Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61541

⸱

21 lipca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Streszczenie

Modele organoidów nabłonkowych służą jako cenne narzędzia do badania podstawowej biologii układu narządów i do modelowania chorób. Hodowane jako organoidy, nabłonkowe komórki progenitorowe mogą samoodnawiać się i generować zróżnicowane potomstwo, które wykazuje funkcje komórkowe podobne do ich odpowiedników in vivo. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół izolowania specyficznych dla regionu komórek progenitorowych z ludzkich płuc i generowania kultur organoidów 3D jako narzędzia eksperymentalnego i walidacyjnego. Definiujemy proksymalne i dystalne obszary płuc w celu wyizolowania komórek progenitorowych specyficznych dla regionu. Wykorzystaliśmy kombinację dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej, aby wyizolować wszystkie komórki z płuc i tchawicy. Specyficzne komórki progenitorowe zostały następnie pofrakcjonowane z komórek pochodzenia proksymalnego lub dystalnego za pomocą sortowania komórek związanych z fluorescencją (FACS) w oparciu o markery powierzchniowe specyficzne dla typu komórki, takie jak NGFR do sortowania komórek podstawnych i HTII-280 do sortowania komórek pęcherzykowych typu II. Izolowane podstawowe lub pęcherzykowe komórki progenitorowe typu II wykorzystano do wygenerowania 3D kultur organoidowych. Zarówno dystalne, jak i proksymalne komórki progenitorowe tworzyły organoidy o skuteczności tworzenia kolonii wynoszącej 9-13% w okolicy dystalnej i 7-10% w okolicy proksymalnej po posiewie 5000 komórek / studzienki w 30 dniu. Dystalne organoidy utrzymywały HTII-280+ komórki pęcherzykowe typu II w hodowli, podczas gdy organoidy proksymalne różnicowały się w komórki rzęskowe i wydzielnicze do 30 dnia. Te 3D hodowle organoidów mogą być wykorzystywane jako narzędzie eksperymentalne do badania biologii komórki nabłonka płuc i nabłonkowych interakcji mezenchymalnych, a także do opracowywania i walidacji strategii terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcję nabłonka w chorobie.

Wprowadzenie

Przestrzenie powietrzne ludzkiego układu oddechowego można podzielić na strefy przewodzące i oddechowe, które pośredniczą odpowiednio w transporcie gazów i ich późniejszej wymianie przez barierę nabłonkowo-mikronaczyniową. Przewodzące drogi oddechowe obejmują tchawicę, oskrzela, oskrzeliki i oskrzeliki końcowe, podczas gdy przestrzenie oddechowe obejmują oskrzeliki oddechowe, przewody pęcherzykowe i pęcherzyki płucne. Wyściółka nabłonkowa tych przestrzeni powietrznych zmienia swój skład wzdłuż osi proksymo-dystalnej, aby dostosować się do unikalnych wymagań każdej funkcjonalnie odrębnej strefy. Pseudostratyfikowany nabłonek tchawiczo-oskrzelowych dróg oddechowych składa się z trzech głównych typów komórek, podstawnych, wydzielniczych i orzęsionych, oprócz mniej licznych typów komórek, w tym zaroślowych, neuroendokrynnych i jonocytów1,2,3. W drogach oddechowych oskrzelików występują morfologicznie podobne typy komórek nabłonkowych, chociaż istnieją różnice w ich liczebności i właściwościach funkcjonalnych. Na przykład komórki podstawne są mniej obfite w oskrzelowych drogach oddechowych, a komórki wydzielnicze zawierają większy odsetek komórek maczugowych w porównaniu z komórkami surowiczymi i kubkowymi, które dominują w tchawiczo-oskrzelowych drogach oddechowych. Komórki nabłonkowe strefy oddechowej obejmują słabo zdefiniowany prostopadłościenny typ komórek w oskrzelikach oddechowych, oprócz komórek pęcherzyków płucnych typu I (ATI) i typu II (ATII) przewodów pęcherzykowych i pęcherzyków płucnych1, 4.

Tożsamość typów komórek macierzystych i progenitorowych nabłonka, które przyczyniają się do utrzymania i odnowy nabłonka w każdej strefie, nie jest w pełni opisana i w dużej mierze wywnioskowana z badań na modelach zwierzęcych5,6,7,8. Badania na myszach wykazały, że albo komórki podstawne pseudostratyfikowanych dróg oddechowych, albo komórki maczugowe dróg oddechowych oskrzelików lub komórki ATII nabłonka pęcherzyków płucnych, służą jako nabłonkowe komórki macierzyste w oparciu o zdolność do nieograniczonego samoodnawiania się i multipotencjalnego różnicowania7,9,10,11,12. Pomimo niemożności przeprowadzenia badań genetycznych nad linią genealogiczną w celu oceny macierzystych typów komórek nabłonka płuc ludzkich, dostępność modeli hodowlanych opartych na organoidach do oceny potencjału funkcjonalnego nabłonkowych komórek macierzystych i progenitorowych stanowi narzędzie do badań porównawczych między myszą a człowiekiem13,14,15,16,17.

Opisujemy metody izolacji typów komórek nabłonkowych z różnych regionów ludzkiego płuca i ich hodowli za pomocą systemu organoidów 3D do podsumowania regionalnych typów komórek. Podobne metody zostały opracowane do analizy funkcjonalnej i modelowania chorób komórek nabłonkowych z innych układów narządów18,19,20,21. Metody te stanowią platformę do identyfikacji regionalnych nabłonkowych komórek progenitorowych, do prowadzenia badań mechanistycznych nad ich regulacją i mikrośrodowiskiem, a także do modelowania chorób i odkrywania leków. Mimo że badania komórek progenitorowych nabłonka płuc przeprowadzone na modelach zwierzęcych mogą odnieść korzyści z analizy, zarówno in vivo, jak i in vitro, wgląd w tożsamość ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc był w dużej mierze zależny od ekstrapolacji z organizmów modelowych. W związku z tym metody te stanowią pomost do powiązania tożsamości i zachowania typów komórek nabłonka płuc u ludzi z badaniami badającymi regulację komórek macierzystych / progenitorowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzka tkanka płucna została pobrana od zmarłych dawców tkanek zgodnie z procedurami zgody opracowanymi przez International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) i zatwierdzonymi przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną Centrum Medycznego Cedars-Sinai.

1. Przetwarzanie tkanek w celu izolacji komórek płuc z obszarów tchawiczo-oskrzelowych lub małych dróg oddechowych/miąższu (małe drogi oddechowe i pęcherzyki płucne)

  1. Przygotuj i autoklawuj wszystkie narzędzia do preparacji, szkło i odpowiednie roztwory na jeden dzień przed izolacją komórek.
  2. Po otrzymaniu tkanki płucnej zidentyfikuj i oddziel obszary proksymalne i dystalne. Tchawica i oskrzela są uważane za "proksymalne". Dla celów tego protokołu tchawica i pierwsze 2-3 pokolenia oskrzeli są rozdzielane i wykorzystywane do izolacji "proksymalnego" nabłonka dróg oddechowych. Małe drogi oddechowe o średnicy 2 mm lub mniejszej i otaczająca je tkanka miąższowa są, do celów niniejszego protokołu, uważane za "dystalne" nabłonek płuc (Rysunek 1A).
    UWAGA: Wszystkie zabiegi związane z przetwarzaniem ludzkiej tkanki płucnej powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z użyciem odpowiedniego wyposażenia ochrony indywidualnej.

2. Wzbogacanie i podstawianie małych komórek progenitorowych nabłonka dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych z dystalnej tkanki płucnej

  1. Przygotowanie tkanki dystalnej
    1. Umieścić dystalną tkankę płucną na sterylnej szalce Petriego (150 x 15 mm). Pokrój tkankę w kostkę na około 1 cm3 kawałki i umieść w czystej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Umyj tkankę 3x schłodzonym HBSS, za każdym razem odrzucając płyn do płukania HBSS, aby usunąć krew i płyn z wyściółki nabłonka.
    3. Umieść chusteczkę na nowej szalce Petriego i osusz sterylnymi chusteczkami zapobiegającymi kłaczeniu. Za pomocą kleszczy i nożyczek usuń jak najwięcej opłucnej trzewnej (delikatnej przezroczystej błony pokrywającej powierzchnię płuca).
    4. Za pomocą nożyczek zmielić tkankę na kawałki o średnicy około 2 mm. Przenieś zmieloną tkankę na czystą szalkę Petriego i zmiel ją dalej, siekając ją do przybliżonej wielkości 1 mm za pomocą sterylnej jednostronnej żyletki.
  2. Trawienie enzymatyczne
    UWAGA: Podstawowy roztwór liberazy wynosi 5 mg/ml (100x), a zapas DNazy wynosi 2,5 mg/ml (100x) (tabela materiałów).
    1. Dodaj 50 μg/ml liberazy i 25 μg/ml DNazy do sterylnego HBSS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Przenieść około 2-3 g tkanki mielonej do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 25 ml HBSS zawierającej liberazę i DNazę. Inkubować przez 40-60 minut w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem przy użyciu mieszalnika ustawionego na 900 obr./min. Po 30 minutach inkubacji rozetrzeć strawioną tkankę za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml bez igły, aby uniknąć tworzenia się grudek i kontynuować inkubację.
      UWAGA: Czas inkubacji enzymów może się różnić w zależności od rodzaju lub stanu tkanki. Na przykład trawienie enzymatyczne prawidłowej tkanki trwa około 45 minut. Jednak tkanka zwłóknieniowa z próbek idiopatycznego zwłóknienia płuc może wymagać dłuższego czasu inkubacji, do 60 minut. Dlatego na tym etapie należy uważnie monitorować tkankę, aby zapobiec uszkodzeniu markerów powierzchniowych, co ma kluczowe znaczenie dla FACS.
  3. Izolacja pojedynczej komórki
    1. Roztarć tkankę, przeciągając 5x przez igłę 16 G dopasowaną do strzykawki o pojemności 30 ml. Narysuj zawiesinę tkankową do pipety o szerokim otworze i przepuść przez szereg siatek do komórek (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) pod ciśnieniem podciśnienia. Przemyj sitko 20 ml buforu HBSS+, aby zebrać pozostałe komórki. Przepis na bufor HBSS+ znajduje się w Tabeli Materiałów.
    2. Dodać równą objętość buforu HBSS+ po 45 minutach do filtratu, aby zahamować aktywność liberazy i zapobiec nadmiernemu trawieniu.
    3. Odwirowywać filtrat przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Dodać 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) do osadu, delikatnie kołysać probówką, aby usunąć osad i inkubować na lodzie przez 1 minutę.
      UWAGA: Ilość i czas w roztworze do lizy RBC zależy od wielkości osadu. Ważne jest, aby utrzymywać komórki na lodzie i uważnie monitorować czas w roztworze do lizy RBC, aby zapobiec lizie komórek docelowych. Jeśli liza RBC jest niewystarczająca, powtórz krok.
    4. Dodaj 10-20 ml buforu HBSS +, aby zneutralizować bufor do lizy RBC. Odwirowywać filtruje w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Jeśli zlizowane krwinki czerwone (komórki duchowe) tworzą mętną warstwę nad osadem komórkowym, ponownie zawieś osad w 10 ml buforu HBSS + i przecedź zawiesinę przez sitko do komórek o wielkości 70 μm w celu wyeliminowania komórek duchów. Odwirować filtrat o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przejść do dalszych etapów.
  4. Zubożenie komórek odpornościowych i komórek śródbłonka (krok opcjonalny)
    1. Zubożyć komórki śródbłonka CD31 + i komórki odpornościowe CD45 + z puli wszystkich komórek za pomocą mikrokulek CD31 i CD45 sprzężonych z monoklonalnymi przeciwciałami anty-ludzkimi CD31 i CD45 (izotyp myszy IgG1) i kolumnami LS zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów).
    2. Zebrać przepływ, składający się głównie z komórek nabłonka i zrębu, do świeżej sterylnej probówki i odwirować ją przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić liczenie komórek w celu ustalenia całkowitej liczby komórek w przepływie.
  5. Barwienie powierzchni komórek w celu sortowania komórek związanych z fluorescencją (FACS)
    1. Ponownie zawiesić 1 x 107 komórek na 1 ml buforu HBSS +. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe o wymaganym stężeniu i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. W tym badaniu zastosowano przeciwciała pierwszorzędowe sprzężone z fluoroforem, chyba że zaznaczono inaczej. Szczegółowe informacje na temat źródeł przeciwciał i mian są opisane w Tabeli materiałów.
      UWAGA: HTII-280 jest obecnie najlepszym przeciwciałem reaktywnym powierzchniowo, które umożliwia podzbiór dystalnych komórek płuc na frakcje komórek z przewagą dróg oddechowych (HTII-280-) i pęcherzyków płucnych typu 2 (HTII-280+). Zastrzeżeniem do tej strategii jest to, że komórki AT1 nie są barwione tą metodą i są słabo reprezentowane ze względu na ich kruchość. Jednak komórki AT1 są słabo reprezentowane w dystalnych przygotowaniach płuc, prawdopodobnie ze względu na ich kruchość i utratę podczas selekcji żywotnych komórek przez FACS, a zatem reprezentują tylko rzadkie zanieczyszczenie frakcji komórek dróg oddechowych.
    2. Przemyć komórki, dodając 3 ml buforu HBSS+ i odwirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. W przypadku stosowania niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych dodać wymagane stężenie odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem i inkubować przez 30 minut na lodzie. Zmyć nadmiar przeciwciał drugorzędowych, dodając 3 ml buforu HBSS+ i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze HBSS+ na 1 x 107 komórek/ml. Przefiltruj komórki do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml przez nasadkę sitka, aby zapewnić utworzenie zawiesiny pojedynczej komórki. Dodaj DAPI (1 μg/ml) do barwienia przepuszczalnych (martwych) komórek.
      UWAGA: Konieczne jest stosowanie odpowiednich jednokolorowych i fluorescencyjnych minus jeden (FMO) kontroli (tj. koktajl barwienia przeciwciał minus jedno przeciwciało każdy), aby zminimalizować wyniki fałszywie dodatnie podczas FACS. W tym badaniu zastosowano dodatnie i ujemne koraliki selekcyjne do empirycznej kompensacji nakładania się widm emisyjnych między fluoroforami (Tabela materiałów). FACS wzbogacają interesujące typy komórek. Żywotne komórki nabłonkowe są wzbogacane na podstawie ich fenotypu powierzchni komórek CD45-ujemnego, CD31-ujemnego, CD236-dodatniego i ujemnego barwienia DAPI. Ta frakcja komórek nabłonkowych może być dalej podzbiorowa na podstawie barwienia markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki, takich jak specyficzne barwienie komórek HTII-280-dodatnich, które są wzbogacone o komórki AT2. W przeciwieństwie do tego, selekcja negatywna dla HTII-280 pozwala na wzbogacenie małych komórek nabłonka dróg oddechowych, takich jak komórki klubowe i rzęskowe (Ryc. 2).

3. Wzbogacanie i podzbiór nabłonkowych komórek progenitorowych z tchawiczo-oskrzelowych dróg oddechowych

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Wyciąć proksymalne drogi oddechowe (tchawica/oskrzela) z płuc. Otwórz drogi oddechowe wzdłuż ich długości za pomocą nożyczek, aby odsłonić światło i dodaj 50 μg/ml Liberazy, aby całkowicie pokryć tkankę.
    2. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem przy użyciu mieszarki termicznej ustawionej na 900 obr./min.
    3. Usunąć proksymalne drogi oddechowe z probówki wirówkowej i umieścić ją na sterylnej szalce Petriego (150 x 15 mm). Delikatnie zeskrob powierzchnię dróg oddechowych za pomocą skalpela, aby całkowicie usunąć komórki nabłonka światła z tkanki.
    4. Przemyć szalkę Petriego 5 ml sterylnego buforu HBSS+ w celu zebrania wszystkich usuniętych komórek nabłonka światła i przeniesienia usuniętych komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Rozprowadzić zawiesinę, pobierając 5x przez igłę 16 G i igłę 18 G dopasowaną do strzykawki o pojemności 10 ml, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    5. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w świeżym buforze HBSS+ i przechowywać te luminalne komórki dróg oddechowych na lodzie, gotowe do połączenia z zawiesiną jednokomórkową wytworzoną z rozdrobnionych proksymalnych dróg oddechowych w nadchodzących krokach.
    6. Za pomocą nożyczek przetnij pozostałą tkankę tchawiczo-oskrzelową wzdłuż jej pierścieni, aby wytworzyć małe paski tkanki i przenieś paski na świeżą szalkę Petriego. Zmiel paski tkanek za pomocą jednostronnej żyletki, aby uzyskać mniejsze kawałki.
      UWAGA: Ponieważ proksymalne drogi oddechowe są chrzęstne, nie można ich rozdrobnić tak drobno jak dystalnej tkanki płucnej.
    7. Przenieść zmieloną tkankę do probówek C, dodać 2 ml liberazy do probówki, upewniając się, że tkanka jest zanurzona. Załaduj rurkę C do automatycznego dysocjatora i uruchom Protokół Ludzkiego Płuca-2, aby dalej mechanicznie dysocjować tkankę.
      UWAGA: Dysocjator używany w tym protokole oferuje zoptymalizowany program o nazwie protokół ludzkiego płuca-2 dla tego konkretnego zastosowania (patrz Tabela materiałów).
  2. Trawienie enzymatyczne i izolacja pojedynczych komórek
    1. Przenieść około 2 g mielonej tkanki proksymalnej z probówki C do każdej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 50 μg/ml liberazy i 25 μg/ml roztworu DNazy do każdej probówki.
      UWAGA: Aby zapewnić skuteczną dysocjację, probówki nie powinny być napełniane powyżej oznaczenia 30 ml.
    2. Inkubować zmieloną tkankę przez 45 minut w temperaturze 37 °C, ciągle wstrząsając, używając mieszadła ustawionego na 900 obr./min.
    3. Przepuścić zdysocjowaną zawiesinę tkankową przez szereg filtrów komórkowych (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) pod ciśnieniem podciśnienia, jak wspomniano powyżej, i zebrać przepływ. Przemyj sitko 20 ml buforu HBSS+, aby zebrać pozostałe komórki.
      UWAGA: Ponieważ tkanka proksymalna jest chrzęstna i masywna w porównaniu z tkanką dystalną, istnieje większe prawdopodobieństwo zatkania filtrów. Korzystanie z lejka może pomóc w zapobieganiu przelewaniu się cieczy podczas przechodzenia przez sitka.
    4. Dodać równą objętość buforu HBSS+ do filtratu, aby zahamować aktywność liberazy i zapobiec nadmiernemu trawieniu. Na tym etapie dodać izolowane luminalne komórki proksymalnych dróg oddechowych z 3.1.5 do zawiesiny komórek.
    5. Odwirować zawiesinę połączonych komórek o sile 500 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i powtórzyć płukanie komórek w buforze HBSS+. Wykonaj zubożenie komórek odpornościowych CD45 + i komórek śródbłonka CD31 +, jak wspomniano powyżej w 2.4 (krok opcjonalny).
    6. Metody barwienia są podobne do dystalnej tkanki płucnej, postępuj zgodnie z krokami w 2.5. Wzbogać żywotne komórki nabłonkowe w oparciu o ich fenotyp powierzchni komórek CD45-ujemny, CD31-ujemny, CD236-dodatni i ujemne barwienie DAPI.
    7. Dalej podzbiór frakcji komórek nabłonkowych na podstawie barwienia dla markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki, takich jak NGFR, co pozwala na wzbogacenie podstawowych (NGFR dodatnich) i niebazalnych (NGFR ujemnych; wydzielnicze, orzęsione, neuroendokrynne) typów komórek (Rysunek 3).

4. Hodowla organoidów

  1. Dodaj 5,000 (liczbę tę można dostosować, aby uzyskać pożądaną gęstość organoidów nabłonkowych) posortowanych komórek nabłonka proksymalnego lub dystalnego do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml wraz z 7,5 x 104 komórkami MRC-5 (linia komórkowa ludzkich fibroblastów płuc). Interakcje nabłonkowo-mezenchymalne mają kluczowe znaczenie dla ekspansji komórek progenitorowych.
  2. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ważne jest, aby ręcznie potwierdzić liczbę komórek uzyskaną z sortownika, aby zapewnić dokładność wydajności tworzenia kolonii organoidów.
  3. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl lodowatej pożywki uzupełnionej antybiotykami. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.
  4. Dodać 50 μl lodowatej pożywki z matrycą membrany podstawnej o 1x zubożonym w czynnik wzrostu do fiolki i delikatnie odpipetować zawiesinę na lodzie, aby wymieszać.
    UWAGA: Ważne jest, aby używać lodowatych pożywek i utrzymywać komórki na lodzie, aby uniknąć przedwczesnej polimeryzacji podłoża macierzystego błony podstawnej.
  5. Przenieść zawiesinę komórkową na wkładkę do hodowli komórkowej o wielkości porów 0,4 μm na płytce 24-dołkowej (1,4 x 104 komórki/cm2), uważając, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-45 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy.
  7. Dodać 600 μl wstępnie podgrzanego podłoża do studzienki.
    UWAGA: Pożywkę uzupełniano środkami przeciwgrzybiczymi (0,4%) i paciorkowcem Pen (1%) przez pierwsze 24 godziny po wysiewie oraz inhibitorem 10 μM kinazy Rho przez pierwsze 72 godziny.
  8. Hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez 30 dni, w tym czasie pożywki należy wymieniać co 48 godzin/>< UWAGA: Czas trwania hodowli można zmienić w zależności od celu eksperymentu. Dłuższe punkty końcowe są stosowane do badania różnicowania, podczas gdy krótsze punkty końcowe wynoszące 7 dni, 14 dni itd. mogą być stosowane, jeśli celem eksperymentu nie jest osiągnięcie całkowitego zróżnicowania.
  9. Dodaj 10 μM inhibitor TGFβ do pożywki hodowlanej przez 15 dni, aby utrzymać komórki w fazie proliferacyjnej i zahamować przerost fibroblastów.
    UWAGA: Wyniki różnią się w zależności od pożywki użytej do testu. Na przykład wyniki przedstawione w niniejszym dokumencie zostały wygenerowane przy użyciu pożywki Pneumacult-ALI, co skutkuje generowaniem dużych organoidów z dystalnego płuca, dobrze zróżnicowanych i większych organoidów z bliższego płuca.

5. Barwienie organoidów

  1. Mocowanie i osadzanie organoidów
    1. Zassać pożywkę zarówno z górnej, jak i dolnej komory wkładu transbłonowego i spłukać raz ciepłym PBS.
    2. Utrwalić kultury, umieszczając 300 μl PFA (2% w/v) we wkładce i 500 μl w studzience na 1 godzinę w temperaturze 37°C. Usuń utrwalacz i spłucz ciepłym PBS, uważając, aby nie przesunąć zatyczki matrycy membrany basememt.
      UWAGA: Utrwalone organoidy mogą być przechowywane zanurzone w PBS w temperaturze 4 °C przez jeden do dwóch tygodni przed rozpoczęciem dalszych kroków.
    3. Zassać PBS, odwrócić wkładkę i ostrożnie przeciąć membranę wkładki na jej obwodzie. Za pomocą kleszczy usuń membranę transwell, uważając, aby nie naruszyć zatyczki matrycy.
    4. Na szalce Petriego postukaj w wkładkę, aby odzyskać zatyczkę matrycy.
    5. Dodać kroplę żelu do przetwarzania próbek, takiego jak Histogel (utrzymywany w temperaturze 37 °C) do zatyczki matrycy i utrzymywać w temperaturze 4 °C, aż żel zestala się.
    6. Przenieś zatyczkę do kasety do zatapiania, odwodnij poprzez zwiększające się stężenie etanolu (70, 90 i 100%), wyczyść w ksylenie i zatopić w wosku parafinowym.
    7. Wytnij odcinki 7 μm na mikrotomie i zbierz na dodatnio naładowanych szkiełkach.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów
    1. Umieścić szkiełka w temperaturze 65 °C na 30 minut w celu odwoskowania.
    2. Odparafinować skrawki przez zanurzenie w ksylenie i ponownie uwodnić poprzez zmniejszenie stężeń etanolu.
    3. Przeprowadzić pobieranie antygenu w wysokiej temperaturze w roztworze demaskującym antygen, bazie kwasu cytrynowego za pomocą dostępnego w handlu retrievera, zanurzając szkiełka w roztworze na 15 minut (tabela materiałów).
    4. Otocz tkankę barierą hydrofobową za pomocą pisaka.
    5. Zablokuj niespecyficzne barwienie między pierwszorzędowymi przeciwciałami a tkanką, poprzez inkubację w buforze blokującym.
    6. Inkubować skrawki w odpowiednim stężeniu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze inkubacyjnym przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    7. Wypłukać sekcje 3x w temperaturze pokojowej za pomocą buforu myjącego.
    8. Inkubować w odpowiednim stężeniu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorochromem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Opłucz sekcje 3x w temperaturze pokojowej 0,1% Tween 20-TBS. Inkubuj sekcje przez 5 minut w DAPI (1 μg/ml). Spłucz sekcje raz w TBS (soli fizjologicznej buforowanej tris) 0,1% Tween 20, wysusz i zamontuj w roztworze montażowym (Rysunek 4 i < silna klasa = "xfig" > Rysunek 5).
      UWAGA: Źródło i optymalne rozcieńczenie robocze przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych stosowanych do barwienia immunofluorescencyjnego są zawarte w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyjściowa tkanka płucna
Tchawica i oskrzela pozapłucne (Rysunek 1A) posłużyły jako tkanka wyjściowa do izolacji komórek nabłonkowych proksymalnych dróg oddechowych i późniejszej generacji organoidów proksymalnych. Dystalna tkanka płucna obejmująca zarówno miąższ, jak i małe drogi oddechowe o średnicy mniejszej niż 2 mm (Rysunek 1A) została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych małych dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych (dystalny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy wiarygodną metodę izolacji zdefiniowanych subpopulacji komórek płuc z ludzkiej tkanki płucnej do analizy molekularnej lub funkcjonalnej i modelowania choroby. Kluczowymi elementami metod są zdolność do osiągnięcia dysocjacji tkanek z zachowaniem epitopów powierzchniowych, które umożliwiają wzbogacenie świeżo wyizolowanych komórek za pośrednictwem przeciwciał, oraz optymalizacja metod hodowli w celu wydajnego generowania organoidów nabłonkowych specyficznych dla regionu. Koncentrujemy się na odzyskiwaniu i wzbog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Doceniamy wsparcie ze strony Mizuno Takako w zakresie barwienia IFC oraz H i E, Vanessy Garcii w sekcji tkanek oraz Aniki S Chandrasekaran za pomoc w przygotowaniu manuskryptu. Prace te są wspierane przez National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) oraz Celgene IDEAL Consortium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izolacja
10 ml Sterylne strzykawki, końcówka Luer-Lok FisherscientificBD 309646
30 ml Sterylne strzykawki, końcówka Luer-LokVWRBD302832
BiohazardVWR89495-440
Worki BiohazardVWR89495-440
Pierścień łączącyPluriselect41-50000-03
Deoksyrybonukleaza (lot#SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Jednorazowe szalki PetriegoCorning/Falcon25373-187
LejekPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
igła 16GVWR305198
igła 18GVWR305199
PluriStrainer 100 &mikro; m (Sitko komórkowe)Pluriselect43-50100-51
Filtr siatkowy PluriStrainer 300 µ m (Sitko komórkowe)Pluriselect43-50300-03
Filtr siatkowy PluriStrainer 40 & mikro; m (Sitko komórkowe)Pluriselect43-50040-51
Filtr siatkowy PluriStrainer 500 µ m (Sitko komórkowe)Pluriselect43-50500-03
Filtr siatkowy PluriStrainer 70 & mikro; m (Sitko do komórek)Pluriselect43-50070-51
ŻyletkiVWR55411-050
Bufor do lizy czerwonych krwinekeBioscience00-4333-57
Sprzęt" s
GentleMACS C RurkiMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DisocjatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Procesor
LS KolumnyMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixerEppendorf05-412-503
ThermomixerEppendorf05-412-503
HBSS+ Bufor
Amfoterycyna BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0,5 M), pH 8,0, bez RNazThermo fisherscientific AM9260G500µ l
Płodowa surowica bydlęca GeminiBio-Products100-10610ml
HBSS Zbilansowany roztwór soli Hanka 1X 500 mlVWR45000-456500ml butelka
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Mieszanina antybiotyków penicylina-streptomycyna-neomycyna (PSN)Thermo fisher scientific156400555ml
Lista przeciwciała dla FACS
Alexa Fluor 647 anty-human CD326 (EpCAM) PrzeciwciałoBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Zestaw cząstek kontroli negatywnejFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, ludzkiMiltenyi Biotec130-091-93520µ l / 107 całkowita liczba komórek
CD45 Mikrokulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-045-80120&mikro; l / 107 łączna liczba komórek
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anty-ludzki CD235aBioLegend3491041:100
FITC anty-ludzki CD31BioLegend3031041:100
FITC anty-ludzki CD45BioLegend3040541:100
FITC anty-mysie przeciwciało IgMBioLegend4065061:500
Mysi IgM anty ludzki HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE anty-ludzki CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Skład pożywek do hodowli organoidów
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Nabłonek małych dróg oddechowych Pożywka do wzrostu komórekPromoCellC-21170
ThinCert Wkładki do hodowli tkankowych, sterylnyGreiner Bio-One662641
Y-27632 (inhibitor ROCK) 100mM zapas (1000x)Stemcell Technologies72302
Mysz Podłoże podstawowe:
Amfoterycyna BThermo fisher naukowy1529001850 &mikro; l
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
Surowica bydlęcadla płodu Gemini Bio-Products100-1065 ml
Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100X)ThermoFishernaukowy 41400045500 &mikro; l
Mieszanina antybiotyków penicylina-streptomycyna-neomycyna (PSN)Thermo fisher scientific15640055500 µ l
SB431542 Inhibitor szlaku TGF-&beta (zapas 100 mM)Komórka macierzysta722345 i mikro; l
Wykaz przeciwciał do immunohistochemii
Roztwór demaskujący antygenwektorH-3300937 i mikro na bazie kwasu cytrynowego; l w 100 ml wody
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Przeciwciała
Anty HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
Przeciwciało monoklonalne FOXJ1 (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Ludzkie układy R i D przeciwciał uteroglobiny/SCGB1A1MAB42181:300
Keratyna 5 Poliklonalne przeciwciało kurczaka, oczyszczone [Poly9059]Biolegend9059011:500
Przeciwciało monoklonalne MUC5AC (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Podoplanina Przeciwciało (klon 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Oczyszczone mysie przeciwciało anty-E-KadherynaBD biosciences6101821:1000
Przeciwciało Sox-2Santa Cruz biotechnologiessc-3659641:300
Przeciwciała
Osioł anty-królik lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC przeciwciało anty-mysie IgMBioLegend4065061:500
Kozie przeciwciało przeciw chomikowi IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-211131:500
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG1 z adsorbcją, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211211:500
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2a z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211311:500
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2a z adsorbcją, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2b z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211441:500
Immunohistochemiczny roztwórblokujący 3% BSA, o.4% Triton-x100 w TBS (sól fizjologiczna na bazie Tris)
Roztwór3% BSA, ).1% Triton-X100 w TBS
Immunohistochemiczny roztwórTBS z 0,1% Tween 20
komórek Worki tkanek, pierwotnedrugorzędowe do inkubacji immunohistochemicznej myjący

Bibliografia

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  3. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  4. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  5. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  6. Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
  7. Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
  8. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  9. Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050(2008).
  10. McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
  11. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
  12. Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
  13. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
  14. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634(2018).
  17. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  18. Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  19. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  20. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  21. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
  22. Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
  23. Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
  24. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  27. Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sortowanie kom rek aktywowane fluorescencjdysocjacja tkankimarkery powierzchniowe kom rekkom rki podstawne NGFRkom rki p cherzykowe HTII 280deplekcja za pomoc kulek magnetycznychwydajno tworzenia koloniigenerowanie organoid w 3D
Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.