Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Podsumowanie

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Streszczenie

Nefropatia immunoglobuliny A (IgA) jest rodzajem pierwotnego kłębuszkowego zapalenia nerek charakteryzującego się nieprawidłowym odkładaniem się IgA, prowadzącym do schyłkowej niewydolności nerek. W ostatnich latach odnotowano udział mikroRNA (miRNA) w patogenezie nefropatii IgA. Nie ma jednak ustalonej metody profilowania miRNA w nefropatii IgA przy użyciu małych modeli zwierzęcych. Dlatego opracowaliśmy wiarygodną metodę analizy miRNA w nerce mysiego modelu IgA (myszy HIGA). Celem tego protokołu jest wykrycie zmienionych poziomów ekspresji miRNA w nerkach myszy HIGA w porównaniu z poziomami w nerkach myszy kontrolnych. Krótko mówiąc, metoda ta składa się z czterech etapów: 1) uzyskania próbek nerek od myszy HIGA; 2) oczyszczanie całkowitego RNA z próbek nerek; 3) synteza komplementarnego DNA z całkowitego RNA; oraz 4) ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) miRNA. Korzystając z tej metody, udało nam się wykryć poziomy ekspresji kilku miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p i miR-21-5p) w nerkach myszy HIGA. Ta nowa metoda może być zastosowana w innych badaniach profilujących miRNA w nefropatii IgA.

Wprowadzenie

Nefropatia immunoglobuliny A (IgA) jest rodzajem pierwotnego kłębuszkowego zapalenia nerek charakteryzującego się nieprawidłowym odkładaniem się IgA w okolicy kłębuszkowej nerki^1,2. Jest to najczęstsze z pierwotnych kłębuszkowych zapaleń nerek i prowadzi do schyłkowej niewydolności nerek u 20%–40% pacjentów². Przyczyna jest nadal nieznana, ale uporczywa infekcja błony śluzowej została zamieszana^1,3. Kortykosteroidy, leki immunosupresyjne i inhibitory układu renina-angiotensyna zostały zaproponowane jako metody terapeutyczne^1,3, ale nie zostały w pełni ustalone³. Dlatego konieczne są dalsze badania w celu wyjaśnienia etiologii i metod terapeutycznych leczenia nefropatii IgA.

mikroRNA (miRNA) to małe, niekodujące RNA, które odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów^4,5. Zgłoszono, że miRNA są zaangażowane w patogenezę różnych chorób, a niektóre zostały zidentyfikowane jako biomarkery choroby i czynniki terapeutyczne^4,5. W ostatnich latach odnotowano również związek między miRNA a patogenezą nefropatii IgA^2,6,7. Na przykład wykazano, że miR-148b jest zaangażowany w nieprawidłowości strukturalne IgA u pacjentów z nefropatią IgA^2,6,7, podczas gdy miR-148b i let-7b zostały udokumentowane jako nowe biomarkery do wykrywania nefropatii IgA⁷. Chociaż zrozumienie wpływu miRNA na nefropatię IgA może pomóc w dalszym wyjaśnieniu etiologii i leczenia², standardowe metody profilowania miRNA w nefropatii IgA przy użyciu małych modeli zwierzęcych nie zostały jeszcze ustalone².

Opracowaliśmy tutaj prostą i niezawodną metodę pomiaru poziomów ekspresji miRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Mysz HIGA jest charakterystycznym szczepem ddY wykazującym szczególnie wysoki poziom IgA w surowicy i nieprawidłowe odkładanie się IgA w kłębuszkach nerkowych^8,9,10,11. Dlatego myszy HIGA mogą być używane jako mysi model nefropatii IgA^8,9,10,11. Nasza metoda składa się z czterech głównych etapów: po pierwsze, chirurgiczne pobranie próbek nerek od myszy HIGA; po drugie, homogenizacja próbek i oczyszczanie całkowitego RNA za pomocą kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej; po trzecie, synteza komplementarnego DNA (cDNA) z całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkrypcji; i po czwarte, wykrywanie poziomów ekspresji miRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Uzasadnienie tej metody i wiarygodność wyników są oparte na poprzednich raportach^12,13. Pokazujemy, że jest to przydatna technika do dokładnego pomiaru poziomów ekspresji miRNA w mysim modelu nefropatii IgA i że może być wykorzystana do ułatwienia przyszłych badań nad miRNA w nefropatii IgA.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Jichi i są zgodne z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego w Jichi.

1. Pobieranie próbek nerek od myszy HIGA

UWAGA: Myszy HIGA wykazują stabilny fenotyp nefropatii IgA po 25 tygodniu życia8^,9,10,11. Myszy Balb/c powinny być wybrane jako grupa kontrolna^8,9,10,11. Uzyskano 25-tygodniowe samice myszy HIGA (n = 10) i 25-tygodniowe samice myszy Balb/c (n = 10). Konieczne jest wcześniejsze określenie liczby myszy potrzebnych do eksperymentów. Ten etap wymaga około 7–8 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy Balb/c.

1. Przygotuj następujące przedmioty: myszy HIGA (25-tygodniowe, żeńskie), myszy Balb/c (25-tygodniowe, samica), aparat do znieczulenia wziewnego, izofluran, arkusz korkowy, szpilka, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), strzykawki do wstrzykiwań, igły, nożyczki chirurgiczne i kleszcze.
2. Znieczulij mysz HIGA za pomocą 4%-5% izofluranu za pomocą aparatu do znieczulenia wziewnego i zamontuj ją w pozycji grzbietowej na arkuszu korkowym za pomocą szpilek. Dostosuj stężenie izofluranu do 2%–3% jako dawkę podtrzymującą po indukcji znieczulenia.
   UWAGA: Głębokość znieczulenia jest utrzymywana na poziomie, na którym ból związany z inwazyjnym zabiegiem zostaje całkowicie wyeliminowany. W szczególności stężenie izofluranu należy dostosować do 4-5% podczas wycinania tkanek takich jak klatka piersiowa. Depilacja i maść do oczu nie są konieczne. Nie ma potrzeby montowania myszy na poduszce grzewczej, jeśli zabieg można wykonać szybko.
3. Wykonaj 3–4 cm nacięcie w linii środkowej ściany brzucha myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy i dokładnie zidentyfikuj obie strony nerki.
4. Naciąć żebra i przeponę nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami, aby odsłonić serce. Po nacięciu prawego przedsionka wstrzyknąć PBS do lewej komory, aż kolor nerek zmieni się na bladożółty (ta procedura oznacza, że całe ciało myszy jest perfundowane PBS).
5. Przeciąć tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód oraz usunąć nerkę. Podzielić nerkę na kawałki 30 mg do użycia w następnym kroku.
   UWAGA: Patologia nefropatii IgA obejmuje głównie kłębuszki nerkowe w korze nerkowej (zewnętrzna część nerki). Chociaż trudno jest makroskopowo i całkowicie odróżnić korę i rdzeń, pożądane jest głównie zebranie zewnętrznej części nerki. Próbki te mogą być przechowywane w temperaturze –80 °C przez kilka miesięcy.

2. Oczyszczanie całkowitego RNA z próbek nerek

UWAGA: W tym kroku używany jest dostępny na rynku zestaw do izolacji miRNA do ekstrakcji całkowitego RNA. Dodatkowo stosowana jest kolumna wirowa z rozdrabnianiem biopolimerów. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje. Zestaw do izolacji miRNA zawiera kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej, odczynniki do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania guanidyny/etanolu (bufor do płukania 1), bufor do płukania etanolem (bufor do płukania 2) i wodę wolną od nukleaz. Ten krok wymaga około 3 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy kontrolnych.

1. Przygotuj następujące elementy: probówki zbiorcze o pojemności 1,5 lub 2,0 ml, 100% etanol, chloroform, homogenizator krzemu, mikropipety, końcówki do pipet, wirówka, kolumna wirowa do rozdrabniania biopolimerów, kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej, odczynniki do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania guanidyny/etanolu (bufor do płukania 1), bufor do płukania etanolu (bufor do płukania 2) i woda wolna od nukleaz.
2. Homogenizować 30 mg próbek nerek za pomocą homogenizatora krzemowego i 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: MiRNA w próbce są wrażliwe, dopóki nie zostaną wystawione na działanie odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny, dlatego te kroki należy wykonać niezwłocznie.
3. Przenieść lizat do kolumny wirowej rozdrabniającej biopolimery i odwirować go przy 15 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
4. Do filtratu dodać 140 μl chloroformu i energicznie mieszać przez 15 s. Pozostawić na 2–3 min, następnie odwirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min.
5. Delikatnie przenieść klarowny supernatant bez dotykania środkowej warstwy do nowej probówki zbiorczej i dodać określoną objętość (patrz poniżej) 100% etanolu. Wir przez 5 s.
   UWAGA: Wymagane jest 100% etanol o objętości 1,5x większej niż otrzymany supernatant.
6. Przenieść próbkę (górna granica 700 μl) do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.
7. Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować kolumnę w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.
8. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować ją w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.
9. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować ją w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.
10. Ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej, nie dodając niczego w celu usunięcia dodatkowego etanolu, przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wyrzucić filtrat.
11. Zmień rurkę przymocowaną do kolumny wirującej na nową probówkę zbiorczą.
12. Dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować ją przy 8 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Otrzymany roztwór o objętości 30 μl zawiera wysokie stężenie całkowitego RNA. Próbka ta może być przechowywana w temperaturze –80 °C przez kilka miesięcy.

3. Synteza cDNA z całkowitego RNA

UWAGA: W tym kroku używany jest dostępny na rynku zestaw do odwrotnej transkrypcji. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje. Ten zestaw zawiera mieszaninę kwasów nukleinowych, mieszaninę odwrotnej transkryptazy i bufor. Procedura ta musi być wykonywana na lodzie, aby zapobiec postępowi reakcji. Ten krok wymaga około 3 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy kontrolnych.

1. Przygotuj następujące elementy: probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml, ośmiodołkowe probówki paskowe, mikropipety, końcówki do pipet, spektrofotometr, woda wolna od nukleaz, lód, mieszanina kwasów nukleinowych, mieszanina odwrotnej transkryptazy, bufor i termocykler.
2. Zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Następnie oblicz wymaganą objętość wody wolnej od nukleaz, tak aby 12 μl zawierało 1 μg całkowitego RNA.
3. Przygotować mieszaninę wzorcową o następującej zawartości: 2,0 μl mieszaniny kwasów nukleinowych, 2,0 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy i 4,0 μl buforu, co daje łącznie 8,0 μl na próbkę.
4. Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka z ośmiodołkowymi probówkami paskowymi.
5. Rozcieńczyć całkowite RNA w objętości wody wolnej od nukleaz obliczonej w ppkt 3.2. Następnie dodaj 12 μl całkowitego roztworu RNA (zawierającego 1 μg całkowitego RNA) do każdej studzienki ośmiodołkowych probówek paskowych.
6. Inkubować próbkę w 8-dołkowych probówkach paskowych w temperaturze 37 °C przez 60 minut przy użyciu termocyklera. Następnie inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut przy użyciu termocyklera.
   UWAGA: Roztwór po inkubacji zawiera wysokie stężenie cDNA.
7. Przenieś ten roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 200 μl wody wolnej od nukleaz.
   UWAGA: Otrzymane 200 μl roztworu można wykorzystać do qRT-PCR jako matrycę cDNA. Próbka ta może być przechowywana w temperaturze –80 °C przez około 1 rok.

4. qRT-PCR miRNA

UWAGA: W tym kroku używany jest komercyjnie dostępny zestaw do PCR. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje. Ten zestaw zawiera mieszankę PCR, uniwersalny podkład i wodę wolną od nukleaz. Próbki powinny być przygotowane w dwóch egzemplarzach, a dokładność wyników powinna być brana pod uwagę w każdym przypadku. Poziomy ekspresji miRNA określa się ilościowo metodą ΔΔCT. Ten krok wymaga około 4 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy kontrolnych.

1. Przygotuj następujące elementy: probówkę zbiorczą o pojemności 1,5 ml, 96-dołkową płytkę reakcyjną, folię samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, mikropipety, końcówki do pipet, mieszankę PCR, uniwersalny starter, wodę wolną od nukleaz, startery specyficzne dla miRNA oraz przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym.
2. Przygotuj mieszankę wzorcową o następującej zawartości: 12,5 μl mieszanki PCR, 2,5 μl uniwersalnego startera, 1,25 μl 5 μM startera specyficznego dla miRNA i 6,25 μl wody wolnej od nukleaz na każdą studzienkę.
   UWAGA: W tym teście użyto starterów specyficznych dla miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p i miR-21-5p]. RNU6-2 został użyty jako endogenna kontrola¹⁴.
3. Dodać 22,5 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki reakcyjnej.
4. Dodać 2,5 μl cDNA przygotowanego w kroku 3.7 do indywidualnego dołka płytki 96-dołkowej.
5. Przykryj 96-dołkową płytkę reakcyjną folią adhezyjną, a następnie odwiruj przy 1 000 x g przez 30 s.
6. Uruchom urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj przyrząd do PCR w następujący sposób: wstępna aktywacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut, następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s.
7. Określić ilościowo ekspresję genów za pomocą metody ΔΔCT. Względne poziomy ekspresji określa się jako 2^–ΔΔCT.
   UWAGA: W celu wykluczenia z wyników należy wziąć pod uwagę nieprawidłowe krzywe amplifikacji PCR.

Wyniki

Zbadaliśmy poziomy ekspresji miRNA w nerkach myszy HIGA (n=10). Wynik ten uzyskano całkowicie w oparciu o opisany protokół. Nerki myszy Balb/c wybrano jako grupę kontrolną (n = 10). W obu grupach wybrano osoby w wieku 25 tygodni. U dostawcy dostępne były tylko samice myszy HIGA. Poziomy ekspresji trzech miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p i miR-21-5p; Rysunek 1) wykryto te, które wcześniej zgłaszano jako związane z nefropatią IgA^15,16. Względne poz...

Dyskusja

Byliśmy w stanie zmierzyć poziomy ekspresji miRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA) przy użyciu tej nowej metody. Nefropatia IgA jest niewyjaśnioną chorobą, która wymaga dalszych badań w celu wyjaśnienia jej etiologii i celów terapeutycznych ^1,3. Jednak pobieranie próbek ludzkich nerek jest wysoce inwazyjne. Ta nowa technika jest korzystna, ponieważ umożliwia badanie nefropatii IgA na małych zwierzętach i powinna ułatwić przyszłe badania nad ne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BALB/cCrSlc (25-tygodniowa, kobieta)	Japonia SLC, Inc.	brak	Mysz do sterowania
HIGA/NscSlc (25-tygodniowa, suczka)	Japonia SLC, Inc.	brak	Mysia nefropatia IgA model
MicroAmp Optical 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-dołkowa płytka reakcyjna
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna Thermo	Fisher Scientific	4311971	do 96-dołkowej płytki reakcyjnej
Zestaw miScript II RT	Qiagen	218161	Zestaw eksperymentalny do syntezy cDNA
miRNeasy Mini zestaw	Qiagen	217004	Eksperymentalny zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA
Test startera miScript (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	test miScript Primer specyficzny dla miRNA
miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	specyficzny dla miRNA starter
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	test miScript Primer specyficzny dla miRNA
(miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	specyficzny dla miRNA starter
miScript SYBR Zestaw do zielonego PCR	Qiagen	218073	Eksperymentalny zestaw do rozdrabniania PCR w czasie rzeczywistym
Niszczarka QIA	Qiagen	79654	biopolimerowa kolumna wirowa
QuantStudio 12K Flex Flex System do PCR w czasie rzeczywistym	Thermo Fisher Scientific	4472380	czasie rzeczywistym
Oprogramowanie QuantStudio 12K Flex Wersja 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	oprogramowanie przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym Takara,
standard biomasheru	Takara Bio	9790B	homogenizator krzemu