Ten artykuł przedstawia metodę tworzenia in vitro łuszczycowego modelu zapalnego skóry na poziomie transkrypcji przy użyciu kombinacji pięciu cytokin (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) na linii komórkowej HaCaT.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustalanie profilu transkrypcyjnego łuszczycowej skóry in vitro przy użyciu komórek HaCaT stymulowanych kombinacją cytokin
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Łuszczyca jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną skóry, w której pośredniczy wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy, charakteryzująca się nieprawidłową proliferacją i różnicowaniem keratynocytów naskórka oraz naciekaniem komórek zapalnych. Keratynocyty specyficzne dla skóry są kluczowymi uczestnikami odporności wrodzonej, reagując na komórki odpornościowe i stymulację środowiskową, odgrywając w ten sposób ważną rolę w immunopatogenezie łuszczycy. W tym miejscu przedstawiamy metodę indukowania zapalenia keratynocytów łuszczycowych na poziomie transkrypcji za pomocą linii komórkowej HaCaT przy użyciu kombinacji pięciu cytokin prozapalnych (kombinacja M5), w tym IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α i onkostatyny M. Wyniki pokazują, że komórki HaCaT indukowane kombinacją M5 wykazywały zwiększony poziom peptydów przeciwdrobnoustrojowych (BD2, S100A7, S100A8 i S100A9), chemokin i cytokin (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 i IL-18). Poziomy mRNA markerów różnicowania keratynocytów (Keratyna1, Keratyna10, Filaggin i Loricrin) były regulowane w dół, co było zgodne z danymi transkryptomu pochodzącymi z keratynocytów podobnych do łuszczycy. Opisana tutaj metoda ustanawia zatem in vitro łuszczycowe zapalenie skóry na poziomie transkrypcji i przyczynia się do badań nad molekularną patogenezą łuszczycy.
Wprowadzenie
Łuszczyca jest powszechną, niezakaźną, przewlekłą chorobą zapalną skóry wywołaną przez rozregulowaną odpowiedź immunologiczną, wpływającą na keratynocyty, które głównie tworzą naskórek1, charakteryzującą się nienormalnie szybkim namnażaniem keratynocytów z hiperkeratozą i parakeratozą. Łuszczyca dotyka około 3% populacji żyjącej na świecie2. Obciążenie chorobami jest dodatkowo zwiększane przez kilka chorób współistniejących, w tym choroby układu krążenia i zespół metaboliczny spowodowany przez zespół3.
Naskórek składa się z pięciu warstw keratynocytów i przechodzi zmian....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wykonaj kroki od 1 do 3 w sterylnych warunkach. Cała pożywka hodowlana zawierała 0,1 mg/ml penicyliny i streptomycyny.
1. Przygotowanie komórek
- Wysiew 1 x 106 komórek HaCaT w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2 dni.
- Gdy kultura osiągnie około 80% zbieżności, ostrożnie wyjmij pożywkę z naczynia hodowlanego i umyj komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stymulacja kombinacją M5 wywołała odpowiedź zapalną komórek HaCaT.
Komórki HaCaT stymulowano kombinacją cytokin M5 lub nie przez 24 h. Oceńiono ekspresję mRNA genów związanych z łuszczycą, które uczestniczą w regulacji chemokin odpornościowych i zapalnych oraz peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Chemokiny neutrofilowe CXCL138, CXCL239, CXCL840 oraz chemokiny limfocytów .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana w niniejszym artykule jest metoda wykorzystująca kombinację pięciu cytokin (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) do linii komórkowej HaCaT w celu ustalenia in vitro profilu łuszczycowego zapalenia skóry na poziomie transkrypcji. Protokół ten można zaadaptować do badań nad mechanizmem genów w patogenezie łuszczycy, a także do badań przesiewowych leków terapeutycznych na łuszczycę. Ostatnie doniesienia wykazały, że nadekspresja limfocytów T CD8 wytwarzających IL-17A i IL22 w zmienionej chorobowo skórze sugeruje ich ud.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 i 81601462]
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM— Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965092 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco | 10100139C | |
| Komórki HaCaT | Chińskie Centrum Hodowli Typu Collection | GDC0106 | Mniej niż 15 pokoleń |
| Ludzka IL-1 i beta; Zestaw ELISA | Beyotime | PI305 | |
| Ludzki zestaw ELISA IL-6 | Beyotime | PI330 | |
| Ludzki zestaw ELISA IL-8 | Beyotime | PI640 | |
| IL-1 alfa Human | Prospec | CYT-253 | Rekombinowane białko |
| IL-17 Ludzki | Prospec | CYT-250 | Rekombinowane białko |
| IL-22 Ludzkie | białko | CYT-328 | Rekombinowane białko |
| OSM Human | Prospec | CYT-231 | Rekombinowane białko |
| PBS | Gibco | 10010049 | pH 7,4 |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140163 | |
| PrimeScrip RT | TAKARA | RR047A | |
| TB Green Premix Ex Taq | TAKARA RR420A | ||
| TNF alfa Człowiek | Prospec | CYT-223 | Rekombinowany odczynnik białkowy |
| TRIzo | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa | Gibco | 25200072 |
Bibliografia
- Lowes, M. A., Bowcock, A. M., Krueger, J. G. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445 (7130), 866-873 (2007).
- Gupta, R., Debbaneh, M. G., Liao, W. Genetic epidemiology of psoriasis. Current dermatology reports. 3 (1), 61-78 (2014).
- Boehncke, W. -H., Schön, M. P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
