Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustalanie profilu transkrypcyjnego łuszczycowej skóry in vitro przy użyciu komórek HaCaT stymulowanych kombinacją cytokin

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61537

⸱

15 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, West China Medical School, Sichuan University and Collaborative Innovation Center for Biotherapy, 2Department of Cardiovascular Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę tworzenia in vitro łuszczycowego modelu zapalnego skóry na poziomie transkrypcji przy użyciu kombinacji pięciu cytokin (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) na linii komórkowej HaCaT.

Streszczenie

Łuszczyca jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną skóry, w której pośredniczy wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy, charakteryzująca się nieprawidłową proliferacją i różnicowaniem keratynocytów naskórka oraz naciekaniem komórek zapalnych. Keratynocyty specyficzne dla skóry są kluczowymi uczestnikami odporności wrodzonej, reagując na komórki odpornościowe i stymulację środowiskową, odgrywając w ten sposób ważną rolę w immunopatogenezie łuszczycy. W tym miejscu przedstawiamy metodę indukowania zapalenia keratynocytów łuszczycowych na poziomie transkrypcji za pomocą linii komórkowej HaCaT przy użyciu kombinacji pięciu cytokin prozapalnych (kombinacja M5), w tym IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α i onkostatyny M. Wyniki pokazują, że komórki HaCaT indukowane kombinacją M5 wykazywały zwiększony poziom peptydów przeciwdrobnoustrojowych (BD2, S100A7, S100A8 i S100A9), chemokin i cytokin (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 i IL-18). Poziomy mRNA markerów różnicowania keratynocytów (Keratyna1, Keratyna10, Filaggin i Loricrin) były regulowane w dół, co było zgodne z danymi transkryptomu pochodzącymi z keratynocytów podobnych do łuszczycy. Opisana tutaj metoda ustanawia zatem in vitro łuszczycowe zapalenie skóry na poziomie transkrypcji i przyczynia się do badań nad molekularną patogenezą łuszczycy.

Wprowadzenie

Łuszczyca jest powszechną, niezakaźną, przewlekłą chorobą zapalną skóry wywołaną przez rozregulowaną odpowiedź immunologiczną, wpływającą na keratynocyty, które głównie tworzą naskórek1, charakteryzującą się nienormalnie szybkim namnażaniem keratynocytów z hiperkeratozą i parakeratozą. Łuszczyca dotyka około 3% populacji żyjącej na świecie2. Obciążenie chorobami jest dodatkowo zwiększane przez kilka chorób współistniejących, w tym choroby układu krążenia i zespół metaboliczny spowodowany przez zespół3.

Naskórek składa się z pięciu warstw keratynocytów i przechodzi zmiany morfologiczne wraz z procesem różnicowania: warstwa podstawna, warstwa kolczasta, warstwa ziarnista, warstwa lucidum (znajdująca się na dłoniach i podeszwach) oraz warstwa rogowa naskórka opisana tutaj od wewnętrznej do zewnętrznej powierzchni4. Zmiana różnicowania naskórka prowadzi do zaburzenia bariery skórnej, co jest istotne dla patogenezy chorób zapalnych skóry5,6,7,8. Keratynocyty odgrywają istotną rolę w utrzymaniu nienaruszonej bariery naskórkowej, zapobiegając utracie wody i czynnikom środowiskowym, takim jak ekspozycja na promieniowanie UVB, alergeny i patogeny9. Zdrowe osoby wykazują równowagę między proliferacją komórek podstawnych a złuszczeniem warstwy rogowej naskórka, podczas gdy wiele chorób skóry, w tym łuszczyca, charakteryzuje się brakiem równowagi tego złożonego mechanizmu10.

Oprócz tworzenia funkcji barierowej, keratynocyty są również kluczowym elementem układu odpornościowego skóry. W immunopatogenezie łuszczycy aktywacja rezydujących w skórze limfocytów T pomocniczych typu 1 (Th1) i limfocytów T pomocniczych typu 17 (Th17) prowadzi do zwiększonej produkcji odpowiednio IFN-γ i IL-17A. Cytokiny te indukują zwiększoną syntezę chemokin (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), peptydów przeciwdrobnoustrojowych (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) i innych czynników zapalnych (TNF-α, IL-6, IFN-β) w keratynocytach, prowadząc do rekrutacji większej ilości Th1, Th17 i neutrofili do skóry, dodatkowo wzmacniając oś IL-17/IL2311. Wzajemne oddziaływanie między keratynocytami a komórkami odpornościowymi jest odpowiedzialne za indukcję i utrzymanie łuszczycy11.

Kompleks sieci cytokin został opisany w łuszczycy, a centralna rola cytokin prozapalnych (takich jak IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, onkostatyna M(OSM) i TNF-α) wytwarzanych przez infiltrację komórek odpornościowych została podkreślona12,13. Rzeczywiście, poprzednie badania wykazały, że podwyższone poziomy IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α i OSM indukowały profil łuszczycy na normalnych ludzkich keratynocytach naskórka in vitro14.

Nieśmiertelne linie komórkowe keratynocytów (HaCaT), które są łatwiejsze do uzyskania i hodowli niż pierwotne keratynocyty o lepszej odtwarzalności, były szeroko stosowane do badania łuszczycy15,16,17,18,19,20. W odróżnieniu od wirusa brodawczaka ludzkiego16 E6/E7 transformowanych komórek HEK001 i KerTr, linia komórkowa HaCaT jest zdolna do ekspresji produktów genów różnicowania, w tym Keratyny1 (KRT1), Keratyny10 (KRT10), Loricryny i filaggrin20,21,22, zapewniając w ten sposób obiecujące narzędzie podobne do pierwotnych keratynocytów do badania regulacji keratynizacji i prozapalności.

KRT5/14 to główna para keratyny typu I typu II wyrażona w proliferacyjnych keratynocytach podstawnych, podczas gdy zróżnicowane keratynocyty w warstwach nadpodstawowych obniżają KRT5/14 i wyrażają KRT1/10 jako główna para keratyny23. Porównując zmianę łuszczycową ze zdrową skórą, zmiany w ekspresji keratyny obejmowały zmniejszenie KRT1/1024,25 i wzrost KRT5/14 w łuszczycowym epidermie26, charakteryzujące się hiperproliferacją i parakeratozą27. Loricrin jest ostatecznie różnicującym się białkiem strukturalnym stanowiącym ponad 70% zrogowaciałej otoczki, przyczynia się do funkcji bariery ochronnej warstwy rogowej naskórka28, regulowanej w dół w skórze pacjentów z łuszczycą29. Filaggryna ulega ekspresji w końcowych stadiach różnicowania keratynocytów i bierze udział w agregacji przypominającej rusztowanie zrogowaciałej otoczki 30, zmniejszona ekspresja w skórze zmiany łuszczycowej29.

Ogólnie rzecz biorąc, naszym celem było wygenerowanie modelu keratynocytów zapalnych w komórkach HaCaT za pomocą kombinacji cytokin, która będzie w stanie synergistycznie podsumować niektóre cechy zmian skórnych łuszczycy, w tym zainicjowanie odpowiedzi immunologicznej, proliferację keratynocytów i różnicowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykonaj kroki od 1 do 3 w sterylnych warunkach. Cała pożywka hodowlana zawierała 0,1 mg/ml penicyliny i streptomycyny.

1. Przygotowanie komórek

  1. Wysiew 1 x 106 komórek HaCaT w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2 dni.
  2. Gdy kultura osiągnie około 80% zbieżności, ostrożnie wyjmij pożywkę z naczynia hodowlanego i umyj komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Delikatnie kołysz ręcznie naczynie hodowlane.
  3. Usuń PBS i dodaj 2 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do komórek. Delikatnie potrząśnij naczyniem hodowlanym, aby roztwór całkowicie pokrył monowarstwę komórek.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 5 minut, aż komórki zostaną w widoczny sposób oderwane od powierzchni szalki hodowlanej pod mikroskopią z kontrastem fazowym.
    UWAGA: Morfologia komórek powinna być okrągła. Jeśli komórki nie są dobrze oddzielone, inkubować przez dodatkowy okres 5 minut wraz z ręcznym mieszaniem.
  5. Po odłączeniu komórek dodaj 5 ml DMEM plus 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę i zebrać zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety.
  6. Odwirować probówkę zawierającą zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant.
  7. Dodaj 10 ml DMEM plus 10% pożywki FBS do osadu i delikatnie pipetuj pożywkę w górę iw dół, aby doprowadzić komórki do zawiesiny.

2. Wysiewanie komórek w płytce 6-dołkowej

  1. Zasiać komórki o gęstości 2,0 x 105 komórek/dołek na 6-dołkowej płytce hodowlanej.
  2. Inkubować 6-dołkową płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc przed stymulacją kombinowaną M5, aby komórki mogły przylgnąć do płytki.

3. Stymulacja komórek HaCaT M5

  1. Przygotować pożywkę mieszankę cytokiny M5 zawierającą 10 ng/ml rekombinowanego białka IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α i onkostatyny M w DMEM zawierającym 2% FBS.
    UWAGA: Kombinacja M5 składała się z rekombinacji IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α i onkostatyny M. Synergistyczne działanie kombinacji M5 podsumowuje niektóre cechy łuszczycy, takie jak regulacja w górę chemokin i produkcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych31.
  2. Po całonocnej hodowli komórkowej usunąć supernatant i odpipetować 2 ml mieszaniny M5 do każdego dołka.
  3. Kontynuuj hodowlę komórek; lizaty komórkowe zebrano po 24 godzinach w celu ilościowego oznaczania mRNA (krok 4) lub supernatant hodowli pobrano po 48-72 godzinach w celu określenia poziomów cytokin za pomocą testu ELISA32,33,34,35,36,37 (krok 6).

4. Zbieranie mRNA z komórek HaCaT stymulowanych M5

  1. Odessać pożywkę do mieszania M5 i przemyć raz 1-2 ml zimnego PBS.
  2. Odessać PBS i dodać 1 ml dostępnego w handlu roztworu izotiocyjanianu guanidu bezpośrednio do szalki hodowlanej w celu lizy komórek.
  3. Kilkakrotnie pipetować lizat w górę i w dół, aby homogenizować i przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  4. Dodać 200 μl chloroformu, energicznie wstrząsać probówką przez około 20 s i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Do fazy wodnej dodać 500 μl izopropanolu i delikatnie wymieszać. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  8. Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odessać izopropanol i dodać 1 ml 75% etanolu. Umyj granulkę raz.
  10. Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlewać etanol i pozostawić granulki do wyschnięcia na powietrzu.
  11. Dodaj 30 μl uzdatnionej wody DEPC do osadu RNA. Przygotuj się do wykrycia metodą RT-PCR.

5. Analiza ekspresji mRNA metodą Real-Time PCR

  1. Przeprowadź syntezę cDNA z 1 μg całkowitego RNA przy użyciu dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: 1 μg całkowitego RNA do testu SYBR Green RT-PCR.
  2. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR. 12,5 μl premiksu SYBR EX Taq II, 1 μl PCR Forward Primer (10 μM), 1 μl PCR Reverse Primer (10 μM), 2 μg cDNA i 8,5 μl dH2O. Ostateczna objętość wynosi 25 μl na reakcję.
    UWAGA: Lista sekwencji starterowych genów użytych do analizy RT-PCR w tym badaniu znajduje się w Tabeli 1.
  3. Inkubować w termocyklerze. Warunki cykliczne obejmowały etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 30 s, 72°C przez 20 s oraz analizę krzywej topnienia.
  4. Analizuj dane z eksperymentu RT-PCR, obliczając względne różnice w ekspresji genów na podstawie wartości Ct (cyklu progowego) przy użyciu równań 2-ΔΔCT. Stosować β-aktynę jako wewnętrzną kontrolę względnej ilościowej standaryzacji ekspresji genów RT-PCR.

6. Pobieranie supernatantu do hodowli komórkowych dla testu ELISA

  1. Odpipetować każdą pożywkę do hodowli komórkowych do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Wirować przy 1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Podzielić supernatant i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Analiza ekspresji cytokin za pomocą testu ELISA

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować wszystkie odczynniki, działający wzorzec i próbki. Trzykrotne seryjne rozcieńczanie wzorca rozcieńczalnikiem próbki w zakresie od 2,000 do 2,74 pg/ml. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:2 rozcieńczalnikiem do próbek.
  2. Dodać 100 μl wzorca i próbkę do dołka. Przykryj studzienki pokrywką i uszczelnij płytkę folią parafinową. Inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Po 2,5 godziny wyrzuć roztwór. Dodać 300 μl buforu do przemywania do każdego dołka płytki na 3 minuty i aspirować. Powtórz ten proces jeszcze cztery razy. Po ostatnim praniu odwróć talerz i postukaj w chłonny papier, aby usunąć pozostały płyn.
  4. Dodać 100 μl roztworu przeciwciała wykrywającego do każdej studzienki. Inkubować płytkę na wytrząsarce przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Biotynylowany roztwór przeciwciał detekcyjnych jest przygotowywany w każdym zestawie ELISA.
  5. Odessać i przemyć każdą studzienkę płytki pięciokrotnie za pomocą 300 μl buforu do płukania. Po ostatnim praniu odwróć płytkę i postukaj w chłonny papier, aby usunąć pozostały płyn.
  6. Dodać 100 μl koniugatu HRP-Streptawidyny do każdej studzienki. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  7. Po inkubacji wyrzucić roztwór, zasysając go pipetą. Umyć każdą studzienkę płytki pięciokrotnie za pomocą 300 μl buforu do płukania. Po ostatnim praniu odwróć talerz i postukaj w papier chłonny, aby usunąć pozostały płyn.
  8. Wykonaj detekcję, dodając 100 μl substratu TMB do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  9. Dodaj 50 μl roztworu zatrzymującego, gdy kolor się rozwinie, do każdego dołka. Delikatnie postukaj w płytkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Odczyt przy długości fali 450 nm natychmiast.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stymulacja kombinacją M5 wywołała odpowiedź zapalną komórek HaCaT.
Komórki HaCaT stymulowano kombinacją cytokin M5 lub nie przez 24 h. Oceńiono ekspresję mRNA genów związanych z łuszczycą, które uczestniczą w regulacji chemokin odpornościowych i zapalnych oraz peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Chemokiny neutrofilowe CXCL138, CXCL239, CXCL840 oraz chemokiny limfocytów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana w niniejszym artykule jest metoda wykorzystująca kombinację pięciu cytokin (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) do linii komórkowej HaCaT w celu ustalenia in vitro profilu łuszczycowego zapalenia skóry na poziomie transkrypcji. Protokół ten można zaadaptować do badań nad mechanizmem genów w patogenezie łuszczycy, a także do badań przesiewowych leków terapeutycznych na łuszczycę. Ostatnie doniesienia wykazały, że nadekspresja limfocytów T CD8 wytwarzających IL-17A i IL22 w zmienionej chorobowo skórze sugeruje ich ud...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 i 81601462]

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM— Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Płodowa surowica bydlęcaGibco10100139C
Komórki HaCaTChińskie Centrum Hodowli Typu CollectionGDC0106Mniej niż 15 pokoleń
Ludzka IL-1 i beta; Zestaw ELISABeyotimePI305
Ludzki zestaw ELISA IL-6BeyotimePI330
Ludzki zestaw ELISA IL-8BeyotimePI640
IL-1 alfa HumanProspecCYT-253Rekombinowane białko
IL-17 LudzkiProspecCYT-250Rekombinowane białko
IL-22 LudzkiebiałkoCYT-328Rekombinowane białko
OSM HumanProspecCYT-231Rekombinowane białko
PBSGibco10010049pH 7,4
Penicylina-StreptomycynaGibco15140163
PrimeScrip RTTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARA RR420A
TNF alfa CzłowiekProspecCYT-223Rekombinowany odczynnik białkowy
TRIzoInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200072
Zestaw odczynników

Bibliografia

  1. Lowes, M. A., Bowcock, A. M., Krueger, J. G. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445 (7130), 866-873 (2007).
  2. Gupta, R., Debbaneh, M. G., Liao, W. Genetic epidemiology of psoriasis. Current dermatology reports. 3 (1), 61-78 (2014).
  3. Boehncke, W. -H., Schön, M. P. Psoriasis. Lancet. 386 (9997), London, England. 983-994 (2015).
  4. Zaidi, Z., Lanigan, S. W. Dermatology in Clinical Practice. Lanigan, W. S., Zaidi, Z. , Springer. London. 1-15 (2010).
  5. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: An indispensable barrier. Experimental Dermatology. 17 (12), 1063-1072 (2008).
  6. Van Smeden, J., Janssens, M., Gooris, G., Bouwstra, J. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (3), 295-313 (2014).
  7. Wolf, R., Orion, E., Ruocco, E., Ruocco, V. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of psoriasis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 323-328 (2012).
  8. Proksch, E., Brasch, J. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of contact dermatitis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 335-344 (2012).
  9. Bäsler, K., Brandner, J. M. Tight junctions in skin inflammation. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 469 (1), 3-14 (2017).
  10. Hoffjan, S., Stemmler, S. On the role of the epidermal differentiation complex in ichthyosis vulgaris, atopic dermatitis and psoriasis. British Journal of Dermatology. 157 (3), 441-449 (2007).
  11. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends in Immunology. 34 (4), 174-181 (2013).
  12. Saxena, A., Raychaudhuri, S. K., Raychaudhuri, S. P. Psoriatic Arthritis and Psoriasis. , Springer. 73-82 (2016).
  13. Lowes, M. A., Suárez-Fariñas, M., Krueger, J. G. Immunology of psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  14. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. The Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  15. Wang, Z., et al. Autophagy-based unconventional secretion of HMGB1 by keratinocytes plays a pivotal role in psoriatic skin inflammation. Autophagy. , 1-24 (2020).
  16. Choi, D. H., Hwang, H. S. Anti-inflammation activity of brazilin in TNF-α induced human psoriasis dermatitis skin model. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 46(2019).
  17. Teng, X., et al. IL-37 ameliorates the inflammatory process in psoriasis by suppressing proinflammatory cytokine production. Journal of Immunology. 192 (4), 1815-1823 (2014).
  18. Wu, S., et al. The potential of Diosgenin in treating psoriasis: Studies from HaCaT keratinocytes and imiquimod-induced murine model. Life Sciences. 241, 117115(2020).
  19. Katarzyna, B., Elwira, S., Marta, M., Joanna, J. -B., Magdalena, G. -C. Models in the Research Process of Psoriasis. International Journal of Molecular Ences. 18 (12), 2514(2017).
  20. Auewarakul, P., Gissmann, L., Cid-Arregui, A. Targeted expression of the E6 and E7 oncogenes of human papillomavirus type 16 in the epidermis of transgenic mice elicits generalized epidermal hyperplasia involving autocrine factors. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8250-8258 (1994).
  21. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  22. Irma, C., et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators of Inflammation. 2017, 7435621(2017).
  23. Melino, G., et al. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Results & Problems in Cell Differentiation. 24 (4), 175(1998).
  24. Thewes, M., Stadler, R., Mischke, B. K. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation-associated keratins. Archives of Dermatological Research. , (1991).
  25. Ishida-Yamamoto, A., Senshu, T., Takahashi, H., Akiyama, K., Iizuka, H. Decreased deiminated keratin K1 in psoriatic hyperproliferative epidermis. Journal of investigative Dermatology. 114 (4), 701-705 (2000).
  26. Elango, T., et al. Methotrexate normalized keratinocyte activation cycle by overturning abnormal keratins as well as deregulated inflammatory mediators in psoriatic patients. Clinica Chimica Acta. , 329-337 (2015).
  27. Ghadially, R., Reed, J. T., Elias, P. M. Stratum corneum structure and function correlates with phenotype in psoriasis. Journal of investigative dermatology. 107 (4), 558-564 (1996).
  28. Nithya, S., Radhika, T., Jeddy, N. Loricrin - An overview. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 19 (1), (2015).
  29. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal Kinase: Role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. Journal of Allergy & Clinical Immunology. 127 (2), (2011).
  30. Gutowska-Owsiak, D., et al. IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion. Experimental dermatology. 21 (2), 104-110 (2012).
  31. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  32. Jeon, B., et al. Optimization and validation of a method to identify skin sensitization hazards using IL-1 α and IL-6 secretion from HaCaT. Toxicology In Vitro : An International Journal Published in Association with BIBRA. 61, 104589(2019).
  33. Lee, K. -M., Kang, J. H., Yun, M., Lee, S. -B. Quercetin inhibits the poly(dA:dT)-induced secretion of IL-18 via down-regulation of the expressions of AIM2 and pro-caspase-1 by inhibiting the JAK2/STAT1 pathway in IFN-γ-primed human keratinocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 116-122 (2018).
  34. Lee, N., Chung, Y. C., Kang, C. I., Park, S. -M., Hyun, C. -G. 7,8-dimethoxycoumarin attenuates the expression of IL-6, IL-8, and CCL2/MCP-1 in TNF-α-treated HaCaT cells by potentially targeting the NF-κB and MAPK pathways. Cosmetics. 6 (3), (2019).
  35. Smolińska, E., Moskot, M., Jakóbkiewicz-Banecka, J., Wgrzyn, G., Gabig-Cimińska, M. Molecular action of isoflavone genistein in the human epithelial cell line HaCaT. PLoS One. 13 (2), 0192297(2018).
  36. Ying, X., Yan, Y., Li, Y. Tripterine alleviates LPS-induced inflammatory injury by up-regulation of miR-146a in HaCaT cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 105, 798(2018).
  37. Zhang, M., et al. AIM2 inflammasome mediates Arsenic-induced secretion of IL-1 β and IL-18. Oncoimmunology. 5 (6), 1160182(2016).
  38. Lowes, M. A., et al. Immunology of Psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  39. Nedoszytko, B., Wojdyło, M. S., Dziurdzińska, K. -S., Roszkiewicz, J., Nowicki, R. J. Chemokines and cytokines network in the pathogenesis of the inflammatory skin diseases: atopic dermatitis, psoriasis and skin mastocytosis. Postepy Dermatologii i Alergologii. 31, 84-91 (2014).
  40. Glowacka, E., Lewkowicz, P., Rotsztejn, H., Zalewska, A. IL-8, IL-12 and IL-10 cytokines generation by neutrophils, fibroblasts and neutrophils- fibroblasts interaction in psoriasis. Advances in Medical Sciences. 55 (2), 254-260 (2010).
  41. Li, H., et al. Cyr61/CCN1 induces CCL20 production by keratinocyte via activating p38 and JNK/AP-1 pathway in psoriasis. Journal of Dermatological Science. 88 (1), 46-56 (2017).
  42. Kim, T. G., et al. Dermal clusters of mature dendritic cells and T cells are associated with the CCL20/CCR6 chemokine system in chronic psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1462-1465 (2014).
  43. Kolbinger, F., et al. β-Defensin 2 is a responsive biomarker of IL-17A-driven skin pathology in patients with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), (2017).
  44. Ekman, A., Vegfors, J., Eding, C., Enerbäck, C. Overexpression of psoriasin (S100A7) contributes to dysregulated differentiation in psoriasis. Acta Dermato-Venereologica. 97 (4), 441-448 (2016).
  45. Peric, M., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "Alarmins" psoriasin (S100A7) and Koebnerisin (S100A15) in psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  46. Aochi, S., et al. Markedly elevated serum levels of calcium-binding S100A8/A9 proteins in psoriatic arthritis are due to activated monocytes/macrophages. Journal of the American Academy of Dermatology. 64 (5), 879-887 (2011).
  47. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. Journal of Allergy Clinical Immunology. 130 (1), 145-154 (2012).
  48. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology & Venereology. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  49. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2018).
  50. Mizutani, H., Ohmoto, Y., Mizutani, T., Murata, M., Shimizu, M. Role of increased production of monocytes TNF-alpha, IL-1beta and IL-6 in psoriasis: relation to focal infection, disease activity and responses to treatments. Journal of dermatological science. 14 (2), 145-153 (1997).
  51. Pietrzak, A., Lecewicz-Torun, B., Chodorowska, G., Rolinski, J. Interleukin-18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI score. Acta Dermato-Venereologica. 83 (4), 262-265 (2003).
  52. Cai, Y., et al. A critical role of the IL-1β-IL-1R signaling pathway in skin inflammation and psoriasis pathogenesis. Journal of investigative Dermatology. 139 (1), 146-156 (2018).
  53. Arican, O., Aral, M., Sasmaz, S., Ciragil, P. Serum levels of TNF-α, IFN-γ IL-6, IL-8,IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity. Mediators of Inflammation. 2005 (5), 273-279 (2005).
  54. Grossman, R. M., et al. Interleukin 6 is expressed in high levels in psoriatic skin and stimulates proliferation of cultured human keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6367-6371 (1989).
  55. Nair, R. P., et al. Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways. Nature Genetics. 41 (2), 199-204 (2009).
  56. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. The Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  57. Deyrieux, A. F., Wilson, V. G. In vitro culture conditions to study keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. Cytotechnology. 54 (2), 77-83 (2007).
  58. Micallef, L., et al. Effects of extracellular calcium on the growth-differentiation switch in immortalized keratinocyte HaCaT cells compared with normal human keratinocytes. Experimental Dermatology. 18 (2), 143-151 (2009).
  59. Wilson, V. G. Epidermal Cells. , Springer. 33-41 (2013).
  60. Ding, J., et al. Gene expression in skin and lymphoblastoid cells: Refined statistical method reveals extensive overlap in cis-eQTL signals. American Journal of Human Genetics. 87 (6), 779-789 (2010).
  61. Res, P. C., et al. Overrepresentation of IL-17A and IL-22 producing CD8 T cells in lesional skin suggests their involvement in the pathogenesis of psoriasis. PLoS One. 5 (11), (2010).
  62. Groves, R. W., Mizutani, H., Kieffer, J. D., Kupper, T. S. Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11874-11878 (1995).
  63. Chan, J. R., et al. IL-23 stimulates epidermal hyperplasia via TNF and IL-20R2-dependent mechanisms with implications for psoriasis pathogenesis. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2577-2587 (2006).
  64. Zheng, Y., et al. Interleukin-22, a TH 17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis. Nature. 445 (7128), 648-651 (2007).
  65. Ma, H. -L., et al. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation. The Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 597-607 (2008).
  66. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends Immunol. 34 (4), 174-181 (2013).
  67. Banno, T., Gazel, A., Blumenberg, M. Effects of tumor necrosis factor-α (TNFα) in epidermal keratinocytes revealed using global transcriptional profiling. Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32633-32642 (2004).
  68. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  69. Boniface, K., et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. The Journal of Immunology. 178 (7), 4615-4622 (2007).
  70. Terui, T. Role of neutrophils in induction of acute inflammation in T-cell-mediated immune dermatosis, psoriasis: A neutrophil-associated inflammation-boosting loop. Experimental Dermatology. 9, (2000).
  71. Chiang, C. -C., Cheng, W. -J., Korinek, M., Lin, C. -Y., Hwang, T. -L. Neutrophils in psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 2376(2019).
  72. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 105-113 (2012).
  73. Morizane, S., Gallo, R. L. Antimicrobial peptides in the pathogenesis of psoriasis. The Journal of Dermatology. 39 (3), 225-230 (2012).
  74. Vandal, K., et al. Blockade of S100A8 and S100A9 suppresses neutrophil migration in response to lipopolysaccharide. The Journal of Immunology. 171 (5), 2602-2609 (2003).
  75. Ryckman, C., Vandal, K., Rouleau, P., Talbot, M., Tessier, P. A. Proinflammatory activities of S100: proteins S100A8, S100A9, and S100A8/A9 induce neutrophil chemotaxis and adhesion. The Journal of Immunology. 170 (6), 3233-3242 (2003).
  76. Nukui, T., et al. S100A8/A9, a key mediator for positive feedback growth stimulation of normal human keratinocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (2), 453-464 (2008).
  77. Yang, D., et al. β-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science. 286 (5439), 525-528 (1999).
  78. Hsu, K., et al. Anti-infective protective properties of S100 calgranulins. Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents). 8 (4), 290-305 (2009).
  79. Nestle, F. O., Kaplan, D. H., Barker, J. Psoriasis. The New England journal of medicine. 361 (5), 496-509 (2009).
  80. Tsoi, L. C., et al. Identification of 15 new psoriasis susceptibility loci highlights the role of innate immunity. Nature Genetics. 44 (12), 1341(2012).
  81. Swindell, W. R., et al. RNA-seq identifies a diminished differentiation gene signature in primary monolayer keratinocytes grown from lesional and uninvolved psoriatic skin. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  82. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 328-340 (2005).
  83. Frost, P., Weinstein, G. D., Van Scott, E. J. The ichthyosiform dermatoses II. Journal of Investigative Dermatology. 47, 561-567 (1966).
  84. Reichelt, J., Furstenberger, G., Magin, T. M. Loss of keratin 10 leads to mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, increased keratinocyte turnover, and decreased tumor formation in mice. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 973-981 (2004).
  85. Hu, Z., et al. Loss-of-function mutations in filaggrin gene associate with psoriasis vulgaris in Chinese population. Human Genetics. 131 (7), 1269-1274 (2012).
  86. Giardina, E., et al. Characterization of the loricrin (LOR) gene as a positional candidate for the PSORS4 psoriasis susceptibility locus. Annals of Human Genetics. 68 (6), 639-645 (2004).
  87. Suga, H., et al. Skin barrier dysfunction and low antimicrobial peptide expression in cutaneous T-cell lymphoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4339-4348 (2014).
  88. Iotzova-Weiss, G., et al. S100A8/A9 stimulates keratinocyte proliferation in the development of squamous cell carcinoma of the skin via the receptor for advanced glycation-end products. PLoS One. 10 (3), (2015).
  89. Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomolecules & Therapeutics. 20 (2), 171-176 (2012).
  90. Soboleva, A. G., et al. Genetically predetermined limitation in the use of HaCaT cells that affects their ability to serve as an experimental model of psoriasis. Genetika. 50 (10), 1222-1231 (2014).
  91. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2019).
  92. Inoue, K., et al. Mechanism underlying ATP release in human epidermal keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1465-1468 (2014).
  93. Harden, J. L., et al. CARD14 expression in dermal endothelial cells in psoriasis. PLoS One. 9 (11), 111255(2014).
  94. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (1), (2012).
  95. Hegyi, Z., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "alarmins" psoriasin (S100A7) and koebnerisin (S100A15) in psoriasis. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  96. Schonthaler, H. B., et al. S100A8-S100A9 protein complex mediates psoriasis by regulating the expression of complement factor C3. Immunity. 39 (6), 1171-1181 (2013).
  97. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology : JEADV. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  98. Leuner, K., et al. Reduced TRPC channel expression in psoriatic keratinocytes is associated with impaired differentiation and enhanced proliferation. PLoS One. 6 (2), 14716(2011).
  99. Gao, L., et al. Ozone therapy promotes the differentiation of basal keratinocytes via increasing Tp63-mediated transcription of KRT10 to improve psoriasis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (8), 4819-4829 (2020).
  100. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal kinase: role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (6), 1272-1279 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stan zapalny sk ry o charakterze uszczycowatymkombinacja cytokinpeptydy przeciwdrobnoustrojower nicowanie keratynocyt wanaliza transkryptomubadania nad uszczycmodel in vitrostymulacja cytokinamiekspresja gen w
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.