji pochodzą z badania naukowego nad oliwą z oliwek z pierwszego tłoczenia (EVO) przeprowadzonego w laboratorium autorów¹⁴. W szczególności frakcja lotna (tj. lotność) włoskich olejów EVO jest pobierana za pomocą mikroekstrakcji do fazy stałej w przestrzeni nadpowierzchniowej (HS-SPME) i analizowana za pomocą GC×GC-TOF MS w celu uchwycenia diagnostycznych odcisków palców w celu uzyskania kwalifikacji jakościowej i sensorycznej próbek. Szczegółowe informacje na temat próbek, warunków pobierania próbek i konfiguracji analitycznej znajdują się w tabeli materiałów.

Kroki 1–6 opisują wstępne przetwarzanie chromatogramów. Kroki 7–9 opisują przetwarzanie i analizę poszczególnych chromatogramów. Kroki 10–12 opisują tworzenie i dopasowywanie szablonów, które są podstawą analizy krzyżowej. Kroki 13–16 opisują zastosowanie protokołu do zestawu chromatogramów, z krokami 14–16 dla analizy UT.

Protokół

1. Importowanie surowych danych

UWAGA: To tworzy dwuwymiarową tablicę rastrową do wizualizacji i przetwarzania.

1. Uruchom oprogramowanie obrazu.
2. Wybierz punkt menu Plik | Przywóz; nawigować i wybierać plik danych surowych pozyskanych przez system GC×GC-TOF MS o nazwie "VIOLIN 101.lsc" (Plik uzupełniający 1); następnie kliknij przycisk Otwórz. Chromatogram otwiera się w tym oprogramowaniu.
   UWAGA: Format pliku danych surowych zależy od producenta urządzenia. Oprogramowanie importuje różne formaty plików wymienione w podręczniku użytkownika.
3. W oknie dialogowym Import ustaw Okres modulacji (P_M) na 3,5 s, a następnie kliknij OK.
   UWAGA: Niektóre programy do akwizycji mogą nie rejestrować okresu modulacji.
4. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz obraz jako; przejdź do żądanego folderu; wpisać nazwę "Olej 1 RAW.gci" (plik uzupełniający 2); następnie kliknij Zapisz.

2. Przesunięcie fazy modulacji

UWAGA: To umieszcza wszystkie piki w każdym cyklu modulacji w tej samej kolumnie obrazu, łącznie z pikami, które zawijają się pod koniec okresu modulacji, w czas pustki następnego okresu modulacji²⁰.

1. Wybierz punkt menu Przetwarzanie | Faza zmiany.
2. W oknie dialogowym Shift Phase (Faza przesunięcia) ustaw wartość Shift Amount (Wartość przesunięcia) na -0,8 s, a następnie kliknij przycisk OK.

3. Korekta linii bazowej²¹

1. Wybierz punkt menu Grafika | Narysuj prostokąt.
2. Kliknij i przeciągnij, aby narysować prostokąt na obrazie, w którym nie są wykrywane szczyty.
3. Wybierz punkt menu Narzędzia | Wizualizacja danych; zwrócić uwagę na średnią i odchylenie standardowe sygnału detektora, tutaj 21,850 ± 1,455 SD bezjednostkowo bezjednostkowo (DN); Następnie zamknij narzędzie.
4. Wybierz punkt menu Przetwarzanie | Prawidłowa linia bazowa.

4. Kolorowanie obrazu chromatograficznego za pomocą mapy wartości i mapy kolorów²⁰

1. Wybierz punkt menu Widok | Pokolorować.
2. W oknie dialogowym Kolorowanie wybierz kartę Importuj/Eksportuj, wybierz niestandardową mapę kolorów #AAAA (Plik uzupełniający 3) dostarczoną jako materiał dodatkowy, a następnie kliknij przycisk Importuj.
3. W kontrolkach Mapowanie wartości ustaw zakres wartości na wartości minimalne i maksymalne, a następnie kliknij przycisk OK.

5. ^Wykrywaniepików 2 D (tj. plam) dla analitów¹⁸

1. Wybierz punkt menu Przetwarzanie | Wykrywanie obiektów blob z ustawieniami domyślnymi; Następnie obserwuj, że niektóre piki są podzielone i występują fałszywe detekcje.
2. Wybierz pozycję Konfiguruj | Ustawienia | Wykrywanie obiektów blob; następnie ustaw Smoothing na 0.1 dla pierwszego wymiaru i 2.0 dla drugiego wymiaru oraz ustaw Minimum Volume (tj. próg dla zsumowanych wartości) na 1.00 E6; następnie kliknij przycisk OK.
3. Wybierz punkt menu Przetwarzanie | Wykrywanie obiektów blob przy użyciu nowych ustawień; Następnie obserwuj ulepszenia.

6. Filtracja szczytów ²D

UWAGA: To jest robione w celu automatycznego usuwania bezsensownych wykryć spowodowanych spadami kolumn wzdłuż ¹D i uderzeniami lub odpadkami wzdłuż ²D.

1. Wybierz punkt menu Przetwarzanie | Interaktywne wykrywanie obiektów blob.
2. Zanotuj ustawienia wykrywania obiektów blob, a następnie kliknij przycisk Wykryj.
3. W konstruktorze filtrów zaawansowanych kliknij przycisk Dodaj, a następnie w oknie dialogowym Nowe ograniczenie wybierz opcję Przechowywanie II, a następnie kliknij przycisk OK.
4. Na suwakach Ograniczenia ustaw minimalny i maksymalny czas przechowywania ^2Ddla filtru, aby zmniejszyć liczbę fałszywych szczytów bez utraty prawdziwych szczytów.
5. Kliknij przycisk Zastosuj, a następnie kliknij przycisk Tak, aby zapisać ustawienia wykrywania z nowym filtrem.
   UWAGA: Do radzenia sobie z konkretnymi problemami z wykrywaniem mogą być wymagane bardziej zaawansowane narzędzia, takie jak wykrywanie pików jonowych lub dekonwolucja dla koelucji¹⁹.

7. Kalibracja wskaźników retencji liniowej

UWAGA: Wykonaj ten krok²² (I^T) dla konkretnych czasów retencji w zestawie standardów wskaźnika retencji (RI) (zazwyczaj n-alkanów).

1. Wybierz pozycję Konfiguruj | Tabela RI | Wskaźnik retencji (Col I).
2. W oknie dialogowym Konfiguracja tabeli wystąpień zarezerwowanych kliknij przycisk Importuj, a następnie wybierz plik kalibracji wystąpień zarezerwowanych (w formacie CSV z nazwą, czasem przechowywania i indeksem przechowywania) o nazwie "LRI table.csv" – (Plik uzupełniający 4).
3. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz obraz A. Przejdź do żądanego folderu; wprowadzić nazwę "Oil 1 LRI CALIBRATED.gci" (plik uzupełniający 5); następnie kliknij Zapisz.

8. Wyszukiwanie widm pików w bibliotece MS NIST17²³

1. Wybierz pozycję Konfiguruj | Ustawienia | Przeszukaj bibliotekę.
2. W oknie dialogowym Biblioteka wyszukiwania ustaw Typ widma na Szczyt MS, Próg intensywności na 100, Typ wyszukiwania NIST na Prosty (podobieństwo), Typ kolumny NIST RI na Standardowy biegun i Tolerancja NIST RI na 10, a następnie kliknij przycisk OK. NIST MS Search oferuje wiele innych ustawień, które są tutaj ustawione na wartości domyślne.
3. Wybierz punkt menu Przetwarzanie | Wyszukaj w bibliotece wszystkie obiekty blob.

9. Przegląd i poprawność identyfikacji analitów

1. Na palecie narzędzi ustaw tryb kursora na Blob | Wybierz pozycję Obiekty blob.
2. W widoku Obraz kliknij prawym przyciskiem myszy żądany szczyt.
3. W oknie dialogowym Właściwości obiektu blob sprawdź właściwości obiektu blob, a następnie kliknij pozycję Lista trafień.
4. Sprawdź listę trafień, a następnie, jeśli identyfikacja jest nieprawidłowa, zaznacz znacznik wyboru obok prawidłowej identyfikacji.
5. W oknie dialogowym Właściwości obiektu blob wprowadź nazwę grupy, aby wyznaczyć klasę chemiczną i inne żądane metadane, a następnie kliknij przycisk OK.
6. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz obraz jako; przejdź do żądanego folderu; wprowadź nazwę "Olej 1 KOLOROWANY dla Template construction.gci" (Plik uzupełniający 6); następnie kliknij Zapisz.
   UWAGA: Ten plik znajduje się w archiwum uzupełniającym, które można otworzyć dla kroku 10.

10. Utwórz szablon z docelowymi szczytami¹⁵

1. W widoku obrazu (nadal w trybie Wybierz obiekty blob z kroku 9.1) wybierz żądane szczyty, klikając pierwszy szczyt i naciskając CTRL + kliknij dodatkowe szczyty.
2. Na palecie narzędzi kliknij przycisk Dodaj do szablonu.
3. Po zakończeniu tworzenia szablonu wybierz pozycję Plik | Zapisz szablon; określ nazwę folderu i pliku; następnie kliknij Zapisz.
4. Wybierz punkt menu Plik | Zamknij Image.
   UWAGA: W tym momencie instrukcje te stanowią kontynuację szablonu utworzonego w celu uwzględnienia żądanych docelowych szczytów, dostępnego jako "Docelowe tamplate.bt" (Plik uzupełniający 7).

11. Dopasuj i zastosuj szablon

UWAGA: Dopasowanie rozpoznaje wzór szablonu w wykrytych pikach nowego chromatogramu. Zastosowanie pasujących zestawów, identyfikatorów i innych metadanych w nowym chromatogramie z szablonu.

1. Wybierz punkt menu Plik | Otwórz obraz; przejść do pliku chromatogramu "Oil 2 COLORIZED.gci" (Plik uzupełniający 8) (który jest wstępnie przetworzony) i wybrać go; następnie kliknij przycisk Otwórz.
2. Na palecie narzędzi ustaw tryb kursora na Szablon | Wybierz opcję Obiekty.
3. Wybierz szablon | Załaduj szablon.
4. W oknie dialogowym Załaduj szablon kliknij przycisk Przeglądaj, przejdź do szablonu docelowych szczytów "Docelowe template.bt" (plik uzupełniający 7) i wybierz go, a następnie kliknij przycisk Otwórz.
5. W oknie dialogowym Załaduj szablon kliknij przycisk Załaduj, a następnie odrzuć.
6. W widoku Obraz kliknij prawym przyciskiem myszy pik szablonu, a następnie sprawdź jego właściwości obiektu, w tym qCLIC i odniesienie MS.
7. Wybierz szablon | Interaktywny szablon dopasowania i transformacji.
8. W interfejsie Interactive Match kliknij przycisk Dopasuj wszystko, a następnie przejrzyj pasujące wyniki zarówno w tabeli, jak i na obrazie, w którym każdy szczyt szablonu jest oznaczony niewypełnionymi okręgami, a jeśli zostanie wykonane dopasowanie, istnieje link do wypełnionego okręgu dla wykrytego szczytu.
9. Edytuj dopasowania zgodnie z potrzebami; gdy są spełnione, kliknij Zastosuj, aby przenieść metadane z szablonu do chromatogramu.
   UWAGA: Ograniczenia dopasowania, takie jak qCLIC, pomagają dopasować prawidłowy wzór wśród wykrytych pików nowego chromatogramu. Parametry ograniczenia obejmują typ podpisu MS używanego jako odniesienie do szablonu (szczyt MS lub MS obiektu blob) oraz wartości progowe podobieństwa spektralnego (Direct Match Factor (DMF) i Reverse Match Factor (RMF)). Tutaj parametry są ustawiane na podstawie poprzednich badań^13,14, aby ograniczyć fałszywie ujemne dopasowania: szczyt MS i DMF oraz próg podobieństwa RMF 700.

12. Przekształć szablon dla zasadniczo odmiennej chromatografii

UWAGA: Ten krok nie jest konieczny, chyba że warunki chromatograficzne znacznie się zmieniają, powodując niedopasowanie matrycy do nowego chromatogramu, co może mieć miejsce w przypadku badań długoterminowych lub po zainstalowaniu nowej kolumny. W takich przypadkach szablon może zostać geometrycznie przekształcony w chromatograficznej płaszczyźnie czasów retencji, aby lepiej pasował do nowego chromatogramu^12,13. W tym przykładzie wzorce pików matrycy i chromatogramu są podobne, ale różnią się geometrią czasów retencji, tak jak byłyby widoczne dla różnych warunków chromatograficznych.

1. Powtórz kroki 11.2–11.5, z wyjątkiem przechodzenia do 2.bt szablonu docelowego, wybierania i ładowania (plik uzupełniający 9).
2. Wybierz szablon | Interaktywny szablon meczu; następnie kliknij w Edytuj transformację.
3. W interfejsie szablonu przekształcenia zmieniaj skale ¹D i ²D, translacje i ścinania, aby lepiej wyrównać szablon z wykrytymi pikami, a następnie kliknij przycisk Przekształć szablon.
4. Po przekształceniu szablonu kliknij przycisk Edytuj dopasowanie, a następnie powtórz kroki 11.8–11.9.

13. Wykonaj połączoną analizę nieukierunkowaną i ukierunkowaną na zestawie chromatogramów

UWAGA: Połączony szablon nieukierunkowany i ukierunkowany (UT), określany również jako szablon funkcji^24,25, po dopasowaniu do każdego z zestawu chromatogramów, ustala korespondencję między analitami nieukierunkowanymi i docelowymi, a następnie wyodrębniane są spójne cechy próbki krzyżowej w celu rozpoznania wzorca.

1. Przeprowadzić obróbkę wstępną (kroki 1–6) i dopasowanie matrycy UT (kroki 11.1–11.9) dla wszystkich chromatogramów w zestawie (tj. chromatogramów ²D olejów). Alternatywnie zautomatyzuj ten krok za pomocą oprogramowania projektowego lub podobnego oprogramowania, które nie zostało tutaj opisane.
2. Uruchom oprogramowanie Investigator.
3. Wybierz punkt menu Plik | Otwarta analiza; następnie wybierz i otwórz "Feature Jove su 70 eV.gca" (Plik uzupełniający 10).
4. Kliknij przycisk OK, aby otworzyć i sprawdzić wyniki.
5. Kliknij kartę Związki, aby przejrzeć wartości metryczne i statystyki dla określonych analitów (tj. analitów docelowych z powiązanymi nazwami chemicznymi) lub analitów niedocelowych z identyfikatorami (#) wyrównanymi na wszystkich chromatogramach, a następnie wykonaj poniższe czynności.
   1. Kliknij zakładkę Atrybuty, aby przejrzeć wartości i statystyki dla określonych metryk na różnych chromatogramach.
   2. Kliknij kartę Podsumowanie, aby przejrzeć statystyki podsumowujące zarówno dla związków, jak i cech. Jeśli chromatogramy pochodzą z różnych klas, jak w tym przypadku w przypadku oliwy wyprodukowanej z oliwek zebranych w dwóch różnych regionach Włoch, wówczas zakładka Podsumowanie zawiera dane statystyczne współczynnika Fishera (F i FDR), które zapewniają wgląd w cechy umożliwiające rozróżnienie między klasami.
   3. Przeglądaj różne wykresy na wszystkich kartach i, w razie potrzeby, przeprowadź analizę głównych składowych (PCA) na karcie Atrybuty.

14. Modyfikowanie szablonu UT do równoległej analizy MS

UWAGA: Analiza została przeprowadzona zarówno przy energii jonizacji elektronów 70 eV, jak i 12 eV (tj. wysokiej i niskiej)^26,27.

1. Otwórz jeden z 12 chromatogramów eV, np. "Oil 1 12 eV RAW.gci" (Plik uzupełniający 11), wykonaj obróbkę wstępną (kroki 1–6) i załaduj matrycę UT "UT template 70 relaxed.bt" (Supplementary File 12) zgodnie z opisem w krokach 11.1–11.6. Pliki są dostarczane jako materiał uzupełniający.
2. W razie potrzeby dostosuj szablon tak, aby pasował do wykrytych szczytów 12 eV, jak opisano w kroku 12. W tym przypadku nie ma znaczącej niewspółosiowości, ponieważ sygnały tandemowe są multipleksowane. Należy jednak zauważyć, że ponieważ różne ustawienia jonizacji powodują różne fragmentacje, konieczne jest złagodzenie ograniczeń dla ograniczeń qCLIC dotyczących podobieństwa widmowego DMF i RMF (nie wykazane tutaj).
3. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz szablon; określ folder i nazwę pliku, np. "UT template 12.bt" (Plik uzupełniający 13); następnie kliknij Zapisz.

15. Wykonaj połączoną analizę nieukierunkowaną i ukierunkowaną na 12 chromatogramach eV

1. Wybierz punkt menu Plik | Otwarta analiza; następnie wybierz i otwórz "Feature Jove su 12 eV.gca" - Plik uzupełniający 14 dostarczony plik.
2. Kliknij przycisk OK, aby otworzyć i sprawdzić wyniki.
3. Kliknij kartę Związki, aby przejrzeć wartości metryczne, zapoznaj się z odpowiedziami 12 eV i statystykami dla określonych analitów (tj. analitów docelowych z powiązanymi nazwami chemicznymi) lub analitów nieukierunkowanych z identyfikatorami (#) wyrównanymi na wszystkich chromatogramach, a następnie wykonaj poniższe czynności.
   1. Kliknij zakładkę Atrybuty, aby przejrzeć wartości i statystyki dla określonych metryk na różnych chromatogramach.
   2. Kliknij zakładkę Podsumowanie, aby przejrzeć statystyki podsumowujące zarówno dla związków, jak i cech przy 12 eV. Jeśli chromatogramy pochodzą z różnych klas, jak w tym przypadku w przypadku oliwy wyprodukowanej z oliwek zebranych w dwóch różnych regionach Włoch, wówczas zakładka Podsumowanie zawiera dane statystyczne współczynnika Fishera (F i FDR), które zapewniają wgląd w cechy umożliwiające rozróżnienie między klasami.
   3. Wyświetl różne wykresy dostępne na wszystkich kartach i, w razie potrzeby, przeprowadź analizę głównych składowych (PCA) na karcie Atrybuty.

Wyniki

Wzorce GC×GC-TOF MS volatilomu wysokiej jakości oliwy z oliwek extra virgin wykazują około 500 piki ²D powyżej progu stosunku sygnału do szumu (SNR) wynoszącego 100. Taki próg został zdefiniowany w poprzednich badaniach nad lotnymi związkami w żywności^14,27 jako minimalny względny sygnał powyżej progu niezbędny do uzyskania wiarygodnych widm do analizy porównawczej. Składniki są rozmieszczone w przestrzeni chromatograficznej zgodnie z ich względną retencją w dwóch wymiarach chromatograficznych, a konkretnie w oparciu o ich lotność/polarność w ¹D oraz lotność w ²D. W tym przypadku kombinacja kolumn to polarna × półpolarna (tj. Carbowax 20M × OV1701).

Wzorzec ²D wykazuje wysoki stopień uporządkowania. Wzorce względnej retencji dla serii homologicznych i klas przedstawiono na Rysunku 1A wraz z adnotacjami (grafiki dla grup i pęcherzyki dla pików) dla liniowych węglowodorów nasyconych (czarne), węglowodorów nienasyconych (żółte), liniowych aldehydów nasyconych (niebieskie), aldehydów jednonienasyconych (czerwone), aldehydów wielonienasyconych (łososiowe), alkoholi pierwszorzędowych (zielone) oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (cyjanowe).

Wykryte piki ²D można następnie zidentyfikować poprzez porównanie średniego widma MS wyodrębnionego z całego piku ²D (widmo blob) lub z największego widma (widmo apex). Rysunek 2 przedstawia wynik wyszukiwania widma apex dla obiektu blob 5, który zwraca dopasowanie o wysokim podobieństwie (pierwsze 10 wyników) dla (E)-2-heksenalu. Przeszukane bazy danych to te, które zostały wcześniej wybrane przez analityka w kroku 8 metody.

Identyfikację waliduje indeksowanie czasu retencji. Część eksperymentalna I^T obliczono wartość dla ²piki, tak aby na tym etapie wyszukiwanie w bibliotece priorytetowo traktowało wyniki ze spójnymi wartościami zestawieniowych I^TZakresy tolerancji można dostosować w zależności od doświadczenia analityka, wiarygodności wartości w bazie danych referencyjnych w odniesieniu do fazy stacjonarnej oraz zastosowanych warunków analitycznych. Nowe narzędzia do inteligentnej kalibracji liniowych indeksów retencji bez konieczności przeprowadzania eksperymentalnej kalibracji za pomocą n-alkany, zostały niedawno opracowane i omówione w badaniu przeprowadzonym przez Reichenbach i współpracowników¹⁹.

Zbiór zidentyfikowanych pików ²D (tj. piki docelowe) można wykorzystać do stworzenia szablonu pików docelowych, aby szybko i niezawodnie ustanowić odpowiedniości dla tego samego związku we wszystkich chromatogramach próbek. Zbiór szablonowych pików docelowych przedstawiono na Rysunku 1B. Czerwone okręgi odpowiadają 196 związkom docelowym, w tym dwóm wzorcom wewnętrznym (IS) połączonym z pikami szablonowymi liniami łączącymi. Wzorce wewnętrzne są wykorzystywane do normalizacji odpowiedzi, a linie łączące pomagają zwizualizować, który z dołączonych IS zostanie przyjęty do normalizacji odpowiedzi każdego piku/blobu ²D.

Na Rysunku 1B wypełnione kropki oznaczają pozytywne dopasowania między pikiem szablonu a rzeczywistym wzorcem, natomiast puste kropki dotyczą pików szablonu, dla których odpowiedniość nie została zweryfikowana. Liczbę fałszywie ujemnych dopasowań można ograniczyć poprzez odpowiedni dobór parametrów progowych, widm referencyjnych oraz funkcji ograniczeń^13,14,18,19. W przypadku złożonych wzorców z wielokrotnymi koelucjami zaleca się stosowanie funkcji wykrywania pików jonowych opartych na dekonwolucji widma, co może być trafnym rozwiązaniem¹⁹. Metadane piku szablonu dla (E)-2-heksenalu przedstawiono w powiększonym panelu na Rysunku 1B.

Specyficzność dopasowania szablonu opiera się na możliwości zastosowania funkcji ograniczeń, które ograniczają pozytywną odpowiedniość do tych szczytów kandydujących, które, mieszcząc się w oknie wyszukiwania algorytmu, wykazują podobieństwo widm MS powyżej określonego progu. W tym przypadku, w kroku 11, progi podobieństwa²³ ustawiono na 700 zgodnie z poprzednimi eksperymentami mającymi na celu zdefiniowanie optymalnych parametrów ograniczających fałszywie ujemne dopasowania¹⁴. Wyróżnione obszary właściwości szczytu szablonu na Rysunku 1B przedstawiają informacje o ciągu referencyjnego widma MS oraz funkcji ograniczenia qCLIC (tj. (Match("

Stosując szablon do wszystkich chromatogramów z zestawu, można napotkać trudne sytuacje, takie jak w przypadku częściowego przesunięcia wzorców. Może być ono spowodowane niespójnością temperatury w piecu, niestabilnością przepływu/ciśnienia gazu nośnego lub interwencją manualną w systemie, np. w przypadku wymiany kolumny lub kapilary pętli modulatora^14,28. Rysunek 3 przedstawia sytuację częściowego przesunięcia pomiędzy docelowym szablonem a rzeczywistym chromatogramem. W przypadku minimalnych przesunięć, interaktywne transformacje szablonu (Rysunek 3, panel sterowania) pozwalają na repozycjonowanie pików szablonu w celu lepszego dopasowania. Po repozycjonowaniu szablon może zostać dopasowany w celu ustalenia odpowiedniości. W przykładzie piki szablonu (Rysunek 3, krok 12) poprawnie odpowiadają rzeczywistemu wzorcowi ²D. W przypadku poważnych przesunięć, których tutaj nie omawiamy, powtarzanie czynności dopasowania, transformacji i aktualizacji może iteracyjnie dostosowywać położenie pików szablonu do rzeczywistego wzorca pików^12,13,14.

W tym przypadku piki docelowe (tj. znane anality) stanowią około 40% wyniku chromatograficznego (średnio 196 pików docelowych z około 500 pików wykrywalnych). Pozostałe 60% związków, wraz z niesionymi przez nie informacjami, nie jest brane pod uwagę w analizie celowanej. Aby badanie było w pełni kompleksowe, należy ustanowić spójne wzajemne dopasowanie niecelowanych pików ²D. Pierwsze zastosowanie, w którym dopasowanie do szablonu rozszerzono na wszystkie wykrywalne anality, dotyczyło złożonego wolatilomu kawy palonej⁷. Proces ten jest zautomatyzowany za pomocą oprogramowania (np. Investigator), przedstawionego tutaj w krokach 14–15.

W tym procesie obrazy wstępnie wycelowane, należące do badanego zestawu próbek (20 próbek), są wykorzystywane do zdefiniowania wiarygodnych pików poprzez wzajemne dopasowanie wszystkich wzorców obrazów²⁹. Następnie budowany jest chromatogram kompozytowy, na podstawie którego można zidentyfikować wiarygodne piki UT oraz regiony pików (tj. ślad pików ²D) w tzw. szablonie cech¹⁷.

W przypadku analiz przeprowadzonych przy 70 eV proces wyznaczył 144 wiarygodne piki przy zastosowaniu rozluźnionych kryteriów wiarygodności²⁹, z których 76 należało do listy pików docelowych. Na podstawie tych 144 wiarygodnych pików proces spójnie wyrównuje wszystkie chromatogramy zgodnie ze średnimi czasami retencji wiarygodnych pików, a następnie łączy je w celu utworzenia chromatogramu kompozytowego. Rysunek 4 przedstawia listę wszystkich próbek oznakowanych zgodnie z regionem produkcji oleju (po lewej) oraz listę wiarygodnych pików/objętości blob w każdej próbce (po prawej).

Nietargetowany szablon cech składa się z pików ²D analitytów wykrytych na chromatogramie zbiorczym, przedstawionym na Rysunku 5A, które są dopasowane do szablonu pików wiarygodnych (n = 168 – czerwone okręgi dla pików targetowanych i zielone okręgi dla pików nietargetowanych). Widma masowe pików zbiorczych, a także ich czasy retencji, są zapisywane w szablonie cech, co pokazano dla octanu (Z)-3-heksenolu w powiększonym obszarze. Regiony pików przedstawiono na Rysunku 5B jako grafiki w kolorze czerwonym; są one jednak definiowane przez obrysy wszystkich pików ²D wykrytych na chromatogramie zbiorczym (n = 3578).

Kiedy nienadzorowane rozpoznawanie wzorców metodą analizy głównych składowych (PCA) zostanie zastosowane do rozkładu wybranych pików w 20 analizowanych próbkach, oleje z Sycylii i Toskanii tworzą oddzielne klastry, co sugeruje, że warunki pedoklimatyczne oraz terroir wpływają na względną zawartość substancji lotnych. Wyniki przedstawiono na Rysunku 6A, a wyniki PCA dla rozkładu pików wiarygodnych przedstawiono na Rysunku 6B. Oba podejścia potwierdzają wzajemnie, że oleje z różnych obszarów geograficznych posiadają odmienne, choć spójne sygnatury chemiczne, niezależnie od tego, czy analizowane są związki celowe, niecelowe, czy obie te grupy.

Wreszcie, oprogramowanie umożliwia szybkie i skuteczne ponowne wyrównanie wzorców w równoległych kanałach detekcji. W niniejszym zastosowaniu ponowne wyrównanie jest proponowane dla tandemowych sygnałów jonizacji. Źródło jonów spektrometru mas przełącza się między dwiema energiami jonizacji (tj. 70 i 12 eV) z częstotliwością akwizycji 50 Hz na kanał³⁰. Dwa wynikające z tego wzorce chromatograficzne są ściśle wyrównane, podczas gdy dane spektralne (tj. sygnatury i odpowiedzi spektralne) dostarczają komplementarnych informacji o różnych zakresach dynamiki odpowiedzi^26,27. Wyrównane wzorce umożliwiają wyodrębnienie cech (pików ²D i obszarów pików) z jednoznacznymi identyfikatorami (tj. nazwami chemicznymi dla pików celowanych oraz unikalną numeracją # dla pików i obszarów pików niecelowanych).

Dopasowanie szablonów umożliwia efektywne wyrównanie krzyżowe. W tej sytuacji rozbieżności są niewielkie, jednak ograniczenia MS muszą zostać poluzowane, aby umożliwić dopasowanie piko- sygnałów UT. Z drugiej strony, wyróżnione regiony piko- sygnałów UT, które nie posiadają ograniczeń MS, są bezzwłocznie dopasowywane bez występowania wyników fałszywie ujemnych. Rycina 5C przedstawia powiększony obszar chromatogramu 12 eV, w którym dopasowany został szablon cech zbudowany na podstawie danych 70 eV. Wiarygodne piko- sygnały UT są dopasowywane pozytywnie dzięki obniżonym ograniczeniom qCLIC (np. próg DMF na poziomie 600). Należy zauważyć, że przy 12 eV wykryto mniej piko- sygnałów ze względu na ograniczoną fragmentację indukowaną niską energią jonizacji.

Rycina 1: Dwuwymiarowy wykres konturowy i szablon celowany. (A) Wykres konturowy frakcji lotnej oliwy z oliwek extra virgin z Toskanii. Uporządkowane wzorce serii homologicznych i klas zostały wyróżnione różnymi kolorami i liniami: liniowe węglowodory nasycone (czarna linia i kontury ²D), węglowodory nienasycone (żółty), liniowe aldehydy nasycone (niebieski), aldehydy mononienasycone (czerwony), aldehydy polienasycone (łososiowy), alkohole pierwszorzędowe (zielony) oraz krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (cyjanowy). (B) Nałożony szablon celowany znanych analitów (czerwone okręgi) z liniami łączącymi standardy wewnętrzne (ISs). Panele przedstawiają metadane właściwości piku/plamy ²D (Decanal) lub właściwości piku szablonu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: Wyszukiwanie Apex MS. Wynik wyszukiwania Apex MS dla blob 5. Lista wpisów w bazie danych o najwyższym stopniu podobieństwa wraz z powiązanymi metadanymi dostępnymi w bibliotece. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Ponowne dopasowanie szablonu.Schemat przedstawiający kroki umożliwiające ponowne dopasowanie szablonu za pomocą transformacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Interfejs GC Investigator. Panel Investigator z wszystkimi wybranymi obrazami opisanymi zgodnie z regionem produkcji oleju (po lewej) oraz listą wiarygodnych pików/objętości blobów w każdej próbce (po prawej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Szablon ukierunkowany i UT. (A) Wiarygodne piki będące wynikiem zautomatyzowanego przetwarzania w kroku 11; czerwone okręgi odpowiadają znanym analitytom, natomiast zielone okręgi to związki nieznane. Na nałożonym panelu pokazano właściwości obiektu szablonu dla (Z)-3-heksenalu. (B) Powiększony obszar pokazujący piki UT (czerwone i zielone okręgi) oraz regiony pików (czerwona grafika) szablonu UT dopasowanego do próbki oleju pozyskanej przy energii jonizacji 70 eV. (C) Szablon UT dopasowany do próbki oleju pozyskanej przy energii jonizacji 12 eV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 6: Wykresy ładunków PCA. Przedstawiają one naturalną konfigurację próbek (olejów z Toskanii i Sycylii) wynikającą z (A) rozkładu pików celowanych lub (B) rozkładu pików UT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Pliki uzupełniające. Aby pobrać te pliki, kliknij tutaj.

Dyskusja

Wizualizacja danych GC×GC-TOF MS jest podstawowym krokiem do właściwego zrozumienia wyników uzyskanych dzięki kompleksowym dwuwymiarowym separacjom. Wykresy obrazów z dostosowaną koloryzacją pozwalają analitykom docenić różnice w odpowiedziach detektora, a tym samym różnicowy rozkład składników próbki. To wizualne podejście całkowicie zmienia perspektywę analityków na interpretację i opracowanie chromatogramów. Ten pierwszy krok, raz zrozumiany i pewnie stosowany przez chromatografów, otwiera nową perspektywę w dalszym przetwarzaniu.

Innym fundamentalnym aspektem przetwarzania danych jest dostęp do pełnej macierzy danych (tj. danych spektralnych MS i odpowiedzi) dla wszystkich punktów próbkowania, z których każdy odpowiada pojedynczemu zdarzeniu detektora. Pod tym względem całkowanie ^{pików 2D}, tak że zbiór zdarzeń detektora odpowiadających pojedynczemu analitowi stanowi krytyczny krok. W obecnym protokole detekcja pików ^2Dopiera się na algorytmie zlewni¹⁸ z pewnymi adaptacjami w celu poprawy czułości wykrywania w przypadku związków częściowo koeluujących. Aby uczynić ten proces bardziej szczegółowym, należy przeprowadzić dekonwolucję i przyjąć bardziej wyrafinowane procedury. Jest to możliwe dzięki wykonaniu detekcji piku jonowego dla danych MS; Algorytm przetwarza tablicę danych i izoluje odpowiedź od pojedynczych analitów na podstawie profili spektralnych^19,31.

Ważnym, ale krytycznym etapem protokołu i każdego procesu interpretacji danych GC×GC-MS jest identyfikacja analitów. Procedura ta, zaproponowana w krokach 8 i 9, w przypadku braku analizy potwierdzającej zgodnej z autentycznymi standardami, musi być starannie przeprowadzona przez analityka. Zautomatyzowane działania są dostępne w każdym oprogramowaniu komercyjnym; obejmują one ocenę podobieństwa sygnatury spektralnej MS w stosunku do zebranych widm referencyjnych (tj. bibliotek spektralnych) oraz ocenę stosunków charakterystycznych między jonami kwalifikatora/kwantyfikatora. Potrzebne są jednak dodatkowe kryteria potwierdzające w celu ujednoznacznienia identyfikacji izomerów. W protokole proponuje się przyjęcie liniowych wskaźników retencji w celu ustalenia priorytetów listy kandydatów; Limit dotyczy tutaj dostępności danych dotyczących przechowywania i ich spójności.

Główną cechą, która czyni to podejście wyjątkowym, jest dopasowanie szablonu 12,13,15,29. Dopasowywanie szablonów umożliwia rozpoznawanie wzorców ^2Dw bardzo skuteczny, konkretny i intuicyjny sposób. Można go ustawić, pod względem czułości i swoistości, stosując niestandardowe wartości progowe i/lub funkcje ograniczeń, podczas gdy analityk może nadzorować procedurę, aktywnie wchodząc w interakcję z parametrami funkcji transformacji. Specyfika tego procesu polega na możliwości krzyżowego dopasowania informacji o pikach ukierunkowanych i niedocelowych między próbkami jednolitej partii, ale także między próbkami uzyskanymi w tych samych warunkach nominalnych, pomimo średniej do ciężkiej niewspółosiowości. Zalety tej operacji dotyczą możliwości zachowania wszystkich identyfikacji docelowych analitów, co jest czasochłonnym zadaniem dla analityka, oraz wszystkich metadanych zapisanych dla docelowych i niedocelowych pików z poprzednich sesji opracowania.

Dopasowywanie szablonów jest również bardzo skuteczne pod względem czasu obliczeniowego; pliki danych MS o niskiej rozdzielczości składają się z około 1–2 GB spakowanych danych, podczas gdy analizy MS o wysokiej rozdzielczości mogą osiągać 10–15 GB na pojedynczą serię analityczną. Dopasowywanie szablonów nie przetwarza za każdym razem pełnej macierzy danych, ale najpierw wykonuje wyrównanie czasu retencji między chromatogramami za pomocą pików matrycy, a następnie przetwarza piki kandydatów w oknie wyszukiwania pod kątem ich dopasowania podobieństwa do odniesienia w szablonie. W przypadku poważnej niewspółosiowości, która jest najtrudniejszą sytuacją, globalne transformacje wielomianowe drugiego rzędu działały lepiej niż metody lokalne, jednocześnie skracając czas obliczeń¹³.

Aby technika GC×GC mogła rozprzestrzenić się daleko poza środowisko akademickie i laboratoria badawcze, narzędzia do przetwarzania danych muszą ułatwiać podstawowe operacje wizualizacji i kontroli chromatogramów; identyfikacja analitów powinna oferować możliwość przyjęcia znormalizowanych algorytmów i procedur (np. algorytm wyszukiwania NIST ^{i kalibracja} IT); i analiza porównawcza powinna być intuicyjna, skuteczna i wspierana przez interaktywne narzędzia. Proponowane podejście odpowiada na te potrzeby, oferując jednocześnie zaawansowane opcje i narzędzia do radzenia sobie ze złożonymi sytuacjami, takimi jak koelucja analitów, kalibracja wielu analitów, analiza grupowa i równoległe dopasowywanie detekcji.

Cytowana literatura obejmuje wiele możliwych scenariuszy, w których GC×GC i, bardziej ogólnie, kompleksowa chromatografia dwuwymiarowa, oferują unikalne rozwiązania i wiarygodne wyniki, których nie można osiągnąć za pomocą ¹chromatografii D w analizie jednoprzebiegowej. ^5,32,33 Chociaż GC×GC jest najpotężniejszym narzędziem zwiększającym zdolność separacji i czułość, zawsze istnieją ograniczenia dotyczące siły separacji, czułości i innych zdolności systemowych. W miarę zbliżania się do tych granic systemowych analiza danych staje się coraz trudniejsza. W związku z tym prace badawczo-rozwojowe muszą nadal ulepszać narzędzia analityczne, którymi dysponujemy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1D Kolumna SolGel-Wax (100% glikol polietylenowy; 30 m & razy 0,25 mm dc & 0,25 μ m df). Gaz nośny hel o stałym przepływie nominalnym 1,3 ml/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia	PN 054796	Gaz nośny hel o stałym przepływie nominalnym 1,3 ml/min. Programowanie temperatury piekarnika ustawione w następujący sposób: 40° C (2 min) do 240° C (10 min) przy 3,5& Ok.
Kolumna 2D OV1701 (86% polidimetylosiloksan, 7% fenyl, 7% cyjanopropyl; 1 m i razy; 0,1 mm dc & razy; 0,10 μ m df) od .	Mega, Legnano, Mediolan, Włochy	PN MEGA-1701
Zautomatyzowany system do przygotowania próbek: SPR Autosampler dla GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, Wielka Brytania
Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia: Sycylia i Toskania, Włochy	Projekt SKRZYPCE (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Próbki (n=10) zostały pobrane w roku produkcyjnym 2018 w ramach kampanii samplingowej projektu "Skrzypce". Oleje przekazano do HS-SPME w celu pobrania próbek substancji lotnych zgodnie z protokołem referencyjnym zatwierdzonym w poprzednim badaniu Stilo et al.14
Chromatograf gazowy: Model 7890B	GC Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC× GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Spektrometr masowy: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, Wielka Brytania
Oktynian metylo-2-oktynonianu (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Sterownik modulatora: Optimode v2.0	Intruments, Cernusco sul Naviglio, Mediolan, Włochy
Modulator: KT 2004 pętla typu	Zoex Corporation Houston, TX, USA
Biblioteka MS i oprogramowanie wyszukiwania: NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alkany C8-C40 do indeksowania retencji	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-heksantowa (CAS 110-54-3) chromatografia gazowa MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Włókno mikroekstrakcyjne do fazy stałej	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-tujon (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314